W
W YN
.D W
Možnosti M ž i a úskalí ú k lí detekce d k DNA Borrelia burgdorferi sensu lato
EX
Bolehovská R R., Plíšková L L.,
Z
.C
Ústav Ú t kli klinické i ké biochemie bi h i a diagnostiky LF a FN Hradec Králové
W
W
Diagnostika lymeské boreliózy
YN
.D W
Dobtížná Dklinický obraz – velmi rozmanitý Danamnestické údaje (přisátí klíštěte ~ 60 %) Dlaboratorní l b í - nejednoznačnost laboratorních í nálezů á ů
EX
elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenčníí analýza, ý PCR, …
Z
.C
DCSF - vyšetření leukocytů (pleocytóza, zejm. mononukleáry) y , celkové bílkoviny y (↑, někdyy ↑ gamaglobuliny) × někdy norm. nález
W
W
Molekulárně biologické metody (PCR)
.D W
Dvýhody – rychlost, citlivost, specifita, možnost vyšetření v jakémkoliv materiálu
D preanalytická
YN
Dúskalí
EX
fáze – výběr pacientů, materiálů a jejich načasování, načasování podmínky transportu apod. apod D příprava vzorků, izolace (optimalizace), uchování DNA D výběr primerů, optimalizace a validace metody D kontrola kvality (VKK, (VKK EHK)
Z
.C
W
W
Preanalytická fáze
D akutní
.D W
Dvýběr pacientů – dif. dg.
YN
LB - genom. DNA ve vyšších konc. D chronická LB – stopová množství genom. DNA (doplnit o detekci p plazmidové DNA)) ⇒ ↑ záchytnost y ???
Dvýběr materiálů, načasování odběru – krev, likvor, moč, č synoviální á í tekutina, tkáň, áň vzorky kůže z EM apod. X klíště D volba lb materiálu t iál – dle dl příznaků, ří ků stádia tádi a d doby b onem. D transport – v chladu (nemrazit!!!) – vysoká teplota snižuje procento pozitivity pozitivity, hemolytické materiály ⇒ ↑ inhibicí
EX
D materiály á
Z
.C
W
W
Materiály
.D W
Dkrev k – nízká í ká senzitivita iti it D boreliémie
YN
pouze krátkodobá, přechodná, pouze v období diseminovaného onem onem. (EM (EM, neuroborelióza, neuroborelióza karditidy) Dp plazma m (10) ( ) X sérum m ((20)) X p plná krev ((100 spirochet/ml) - Mouritsen et al., Am.J.Clin.Pathol., 1996
DCSF – neuroborelióza
závislost na délce trvání onem. – do 2 týdnů PCR pozit. u 50 % X více než 2 týdny pouze u 13 % -
D možnost
.C
Lebech et al., Mol. Diagn., 2000
EX
D nepřímá
Z
adheze ke tkáním ⇒ nízká senzitivita v pozdních d í h stádiích, ád í h význam ý PCR pouze v časných č ý h stádiích
.D W
D nižší
W
W Dmoč č
Materiály
YN
senzitivita, nereprodukovatelnost D neodebírat 1. proud ranní moče D centrifugace při 36 000 g (při 14 000 g všechny moče negat.) – Bergmann et al., J. Clin. Microbiol., 2002 D vyšší
EX
Dsynoviální tekutina – artritida
Z
Priem et al., Ann. Rheum. Dis., 1998
.C
procento pozitivit D závislost na antibiotické terapii – po léčbě negat. negat PCR v synoviální tekutině, ale možnost detekce BB v synoviální membráně –
W
W
Materiály
D vysoká y
.D W
Dkůže – kožní manifestace senzitivita
Dléze EM - 36 až 88 % Dpac. s chron. atrofickou akrodermatitidou – 54 až 100 %
v transportním transportním, kultivačním médiu – po 24 hod. migrace spirochét do média ⇒ izolace DNA z kůže,, ale i z média
EX
YN
D uchování
Dklíště – výpovědní hodnota ??? D pozitivní iti í
Z
.C
nález ál ⇒ nemusíí znamenatt nákazu ák (d (doba b přisátí ři átí klíštěte – odstranění do 24 hod. riziko rozvoje LB velmi nízké)) D význam pro epidemiologické a jiné vědecké studie
W
W
Izolace
D co nejdříve (zamrazit max. max 3 měsíce) Dis., 2003
.D W
Dporovnání 3 izolací – Exner et al., Diagn. Microbiol. Infect. D fenol-chloroformová
YN
