DE ETIOLOGIE EN EPIDEMIOLOGIE VAN BOTULISMUS BU WATERVOGELS IN NEDERLAND

DE ETIOLOGIE EN EPIDEMIOLOGIE VAN BOTULISMUS BU WATERVOGELS IN NEDERLAND METBIJZONDERE AANDACHT VOOR ASPECTEN BETREFFENDE DE THERMISCHE WATERVERONTREINIGING EN DE VOLKSGEZONDHEID

ETIOLOGYANDEPIDEMIOLOGY OFBOTULISM INWATERFOWLINTHENETHERLANDS WITH SPECIAL REFERENCE TO THERMAL WATER POLLUTION AND PUBLIC HEALTH

(with asummary in English)

PROEFSCHRIFT T I R VERKRIJGING VANDKG R A A D VAN DOCTOR IN DK DIKRGKNKKSKUNDK AAN DI RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT. OP GEZAG VANDE RECTOR MAGNIFICUS PROF. DR.Sj. GROENMAN, VOLGENS BESLUIT VAN HET COLLEGE VAN DEKANEN IN HET OPENBAAR TE VERDEDIGEN OP DONDERDAG 7 JUNI 1973 DES NAMIDDAGS TE4.1 SUUR DOOR

JANHAAGSMA GEBOREN OP3 FEBRUARI 1933 TE WYMBRITSERADEEL

PROMOTOR: PROF. A. VAN DER SCHAAF

De inhoud van dit proefschrift verschijnt tevens als publicatie van het Centraal Diergeneeskundig Instituut, afdeling Rotterdam, Prof. Poelslaan 35, Rotterdam-7. 1<m BRONDER-OFFSET B.V. - ROTTERDAM

Aan zijdie mijliefzijn endiedaardoor eenvoortdurende stimulanszijngeweest

VOORWOORD Bij het verschijnen van dit proefschrift wil ik gaarne de gelegenheid benutten U, Hoogleraren, Oud-hoogleraren en andere docenten van de Faculteit der Diergeneeskunde, dank te zeggen voor Uw bijdrage tot mijn wetenschappelijke vorming. Hooggeleerde Van der Schaaf, Hooggeachte Promotor, ikben Uzeer erkentelijk voor de prettige en geestdriftige wijze, waarop U de totstandkoming van dit proefschrift hebt begeleid. Voor het vertrouwen dat U mij hebt geschonken en voor de voortvarende wijze waarop U het manuscript hebt doorgewerkt, waarin ook Uw officiële afscheid als Hoogleraar geen verandering bracht, ben ik U oprecht dankbaar. GeleerdeBool,beste Jeroen, ik ben je zeer veel dank verschuldigd voor de stimulerende belangstelling die je steeds voor het onderzoek hebt getoond. Datje, naast de bergen werk die je uit hoofde van je functie moest verzetten, nog gelegenheid vond het tot stand komen van dit manuscript op de voet te volgen en toestemde als co-referent te willen optreden, heeft mij met groot respect vervuld. Zeergeleerde Over,beste Hans,de buitengewoon plezierige en enthousiaste wijze, waarop wij hebben samengewerkt, is nauwelijks in woorden te vangen. Voor bepaalde gedeelten van dit onderzoek was een tandem dierenarts - bioloog van eminent belang.Ik heb de overtuiging dat dank zij deze koppeling het onderzoek met een extra dimensie isverrijkt. Tijdens het veldwerk heb ik bijzonder genoten van je grote kennis van al wat leeft en bloeit. Ik ben je daarom zeer erkentelijk datjuistjij mij alsparanymf wilt bijstaan. Zeergeleerde Terpstra, toen wij bij de eerste watervogels met botulismus stonden, was U er snel van overtuigd dat hier een taak lag voor het Instituut; U fiatteerde daarmede de aanloop van de eerste onderzoekingen. Gaarnebetuigikmijn dankvoordenuttigecontacten dieikbijhet totstandkomen van dit proefschrift met collega's van het Instituut had. De prettige en collegiale sfeer tussen onsheeft hier zeer toe bijgedragen.

Bijzonder veel dank ben ik verschuldigd aan de medewerkers van de afdeling voor de uitvoering van delaboratoriumwerkzaamheden. Geachte mejuffrouw van Pelt, beste Frida, deze dank beperkt zichvoorjou niet alleen tot de voorgevechten die op dit onderzoek betrekking hebben. Geachte mejuffrouw Schwarz en geachte heren Maas en de Jong, beste Alie, Maas en Dirk, jullie inzet is steeds boven alle lof verheven geweest en zonder jullie nimmer aflatende hulp had dit werkstuk nimmer tot stand kunnen komen. De goede sfeer en teamgeest zijn mede bepalend geweest voor het eindresultaat. Veel andere medewerkers van het Instituut moet ik eveneens dankzeggen voor hun aandeel. In het bijzonder wil ik gaarne memoreren de grote nauwgezetheid waarmede mevrouw van Daal-Vervloet al het typewerk heeft verzorgd en de consciëntieuze wijze waarop de heer Koster de foto's en figuren heeft vervaardigd. Het is niet mogelijk verder iedereen apart dank te zeggen,doch wilik nog eenuitzonderingmaken voor de medewerkers van de afdeling voedingsmedia,de sectiezaal en de technische dienst. Ik stel het zeer op prijs ook de hulp te memoreren die ik heb ontvangen van personen en instellingen buiten het Instituut; de geographische spreiding weerspiegelt zich in de inhoud van dit proefschrift. Voor de belangrijke observaties die in Hilvarenbeek, in het bijzonder in het Talingputje, konden worden uitgevoerd, ben ik zeer veel dank verschuldigd aan U, Zeergeachte mevrouw van Puyenbroek en aan Uw medewerker, de heer van der Berg.Voor de hulp bij het onderzoek in 's-Gravenhage wil ik danken U, geleerde Ansingh van de Gemeentelijke Geneeskundige- en Gezondheidsdienst en Uw medewerker de heer Nieuwenhoven. Geleerde van der Kamp,beste Jan, in Groningen mocht ik opjou steun rekenen. Geachte heer Musters, zeer veel gegevens betreffende "Amsterdam" ontving ik dank zij Uw bemiddeling. Medewerkers van de afdeling Parasitologic te Lelystad, ik gedenk gaarne het materiaal dat door jullie werd verzameld. Ook al diegenen, wier namen ik niet heb genoemd, maar die toch op enigerlei wijze hebben bijgedragen in dit onderzoek, wilik oprecht dankzeggen. Het zij mij vergund ook mijn eigen gezin in deze dankbetuigingen te betrekken. Lieve Maaike, jij hebt schijnbaar moeiteloos allerlei huiselijke beslommeringen op je schouders erbij genomen en het daardoor mogelijk gemaakt dat ik mij volledig kon inzetten. Wij zullen zeker nogvaak moeten glimlachen bij de herinnering aan Johan Frank's meestal 'savonds na het nieuws vermanend uitgesproken woorden: nu moet papa werken.

INHOUD HOOFDSTUK 1. INLEIDING

15

HOOFDSTUK 2. LITERATUURSTUDIE

17

2.1. Algemeengedeelte 2.1.1. Historie en voorkomen 2.1.2. Etiologie 2.1.3. Pathogenese 2.1.4. Symptomatologie 2.1.5. Pathologische anatomie 2.1.5.1. Macroscopische veranderingen 2.1.5.2. Histologische veranderingen 2.1.6. Diagnostiek 2.1.7. Prophylaxe en therapie 2.2. Bijzonder gedeelte 2.2.1. Deetiologie van botulismusbij watervogels 2.2.2.

Deepidemiologie van botulismus bij watervogels

2.3. Samenvatting HOOFDSTUK 3. MATERIALEN ENMETHODIEKEN 3.1. Materialen 3.1.1. Voedingsmedia 3.1.1.1. Vloeibare voedingsmedia voor anaërobe kweek 3.1.1.2. Vaste voedingsmedia voor anaërobe kweek 3.1.1.3. Andere voedingsmedia 3.1.2. Antitoxische sera • 3.1.2.1. Cl.botulinum antitoxinen 3.1.2.2. Cl.tetani antitoxine

17 17 21 24 24 25 25 26 26 27 29 29. 30 34 35 35 35 35 37 38 39 39 40 9

3.2. Methodieken 3.2.1. Aantonen en typering vanhet botulinumtoxine 3.2.2. Isolatie vanCl.botulinum 3.2.2.1. Aantonen in ophopingsculturen 3.2.2.2. Isolatie van Cl.botulinum in reincultuur 3.2.3. Bepalingvan de concentratie van het botulinumtoxine

41 41 44 44 45 47

HOOFDSTUK 4. EENONDERZOEKNAAR HETVOORKOMENVAN BOTULISMUS BIJWATERVOGELSINNEDERLAND 48 4.1. Inleiding

48

4.2. Diagm >stiekvanbotulismus bijwatervogels 4.2.1. Symptomatologie 4.2.2. Post-mortem bevindingen 4.2.3. Aantonen vanhet botulinumtoxine

48 49 50 51

4.3. HetoptredenvanbotulismusbijwatervogelsinNederland 4.3.1. In 's-Gravenhage 4.3.2. In Amsterdam 4.3.3. In Hilvarenbeek 4.3.4. In Zuidelijk Flevoland 4.3.5. In Groningen 4.3.6. In Leiden/Voorschoten 4.3.7. In andere gebieden

54 54 55 60 61 63 64 65

4.4. Samenvatting

67

HOOFDSTUK 5. EENONDERZOEKNAAR HETVOORKOMENVAN CL.BOTULINUM INVERBANDMETHET OPTREDENVAN BOTULISMUS BIJWATERVOGELS

68

5.1. Inleiding

68

5.2. Materialenenmethodieken 5.2.1. Onderzoek van bodemmonsters 5.2.2. Onderzoek van dieren 5.3. Resultaten 5.3.1. Voorkomen van Cl.botulinum in de bodem inNederland 5.3.1.1. In gebieden waar vogelsterfte door botulismus wasvastgesteld 10

69 69 69 71 71 71

5.3.1.2.

5.3.2.

5.3.3.

In gebieden met veelwatervogels,waarin geen vogelsterfte door botulismus wasvastgesteld 5.3.1.3. In willekeurige bodemmonsters Voorkomen van Cl.botulinum bij dieren 5.3.2.1. Bijvogels,afkomstig uit gebieden waar botulismuswasvastgesteld 5.3.2.2. Bijvogels,afkomstig uit gebieden waar botulismusniet wasvastgesteld 5.3.2.3. Bijdiverse zoogdieren 5.3.2.4. Bijvissen 5.3.2.5. Bijinvertebraten Isolatie van Cl.botulinum in reincultuur 5.3.3.1. Cl.botulinum type C 5.3.3.2. Cl.botulinum type E 5.3.3.3. Cl.botulinum type B 5.3.3.4. Cl.botulinum type A

5.4. Samenvatting

76 79 82 83 88 91 92 95 102 102 103 103 104 104

HOOFDSTUK 6. EENONDERZOEKNAARHETVOORKOMENVAN HETBOTULINUMTOXINE 6.1. Inleiding

108 108

6.2. Materialenenmethodieken 108 6.3. Resultaten 110 6.3.1. Onderzoek vankadaversvan vertebraten 110 6.3.1.1. Van watervogels 111 6.3.1.2. Van zoogdieren 112 6.3.1.3. Vanvissen 112 6.3.2. Onderzoek vaninvertebraten 112 6.3.3. Onderzoek vanwater en slib 114 6.3.3.1. Verzameld ingebieden met botulismus 114 6.3.3.2. Productie vanhet botulinumtoxine onder experimentele omstandigheden 115 6.3.3.3. Resistentie vanhet botulinumtoxine in slib 116 6.3.4. Veldproef met wilde eenden 119 6.4. Samenvatting HOOFDSTUK 7. DEGEVOELIGHEIDVANEENDENVOORHET BOTULINUMTOXINE

120

122

7.1. Inleiding

122

7.2. Materialenenmethodieken 7.3. Resultaten 7.3.1. Gevoeligheid voor het type C-toxine 7.3.2. Gevoeligheid voor de toxinetypen A,B en E 7.3.3. Optreden vanhet "Behring phenomeen" 7.3.4. Immunologische aspecten 7.4. Samenvatting

122 125 125 126 129 129 131

HOOFDSTUK 8. MORFOLOGISCHE,CULTURELE,BIOCHEMISCHE ENSEROLOGISCHEONDERZOEKINGEN VANDE GEÏSOLEERDECL.BOTULINUMSTAMMEN 8.1. Inleiding

133 133

8.2. Materialenenmethodieken 8.3. Resultaten 8.3.1. Morfologische, culturele en biochemische eigenschappen 8.3.1.1. Cl.botulinum type C 8.3.1.2. Cl.botulinum type B 8.3.1.3. Cl.botulinum type A 8.3.1.4. Cl.botulinum type E 8.3.2. Serologisch onderzoek 8.3.2.1. Specificiteit vanhet C-mink antitoxine 8.3.2.2. Vergelijkend onderzoek vanC-mink antitoxine met enkele andere type Cantitoxinen 8.3.2.3. Vergelijkend onderzoek vanC-mink antitoxine met het botulinumtoxine van Nederlandse type C-stammen 8.4. Samenvatting

134 137 137 137 142 144 145 147 147 147

149 150

HOOFDSTUK 9. DEINVLOEDVAN DETEMPERATUUR BIJ HET OPTREDEN VAN BOTUL1SMUSBIJWATERVOGELS 152 9.1. Inleiding 9.2. Materialenenmethodieken 12

152 152

9.3. Resultaten 9.3.1. Productie van botulinumtoxine type Cbij lagere temperaturen 9.3.2. Milieutemperaturen in gebieden waar botulismus bij watervogelsisopgetreden 9.3.2.1. In een natuurlijk milieu 9.3.2.2. In gebieden waar sprake isvan een thermische waterverontreiniging 9.4. Samenvatting

153 153 156 156 158 165

HOOFDSTUK 10. BESPREKING VANDERESULTATEN-

166

10.1 Deetiologievanbotulismusbij watervogels

166

10.2. Deepidemiologie vanbotulismusbijwatervogels

169

10.3. Deinvloedvanthermischewaterverontreiniging bijhet optreden vanbotulismusbijwatervogels 10.4. Volksgezondheidsaspecten bijhet optredenvanbotulismusbij watervogels