extrakce, QIAamp DNA kity (OIAGEN), automatická izolace na přístroji MagNA Pure (mg. (mg partikule) ⇒ stejná citlivost u vzorků krve krve, CSF CSF, synov. tekutiny X moč – horší citlivost u QIAamp DNA kitu
DQ QIAamp p
EX
DÚKBD – porovnání 2 izolací
DNA Mini Kit ((TQ), Q) MagNA g Pure LC DNA Isolation Kit III ⇒ srovnatelná citlivost
max. otáčky ⇒ sediment D uchování DNA – 2 až 8°C (↓ teplota - ↓ citlivost)
Z
D centrifugace
.C
DCSF, plazma, moč, synoviální tekutina atd.
W
W
Výběr primerů
.D W
Dneobvyklý genom BB – lineární chromozom + různý
p počet lineárních a cirkulárních plazmidů p ((BB jje mohou „ztrácet“) ⇒ škála Ag specifit ⇒ výběr primerů (schopnost detekce DNA BB)
EX
YN
G - transport a metabolizmus sacharidů h idů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, replikace rekombinace a oprava M – biogeneze buněčného obalu, vnější j membrány y O - posttranslační modifikace, proteinové přeměny, chaperony R – hlavní hl í funkce f k jje pouze předpokládána U – neznámá funkce
Z
.C
funkce proteinů (NC_001318)
W
- Borrelia burgdorferi B31 –
W
NC_001318, lineární dsDNA, délka (9 lineárních a 12 cirkulárních) 93 % kódujících sekvencí, GC obsah 28 %, 23 strukturálních RNA
YN
.D W
910 724 bp, 874 genů, 21 plazmidů
- Borrelia afzelii PKo –
_ , lineární dsDNA,, délka NC_008277,
EX
905 394 bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2 cirkulárních)
Z
.C
- Borrelia garinii Pbi NC_006156, lineární dsDNA, délka 904 246 bp, 904 genů, 2 plazmidy (1 lineární a 1 cirkulární)
W
W
Výběr primerů
D 5S/23S
rRNA, recA, flagellin
- plazmidová oblast OspA
D nejčastěji
př. QIAGEN, GeneProof, Dynex …
Z
D
flagelin. flagelin gen (FlaB)
.C
Dkomerční kity
EX
D OspC,
YN
.D W
D1. PCR – 1989 (chromozomální gen) Dpublikováno pu o áno mnoho sekvencí s nc primerů pr m rů z různých genů - chromozomální m z m oblast
W
W
D flagellin – bičík BB se skládá ze 2 podjednotek – FlaA (37 kDa)
.D W
a majoritního major tn ho FlaB = „flagellar f filament lament 4 41 kDa core prote protein“, n, velikost genu 1011, proteinu 336 AMK, imunogenní protein, chemotaxe a motilita (v závislosti na teplotě)
D OspC (reduktin) – „outer surface protein C“, 21 až 25 kDa,
YN
umístěn na cirkulárním plazmidu cp26, dominantní povrchový Ag ((velikost g genu 633,, proteinu p 210 AMK), ), 21 různých ý typů, yp , aktivace v závislosti na teplotě, průnik BB do slin. žláz, slin
D OspA (adhezin) - 31 kDa, lieární plazmid lp54, povrchový Ag
EX
( (gen 822, 822 protein t i 273 AMK), fce f – vazba b na střevo, tř shlukování hl k á í BB
D další proteiny vnější membrány (OspB – 34 kDa, OspD – 28 kDa, OspE – 19 kDa a OspF – 26 kDa)
.C
D VlsE – „variable major like sequence E“, umístěn na cirkulárním
Z
plazmidu lp28-1, lp28 1 povrchový Ag, Ag BB neustále mění povrchově exprimovaný VlsE – snaha uniknout rozpoznání a eliminaci imunitním systémem
W
.D W
W
Klíště – hypostom – průnik do kůže, vylučování slin ⇒ tvorba cementové zátky, látky potlačující lokální imunitu, tišící b l t b bolest, bránící á í í srážení áž í krve k (ixodin) (i di ) apod. d navíc í buňky hostitele produkují histamin, ale ve slinách klíště bílkovin. látku, která ho vyváže ⇒ ranka nebolí, nesvědí … – střevo klíštěte - ukotvení BB v epitelu střev pomocí OspA
YN
⇒ ↓ exprese OspA – sání krve ⇒ ↑ teploty a ↓ pH (odpoutání BB od epitelu střeva) ↑ exprese OspC (průnik spirochét do slinných žláz přibližně po 24 hod.)