171 174

SAMENVATTING ENCONCLUSIES

179

SUMMARYANDCONCLUSIONS

188

LITERATUUR

196

REGISTERMET VOGELNAMEN

203

CURRICULUMVITAE

205

13

HOOFDSTUK I INLEIDING Botulismus is een specifieke intoxicatie, veroorzaakt door de opname van toxinen die door Clostridium botulinum zijn gevormd. De eerste beschrijving van deze ziekte bij demens werd in 1820gegeven door de Duitse dichter en medische geschiedschrijver Justinus Kerner (Jordan, 1917). Bij dieren is het ziektebeeld reeds in de 18e eeuw beschreven. De ontdekkingsreiziger LeVaillant, dievan 1780 tot 1785door Zuid-Afrika trok, signaleerde bij runderen een door verlammingsverschijnselen gekenmerkte ziekte, die door hem heel passend met "lamsiekte" werd aangeduid. Hutcheon vestigde in 1884 voor het eerst de aandacht op het knagen aan beenderen, speciaal door jonge dieren in de tijd dat de ziekte veel optrad. Later is gebleken dat "lamsiekte"doorhet botulinumtoxine wordt veroorzaakt (Henning, 1956). De etiologie van botulismus bij de mens werd in dejaren 1895-1897opgehelderd door de Belgvan Ermengem;hij toonde het botulinumtoxine aan en isoleerde de eerste Clostridium botulinum-cuhuur. Sindsdien isgebleken dat, opgrond van antigene verschillen tussen de gevormde toxinen, diverse typen van Cl. botulinum kunnen worden gedifferentieerd. Momenteel onderscheidt men 6 toxinetypen, die met de letters A tot en met F worden aangeduid (Dolman en Murakami, 1961). De mens is zeer gevoeligvoor detoxinetypen A, B,Een F,terwijl de typenC en Dvooral verantwoordelijk blijken te zijn voor het optreden vanbotulismus bij dieren. Er bestaat een duidelijk onderscheid in gevoeligheid voor deze toxinetypen bij de verschillende diersoorten. Zo zijn paarden, runderen, schapen, nertsen, bepaalde vogelsoorten en enkele laboratoriumproefdieren zeer gevoeligvoor het botulinumtoxine. De meeste hond-en katachtigen en het varken zijn daarentegen vrijwel ongevoeligvoorhet toxine. Uitgebreide sterfte bij landbouwhuisdieren door botulismus isvooral waargenomen inZuid-Afrika, Noord-Amerikaen West-Australië. Bij watervogels dateert deeerste beschrijving van 1893, toen inZuid-Afrika in 15

de "Agricultural Journal of the Cape" gewag werd gemaakt van "lamsiekte" bij eenden. In de Verenigde Staten is het regelmatig optreden van botulismus bij watervogels sinds 1910bekend. Ook in Australië ismeldinggemaakt van massale sterfte door botulismus bij watervogels. In Europa zijn pas in de laatste jaren enkele vrij ernstige gevallen vanbotulismus bij watervogels vastgesteld, nl. in Zweden (Niléhn en Johannsen, 1965), in Denemarken (Muller, 1967)en in Engeland (Blandford etal., 1969). In Nederland was massale sterfte door botulismus alleen bekend bij farmnertsen, terwijl bij paarden en runderen slechts enkele ziektegevallen zijn waargenomen. Bij watervogels is een enkele keer eenverdacht ziektegeval gesignaleerd, zonder dat de diagnose inhet laboratorium kon worden bevestigd. In deze toestand kwam verandering, toen in de zomer van 1970 op verschillende plaatsen in Nederland grote aantallen watervogels met dezelfde ziekteverschijnselen bleken te sterven. Nader onderzoek leerde dat hier sprake was van botulismus, veroorzaakt door de opname van het toxine van Cl. botulinum type C (Haagsma et al, 1971). Dit eerste massale optreden van botulismus bij watervogels in Nederland was aanleiding een verder onderzoek in te stellen, temeer omdat hier problemen, verband houdende met de milieuverontreiniging en de volksgezondheid, aan het licht kwamen. Dit onderzoek, dat werd gestimuleerd door het nog ernstiger optreden van botulismus in 1971, concentreerde zichvooral op devolgende punten: 1) WatisdeverspreidingvanCl. botulinum in Nederland? 2)#Onder welke omstandigheden heeft de vorming van het botulinumtoxine plaats, zodat massale sterfte bij watervogels en eventueel andere dieren mogelijk wordt? 3) Iser een relatie met bepaalde vormen van milieuverontreiniging? 4) Welkezijn de consequenties voor de volksgezondheid? In devolgendehoofdstukken worden de resultaten vanhet hierboven geschetste onderzoek nader beschreven.

16

H O O F D S T U K II LITERATUURSTUDIE

2.1. ALGEMEENGEDEELTE 2.1.1. Historie envoorkomen Botulismus is de benaming van een ziekte, waarbij een specifieke orale intoxicatie optreedt, veroorzaakt door de opname vantoxinen die door de bacterie Clostridiumbotulinum zijn gevormd (Meyer, 1953). Andere aanduidingen van de ziekte als allantiasis en ichthyosismus zijn thans inhet vergeetboek geraakt. De naam botulismus is afgeleid van het Latijnse woord botulus, wat worst betekent. Men meende in de eerste helft van de 19eeeuw dat botulismus veroorzaakt werd door het eten vangiftige worst, speciaalvan bloedworst zoals dieveel in Zuid-Duitsland werd bereid. Van Ermengem (1897) heeft er echter reeds op gewezen dat de benaming botulismus minder juist is, omdat de ziekte ook kan optreden na het eten van diverse andere levensmiddelen, zoalsham. vleesconserven en zelfsvis. In tegenstelling tot andere vormen van voedselvergiftigingen, waarbij meestal gastro-intestinale symptomen op de voorgrond treden, is botulismus vooral gekenmerkt door het optreden van nerveuze afwijkingen. De etiologie van botulismus werd opgehelderd door van Ermengem (1896, 1897), die een voedselvergiftiging in het Belgische dorpje Ellezelles bestudeerde. De ziekte trad op bij personen, die 14december 1895 aan een rouwplechtigheid hadden deelgenomen. Alle patiënten, waarvan er drie stierven, hadden gegeten van ongekookte, door zout geconserveerde ham. Met restanten van deze ham kon bij proefdieren na orale en parenterale applicatie de toxiciteit van dit voedsel afdoende worden gedemonstreerd. Het gelukte van Ermengem vervolgens uit deze ham en uit de milt van één der overleden patiënten een obligaat anaëroob groeiende bacterie in reincultuur te isoleren. 17

Met toxische culturen en met bacterievrije fikraten van dit micro-organisme konden bij proefdieren dezelfde ziekteverschijnselen worden opgewekt. Muizen, caviae en konijnen waren zeer gevoeligvoor het toxine, duiven en ratten minder. Honden en kippen bleken ook na subcutane toediening vanhet toxine refractair te zijn. Katten waren ook weiniggevoeligvoor het toxine, maar het ziektebeeld, dat pas na hoge subcutaan toegediende doseringen kon worden opgewekt, vertoonde wel de grootste overeenkomst met dat van de mens. Met deze onderzoekingen was afdoende bewezen dat botulismus door het toxine van het anaëroob groeiend micro-organisme werd veroorzaakt, en niet, zoals steeds was verondersteld, door bederf van het voedsel met de daarbij optredende giftige autolytische afbraakproducten (toxische alkaloïden, ptomaïnen). De ontdekkingen van van Ermengem hebben de stoot gegeven aan tal van nieuwe onderzoekingen in verband met het optreden van voedselvergiftigingen, speciaalalser sprake leek te zijn van botulismus. In de jaren 1920-1930 stimuleerde de snel groeiende conservenindustrie het onderzoek bovendien inhoge mate,met name in de Verenigde Staten. Er werden spoedig ook meer Cl.botulinum-culturen geïsoleerd; Leuchs stelde in 1910 als eerste vast, dat er twee immunologisch verschillende toxinetypen waren. Momenteel onderscheidt men 6 toxinetypen, die met de letters A tot en met F worden aangeduid; het C-toxine wordt nog in de subtypen Ca en C/3verdeeld (Dolman en Murakami, 1961). Sinds de eerste wereldoorlog blijkt botulismus bij de mens voornamelijk te worden veroorzaakt door met zout, suiker of door hitte thuis geconserveerd voedsel; vlees en vis veroorzaakten de meeste gevallen, maar uitbraken door groenten en fruit kwamen ook voor. Hierbij werden vrijwel steeds de toxinetypen A, B en Egevonden (Meyer, 1956;Anon., 1963;Foster et al, 1965; Matveev et al., 1967).Slechts Miller en Scheibel (1960)vermelden een gevalvan botulismus in Denemarken, waarbij type F was betrokken. Verder worden enkele discutabele gevallen, veroorzaakt door type C en D, besproken door Dolman en Murakami (1961)en Matveev etal.(1967). In Nederland zijn bij de mens enkele gevallen van botulismus bekend geworden. In de periode 1918 tot 1937 worden 7 gevallen vermeld, waarbij in totaal 19 patiënten waren betrokken; bij 4 personen had de ziekte een fatale afloop. In 4 gevallen betreft het alleen een klinische diagnose, zodat er 3 betrouwbaar gediagnostiseerde botulismusuitbraken overblijven. Het eerstegeval, waarbij beide patiënten stierven, wordt door Gewin (1918) beschreven. Varkensvlees werd als het verdachte voedsel beschouwd, het botulinumtoxine werd hierin aangetoond, doch typering vond niet plaats. Dit geschiedde wel bij de door Clarenburg en Fijen (1937) en Schoonhoven van Beurden en Clarenburg (1937) vermelde gevallen, die zich in Zuid-Limburg voordeden, en waarbij type B-toxine werd aangetoond. In het laatste geval werd uit de voor debotulismus18

uitbraak verantwoordelijk gestelde varkensham tevens Cl. botulinum type B geïsoleerd. Voor zover bekend zijn de laatste gevallen van botulismus bij de mens in de 2e Wereldoorlog voorgekomen. In drie internaten in de omgevingvan Nijmegen, die voedsel van dezelfde keuken ontvingen, zijn in november 1943 in totaal 24 personen ziek geworden waarvan er 9 aan botulismus zijn gestorven. Het botulinumtoxine werd aangetoond in het bloedserum van 2 patiënten en in één van de voedingsmiddelen (varkensham). Interessant is verder de waarneming dat het toxine niet was te neutraliseren met antitoxine type A of B;andere typen antitoxine waren helaas niet beschikbaar (Bekker, 1944;Enneking, 1944). Bij dieren kan eveneens min of meer uitgebreide sterfte optreden door botulismus. In het begin der 20eeeuw zijn in deVerenigde Staten de typen Aen B wel verantwoordelijk gesteld voor botulismusgevallen: forage poisoning bij paarden door type B (Graham en Brueckner, 1919) en limberneck bij kippen door type A(Burke, 1919). Na de ontdekking van de toxinetypen Ca (Bengston, 1922), C/5 (Seddon, 1922) en D (Theiler en Robinson, 1927; Robinson, 1930) is gebleken dat botulismus bij dieren voornamelijk door deze typen wordt veroorzaakt. Bij runderen is botulismus de oorzaak van ernstige ziekte-uitbraken geweest en onder verschillende namen beschreven: als "lamsiekte" in Zuid-Afrika; als "loin disease" en "down in-the-back" in de Verenigde Staten en als "Midland cattle disease", "bulbar paralysis", "dry bible" en "bushsickness" in Australie (Henning, 1956). In Europa is bij runderen ook incidenteel botulismus vastgesteld: in Denemarken door Müller (1963); in Noorwegen door Fj^lstad en Klund (1969) en Hauge (1970);in Nederland door Koopman, de Reusen Haagsma (1971). Paarden en muilezels blijken ook zeer gevoelig te zijn voor het botulinumtoxine; sterfte is dan ook door diverse auteurs beschreven: in Zuid-Afrika door Theiler en Robinson (1927); in Senegal enMauritanië door Doutre en Chambon (1971); in Australië door Bennetts en Hall (1938); in Frankrijk en België door Prévôt en Brygoo (1953); in Denemarken door Muller (1963); in Noorwegen door Hauge(1970);in Nederland door Cysouw en Tesink (1968). Bij schapen isbotulismusvooral een probleem geweest in Australië (Bennetts, 1938). Incidentele 'sterfgevallen zijn waargenomen door Hauge (1970) en Haagsma (1972). Varkens lijken zeer ongevoelig te zijn voor alle toxinetypen; het experimentele onderzoek van Smith etal.(1971)heeft deze meningbevestigd. Enkele in de literatuur vermelde botulismusgevallen zijn wegens de onvolledige diagnostiek onbetrouwbaar. Een uitzondering hierop ismisschien debotulismusuitbraak,die door Beiersen Simmons (1967) wordt beschreven bij 14varkens in Australië. Honden en katten zijn in hoge mate refractair voor het botulinumtoxine. 19

Prévôt en Brygoo (1953) vermelden echter dat zij 5gevallen bij de hond hebben waargenomen, terwijl Johannsen (1965) een geval bij éénhond beschrijft. De wetenschappelijke waarde van deze publicaties is echter aanvechtbaar, omdat niet aan alle diagnostische criteria werd voldaan. Dit geldt ook voor de door Vallée etal.(1956) beschreven ziektegevallen. Bijkatten zijn evenmin goed gedocumenteerde botulismusgevallen aangetroffen. Wel is reeds door van Ermengem (1897) vastgesteld dat bij katten onder experimentele omstandigheden botulismus kan worden opgewekt met grote doses type B-toxine; dit is later door andere onderzoekers bevestigd (Prévôt en Brygoo, 1953). Van de bedrijfsmatig gehouden zoogdieren blijken tenslotte ook nertsen erg gevoelig te zijn voor het botulinumtoxine, speciaal voor het C-toxine; in alle landen met een belangrijke nertsenfokkerij zijn ernstige ziekte-uitbraken voorgekomen, waarbij in enkele dagen vaak duizenden nertsen aan botulismus stierven (o.a. Quortrup en Gorham, 1949; Dinter en Kuil, 1950 en 1955;Avery etal, 1959;Hawkyard, 1965;Yndestad en Loftsgard, 1970). In Nederland is uitgebreide sterfte bij nertsen door botulismus vastgesteld door Akkermans (1961)en Haagsma (1965). Bij vogels is het optreden van botulismus ook veelvuldig beschreven. Bij kippen in de Verenigde Staten was de ziekte reeds in 1918 bekend onder de naam "limberneck". Botulismus werd toen toegeschreven aan het voederen van bedorven keukenafvallen en trad soms gelijktijdig op met ziektegevallen bij de mens; meestal werd hierbij type A aangetoond. Later werd de rol van type C onderkend, waarbij de toxine-opname vooral zou geschieden via maden van sarcophage vliegen (Wilkens en Dutcher, 1920; Graham en Boughton, 1924). ZoalsBlandford en Roberts (1970) en Haagsma (1972) vaststelden, kunnen in de moderne kippenbedrijven ook nogbotulismusuitbraken voorkomen. In fazantenfokkerijen in Zweden is uitgebreide sterfte door botulismus voorgekomen (Dinter en Kuil, 1954). In de Verenigde Staten (Boroff en Reilly, 1962;Fishetal, 1967)isdit ook waargenomen. In gebieden met "lamsiekte" is botulismus ook bij struisvogels vastgesteld (Henning, 1956). Zeer ernstige sterfte door botulismus is voorgekomen bij watervogels in de Verenigde Staten. Eenhistorisch overzicht isgegeven door Kalmbach (1935).De ziekte kwam voor het eerst in 1910 voor, toen in Salt Lake Valley (Utah) ontelbare watervogels het slachtoffer werden. In de daaropvolgendejaren kwam het ook op andere plaatsen tot massale sterfte; zo werden in 1912 bij Ogden (Utah) 30.000, in Salt Lake Valley van 22 augustus tot 21 september 44.000 dode vogels verzameld. Omdat de ziekte vooral in het Westen van de Verenigde Staten voorkwam, sprak men aanvankelijk van "Western duck sickness", later ook welvan "alkali disease". Nadat Bengston in 1922 Cl. botulinum type Ca had ontdekt, werd door onderzoekingen van Kalmbach (1930 en 1932), Giltner en Couch (1930) en 20

Hobmaier (1930) aangetoond, dat deze massale sterfte door het botulinumtoxine type Cawerd veroorzaakt. Botulismusissindsdien bijna elkjaar op steeds meer plaatsen voorgekomen (Kalmbach, 1968). Ook in andere landen isbotulismus bij watervogelsvastgesteld. Waarschijnlijk dateert de eerste beschrijving reeds van 1893, toen in Zuid-Afrika een "lamsiekte" bij eenden werd gesignaleerd (Henning, 1956). In Australië zijn botulismusuitbraken beschreven door Pullar (1934)en Grubb (1964). Sinds enkele jaren is ook inEuropa botulismus bij watervogels onderkend: in Zweden door Niléhn en Johannsen (1965), in Denemarken door Muller (1967a) en in Engeland door Blandford en medewerkers (1969). In Nederland trad de ziekte voor het eerst op in 1970 (Haagsma etal., 1971). 2.1.2. Etiologie Algemeen wordt aangenomen dat botulismus een intoxicatie is en er dus feitelijk niet van een infectieziekte gesproken kan worden. Het oorzakelijke micro-organisme, Cl.botulinum, produceert een zeer krachtigtoxine. Dit toxine wordt na de orale opname geabsorbeerd door de mucosa van de maag en de dunne darm en wekt vervolgens het karakteristieke ziektebeeld op. Botulismus ontstaat niet door de opname van grote dosesbacteriesporen, die door wassen of verhitten zijn gedetoxificeerd (o.a. Tanner en Tanner. 1953: Wilson en Miles. 1957; Lamanna, 1959). Gunnison en Coleman (1932) toonden aan dat ook bij eenden met 6 x l 0 8 gedetoxificeerde bacteriesporen geen ziekteverschijnselen konden worden opgewekt. Slechts enkele publicaties omstreeks 1920 vermelden dat botulismus welkon worden veroorzaakt na de opname van toxinevrije bacteriesporen. De applicatie geschiedde bij caviae subcutaan en per os(o.a.Coleman enMeyer, 1922;Graham en Eriksen, 1922; Starin en Dack, 1925). Deze resultaten zijn later niet door andere onderzoekers bevestigd; zij zijn bovendien aanvechtbaar omdat het zeer lastig blijkt te zijn Cl. botulinum-spoien volledigtoxinevrij te maken (Wilson en Miles, 1957). Bijde mensishet optreden vanbotulismus meestal te wijten aan drie factoren (Foster etal, 1965): 1) aan een inadaequate voorbehandeling van het voedsel (zouten, pekelen, roken, drogen en verhitten); 2) aan het bewaren van het voedsel bij temperaturen die de groei van Cl.botulinum mogelijk maken; 3) aanhet eten zonder voldoende verhitting van het voedselvooraf. In de Verenigde Staten werden talrijke gevallen veroorzaakt door thuis ingemaakte groenten envruchten, in Europa daarentegen vaker door vleesgerechten die van het varken afkomstig waren. In de Verenigde Staten, Canada, Japan, Rusland en de Scandinavische landen blijken botulismusgevallen, waarbij type E 21

is betrokken, meestal te zijn ontstaan doorhet nuttigenvanvisgerechten (Meyer, 1956). Bij het optreden van botulismus bij het rund in Zuid Afrika speelde vaak fosfordeficiëntie, waardoor de neiging tot osteophagie ontstond, eenbelangrijke rol. In gebieden in Zuid-Afrika, waar "lamsiekte" endemisch is, blijkt een hoog percentage van de benige resten van kadavers toxisch te zijn (Henning, 1956).In Australië kunnen toxische kadavers van konijnen botulismus bij schapen veroorzaken (Bennetts en Hall, 1938). De incidentele gevallen van botulismus bij paarden en runderen in Europa werden meestal veroorzaakt door het toxisch geworden kadaver van een kat of een rat, die in het voeder (meestal hooi) was terecht gekomen. Bij nertsen is ondeskundig bewaren van het voedsel de belangrijkste oorzaak van botulismus. De bijzondere omstandigheden die een rol spelen bij het optreden van botulismus bij watervogels,zullen later afzonderlijk worden beschreven. Botulismus kan naast de normale orale infectieweg, zeer sporadisch op een andere wijze worden veroorzaakt: de literatuur vermeldt bij de mens 3gevallen waarin deziekte het gevolgwasvan eenwondinfectie (Lamanna, 1959). Bacteriologie De naam Clostridium botulinum is in 1917 algemeen aanvaard; voordien sprak men meestal van Bacillus botulinus, in navolging van van Ermengem (Winslow et al, 1917). Cl. botulinum iseen Gram-positief staafje met afgeronde uiteinden, sporevormend en obligaat anaëroob (Breed etal., 1957).Zoals reedsis vermeld, onderscheidt men op grond van immunologische verschillen tussen de toxinen, momenteel 6toxinetypen, diemet de letters A,B,C,D,Een F worden aangeduid (Dolman en Murakami, 1961). De in 1896 door van Ermengem beschreven cultuur behoorde tot type B, terwijl de eerste type A-cultuur in 1904 in Duitsland (Darmstadt) werd geïsoleerd;beide stammen zijn helaas reeds spoedigverloren gegaan. In 1922 werd door Bengston in de Verenigde Staten en door Seddon in Australië een nieuw toxinetype geïsoleerd; het bleek dat er slechts een gedeeltelijke serologische verwantschap bestond tussen de toxinen van beide Cl. botulinum-stammen (Pfenninger, 1924). Dit werd bevestigd door Gunnison en Meyer (1929b) en op hun voorstel werd het door Bengston geïsoleerde type met Ca en het door Sed4on gevonden type met Cßaangeduid. Later isgebleken dat type D,in 1927 inZuid-Afrika ontdekt, ook enige serologische verwantschap heeft met type C (Mason en Robinson, 1935). De verwarring rond de verwantschap tussen type Cor,Cß en D is gedeeltelijk opgehelderd door Jansen (1971), die met monospecifïeke antisera en monospecifïeke toxinen werkte. Hierbij is gebleken dat type Ca vooral toxinefactor Cj, ook factor D en afhankelijk van het groeimedium iets factor C 2 produceert; type C/5produceert 22

alleen factor C2 en type Dvooral factor Dmaar ook Cj. Bij dit onderzoek bleek tevens dat het Internationale Standaard type C antitoxine (State Serum Laboratories, Kopenhagen) antistoffen bevat tegen factor C], C 2 en D. Dit gegeven en de omstandigheid dat bij Ca de productie van factor C2 afhankelijk bleek te zijn van het groeimedium, zou andere schijnbaar tegenstrijdige resultaten bij de typering van type C-toxinen (o.a. Avery et al., 1959; Grubb, 1964)kunnen verklaren. De toxinetypen E en F, respectievelijk rond 1935 bij de Kaspische Zee enin 1960 in Denemarken ontdekt, zijn serologisch niet verwant aan de andere toxinetypen. De onderverdeling van Cl botulinum uitsluitend op grond van de geproduceerde toxinen - een indeling die taxonomisch aanvechtbaar is (Lee en Riemann, 1960) —heeft de waarde van de differentiatie door middel van culturele enbiochemische eigenschappen nogal gedevalueerd. Aan één eigenschap, de proteolytische activiteit, is vroeger reeds veel aandacht besteed. Men heeft zelfs geruime tijd de proteolytische stammen (alle type A-stammen en de in Amerika gevonden type B-stammen) apart aangeduid met Cl. parabotulinum. Deze benaming is echter in 1953 vervallen (Dolman en Murakami, 1961). De type C-stammen zijn, evenals de typen Den E,nonproteolytisch; gelatine wordt daarentegen meestal welvervloeid. Tussen de Ca- en C/5-culturen bestaan verschillen in de saccharolytische activiteit. De C/5-stam van Seddon vergist geen koolhydraten; de andere C/5-stammen zijn eveneensweinigactief, terwijl deCa-stammen wel verschillende koolhydraten omzetten (Gunnison en Meyer, 1929b; Dolman en Murakami, 1961;Segner etal, 1971a). De hitte-resistentie van de sporen van type Cligt tussen de sporen van typeA en type E(Segner en Schmidt, 1971). De laagste temperatuur, waarbij groei en toxineproductie plaats vindt, bedraagt voor type C 12,8°C. Demeeste type C-stammen groeien niet bij een pH lager dan 5,62, evenmin bij een zoutconcentratie van 2,5 tot 3%(Segner et al., 1971b). Deze auteurs zagen geen toename van de toxiciteit van het C-toxine na de inwerking van trypsine, in tegenstelling tot andere onderzoekers die bij toxinefactor C2 wel een activatie waarnamen (Jansen en Knoetze, 1971; Eklund enPoysky, 1972). De botulinumtoxinen zijn goed bestand tegen de inwerking van zuur; in alkalisch milieu zijn zij daarentegen weinig stabiel. Verwarmen gedurende 30 minuten bij 80°C inactiveert de toxinen. Het C-toxine is, evenals het D-toxine, nog het meest warmteresistent (Prévôt en Brygoo, 1953;Foster etal., 1965).De chemische structuur van de toxinen is nog niet volledig opgehelderd. Het zijn globulaire proteïnen, uitsluitend opgebouwd uit aminozuren. Detypen A, B enE zijn vooral onderzocht; hiervan zijn ook de moleculairgewichten vastgesteld: 23

Lamanna en Sakaguchi (1971) vermelden resp. 900.000, 165.000 en 350.000. Alleen type A-toxine heeft men kunnen zuiveren tot een stadium waarin kristallisatie mogelijk werd. Alle toxinetypen hebben een fractie diehemagglutinerende eigenschappen bezit. De botulinumtoxinen zijn de meest potente toxinen die in de natuur bekend zijn. De dosis letalisvan zuiver A-of B-toxine voor de menszou slechts ongeveer 0,01 mgbedragen (Wilson enMiles, 1957). 2.1.3. Pathogenese Het botulinumtoxine passeert als zodanig, in tegenstelling tot andere exotoxinen als b.v. tetanustoxine en diphtherietoxine, de mucosa van de digestietractus. Als "porte d'entrée" worden de maagen het begin van de dunne darm opgegeven, waarbij het niet bekend is hoe het maagdarmkanaal deze grote eiwitmoleculen kan absorberen. Via het lymfevatenstelsel komt het toxine in de bloedcirculatie en ontplooit vervolgens haar activiteit in de myoneurale verbindingen (motorische eindplaten) van de cholinergische zenuwen. Hier wordt de prikkeloverdracht geblokkeerd,doordat het botulinumtoxine specifiek de werking van het acetylcholine verhindert. Het toxine kan derhalve geen invloed uitoefenen op de adrenergische en sensibele zenuwen. Het centrale zenuwstelsel wordt evenmin aangetast. Door de neuro-musculaire blokkade ontstaat paralyse van de cholinergisch geïnnerveerde spieren; speciaal de ademhalingsspieren worden beïnvloed, zodat de dood bij botulismus optreedt door asphyxie (Lamanna, 1959;Foster etal., 1965). Het werkingsmechanisme van het botulinumtoxine is niet exact bekend. Stevenson en Girvin (1953) menen dat er een verminderde synthese van acetylcholine plaatsvindt, b.v. doordat de acetylering van choline wordt verstoord. Lamanna (1959) veronderstelt dat het toxine interfereert met het vrijkomen of de diffusie van acetylcholine. Deparalyse isirreversibel en kan niet worden opgeheven door cholinesteraseremmers, zoals dat welmogelijk isbij een curarevergiftiging. 2.1.4. Symptomatologie Van Ermengem (1897) heeft in zijn klassiek geworden beschrijving van de ziekte-uitbraak te Ellezelles reeds uitvoerig de ziekteverschijnselen gemeld, die bij demensbijbotulismus optreden. Ondanks de neurotoxiciteit van de botulinumtoxinen, hebben de eerste symptomen bij de mens toch meestal betrekking op de digestietractus: nausea, vomeren en koliekaanvallen die vaak 12 tot 18 uur na de voedselopname optreden. Typisch zijn deklachten overeen droge mond. Spoedig ontwikkelen zich ook neurologische symptomen, zoals oogafwijkin24

gen (diplopie, accommodatiemoeilijkheden, pupildilatatie, ptosis der oogleden en een starre blik), slikbezwaren, spraakmoeilijkheden en algehele spiermoeheid. In fataal verlopende gevallen voeren respiratiestoornissen meestal na 3 tot 6 dagen tot de dood. Het bewustzijn en het pijngevoel worden niet aangetast (van Ermengem, 1897;Foster etal, 1965). Bij dieren verloopt het ziektebeeld in grote lijnen op dezelfde wijze. Bij paarden en runderen overheerst het beeld van spinaal- of bulbairparalyse. De tongverlamming is bij runderen soms een opvallend verschijnsel, evenals het sterke speekselen door verlamming van de pharynx. De lust om te eten of te drinken issomsnogwelaanwezig (Henning, 1956;Koopman etal., 1971). Bij nertsen treedt het verdwijnen der agressiviteit nogal op de voorgrond (Quortrup en Gorham, 1949). Als belangrijkste ziekteverschijnselen bij watervogels — en vogels in het algemeen - worden genoemd: verlamming van de vleugelspieren, poot- en halsspieren (waardoor de z.g. "limberneck" optreedt);het onvermogen geluid te maken; verdwijnen van de ooglidreflex; ten slotte treden ademhalingsmoeilijkheden op, waarna de dieren uiteindelijk in coma sterven (o.a. Hobmaier, 1930; Pullar, 1934;Niléhn en Johannsen, 1965;Haagsma etal, 1971). Het ziekteverloop is sterk afhankelijk van dehoeveelheid opgenomen toxine. Bij opname van een veelvoud van de letale dosis zal het ziekteproces acuut verlopen, terwijl bij kleinere hoeveelheden toxine zich een meer chronisch ziektebeeld gaat ontwikkelen, dat zich over één of meerdere weken kan uitstrekken. Bij de mens kan het herstel verscheidene maanden vergen (Foster et al, 1965),bij watervogels duurt het korter nl. één tot twee weken. De Symptomatologie schijnt onafhankelijk te zijn van het toxinetype; er bestaat echter wel een duidelijk verschil in gevoeligheid bij de verschillende diersoorten voor de 6 toxinetypen. 2.1.5.Post-mortem bevindingen 2.1.5.1. Macroscopischeveranderingen Inhet algemeen wordt aangenomen dat bij het macroscopisch onderzoek geen typische afwijkingen zijn waar te nemen bij botulismus. In sommige gevallen wordt een hyperaemie van de lever, de nieren of de meninges vastgesteld (van Ermengem, 1897; Wilson en Miles, 1957; Simmons en Tammemagi, 1965). Indien andere macroscopisch waarneembare afwijkingen —b.v. een verslikpneumonie — zijn waargenomen, dienen dezealssecundair te worden beschouwd (Lamanna, 1959). Bij "lamsiekte" kan de aanwezigheid van skeletdelen en andere corpora aliéna in de digestietractus een aanwijzing zijn dat de dieren aan pica hebben geleden (Henning, 1956). 25

maatregel; het antitoxine kan hoogstens werkzaam zijn tegen toxine dat circuleert of nog uit de digestietractus wordt geresorbeerd. Daarbij is de keuze van het juiste antitoxine-type nog een extra complicatie (Henning, 1956; Lamanna, 1959). Kalmbach (1968) vermeldt echter dat de behandeling met antitoxine typeC bij watervogels die aan botulismus lijden, wel succesvol is; zelfs bij ernstig aangetaste vogels had deze therapie waarde. Haagsma et al. (1971) constateerden eveneensgoede resultaten bij wilde eenden en talingen. Bij botulismusuitbraken op nertsenfarms is met de toediening van antitoxine ook een gunstig effect waargenomen, indien de behandeling kort na het begin van deziekteuitbraak kon worden ingezet (Haagsma, 1965). Het toedienen van snelwerkende laxantia wordt eveneens aanbevolen, eventueel te combineren met maagspoelingen. Het botulinumtoxine blijkt in vitro te worden geïnactiveerd door jodium, kaliumpermanganaat en alcohol (Wilson en Miles, 1957). Overhet effect/'« vivo zijn geen betrouwbare gegevens gevonden. Burke et al. (1921)vermelden, dat de absorptie van het toxine is tegen te gaan door de toediening van olijfolie met vloeibare zeep. Bij de bestrijdingsmaatregelen moet bij botulismus het accent vooral op de Prophylaxe worden gelegd. Preventieve vaccinatie wordt algemeen toegepast bij runderen in Zuid-Afrika in lamsiekte-streken (Henning, 1956), bij schapen en runderen in Australië (Bennetts en Hall, 1938) en bij farmnertsen. Bij andere diersoorten is dit niet gebruikelijk vanwege het incidentele voorkomen; hetzelfde geldt voor de mens. De wijze van conservering en de hygiënische behandeling van het voedsel vooraf wordt danvanhet grootste belang. Botulismus was bij de opkomst van de conservenindustrie het zwaard van Damocles. Daarom werd in deze periode aan debacteriologie van Cl. botulinum veel aandacht geschonken, speciaal aan de fhermoresistentie van de sporen (Burke, 1923; Gunnison en Meyer, 1929; Meyer en Gunnison, 1929a, 1929b; Townsend, 1929;Meyer, 1956). Henning (1956) noemt bij "lamsiekte"verder alsaanvullende prophylactische maatregelen het verwijderen van kadavermateriaal en het voorkomen van de osteophagie door toediening van beendermeel. De bestrijding van botulismus op fazantenfokkerijen is vooral gebaseerd op het verwijderen van de kadavers,voordat deze met maden van sarcophage vliegen zijn bezet (Boroff en Reilly, 1962; Fish et al, 1967). Laatstgenoemden bestreden de ziekte ook met behulp van toxoid-vaccinaties, zonder dat dit een gunstig resultaat opleverde; zij veronderstelden dat de immunologische verschillen tussen Ca en C/5verantwoordelijk waren voor dit negatieve resultaat. Boroff

en Reilly (1959) hadden reeds experimenteel aangetoond dat met intraperitoneale injecties van toxoid een actieve immuniteit kan worden opgewekt bij

28

gen (diplopie, accommodatiemoeilijkheden, pupildilatatie, ptosis der oogleden en een starre blik), slikbezwaren, spraakmoeilijkheden en algehele spiermoeheid. In fataal verlopende gevallen voeren respiratiestoornissen meestal na 3 tot 6 dagen tot de dood. Het bewustzijn en het pijngevoel worden niet aangetast (van Ermengem, 1897;Foster etal., 1965). Bij dieren verloopt het ziektebeeld in grote lijnen op dezelfde wijze. Bij paarden en runderen overheerst het beeld van spinaal- of bulbairparalyse. De tongverlamming is bij runderen soms een opvallend verschijnsel, evenals het sterke speekselen door verlamming van de pharynx. De lust om te eten of te drinken issoms nogwel aanwezig (Henning, 1956;Koopman etal., 1971). Bij nertsen treedt het verdwijnen der agressiviteit nogal op de voorgrond (Quortrup en Gorham, 1949). Als belangrijkste ziekteverschijnselen bij watervogels — en vogels in het algemeen —worden genoemd: verlamming van de vleugelspieren, poot- en halsspieren (waardoor de z.g. "limberneck" optreedt);het onvermogen geluid te maken; verdwijnen van de ooglidreflex; ten slotte treden ademhalingsmoeilijkheden op, waarna de dieren uiteindelijk in coma sterven (o.a. Hobmaier, 1930; Pullar, 1934;Niléhn enJohannsen, 1965;Haagsma etal., 1971). Het ziekteverloop is sterk afhankelijk van dehoeveelheid opgenomen toxine. Bij opname van een veelvoud van de letale dosis zal het ziekteproces acuut verlopen, terwijl bij kleinere hoeveelheden toxine zich een meer chronisch ziektebeeld gaat ontwikkelen, dat zich over één of meerdere weken kan uitstrekken. Bij de mens kan het herstel verscheidene maanden vergen (Foster et ai, 1965),bij watervogels duurt het korter nl.één tot twee weken. De Symptomatologie schijnt onafhankelijk te zijn van het toxinetype; er bestaat echter wel een duidelijk verschil in gevoeligheid bij de verschillende diersoorten voor de 6 toxinetypen. 2.1.5.Post-mortem bevindingen 2.1.5.1. Macroscopischeveranderingen In het algemeen wordt aangenomen dat bij het macroscopisch onderzoek geen typische afwijkingen zijn waar te nemen bij botulismus. In sommige gevallen wordt een hyperaemie van de lever, de nieren of de meninges vastgesteld (van Ermengem, 1897; Wilson en Miles, 1957; Simmons en Tammemagi, 1965). Indien andere macroscopisch waarneembare afwijkingen —b.v. een verslikpneumonie — zijn waargenomen, dienen deze alssecundair te worden beschouwd (Lamanna, 1959). Bij "lamsiekte" kan de aanwezigheid van skeletdelen en andere corpora aliéna in de digestietractus een aanwijzing zijn dat de dieren aan pica hebben geleden (Henning, 1956). 25

Bij watervogels worden evenmin pathognomonische laesies waargenomen (Hobmaier, 1930; Pullar, 1934;Niléhn en Johannsen, 1965).Alleen Dobberstein en Piening (1933) beschrijven dat zij bloedingen en necrosehaardjes in de hersenen hebben aangetroffen bij zwanen, die aan botulismus zouden zijn gestorven. In dit geval is de diagnose echter onvoldoende geweest: deze steunde op het aantonen van Cl. botulinum type A in de lever, milt en het maagdarmkanaal, zonder dat het botulinumtoxine in de kadaverswerd vastgesteld. 2.1.5.2.Histologische veranderingen Bij overleden botulismuspatiënten worden geen histologische veranderingen waargenomen, noch in de parenchymateuze organen, noch in het centrale zenuwstelsel. Bij opname van grote concentraties toxine vormt bovendien het snelle ziekteverloop een verklaring voor de afwezigheid van histopathologische veranderingen (Lamanna, 1959). Bij zeer chronische gevallen van botulismus zijn veranderingen van de spiervezels waargenomen. Aan de motorische eindplaten werden aanvankelijk geen veranderingen vastgesteld. Dit gelukte Duchen en Strich (1968) wel bij muizen en caviae na de intramusculaire toediening van subletale hoeveelheden toxine; na 7 tot 14 dagen werden de eerste veranderingen gezien, na 2 tot 5 weken waren deze maximaal. Debelangrijkste veranderingen waren: atrophie van de spiervezelen en woekeringvan de motorische zenuwuiteinden. De afwijkingen zouden een reactie zijn op het verbreken van de neuromusculaire transmissie en geen regeneratieproces. Het herstel trad pas opna 10tot 36 weken. 2.1.6. Diagnostiek De symptomen bij botulismus zijn zowel bij de mens als de dieren vaak zo karakteristiek dat de diagnose op grond van de klinische verschijnselen met redelijke zekerheid kan worden gesteld. De bevestiging van de klinische diagnose vindt in het laboratorium plaats; hierbij is zowel op de aanwezigheid van het botulinumtoxine als op het oorzakelijke micro-organisme te letten. Voor een betrouwbare diagnose is de isolatie van Cl.botulinum niet voldoende, hiervoor dient het toxine te worden aangetoond, dat vervolgens door middel van een serumneutralisatietest is te typeren. Cl. botulinum kan nl. ubiquitair voorkomen, zodat voedsel - vooral groenten en fruit — vaak reeds kiemhoudend kunnen zijn. Aan de isolatie van Cl. botulinum uit voedsel of maagdarminhoud van botulismuspatiënten kan dan ook geen doorslaggevende diagnostische waarde worden toegekend (Dubovsky en Meyer, 1922a; Meyer en Dubovsky, 1922a; Dubovsky en Meyer, 1922b; Henning, 1956;Sterne en Thomson, 1963; Muller, 1967b). Het aantonen van het botulinumtoxine stuit vaak op grote moeilijkheden, vooral als het verdachte voedsel niet meer is te achterhalen. Men is dan 26

aangewezen op bloed, maaginhoud, braaksel of urinevan de patiënt. Bij dodelijk verlopende ziektegevallen kan ook getracht worden het toxine aan te tonen in de maagdarminhoud of in de lever, eventueel aangevuld met andere organen. Bijde grote huisdieren zou het onderzoek van de lever de beste kans op succes geven (Prévôt en Brygoo, 1953;Henning, 1956; Wilson en Miles, 1957). Bij vogels speciaal kippen, pauwen, fazanten en kalkoenen — zouden volgens Gross en Smith (1971) bloed en kropinhoud in de eerste plaats moeten worden onderzocht. Blandford en Roberts (1970) vonden dat bij kippen onderzoek van bloedserum iste prefereren boven dat van de spiermaaginhoud. Bij watervogels schijnt het botulinumtoxine eveneens bij voorkeur te worden aangetoond in het bloed (Jensen en Gntman, 1967; Blandford et al, 1969). Meerdereschrijverswijzeneropdatin een deel van de botulismusgevallen het toxine niet meer is aan te tonen. Dezemoeilijkheid zou zichvooral voordoen in de chronisch verlopende ziektegevallen, waarin nauwelijks één letale dosis van het toxine is opgenomen. Er resteert dan voor de diagnostiek te weinig vrij toxine in het bloed, terwijl uit de inhoud van het maagdarmkanaal het toxine reeds is verdwenen, omdat dit snelwordt geabsorbeerd. Eennegatief verloopvan het toxine-onderzoek bewijst dus niet dat de diagnose "botulismus" moet worden uitgesloten (Prévôt en Brygoo, 1953; Henning, 1956; Gross en Smith, 1971). Sinds de onderzoekingen van van Ermengem (1897) geschiedt het aantonen van het botulinumtoxine met behulp van laboratoriumproefdieren, speciaal muizen. Dit is nog steeds de meest betrouwbare en gevoeligste methode. Quantitatief onderzoek wordt uitgevoerd door muizen intraperitoneaal met een serieverdunningen vanhet toxische materiaal inte spuiten. Andere methodieken, zoals de hemagglutinatietest, de hemagglutinatie inhibitietest, de bentoniet flocculatietest, de agargelprecipitatietest volgens Ouchterlony en de immunofluorescentietechniek blijken minder gevoelig of minder specifiek te zijn (Riemann en Genigeorgis, 1971; Sakaguchi etal., 1971). Bij enkele toxinetypen, met name de typen E en F, kan de diagnostiek worden verfijnd, omdat de toxische activiteit door trypsinisatie wordt verhoogd (Duff et al, 1956; Gerwing et al, 1965;Eklund etal, 1967). Bijpatiënten,dieherstellen,kangetrachtwordenantitoxineninhet bloedaante tonen; de kans op een positief resultaat schijnt klein te zijn (Wilson en Miles, 1957;Grossen Smith, 1971). 2.1.7.Prophylaxeentherapie Een therapeutische behandeling vanbotulismuspatiënten biedt slechts beperkte mogelijkheden. Het toxine dat de neuro-musculaire prikkeloverdracht blokkeert, is onbereikbaar. Het succesvaneen behandeling met antitoxine isdan ook problematisch en bij de mens voornamelijk een psychotherapeutische 27

maatregel; het antitoxine kan hoogstens werkzaam zijn tegen toxine dat circuleert of nog uit de digestietractus wordt geresorbeerd. Daarbij is de keuze van het juiste antitoxine-type nog een extra complicatie (Henning, 1956; Lamanna, 1959). Kalmbach (1968) vermeldt echter dat de behandeling met antitoxine typeC bij watervogels die aan botulismus lijden, wel succesvol is; zelfs bij ernstig aangetaste vogels had deze therapie waarde. Haagsma et al.(1971) constateerden eveneensgoede resultaten bij wilde eenden en talingen. Bij botulismusuitbraken op nertsenfarms is met de toediening van antitoxine ook een gunstig effect waargenomen, indien de behandeling kort na het begin van deziekteuitbraak kon worden ingezet (Haagsma, 1965). Het toedienen van snelwerkende laxantia wordt eveneens aanbevolen, eventueel te combineren met maagspoelingen. Het botulinumtoxine blijkt in vitro te worden geïnactiveerd door jodium, kaliumpermanganaat en alcohol (Wilson en Miles, 1957). Overhet effect invivo zijn geen betrouwbare gegevens gevonden. Burke etal.(1921)vermelden, dat de absorptie van het toxine is tegen te gaan door de toediening van olijfolie met vloeibare zeep. Bij de bestrijdingsmaatregelen moet bij botulismus het accent vooral op de Prophylaxeworden gelegd. Preventieve vaccinatie wordt algemeen toegepast bij runderen in Zuid-Afrika in lamsiekte-streken (Henning, 1956), bij schapen en runderen in Australië (Bennetts en Hall, 1938) en bij farmnertsen. Bij andere diersoorten is dit niet gebruikelijk vanwege het incidentele voorkomen; hetzelfde geldt voor de mens. De wijze van conservering en de hygiënische behandeling van het voedsel vooraf wordt danvanhet grootste belang. Botulismus was bij de opkomst van de conservenindustrie het zwaard van Damocles. Daarom werd in deze periode aan debacteriologie vanCl. botulinum veel aandacht geschonken, speciaal aan de thermoresistentie van de sporen (Burke, 1923; Gunnison en Meyer, 1929; Meyer en Gunnison, 1929a, 1929b; Townsend, 1929;Meyer, 1956). Henning (1956) noemt bij "lamsiekte"verder alsaanvullende prophylactische maatregelen het verwijderen van kadavermateriaal en het voorkomen van de osteophagie door toediening van beendermeel. De bestrijding van botulismus op fazantenfokkerijen is vooral gebaseerd op het verwijderen van dekadavers,voordat deze met maden van sarcophage vliegen zijn bezet (Boroff en Reilly, 1962; Fish et al, 1967). Laatstgenoemden bestreden de ziekte ook met behulp van toxoid-vaccinaties, zonder dat dit een gunstig resultaat opleverde; zij veronderstelden dat de immunologische verschillen tussen Ca en Cß verantwoordelijk waren voor dit negatieve resultaat. Boroff en Reilly (1959) hadden reeds experimenteel aangetoond dat met intraperitoneale injecties van toxoid een actieve immuniteit kan worden opgewekt bij 28

fazanten en eenden. Bij watervogels is de prophylaxe een zeer moeilijke aangelegenheid. Dit blijkt uit het gegeven dat in de U.S.A. sinds 1910vrijwel elkjaar grote aantallen vogels aan botulismus sterven, vaak jaar na jaar in dezelfde gebieden. Men tracht door een betere beheersing van de waterhuishouding te voorkomen dat grote moddervlakten bedekt worden met een dun laagje water. Het wasnl. opgevallen dat in aansluiting hierop vaak grote botulismusuitbraken volgden (Kalmbach, 1968).

2.2.BIJZONDERGEDEELTE 2.2.1. Deetiologie vanbotulismusbijwatervogels De eerste onderzoekingen zijn in de Verenigde Staten verricht, toen men de etiologie van "Western duck sickness" trachtte op te helderen; een goed overzicht is gegeven door Kalmbach (1968). De eerste massale sterfte bij watervogels — speciaal eenden — die zich in 1910in Salt Lake Valley voordeed, is niet nader onderzocht. In 1911 werd bij dode eenden, afkomstig uit dezelfde streek, de voorlopige diagnose darmcoccidiosisgesteld;deze uitspraak werd later herroepen. Wetmore, wiens werkterrein ook in Salt Lake Valley lag, veronderstelde in 1915 dat de sterfte veroorzaakt werd door te hoge zoutconcentraties in het water en sprakvan "alkaline poisoning". In de jaren 1925 tot 1927 werd de juistheid van deze theorie twijfelachtig omdat toen in Canada dezelfde "duck sickness" werd vastgesteld in watergebieden zonder dat er sprake was van een hoog zoutgehalte van het water. Intussen had Bengston H922) Cl. botulinum type C ontdekt en hadden Graham en Boughton (1924) bij kippen en tamme eenden met "limberneck" botulinumtoxine type C aangetoond. De overeenkomst in het ziektebeeld van "limberneck" en "Western duck sickness" leidde tot nieuwe inzichten omtrent de etiologie van "Western duck sickness"; in een serie onderzoekingen werd daarna bewezen dat de massale sterfte bij watervogels in Salt Lake Valley en elders inderdaad veroorzaakt werd door botulinumtoxine type C (Kalmbach, 1930; Hobmaier, 1930; Giltner en Couch, 1930;Kalmbach, 1932).Het C-toxine bleek in toxine-antitoxine testen immunologisch overeen te komen met het door Bengston (1922) geïsoleerde type Ca-toxine (Kalmbach, 1932). Gunnison en Coleman (1932) toonden vervolgens aanin eenvergelijkend onderzoek met type Cdr en type C/5 dat de geïsoleerde "duck strain" in morfologische, culturele, toxicologische en serologische eigenschappen overeenkwam met Cl. botulinum type Ca. Er is daarna steeds aangenomen dat botulismus bij watervogels in de Verenigde Staten door type Cawordt veroorzaakt (Jensen en Gritman, 1967). Naar aanleiding van de resultaten, verkregen in vergelijkende neutralisatie29

testen met Cl.botulinum type O (NCTC 8264) en Cl. botulinum type Cß (NCTC3732),beslootGrubb(1964)datdebotulismusuitbraken inWest-Australië (Perth) eveneens door type Ca werden veroorzaakt. De massale sterfte door botulismus, die in 1932 in Zuid-Oost-Australië (Victoria) voorkwam, werd daarentegen door Pullar (1934) aan type C/5toegeschreven. Van de botulismusuitbraken bij watervogels, die vanaf 1965 in Europa zijn vastgesteld, wordt alleen gemeld dat zij door type Czijn veroorzaakt, zonder dat een definitieve uitspraak over het subtype (Ca of C/5 ) wordt gedaan (Niléhn en Johannsen, 1965;Muller, 1967;Blandford etal., 1969;Haagsma etal., 1971). In navolging van de algemeen aanvaarde mening issteeds aangenomen dat bij watervogels opname van reeds gevormd (preformed) toxine plaatsvindt. De experimenten van Gunnison en Coleman (1932)bevestigen deze mening. In zijn discussie stelt Grubb (1964) echter ook de mogelijkheid van toxinevorming in vivo aan de orde. Boroff en Reilly (1962) komen in hun onderzoek bij fazanten en dwergsterns tot dezelfde gedachte en spreken van toxinevorming de novo. Zij vonden herhaaldelijk Cl.botulinum type C in de lever van vogels, als deze in het eindstadium van botulismus werden afgemaakt. Er zou dan niet alleen sprake zijn van een toxinaemie, maar ook van een bacteriaemie; toxinevorming zou dan kunnen plaatsvinden door Clostridia — die als vegetatieve kiemen of als sporen waren opgenomen — in de digestietractus of inandere organen waar zijvanuit de digestietractus waren terechtgekomen. In oudere publicaties is ook reeds vermeld dat Cl. botulinum type C werd aangetoond in de organen van watervogels (vooral eenden) tijdens botulismusuitbraken (Hobmaier, 1930; Giltner en Couch, 1930; Gunnison en Coleman, 1932). Dat men toch meende dat opname van "preformed" toxine plaatsvindt, is toe te schrijven aan de omstandigheid dat Cl. botulinum ook in de lever van herstelde of anderszins gestorven eenden werd aangetroffen (Hobmaier, 1930; Gunderson, 1933), terwijl bovendien in het milieu van de botulismusgebieden toxine kon worden aangetoond (Kalmbach, 1932). 2.2.2. Deepidemiologievanbotulismusbijwatervogels De epidemiologie van een ziekte behandelt het ontstaan en het verloop van een snel om zich heen grijpende infectieziekte. Daar botulismus een intoxicatie is, veroorzaakt door de consumptie van toxisch voedsel, zaler gewoonlijk sprake zijn van ziekte-uitbraken met een meer beperkte omvang, waarbij zich geen secundaire gevallen voordoen omdat de ziekte op zich zelf niet besmettelijk is. Dit beeld geldt met name voor demens.Maarbij dieren doet zichbij botulismus vaak een geheel andere situatie voor, waarbij wel secundaire ziektegevallen optreden. Gegevens uit de literatuur wijzen er op dat dit o.a. bij watervogels het geval is (Kalmbach, 1930). Voor het verkrijgen van een juist inzicht in de 30

epidemiologie van botulismus bij watervogels is het noodzakelijk de dosisletalis voor de verschillende vogelsoorten te leren kennen, dewijze waarop dezevogels het toxine opnemen en de omstandigheden waaronder de productie van het toxine plaatsvindt. Gunnison en Coleman (1932) hebben toxiciteitsproeven verricht bij wilde pijlstaarteenden. De perorale letale dosis bedroeg voor het G*-toxine ruim 100.000, voor het C/3-toxine stam Seddon ongeveer 10.000, en voor het C/3-toxine stam Heller uit Zuid-Afrika 120.000 subcutane MLD voor caviae. Bij dit onderzoek bleken pijlstaarteenden dus het gevoeligst te zijn voor het C/5-toxinestam Seddon. Boroff en Reilly (1959), die met C/3-toxine, stam Prévôt en Brygoo uit Frankrijk werkten, vermelden dat de orale LD 50 voor wilde eenden overeenkwam met 1orale muis LD 5 0 , terwijl de intramusculaire dosis500 intramusculairemuisLD50 bedroeg. Voor de opname van het toxine uit het milieu lijken tijdens ziekte-uitbraken voldoende mogelijkheden aanwezig te zijn; het toxine isaangetoond inkadavers van watervogels, in diverse invertebraten, in water en slib en in rottend plantaardig materiaal. Vooral de bevindingen van Kalmbach (1932) zijn van groot belang; hij toonde het botulinumtoxine type Ca aan in de kadavers van gestorven vogels, in slib in de onmiddellijke omgeving van de kadavers, in het water van ondiepe plassen, in dode en levende maden van sarcophage vliegenen in mengmonsters bestaande uit overblijfselen van insecten, poppen, slakken, algen en kroos. In Australië kon Pullar (1934) botulinumtoxine aantonen in water en slib van botulismusgebieden. Het onderzoek van Quortrup en Holt (1940) leerde dat de pH en de zuurstofconcentratie van groot belang zijn bij de productie van botulinumtoxine in het milieu van de botulismusgebieden. Met behulp van deze parameters konden zij plaatsen aanwijzen waar het water minstens 1 MLD voor muizen bevatte. De juiste concentratie van het toxine werd echter niet bepaald. Deze onderzoekers stellen verder dat in rottend plantaardig materiaal een goede productie van het C-toxine mogelijk is: 10 tot 20 ml water bleek onder experimentele omstandigheden een letale dosis te bevatten voor pijlstaarteenden en talingen. Ook de samenstelling van de microflora in het betreffende gebied bleek een belangrijke rolte spelen. Volgens Quortrup en Sudheimer (1943) zou Pseudomonas aeruginosa de groei van G. botulinum type Cbevorderen, terwijl andere micro-organismen (b.v.E. coli) een antagonistische werkinghebben. Gegevens omtrent de concentratie vanhet toxine zijn zeer schaars, zodat niet is vast te stellen welk toxisch materiaal bij de epidemiologie van botulismus de belangrijkste rol speelt. Richardson et al. (1965) vermelden dat zij in extracten van maden van de vlieg Phaenica(Syn. Lucilid)sericata, verzameld tijdens een botulismusuitbraak bij eenden, 20.000 tot 200.000 intraperitoneale muis LD 5 0 31

per mlkonden aantonen. Andere onderzoekers in de Verenigde Staten (Anon., 1965)toonden aan dat maden, afkomstig uit de kadavers van vissen — vooralkarpers — minstens 8.000 muisintraperitoneale MLDper gram bevatten. Pullar (1934) vermeldt dat de concentratie van het toxine in water en slib voldoende wasom een caviaper os te doden. Uit de experimenten van Kalmbach (1930) blijkt dat 0,5 tot 1gram oraal verstrekt kadavermateriaal — vooral lever — van een aan botulismus gestorven eend, voldoende was om een fataal verlopend ziektebeeld bij gezonde eenden op te wekken; 0,1 tot 0,05 gramveroorzaakte nogwelziekteverschijnselen, maar de vogels herstelden na 4 tot 6dagen.Het epidemiologisch karakter van botulismus bij watervogels werd door Kalmbach reeds aangetoond, toen hij op deze manier het ziektebeeld 5 maal kon passeren, waarbij in de 5e passage nog geen verlies vandetoxiciteit leekte zijn opgetreden. Voor het optreden van massale sterfte bij watervogels door botulismus, isde aanwezigheid van grote concentraties toxine noodzakelijk. Bij de productie hiervan spelen de ecologische omstandigheden eenbelangrijke rol.Grubb (1964) stelt dat een maximale toxineproductie afhankelijk is van de temperatuur, de mate van anaërobie en de aanwezigheidvangeschikt organisch materiaal voor de bacteriële groei; of in dat geval letale doses toxine aanwezig blijven zal afhankelijk zijn van de regenval, de hoogte vanhet waterpeil,van stromingen en golfbewegingen in het water en van de afbraak door antagonistisch werkende bacteriën. Zowel in Noord-Amerika als in Australië trad botulismus op tijdens het zomerseizoen en het begin van de herfst; speciaalhete en droge zomers schijnen predisponerend te zijn. Hetzelfde geldt voor stilstaand water bij een zeer lage waterstand, b.v. droogvallende slikgebieden (Kalmbach, 1930; Pullar, 1934; Grubb, 1964;Anon., 1965). De botulismusuitbraken, die in Europa zijn beschreven, deden zichook voor in het warme jaargetijde. Afwijkend van de Noord-Amerikaanse omstandigheden is echter dat de ziekte zich vooral heeft voorgedaan inmeren, plassen,vijversen kanalen, waar de waterstand normaal was; soms was er sprake van stilstaand water (Niléhn en Johannsen, 1965; Muller, 1967a en 1972; Blandford et al, 1969;Haagsmaetal., 1971;Keymer etal, 1972;Robertsetal, 1972). Voor het verkrijgen vanvoldoende inzicht indeepidemiologie van botulismus kunnen verder de experimenten van Jensen en Gritman (1967) van belang zijn. Zij constateerden dat wilde eenden en meeuwen {Lams californiens) aan een subletale dosis van het C-toxine stierven als aan de vogels gelijktijdig een subletale dosis E-toxine werd toegediend. In 1964 en 1965 was tijdens massale sterfte van watervogels (vooral meeuwen en futen) in het Michiganmeer reeds E-toxine aangetoond in de kadavers van deze vogels (Kaufmann en Fay, 1964; Fay et al, 1965). Het is volgens Jensen en Gritman (1967)nogniet mogelijk de 32

praktische betekenis van deze "dubbele intoxicatie" voor de epidemiologie van botulismus bij watervogels te overzien. Steunend op oude onderzoekingen van Behring (1893) is door Matveev (1959) een belangwekkend phenomeen gepubliceerd. Matveev beschrijft dat hij — werkend met A-toxine - experimenteel botulismus bij kleine proefdieren (muizen, caviae en konijnen) heeft veroorzaakt door de toediening van multipele, subletale doses toxine; hierbij lag de som van de subletale doses ver beneden de dosisletalisbij een eenmalige applicatie. Kennis omtrent het voorkomen van Cl. botulinum, speciaal van type C, is eveneens nodig om een goed inzicht te verkrijgen in de factoren die bij het ontstaan van botulismusuitbraken een rol spelen. Diverse onderzoekers hebben O.botulinum type C aangetoond in gebieden waar botulismus optrad. In de kadavers van watervogels, die aan botulismus waren gestorven, werd de aanwezigheid van type C aangetoond door Giltner en Couch (1930), Hobmaier (1930). Gunnison en Coleman (1932) en Shaw en Simpson (1936) in Noord-Amerika, door Pullar (1934) en Grubb (1964) in Australië.Cl.botulinum type C werd verder aangetoond inslik vanhet botulismusgebied door Giltner en Couch (1930), Grubb (1964), Anon. (1965), Blandford etal.(1969) enHaagsma etal.(1971). In invertebraten is Cl. botulinum ook aangetoond. Bengston (1922) isoleerde de eerste type C-cultuur uit maden vanLuciliacaesar tijdens botulismusgevallen bij kippen. Kalmbach (1932) toonde type C aan in dode larven en poppen van waterkevers en in de overblijfselen van niet nader genoemde insecten. Gunderson (1935) demonstreerde de aanwezigheid van Cl.botulinum type C in larven van de waterkever EnochrusHamiltoni Hom. Over het voorkomen in Nederland van Cl. botulinum in de natuur is slechts weinig bekend. Het is verrassend dat de oudste gegevens uit de U.S.A. komen: Meyer en Dubovsky (1922b) onderzochten 10 grondmonsters van grasland, die hun waren toegezonden door Prof. D.A. de Jong uit Leiden. In 2 monsters, afkomstig uit Drente en Gelderland, werd Cl. botulinum type Baangetoond; 4 andere monsters uit Friesland, Zuid-Holland, Noord-Brabant en Zeeland waren eveneens toxisch, doch het toxine kon niet worden getypeerd met de toen beschikbare antitoxinen type AenB. Bij een humaan geval van botulismus in Zuid-Limburg isoleerden Schoonhoven van Beurden en Clarenburg(1937) Cl. botulinum type B. Naast type B blijkt ook type C in Nederland voor te komen. De botulismusuitbraken op nertsenfarms werden steeds door het botulinumtoxine type C veroorzaakt (Akkermans, 1961;Haagsma, 1965). Cl.botulinum type C werd later in reincultuur geïsoleerd uit gevallen van botulismus bij paarden (Haagsma, 1968), runderen (Haagsma, 1969; Koopman et al, 1971) en watervogels (Haagsma etal., 1971). 33

2.3. SAMENVATTING Uit deliteratuurgegevens blijkt dat botulismus vrijwel mondiaal voorkomt. Bij de mens zal bij botulismusuitbraken gewoonlijk slechts een beperkt aantal patiënten zijn betrokken; dit isbij dieren ook vaak het geval. Bij dieren kan echter ook massale sterfte optreden, waarbij de ziekte een epidemisch karakter krijgt. Dit ziektebeeld ontwikkelt zich heel duidelijk als botulismus onder bijzondere omstandigheden optreedt bij watervogels. Algemeen wordt aangenomen dat botulismus veroorzaakt wordt door de opname van "preformed" toxine, alhoewel het bij dieren soms moeilijk is hiermede het ontstaan van alle ziektegevallen aannemelijk te maken. Voor de vorming van toxine in vivo of de novo zijn bij dieren geen betrouwbare gegevens bekend geworden. De toxinetypen C en D blijken vooral verantwoordelijk te zijn voor het optreden van botulismus bij dieren. Er is steeds aangenomen dat botulismus bij watervogels uitsluitend door Cl. botulinum type C zou worden veroorzaakt; recente onderzoekingen wijzen er echter op dat type Eook een rol kan spelen bij de epidemiologie van botulismus. De differentiatie van Cl. botulinum type Cin de subtypen Caen C/3 blijkt tal van moeilijkheden op te leveren;degegevensvan oudere publicaties dienen dan ook zeervoorzichtig te worden beoordeeld. Met betrekking tot de Symptomatologie, de pathologische anatomie en de Pathogenese iser weinigverschilvan mening. De diagnostiek van botulismus daarentegen blijkt niet altijd zonder problemen te zijn, zodat men in sommige gevallen niet aan alle noodzakelijke diagnostische kriteria heeft kunnen voldoen. Bij de interpretatie van bijzondere botulismusgevallen bij mens en dier dient men dan ook zeer kritisch te zijn. Dit geldt zowel voor het optreden van ziektegevallen bij refractaire diersoorten als voor het optreden van botulismusgevallen door afwijkende toxinetypen, b.v. type Cof D bij de mens,type Bbijpaarden en type Aof Ebij watervogels. In de kennis van de etiologie en de epidemiologie van botulismus bij watervogels blijken nogtalvanhiaten aanwezig te zijn, zodat opveelvragen geen duidelijk antwoord kan worden gegeven. Erlijken ook ecologische verschillen te bestaan tussen debotulismusgebieden in de Verenigde Staten en in Nederland. Overhet voorkomen vanCl. botulinum inNederland — eenbelangrijk gegeven om het inzicht in de epidemiologie van botulismus te verdiepen — zijn slechts enkele,deelssterk verouderde, gegevens bekend.

34

HOOFDSTUK

III

MATERIALEN EN METHODIEKEN

In dit hoofdstuk worden de materialen en laboratoriumtechnieken beschreven,die in deloopvan het onderzoek geregeld werden toegepast. De technieken die slechts voor één bepaald aspect van het onderzoek zijn gebruikt, zijn inhet betreffende hoofdstuk opgenomen.

3.1. MATERIALEN 3.1.1.Voedingsmedia Voor de groei van Cl. botulinum werd zowel van vloeibare als van vaste voedingsmedia gebruik gemaakt. Cl.botulinum behoort tot de obligaat anaërobe kiemen, zodat degroei steeds in een streng anaëroob milieu dient plaatste vinden. 3.1.1.1.Vloeibarevoedingsmedia voor anaërobe kweek Voor de groei in vloeibare media werden leverpartikelbouillon, vleespartikelbouillon, het medium volgens Cardella et al. (1958) en fortified egg meat medium volgens Segner etal.(1971)gebruikt. Leverbouillon Tien liter van dit medium werd op de volgende wijze bereid: Vijf kg kalfslever, afkomstig van 3 of 4 verschillende dieren, werd in grote stukken gesneden en gedurende ongeveer 1uur in 2,5 liter vleesinfuus gekookt, tot de rode kleur van deleververdwenen was.Destukken leverwerden nu uit de "leverbouillon" gehaald, ontdaan van minder goede delen,in dobbelsteentjes van 0,5 bij 0,5 cm gesneden en daarna in leidingwater gewassen, totdat het bovenstaande water geen zwevende stukjes lever meerbevatte. 35

De "leverbouillon" werd vervolgens met rundvleesbouillon tot 10 liter aangevuld, de pH met 4N natronloog op 8,5 gebracht, 15min. op 100°C verhit en na afkoelen door kaasdoek gefiltreerd. Hierna werd de "leverbouillon" door dubbele papieren Whatman filters gefiltreerd. DepH werd nu met 4N natronloog op 8 gebracht, waarna het medium in hoeveelheden van 10 ml over cultuurbuizen (160 x 16 mm) werd verdeeld. Aan elke cultuurbuis "leverbouillon" werden tenslotte 3 tot 4 stukjes lever toegevoegd en daarna werd de leverpartikelbouillon - ook wel lever-leverbouillon of kortweg leverbouillon genoemd - gedurende 30min.bij 120°C gesteriliseerd. Het vleesinfuus, dat bij de bereiding van de leverbouillon wasgebiuikt,werd alsvolgt gemaakt: Voor 10 liter infuus werd 5 kg mager ribvlees van runderen in kleine stukken gesneden en daarna fijn gemalen in een vleesmolen. Het gemalen vlees werd overgebracht in 10 liter leidingwater en na 20 uur bij 4°C bewaren onder voortdurend roeren aan de kook gebracht. Degrove stukken vleeswerden in een vergiet verwijderd en de resterende vloeistof werd opgekookt engefiltreerd door een gesteriliseerde doek. Runderbouillon werd verkregen door aan het vleesinfuus 1% bacto-pepton (Difco) en 0,5% natriumchloride toe te voegen, waarna de pH op 7,6 werd gebracht. Vleespartikelbouillon Hiervoor werd Cooked Meat Medium (Difco 0267-01) gebruikt, waarvan de volgende samenstelling wordt opgegeven: Een liter medium bevat 454 g runderhart in de vorm van kleine stukjes vlees, 20 g proteose pepton (Difco), 2 g dextrose en 5gnatriumchloride. DepH dient bij 25°C 7,2 te bedragen. Het Cooked Meat Medium (CMM) werd bereid met aqua destillata, vervolgens in hoeveelheden van 10 ml over cultuurbuizen verdeeld en in de autoclaaf gedurende 15min. bij 120°C verhit. Cardella-medium Dit vloeibare medium, dat geen stukjes lever of vlees bevat, werd bereid volgens de gegevens van Cardella et al. (1958).Een liter medium bevat 20gNZ. Case peptone (pancreatic digest of casein, Sheffield Chemical, Norwich, N.Y.), 40 g proteose-pepton (Difco), 20 ggistextract (Difco) en 10 g glucose. De pH wordt op 7,8 gebracht en de sterilisatie vond plaatsmet behulpvan passage door een Seitzfilter. Fortified EggMeat medium Dit medium - voortaan kortweg FEMgenoemd - werdsamengesteldvolgens derichtlijnen van Segneret al.(1971). Een liter van het medium bevat 150geggmeat medium, 10ggistextract, 10 g 36

ammoniumsulfaat en 10 gglucose. Desterilisatie vond plaatsgedurende 15min. bij 120°C en de pH dient hierna 7,0 tot 7,2 te zijn. Desamenstelling vanhet eggmeat medium wordt alsvolgt opgegeven: 454grundvlees,het wit van 6eieren en 5g calciumcarbonaat. 3.1.1.2.Vastevoedingsmediavooranaerobekweek Voor de groei van Cl. botulinum op vaste voedingsbodems werd gebruik gemaakt van hartinfuus-schapebloedagarplaten, glucose-runderbloedagarplaten, Reinforced Clostridium Medium en brain heart runderbloedagarplaten. Hartinfuus-schapebloedagarplaten (HIS) Deze voedingsbodem werd bereid met behulp van Bacto Heart Infusion Agar (Difco 0044-01). Een liter bevat 500 g infuus van runderhart, 10 g bactotryptose, 5gnatriumchloride en 15gbacto-agar. Voor de bereiding van de bloedplaten werd 40 gmedium in 1000 g koude aqua destillata opgelost door verwarmen tot het kookpunt. Hierna werd het medium in de autoclaaf gesteriliseerd gedurende 15min.bij 120°C;na afkoeling tot 45°C werd 5% gedefibrineerde schapebloedcellen toegevoegd. Na goed mengen werd het medium lege artisin steriele Petrischalen gegoten. Glucose-runderbloedagarplaten Deze bloedplaten, ook wel Zeissler-platen genoemd, bevatten 1% glucose,2% agaren 10%gedefibrineerde runderbloedcellen. Reinforced ClostridiumMedium (RCM) Dit medium werd bereid naar gegevens van Hirsch en Grinsted (1954) en is speciaal aanbevolen voor de groeivan Clostridia. Eén liter medium bevat 3 g bacto-gistextract, 10 g pepton (Evans), 10 g vleesextract (Lab-Lemco), 8,34 g 60%natriumlactaat, 5 g natriumacetaat, 1g oplosbaar zetmeel, 20 gbacto-agar en 50 ml 1% cysteine HCloplossing. Hieraan werden 5% gedefibrineerde schapebloedcellen toegevoegd. Brain heartrunderbloedagarplaten (BHR) Als basis voor dit groeimedium diende bacto-brain heart infusion (Difco 0037-01).Deingrediënten per liter zijn: Infuus van kalverhersenen 200 g Infuus van runderhart 250 g Proteose pepton (Difco) 10 g Bacto-dextrose 2 g Natriumchloride 5 g Dinatriumfosfaat 2,5 g Bij de bereiding werd 37 gmedium opgelost in 1liter aqua destillata. Hieraan 37

werd 2%bacto-agar en 5% runderbloed toegevoegd. DepH is7,4 bij 25°C. 3.1.1.3. Anderevoedingsmedia Deze media werden gebruikt bij het onderzoek van de biochemische eigenschappen van de geïsoleerde Cl. botulinum-stammen. Carbohydraatmedia Deze media werden aangewend bij de bestudering van de fermentatie van carbohydraten. Hierbij werd gebruik gemaakt van het volgende basismedium (voorschrift voor debereidingvan 1 liter): Bacto-gistextract 7 g Bacto-casiton 15 g L-cystine (Difco) 0,25 g Natriumchloride 2,5 g Thioglycolzuur 0,3 g Bacto-agar 0,75 g Aan dit basismedium werd 5gvan het gewenste koolhydraat toegevoegd. Het medium werd afgevuld in cultuurbuizen (8 ml per buis) en gedurende 15 min. gesteriliseerd op 110°C. De pH dient 7,2 tot 7,4 te bedragen. Alsindicator werd een oplossing van 0,8%broomthymolblauw in 96%alcohol gebruikt, die echter pasnahet incuberen in de hoeveelheid van 0,1 mlwerd toegevoegd. Gelatinemedium Voor het aantonen van het enzym gelatinase werd gebruik gemaakt van bacto-nutrient gelatine. Deingrediënten voor 1liter medium zijn: Bacto-beefextract 3 g Bacto-pepton 5 g Bacto-gelatine 120 g Debereidingvond plaatsvolgens devoorschriften van de fabrikant.

Desamenstelling van dit medium wasalsvolgt: Vetvrije rauwe ondermelk Runderbouillon Lakmoestinctuur p.a. DepHdient 6,8 te bedragen.

1.000 30 50

ml ml ml

Medium volgensLóffler Deze voedingsbodem werd gebruikt voor het onderzoek van de proteolytische activiteit van de geïsoleerde Cl. botulinum-stammen. Bijdebereidingwerd 1 gglucose in 100mlrunderbouillon opgelost en daarna 38

vermengd met 300 ml normaal paardeserum. De sterilisatie vond plaats door filtratie (Seitzfilter), waarna het medium in cultuurbuizen werd gegoten, en in de serumstollingsstoof schuin werd gestold. Medium volgens Kligler Met dit medium kan devormingvan zwavelwaterstof worden aangetoond. De samenstelling per liter van het gebruikte bacto-Kligler iron agar luidt: Bacto-beefextract 3 g Bacto-gistextract 3 g Bacto-pepton 15 g Bacto-proteose pepton 5 g Bacto-lactose 10 g Bacto-dextrose 1 g Ferrosulfaat 0,2 g Natriumchloride 5 g Natriumthiosulfaat 0,3 g Bacto-agar 12 g Bacto-phenolrood 0,024g Desterilisatie geschiedde door autoclaveren gedurende 15min. bij 120°C.

3.1.2. Antitoxischesera 3.1.2.1. Cl. botulinum antitoxinen De verschillende typen van Cl. botulinum worden gedifferentieerd op grond van de antigene verschillen tussen de gevormde toxinen. Men onderscheidt momenteel 6 toxinetypen, die met de letters Atot en met F worden aangeduid. Voor de typering werd bij dit onderzoek gebruik gemaakt van de volgende antitoxische sera. Antitoxine typeC-mink Dit antitoxine werd bereid met een uit Zweden ontvangen Cl. botulinum type C cultuur. Deze C-stam werd door Dinter en Kuil geïsoleerd bij een botulismusuitbraak bij nertsen. Met de Cl. botulinum type C-mink cultuur werd na groei in leverbouillon door inactivatie met 0,3% formaldehyde anatoxine (toxoid) gemaakt. Dit anatoxine werd vervolgens geadsorbeerd aan aluminiumhydroxide. Voor de bereiding van het antitoxine type C-mink werd aan het instituut een paard met stijgende hoeveelheden C-mink toxoid ingespoten. Het paard werd 4 weken na de laatste injectie verbloed, nadat was vastgesteld dat de antitoxine titer hoog was. Het antiserum werd geconserveerd met 0,5%phenol en opgeslagen bij 4°C. In een hierna uitgevoerde neutralisatietest bij muizen bleek 1ml antiserum 39

meer dan 150.000 en minder dan 1.500.000 LD 5 0 * van het homologe C-mink toxine te neutraliseren. Antitoxine type C-Pasteur Dit antitoxine is, evenals enkele hierna genoemde antitoxinen, van het "Instituut Pasteur" te Parijs afkomstig. Het is verkregen door immunisatie van een paard en is monovalent; een differentiatie in Ca of C/5 wordt niet aangegeven. Het is een hoogwaardig immuunserum waarvan 1 ml in staat is 100.000 MLD voor muizen (1.000 Unités Antitoxiques; 1 UA is de minimale hoeveelheid serum, die in staat is 100 MLD voor muizen van het homologe toxine te neutraliseren) van het homologe toxine te neutraliseren. Bij een vergelijking tussen de neutraliserende werking van de antisera type C-mink en C-Pasteur bleek door beide sera een analoge hoeveelheid C-mink toxine te worden geneutraliseerd, nl. tussen 150.000 en 1.500.000 LD 50 .Dit duidt er op dat de antitoxische werkzaamheid van het C-mink enhet C-Pasteur antiserum in hoge mate met elkaar overeenkomen. Antitoxine typeB-Pasteur Dit antiserum ismonovalent; 1mlbevat 500 Unités Antitoxiques. Antitoxine type B-Atlanta Dit antiserum is ontvangen van het "Center for DiseaseControle" te Atlanta (Georgia). Het antitoxine ismonovalent en bevat volgens opgave per ml ongeveer 10International Units (één IUisgelijk aanéén UA). Antitoxine typeE-Pasteur Dit antiserum isook monovalent enbevat per ml 1.000 UA. Antitoxine type E-Atlanta Dit monovalente antiserum bevat ongeveer 10IUper ml. Antitoxine typeA-Pasteur Dit antitoxine bevat 5.000 UAper ml. 3.1.2.2.CI. tetawz-antitoxine Bij de uitvoering van een neutralisatietest werd gebruik gemaakt van een Cl.tetorti-antitoxine,dat aan het Instituut ineenpaardisbereid en per ml 1.200 internationale eenheden tetanus antitoxine bevat.

* In deverdere tekst wordt een muisintraperitoneale LD™aangeduid met LD^Q.

40

3.2. METHODIEKEN 3.2.1. Aantonenen typeringvanhet botulinumtoxine De aanwezigheid van het botulinumtoxine werd vastgesteld door het aantonen van een toxische stof, die bij muizen een typisch ziektebeeld veroorzaakte en door een specifiek botulinum-antitoxine kon worden geneutraliseerd. Voor het aantonen van het botulinumtoxine in vast materiaal was de bereidingvan extracten nodig.Grote kwanta materiaal, zoalsorganen van grotere dieren, werden in een mixer fijngemalen; kleinere hoeveelheden materiaal — b.v. maden, poppen ofvliegen — werden ineen Griffith tube of mortierfijngewreven. Door toevoeging van runderbouillon werd een 20-50%suspensie verkregen, waaruit na centrifugeren gedurende 15 min. bij 3.000 rpm de grovere bestanddelen werden verwijderd. Complicaties van bacteriële aard werden bij de in te spuiten muizen voorkomen door aan de bovenstaande vloeistof 1.000 E penicilline en 1.000 E streptomycine per ml toe te voegen. Vloeibaar onderzoekingsmateriaal — zoals onstolbaar gemaakt bloed of bloedserum, water en ophopingsculturen - werd met eenzelfde hoeveelheid antibiotica behandeld. Na een inwerkingsduur van 30 min. bij kamertemperatuur werd per muis 0,5 ml intraperitoneaal ingespoten, waarbij per monster meestal 2 muizen werden genomen. Hiervoor werden steeds Swiss Random muizen van 18-20 g gebruikt, afkomstig van het Centraal Proefdierenbedrijf TNOte Zeist. Over het algemeen kon het materiaal onverdund worden ingespoten, zonder dat aspecifieke sterfte optrad. Als de muizen echter FEM, Cardella of CMM culturen onverdund kregen toegediend, traden veelal na korte tijd heftige convulsies op, gevolgd door aspecifieke sterfte. Deze sterfte werd voorkomen door devloeistof van deze culturen 1:5te verdunnen met runderbouillon. De muizen werden na de injectie gedurende 4 dagen nauwkeurig geobserveerd. Deziekteverschijnselen ontwikkelden zichmeestal 2-24uur na de injectie. Bij botulismus treden vooral ademhalingsmoeilijkheden op de voorgrond: de ademhalingsspieren worden door het botulinumtoxine verlamd, de frequentie van de ademhaling daalt en bij het voortschrijden van het ziekteproces ontstaat ten slotte bij elke ademhaling in de flanken een diepe insnoering, de z.g. wespentaille. In het eindstadium wordt bij elke inhalatie de mond wijd opengesperd en krampachtig gesloten (luchthappen).Vaak isook het locomotieapparaat min of meerverlamd en demuizen sterven ten slotte onder symptomen van ernstige benauwdheid. Bij een langzamer verlopend ziekteproces (48 tot 96 uur) sterven demuizen meestal nadat zij incoma zijn geraakt. De verdere identificatie van het toxine vond plaats middels een neutralisatie41

test in muizen met behulp van specifieke antitoxinen. Hiertoe werden in afzonderlijke buisjes het te onderzoeken toxische materiaal en verschillende antitoxinen in de verhouding 10 : 1 bij elkaar gebracht en goed vermengd. Bijde keuze van de antitoxinen kan men zich vaak laten leiden door de resultaten van eerdere onderzoekingen. Als controle opde aanwezigheid van voldoende toxine, werd in een puntbuis het te onderzoeken toxische materiaal vermengd met normaal paardeserum, eveneens in de verhouding 10 : 1. Aan alle toxine-serummengsels werd per ml 1.000 Epenicilline en 1.000 Estreptomycine toegevoegd. De toxine-antitoxine-mengsels en debuis met het toxine-normaal serum-mengsel werden aanvankelijk gedurende 90 minuten bij 37°C geïncubeerd. Het bleek dat hierbij soms toxine verloren ging, omdat ook de muizen, die ingespoten waren methet toxine-normaal paardeserum-mengsel, inlevenbleven. Deincubatie werd daarna in overeenstemming gebracht met de voorschriften van het "Center for Disease Control" te Atlanta, ni. 30 min. bij 20°C. Na de incubatieperiode werden Swiss Random muizen intraperitoneaal ingespoten met 0,5 ml van de toxine-antitoxine-mengsels en het toxine-normaal serum-mengsel. De muizen werden gedurende 4 dagengeobserveerd. Alleen demuizen, dieingespoten waren met een mengsel waarvan het monovalente antitoxine het aanwezige botulinumtoxine in vitro had geneutraliseerd, bleven in leven. De uitslag van deze neutralisatietest wasbepalend voor de typering vanhet toxine. Bij onderzoek van vloeibare ophopingsmedia stierven soms alle met toxineantitoxine-mengsels ingespoten muizen onder typische verschijnselen vanbotulismus. De ervaring leerde dat dan een mengsel van 2(of meer) botulinumtoxinen aanwezig kon zijn. De neutralisatietest werd herhaald, waarbij nu aan het toxische materiaal een mengsel van 2 verschillende antitoxinen in onderling gelijke hoeveelheden werd toegevoegd, weer in de verhouding 10: 1. Als controle op de aanwezige botulinumtoxinen dienden hierbij toxine-antitoxinemengsels,waaraan slechts 1 van debetrokken antitoxinen was toegevoegd. Voorbeeld: 1) Muizen, ingespoten met toxine + antitoxine type C: gestorven aan botulismus. 2) Muizen, ingespoten met toxine + antitoxine type E: gestorven aan botulismus. 3) Muizen, ingespoten met toxine + mengsel van antitoxine C+E: gezond gebleven. Uit dit resultaat werd geconcludeerd dat in het te onderzoeken materiaal zowelC-toxine als E-toxine aanwezigwas. In sommige gevallen bleek ook een mengselvanbotulinum-antitoxinen niet in staat te zijn de toxische substantie te neutraliseren. Deziekteverschijnselen bij de muizen waren soms onduidelijk, terwijl een andere keer tetanische krampen optraden. De typering van het toxische materiaal werd in deze gevallen voortgezet door 42

bij de neutralisatietest ook tetanus-antitoxine te betrekken. De neutralisatietest met tetanustoxine werd met muizen volgens dezelfde principes uitgevoerd alsis aangegeven voor het botulinumtoxine. De neutralisatie vond plaatsgedurende 1 uur bij 20°C; als controle werden muizen intraperitoneaal ingespoten met een mengsel van toxine en normaal paardeserum. Vaak werden tevens controle muizen ingespoten met toxine-botulinum-antitoxine-mengsels,teneinde de differentiatie van het eventueel aanwezige tetanustoxine tegenover bepaalde botulinumtoxinen scherper te stellen. De ervaring leerde uiteindelijk dat in sommige ophopingsculturen een mengsel van botulinum- en tetanustoxine aanwezigbleek te kunnen zijn; erwerd dan een neutralisatie uitgevoerd, waarbij botulinum-antitoxine en tetanus-antitoxine gelijktijdig aan het toxische materiaal werden toegevoegd. Als controle dienden toxine-antitoxine-mengsels, waaraan slechts 1van de betrokken antitoxinen was toegevoegd. Voorbeeld: 1) Muizen, ingespoten met toxine +botulinum-antitoxine type C: gestorven. 2) Muizen,ingespoten met toxine +tetanus-antitoxine: gestorven. 3) Muizen, ingespoten met toxine + een mengsel van botulinum-antitoxine type Cen tetanus-antitoxine: gezond gebleven. Op grond van deze uitslag werd geconcludeerd dat in het toxische materiaal zowel botulinumtoxine type Calstetanustoxine aanwezigwas. In sommige gevallen bleek de hoeveelheid toxine per inoculum van 0,5 ml onvoldoende te zijn: de muizen vertoonden wel min of meer verdachte ziekteverschijnselen, maar herstelden na enkele dagen. In deze gevallen werd getracht de hoeveelheid toxine per inoculum van 0,5 ml te vergroten door speciale bewerkingen toe te passen. Hiervoor werd gebruik gemaakt van "Centriflo" ultrafilters of van trypsinisatie van het te onderzoeken materiaal. Centriflo ultrafilters Deze methodiek werd tijdens dit onderzoek speciaal voor de bovengenoemde doeleinden uitgewerkt. De concentratie met behulp van het centriflo® membraanfilter (Amicon) berust op het vermogen van het membraanfilter om moleculen, afhankelijk van het moleculairgewicht en de vorm, tegen te kunnen houden. Moleculen met een moleculairgewicht beneden de 5.000worden niet en boven de 50.000 worden wel tegengehouden. In het gebied tussen 5.000 en 50.000 moleculairgewicht wordt de retentie vooral bepaald door de grootte en devorm van de moleculen. In een serie oriënterende onderzoekingen bleken de botulinumtoxinen type A, B, Cen E uitstekend met deze methodiek geconcentreerd te kunnen worden. Orgaansuspensies moesten een voorbehandeling ondergaan: door de suspensies 1 of 2maal inte vriezen en weer te ontdooien, werd beoogd een verregaande 43

celdestructie te bewerkstelligen. Het toxische materiaal (ophopingsculturen, bloedserum, orgaansuspensies) werd eerst gedurende 15 minuten bij 3.000 rpm gecentrifugeerd. Daarna werd5 tot 7 ml van de bovenstaande vloeistof in het trechtervormige membraanfilter (membrane cone CF 50A) gepipetteerd. Het filter wordt daarna in een conische houder (CS IA, van polyethyleen) overgebracht, die op haar beurt in een speciale puntvormige buis (CT1)wordt gezet. Descheiding tussen de verschillende moleculen wordt nu door centrifugeren verkregen, waarbij 1.000 g relatieve centrifugale kracht niet dient te worden overschreden. Na 20 tot 45 min.centrifugeren bleef meestal 2tot 3mlvloeistof in het filter achter, zodat het toxine 2tot 3,5 maal wasgeconcentreerd. Dit bleek voldoende te zijn om het botulinumtoxine aan te tonen in een aantal gevallen, waarbij de normale methodiek niet toereikend wasgeweest. Trypsine behandeling De behandeling met trypsine vond vooral plaats, indien de aanwezigheid van E-toxine werd vermoed. Deze bewerking geschiedde volgens richtlijnen aangegeven door Gerwing et al. (1965): de pHvan de te onderzoeken suspensieswerd op 5,8 gebracht en de eindconcentratie van trypsine (Difco) bedroeg 0,5%, waarna het mengsel gedurende 2uur bij 37°C werd geïncubeerd. 3.2.2. Isolatie van Cl.botulinum Voor het aantonen van de aanwezigheid van Cl.botulinum kunnen de normale bacteriologische technieken niet worden aangewend; hierbij moet de bacterie zo snel mogelijk in reincultuur worden verkregen, en deidentificatie kan daarna geschieden op grond van morfologische, culturele en biochemische eigenschappen. Het is nl. slechts zelden mogelijk Cl. botulinum uit sterk met clostridiumsporen verontreinigd materiaal (grond, slib,organen van dieren, voedselresten) in reincultuur te isoleren. Daarom vindt het aantonen van Cl. botulinum in eerste instantie plaats door het onderzoeken van ophopingsculturen op de aanwezigheid van botulinumtoxinen, die bij een positieve uitslag vervolgens in een neutralisatietest bij muizen nader worden getypeerd (zie 3.2.1.). In sommige gevallen kan daarna nog getracht worden Cl. botulinum in reincultuur te isoleren. 3.2.2.1. Aantonen van Cl. botulinum in ophopingsculturen Als voedingsmedia werden leverbouillon, CMM enCardella-medium gebruikt, waarbij vooral aan het eerste medium de voorkeur werd gegeven. Leverbouillon bleek nl. in een vooronderzoek minstens even goed als CMM en het Cardellamedium te zijn, maar heeft het voordeel,dat de cultuurvloeistof onverdund kan 44

worden onderzocht (zie 3.2.1.). De cultuurmedia werden kort voor het enten in een waterbad gedurende minstens 5 min. op 100°C verhit om de zuurstof te verdrijven die in het vloeibare medium was opgelost. Na het enten werden de culturen afgedekt met vloeibare steriele paraffine, zodat de anaërobie in het medium gehandhaafd bleef. Alle culturen werden gedurende 5 tot 7 dagen bij 30°C geïncubeerd, waarna onderzoek op de aanwezigheid van botulinumtoxine plaatsvond (zie 3.2.1.). Het te onderzoeken materiaal werd aanvankelijk zowel onverhit als na verhitten gedurende 30 min. bij 60°C en 70°C onderzocht. Later werd als standaardmethode het materiaal zonder voorafgaande verhitting onderzocht, omdat het aantal positieve bevindingen met betrekking tot Cl. botulinum typeC naverhitten minder hoog bleek te zijn. 3.2.2.2.Isolatie van Cl. botulinum in reincultuur De isolatie van Cl.botulinum uit sterk verontreinigd materiaal is alleen met enige kans op succes mogelijk, indien het materiaal voldoende kiemen en sporen vanCl. botulinum bevat. In subculturen, geënt met onverhit uitgangsmateriaal, bleek de verontreiniging met andere anaëroob groeiende bacteriën zo groot te zijn, dat op vaste voedingsbodems geen opCl. botulinum gelijkende kolonies werden aangetroffen. Er werden slechts weinig toxische subculturen verkregen, indien het uitgangsmateriaalvoor het enten bij 80°C of hoger werd verhit. Voor de isolatie van Cl. botulinum uit grond of slib werd daarom een methodiek gebruikt, die in principe ook door Segner et al. (1971) voor de isolatievan type Cuit maritieme sedimenten werd gevolgd. Als uitgangsmateriaal werden alleen die bodemmonsters in onderzoek genomen, die bij enting van hoogstens 0,1 g nog toxische culturen opleverden. Het uitgangsmateriaal werd eerst gedurende 30 min. bij 65°C verhit, waarna 12 tot 24 cultuurbuizen, gevuld met leverbouillon of FEM werden geënt met de hoeveelheid slib of grond die met een oogje van een entnaald kon worden overgebracht (ongeveer 10-15 mg). Deze leverbouillon en FEM culturen werden na 5 tot 7 dagen op botulinumtoxine onderzocht (zie 3.2.1.) en van de meest toxische culturen werd met een entnaald één druppel cultuur overgebracht in een tweede serie cultuurbuizen met leverbouillon of FEM.Met deze tweede serie subculturen konden volgens dezelfde principes eventueel nog meer series subculturen worden aangelegd. Uit zeer toxische subculturen van de 2e,3een4eserie subculturen werden vervolgens een groot aantal vaste voedingsbodems geënt (24 of meer hartinfuusschapebloedagarplaten of glucose-runderbloedagarplaten), die volgens de principes van Mcintosh en Fildes (1916) gedurende - dagen bij 37°C in een anaëroben-vat werden geïncubeerd. In dit anaëroben-vat kunnen maximaal 12 45

bloedplaten worden bebroed. Het vat dient zeer nauwkeurig te worden afgesloten. Op de bodem van het anaëroben-vat werd een laagsilicagel gebracht om overmatige condensvorming te voorkomen. Het anaëroben-vat werd driemaal vacuum gezogen, waarbij het vat telkensweer met een gasmengsel, bestaande uit 80%stikstof, 10%waterstof en 10%C0 2 , werd gevuld. Dehierna nog resterende zuurstof werd verwijderd met behulp van een gloei-element waar electrische stroom (12 V) door werd geleid. De resterende zuurstof verbindt zich dan met waterstof, nadat voldoende warmte is ontwikkeld. Deze laatste handeling werd na 24 incuberen nogeens herhaald. Na de incubatieperiode werden van vaste voedingsmedia kolonies, die gelijkenis vertoonden met die van Cl. botulinum, inleverbouillon of FEM geënt. Ook deze culturen werden na 5 tot 7 dagen incuberen bij 30°C op botulinumtoxine onderzocht. Indien zich hierbij toxische culturen bevonden, werden deze weer op de eerder genoemde vaste voedingsmedia geënt en op reinheid gecontroleerd. Van reinculturen op deze bloedplaten werden tenslotte monoculturen verkregen in leverbouillon of FEM, waarvan het toxinetype definitief met monovalente anti-toxinen werd vastgesteld. De meest toxogene reincultuur werd aangehouden en hiervan werden vervolgens de culturele en biochemische eigenschappen vastgesteld. De culturele eigenschappen werden nagegaan op hartinfuus-schapebloedagarplaten en BHR, die 48 uur bij 30 of 37°C waren geïncubeerd in anaëroob milieu en van leverbouillon en FEM culturen die bij 30°C waren gegroeid. De media die gebruikt werden bij het onderzoek van de biochemische eigenschappen, zijn reedsvermeld onder 3.1.1. De proteolytische activiteit werd nagegaan in het medium volgens Löffler, in lakmoesmelk,inCMMen in leverbouillon. Het vermogen gelatine te hydroliseren werd vastgesteld in bacto-nutrient gelatine (Difco). De vorming van H 2 S werd in CMM onderzocht met behulp van een papiertje gedrenkt inloodacetaat en inhet medium volgens Kligler (Difco). De hemolytische activiteit werd bepaald met hartinfuus-schapebloedagarplaten enmet brain heart runderbloedagarplaten. De saccharolytische activiteit werd nagegaan in het basismedium, vermeld onder 3.1.1.3. Alle media werden geënt met 0,2 ml van een goed gegroeide leverbouilloncultuur en gedurende minstens 6 dagen bebroed bij 30 of 37°C in anaëroob milieu (Mcintosh en Fildes methode). De fermentatie van de verschillende koolhydraten werd steeds na 6 dagen onderzocht met behulp van de toevoeging van broomthymolblauw en door de meting van de pH met de Portamess902 (Knick). De isolatie van Cl.botulinum in reinculturen uit minder verontreinigd materiaal, zoals uit organen van dieren die aan botulismus hebben geleden, van 46

gezonde dieren die drager bleken te zijn en uit gekweekte sarcophage vliegen, geschiedde volgens dezelfde principes als is vermeld voor de isolatie uit grond, slib, e.d. De isolatie in reincultuur verliep dan soms sneller, zodat het mogelijk was reeds goede kolonies te vinden opvaste voedingsmedia, diegeënt waren met verhit materiaalvan de eerste serie subculturen inleverbouillon of FEM. 3.2.3. Bepalingvandeconcentratie vanhetbotulinumtoxine De concentratie van het botulinumtoxine werd vastgesteld door Swiss Random muizen van 18-20 g met 0,5 ml van de verdunningen van het toxine intraperitoneaal in te spuiten. Het te onderzoeken toxische materiaal werd eerst gedurende 15 min. bij 3.000 rpm gecentrifugeerd, waarna van de bovenstaande vloeistof met runderbouillon een serieverdunningen werd gemaakt. Indien een eenvoudige bepalingvande concentratie vanhet toxine voldoende was, werd de intraperitoneale MLD bepaald met behulp van tienvoudige verdunningen, waarbij 1of 2muizen per verdunning werden gebruikt. Voor een nauwkeurige bepaling van de concentratie van het toxine werd de intraperitoneale LD 50 bepaald met behulp van tienvoudige verdunningen, soms verder aangevuld met tweevoudige verdunningen. Perverdunning werden nu 4 of 5 muizen gebruikt. De intraperitoneale LD<;0 werd bepaald door toepassingvan deberekeningvolgens Reed en Muench (1938).

47

H O O F D S T U K IV EEN ONDERZOEK NAAR HET VOORKOMEN VAN BOTULISMUS BIJ WATERVOGELS IN NEDERLAND 4.1. INLEIDING Botulismus is tot 1970 niet onderkend bij watervogels in Nederland. Bij sterfte van watervogels is in sporadische gevallen in de differentieel-diagnostiek wel aan botulismus gedacht, doch het onderzoek verliep steeds negatief. In de zomer van 1970 stierven op verschillende plaatsen in Nederland grote aantallen watervogels onder dezelfde ziekteverschijnselen; deze ziekte-uitbraken bleken bij nader onderzoek door botulismus te worden veroorzaakt (Haagsma et al, 1971)! In dit hoofdstuk zullen de botulismusgevallen worden beschreven, die sinds de zomer van 1970 inNederland zijn vastgesteld.

4.2. DIAGNOSTIEKVAN BOTULISMUS BIJWATERVOGELS De klinisch waarneembare ziekteverschijnselen kunnen een goede aanwijzing zijn voor de diagnostiek, in tegenstelling tot het patholoog-anatomisch onderzoek. Een definitieve diagnose is pas gesteld als het botulinumtoxine bij zieke of pasgestorven vogels is aangetoond. De diagnostische betekenis van het aantonen vanCl. botulinum bij verdachte ziektegevallen wordt door diverse onderzoekers terecht betwijfeld. In dit onderzoek is dan ook aan de isolatie van Cl. botulinum geen diagnostische waarde toegekend. 48

4.2.1. Symptomatologie Op grond van experimentele ziektegevallen en van waarnemingen inhet veld, bleken de volgende ziekteverschijnselen bij watervogels diagnostische waarde te hebben. Bij botulismus traden de verlammingsverschijnselen sterk op de voorgrond. Als eerste ziekteverschijnsel werd een verminderd vliegvermogen opgemerkt; bij het voortschrijden van de ziekte konden de vogels niet meer vliegen. Er traden daarna ook loopstoornissen op en tenslotte zaten de dieren in elkaar gezakt met afhangende vleugels. Zwembewegingen konden eerst nog wel worden gemaakt, maar duiken was al spoedig niet meer mogelijk. De vogelswaren gemakkelijk te vangen en bleken geen geluid meer te kunnen voortbrengen. Er trad vervolgens ook een verlamming van de halsspieren op (z.g. "limberneck"). Door het verdwijnen van de ooglidreflex ontwikkelde zichveelal een kerato-conjunctivitis. In het eindstadium van de ziekte ontwikkelden zich ernstige ademhalingsstoornissen, waarbij de dieren met krampachtige bewegingen en open snavel trachtten voldoende lucht te inhaleren. Soms stierven devogelsin coma. Het ziekteverloop was sterk afhankelijk van de hoeveelheid opgenomen toxine. Bij opname van een veelvoud van de letale dosis was het ziekteproces binnen 24 uur afgelopen; bij kleinere hoeveelheden toxine ontwikkelde zich een meer chronisch beeld, dat zich overmeerdere dagen kon uitstrekken. Hierbij trad somszelfs spontane genezing op.

Foto 1 Wilde eend met de verlammingsverschijnselen door botulismus;enkele uren ante mortem. Mallard affected with botulism: symptoms of paralysis a few hours before death.

49

•-V.*"

Eroto 2 Meerkoet met botulismus. Coot affected with botulism.

4.2.2.Post-mortem bevindingen Bijhet post-mortem werden geen pathognomonische laesieswaargenomen.De vogels verkeerden meestal in een goede voedingstoestand. In enkele gevallen werd een kleine hoeveelheid heldervocht inhet pericard aangetroffen of werden kleine subepicardiale bloedingen aangetroffen. Bij veel vogels was de omgeving van de cloaca bevuild met groene faeces. Demaagbevatte meestal weinigvoedsel en er werd soms hyperaemie van de darmmucosa of een geringe enteritis vastgesteld. De cloaca was in een aantal gevallen overvuld met faeces en neerslagen van urinezuurzouten. Bij enkele eenden, afkomstig uit de Vecht bij Loenen, Amsterdam en 's-Gravenhage, werden in de neusholte bloedzuigers aangetroffen; somskwamen deze ook voor op de oogleden of in de mondholte. De exemplaren in de neusholte waren in sommige gevallen sterk met bloed gevuld, waardoor een bemoeilijkte luchtpassage kan zijn ontstaan. De bloedzuigers werden gedetermineerd als Theromyzon tessulatum (Müll)*, een soort die in de literatuur als facultatief parasitair levend wordt beschreven (Williams, 1970; Keymer et al, 1972). Volgens andere onderzoekers zou bij jonge eenden de infectie wel fataal kunnen verlopen (Büchli, 1924;Rollinson et al, 1950). * Determinatie verricht door Dr. H J . Over, afdeling Parasitologic, Centraal Diergeneeskundig Instituut te Lelystad.

50

In enkele eenden werden parasitaire infecties van de digestietractus vastgesteld; hierbij werden o.a. aangetroffen een Tetrameresspecies (vermoedelijk T. fissispina),Echinuria uncinataenAmidostomum acutum*. 4.2.3. Aantonen van het botulinumtoxine Voor het aantonen van het botulinumtoxine werden bij voorkeur ziekevogels onderzocht, omdat dan bloed voor het onderzoek kon worden verzameld. Werden deze zieke vogels afgemaakt, dan kon zonodig ook de lever in het onderzoek worden betrokken. De inhoud van de krop of het maagdarmkanaal werd slechts in enkele gevallen aan een verder onderzoek onderworpen, omdat reeds eerder werd ervaren dat het botulinumtoxine met meer succes in delever kan worden aangetoond (Haagsma et al,1971). Bij gestorven watervogels werden de lever en in enkele gevallen de digestietractus op de aanwezigheid van het botulinumtoxine onderzocht. Het onderzoek van gestorven vogels is echter aan beperkingen onderhevig. Met nadruk moet worden gesteld dat voor een betrouwbare, individuele diagnostiek het onderzoek vanversekadaversnoodzakelijk is.Oudere kadavers,waarbij reeds bederfverschijnselen aanwezig zijn, zijn voor de diagnostiek minder betrouwbaar, omdat hierbij rekening moet worden gehouden met een postmortale toxineproductie. Het te onderzoeken materiaal werd, voorzover dit niet direct nodig wasvoor verder onderzoek, steeds bij —20°C bewaard, ten einde een daling van de toxineconcentratie te voorkomen. De werkzaamheden bij kamertemperatuur werden om deze reden verder zo snelmogelijk uitgevoerd (Pigoury et al, 1965). Van het bloed werd na stolling het serum verzameld, terwijl van de lever of van de inhoud van het maagdarmkanaal een 20-50%suspensie werd bereid. Dit materiaal werd daarna op de aanwezigheid van botulinumtoxine onderzocht en bij een positieve uitslag werd het toxine nader getypeerd met behulp van specifieke botulinum-antitoxinen (zie 3.2.1.); hierbij werd uitsluitend het botulinumtoxine type C gevonden. Bij een negatieve uitslag van het toxineonderzoek werd in een aantal gevallen het onderzoek herhaald na concentratie van het materiaal in een centriflo membraanfïlter (zie 3.2.1.). Zowel in bloedserum als in leversuspensies bleek hierdoor het botulinumtoxine te kunnen worden geconcentreerd, zodat het mogelijk werd het toxine specifiek aan te tonen in een aantal gevallen, waarbij de normale methodiek niet toereikend was (tabel 1).

* Determinatie verricht door Dr. H.J. Over, afdeling Parasitologie, Centraal Diergeneeskundig Instituut te Lelystad.

51

Foto 3 Swiss Random muis met typische ziekteverschijnselen van botulismus. Swiss Random mouse with typical symptoms of botulism.

Tabel 1 Resultaten bij het gebruik van centriflo membraanfilters in de diagnostiek van botulismus. Results by means of centriflo membrane ultrafilters for diagnostic examinations of botulism.

Leversuspensies Bloedsera

Toxine met normale methodiek aangetoond

Voor aantonen van toxine gebruik van centriflo membraanfilters noodzakelijk

38 14

10 (=26,3%) 4 (=28,6%)

Hieruit blijkt tevens dat de concentratie van het botulinumtoxine, dat voor diagnostisch onderzoek beschikbaar was, in vrij veel gevallen slechts zeer gering was. Het bleek in sporadische gevallen zelfs nodig de muizen na 24 of 48 uur nog eens met het te onderzoeken materiaal (concentraat van centriflo membraanfilter) te behandelen, omdat na een éénmalige applicatie slechts vage ziekteverschijnselen optraden.De ervaring tijdens het diagnostische onderzoek leerde dat in deleversuspensies per 0,5 ml meestal ongeveer 1MLD*aanwezigwas. * In de verdere test wordt één minimaal letale dosis voor muizen aangeduid met MLD.

52

In het bloedserum was de concentratie van het toxine meestal eveneens niet veel meer dan 1MLD. In enkele gevallen bleek echter wel meer toxine aanwezig te zijn en de hoogste toxineconcentratie die werd vastgesteld, bedroeg 16MLD per ml serum. In bepaalde fracties van de inhoud van de digestietractus werd in een uitzonderlijk geval zelfs een veel hogere concentratie van het botulinumtoxine aangetroffen. Bij 2 dode talingen werden nog intacte maden in de spier- en kliermaag aangetroffen; bij titratie bleek 0,5 ml van een 10%suspensie van deze maden nog 103 resp. 104 MLD toxine te bevatten. In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van het diagnostisch onderzoek. Hieruit blijkt dat bij aan botulismus lijdende vogels (vooral eenden) onderzoek van het bloed de meeste kans op succesbiedt. Bijaan botulismus gestorven vogelsishet onderzoek van de lever te prefereren boven dat van de inhoud van de digestietractus. Dit wordt mede veroorzaakt door de omstandigheid dat bij onderzoek van de digestietractusvaak aspecifieke sterfte optreedt bij de ingespoten muizen. Tabel2 Overzichtvan het diagnostisch onderzoek tot 1september 1972. Survey ofdiagnostic examinations up to 1September, 1972.

Vogelsdieaan botulismus leden

Bloedserum Lever Digestietractus

Toxine aangetoond 20 3 1

Toxine niet aangetoond 1 7 0

Kadaversvanvogelsdieaan botulismus waren gestorven Toxine aangetoond 3 55 9

Toxine niet aangetoond 0 8 8

Een bijzondere waarneming werd verricht bij 3 eenden die met grote bloedzuigers waren geïnfecteerd. In ongestold bloed dat uit deze bloedzuigers kon worden verzameld, werd minstens 1 MLD van het botulinumtoxine aangetoond. Dit gegeven droeg in belangrijke mate bij in de diagnostiek, omdat bij deze dode eenden elders geen ongestold bloed waste verzamelen, terwijl in de leversuspensiesvan deze eenden slechtsweinig toxine aanwezig bleek te zijn: in2 gevallen werden de ingespoten muizen wel specifiek ziek maar stierven niet, in het 3e geval kon in de leversuspensie zelfs geen toxine worden aangetoond. Enkele resultaten van het toxine-onderzoek deden vermoeden dat een negatieve uitslag geen volledige zekerheid gaf dat de vogel niet aan botulismus had geleden. Vooral het volgende onderzoek verschafte hierin een beter inzicht. Van een groep van 8 eenden, die klinisch specifieke symptomen van botulismus 53

vertoonden en waarbij werd vastgesteld dat er sprake was van botulismus, werden 2 eenden na 4 resp. 5 dagen afgemaakt. Het botulinumtoxine kon toen niet meer worden aangetoond, alhoewel bij deze eenden nog symptomen van botulismus waren waar te nemen (niet kunnen vliegen, snel vermoeid na opjagen). 4.3. HET OPTREDEN VAN BOTULISMUS BIJ WATERVOGELS IN NEDERLAND In 6 gebieden werd bij het optreden van botulismus een uitgebreider onderzoek verricht in verband met de bijzondere aspecten die zich hierbij voordeden. Deze gebieden zullen daarom apart worden besproken. 4.3.1. In 's-Gravenhage In de eerste helft van juli 1970 werd door omwonenden opgemerkt, dat veel eenden stierven in het z.g. verversingskanaal, waarin koelwater van het Gemeentelijk Energie Bedrijf wordt geloosd. Door de Gemeentelijke Geneeskundige en Gezondheidsdienst van 's-Gravenhage, die begin augustus te hulp werd geroepen, werden in het water enkele tientallen dode en verscheidene zieke, min of meer verlamde eenden aangetroffen. Als ziekte-oorzaak werd primair gedacht aan een chemische intoxicatie of een infectieziekte. Bijnavraag bleek, dat eind mei 1970 de walkanten van het verversingskanaal met het herbicide MCPA (2-methyl, 4-chloorfenoxyazijnzuur) waren bespoten. Het was opgevallen, dat sindsdien geen ratten meer werden gezien. Het gebruikte herbicide was echter zeer matig gedoseerd en wordt als weinig of niet toxisch voor dieren beschouwd. Eind augustus werden op het Instituut gestorven eenden voor diagnostisch onderzoek ontvangen. Als doodsoorzaak werd hierbij botulismus vastgesteld, nadat het verdere bacteriologisch, virologisch en chemisch-toxicologisch onderzoek negatief wasverlopen. In september 1970verdween de sterfte geleidelijk, maar in december werd bij enkele eenden, afkomstig uit het verversingskanaal, wederom botulismus vastgesteld. Vanaf 20 juli 1971 werd opnieuw botulismus gediagnostiseerd bij eenden in het verversingskanaal. In augustus deed zich echter een geheel nieuwe ontwikkeling voor, doordat nu ook botulismus werd vastgesteld bij eenden en andere watervogels in verschillende grachten, parken en vijvers elders in de stad. Zo werden in het Haagse Bos in enkele dageneen zestigtal eenden aangetroffen met symptomen van botulismus, in de Paleistuin een dertigtal eenden, in het park Clingendael enkele tientallen en in de Hofvijver 15 eenden eneen zwaan. In het verversingskanaal werden nog slechtsenkele zieke eenden gesignaleerd. 54

Desituatie verslechterde bedenkelijk toen eind augustus ook botulismus bleek voor te komen bij watervogels in de duinpannen van het waterleidingbedrijf te Scheveningen. Evenals in 1970 verminderde ook nu in september het aantal botulismusgevallen beduidend. Gedurende de maanden oktober, november en december werden zo nu en dan nog enkele watervogels (vooral eenden) met verschijnselen van botulismus waargenomen, zowel in het verwarmde water van het verversingskanaal als op plaatsen waar het water een normale temperatuur had. Dit beeld zette zich ook in januari en februari 1972 voort. Een opvallende uitbraak van botulismus deed zich eind januari 1972 voor bij tamme grauwe ganzen in het Zuiderpark, waar het water in devijvers een normale temperatuur heeft; deze ganzen konden het park niet verlaten, zodat het zeker was dat de ganzen het toxine ter plaatse hadden opgenomen. Dit in tegenstelling tot de botulismusgevallen gedurende de herfst en de winter bij wilde eenden, waarbij het mogelijk was dat dezehet toxine eldershadden opgenomen,b.v. op plaatsen waar dewatertemperatuur door thermische pollutie wasverhoogd. Van maart tot en metjuni werden geenbotulismusgevallen meer gesignaleerd, maar injuli,augustus en september 1972 ontwikkelde zichweer dezelfde situatie als in de nazomer van 1971: in het verversingskanaal werden slechts enkele en elders in de stad weer tientallen watervogels met symptomen van botulismus waargenomen. Op het terrein van het duinwaterleidingbedrijf te Scheveningen werden in 1972geengevallenvan botulismus vastgesteld. Van de verschillende ziekte-uitbraken werden meestal één of meer watervogels op botulismus onderzocht, speciaal indien de sterfte zich op plaatsen voordeed waar eerder geen botulismusgevallen waren waargenomen.* In alle gevallen, waarin het onderzoek op botulismus positief verliep, werd uitsluitend het type C-toxine aangetoond. In tabel 3 wordt hiervan een overzicht gegeven. Er zijn in 's-Gravenhage geen betrouwbare tellingen verricht, zodat het aantal ziektegevallen niet nauwkeurig kan worden aangegeven. 4.3.2. InAmsterdam In augustus 1970 werd in het Vondelpark en het Sarphatipark sterfte bij enkele watervogels waargenomen, waarbij het ziektebeeld op botulismus wees. Deze diagnose werd bevestigd bij een zieke eend door het botulinumtoxine in het bloed aan te tonen. In juli en augustus 1971 werd in verschillende grachten, parken en plantsoenen wederom veel sterfte bij watervogels vastgesteld; zieke vogels vertoonden steeds verschijnselen van botulismus en in een aantal gevallen werd bevestigd dat hier inderdaad sprakewasvan botulismus (tabel 7). Bij de typering *Veel informaties en materialen voor onderzoek werden ontvangen via de Gemeentelijke Geneeskundige en Gezondheidsdienst van 's-Gravenhage.

55

Tabel 3 Gevallen van botulismus in 's-Gravenhage waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in the Hague, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed.

Tijdvak

Plaatsaanduiding

Diersoort

1970, augustus december 1971, juli augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus augustus september december 1972, januari januari februari februari juli juli augustus augustus augustus september september

Verversingskanaal Verversingskanaal Verversingskanaal Verversingskanaal Clingendael Schwarzerstraat Paleistuin Kwekerijweg Hofvijver Haagse Bos Haringkade Dedemsvaartweg Sluis Verversingskanaal, zeezijde Zuiderpark Veilingsstraat Meer en Bos Duinpannen Waterleidingbedrijf Duinpannen Waterleidingbedrijf Duinpannen Waterleidingbedrijf Hofvijver