EX
– krev v těle klíšťat zahuštěna a sliny, přebytečná voda spolu s BB zpět do hostitele
Z
.C
IO – klíčové postavení subsetů TH lymfocytů - ↑ aktivace TH2 T-lymfo ⇒ časná a dostatečná produkce specif. Ab a eliminace BB - ↑ aktivace TH1 T-lymfo T lymfo ⇒ odpovědná za buňkami zprostředkovanou cytotoxickou reaktivitu, nevede k eliminaci BB, možnost perzistence (hypotéza – plazmidy)
W
W
Validace metody y
Z
.C
0 39 pg/ml 0,39
EX
sro nat ná s srovnatelná publik. závěry
YN
.D W
D detekce DNA BB a IC v jedné zkumavce (multiplex (m p realtime PCR) D IC – HLA-DQ gen
W
EX
YN
.D W
W
Porovnání různých metod
Z
.C DYNEX
W
W
Kontrola kvality - VKK
EX
YN
.D W
Dpozitivní, í negativníí a inhibiční hbč ík kontrola l – nutnost Dreal-time PCR ⇒ možnost sledování rozmezí SD a 1 řádu ⇒ standardizace metody
Z
.C
EX
YN
.D W
W
W
Z
.C
W
W
Kontrola kvality - VKK
k nt l 10 org./ml kontrola /ml
EX
YN
.D W
kontrola 25 org./ml
Z
.C
W
W
Kontrola kvality
.D W
DEHK - INSTAND e. V. D mezilaboratorní
EX
YN
porovnání (reprodukovatelnost) D r. r 2008 – 97 laboratoří D ověření metody (validace) D komutabilita EHK vzorků ????
Z
.C
W
W
Soubor pacientů
.D W
2007 CSF x krev 1 : 1
EX
YN
2008 CSF x krev 7 : 3
.C
9 za 15 měsíců vyšetřeno 1822 materiálů - 1151 likvorů (63,2 %), 609 krví (33,4 %) a 62 jiných materiálů (3,4 %) - punktát kolene, moč, vzorek kůže, cysta
9 u 4 vzorků přítomnost inhibitorů DNA polymerázy (0,2 %)
Z
9 17 vzorků pozitivních (0,9 %) - 14 likvorů, 1 krev a 2 kolenní punktáty
.D W
W
W
Závěr
EX
YN
DPCR není v dg. g LB 100% Dnegativní výsledky nevylučují onemocnění X pozitivní výsledky onemocnění potvrzují Dnutnost výběru pacientů, resp . načasování odběru výběr biologického materiálu odběru, materiálu, dodržení preanalytické fáze Dv laboratoři udělat maximum (validní výsledky)
.C Z
Dklinická korelace PCR je neuspokojivá
EX
YN
.D W
W
W Z
.C
Děkuji za pozornost
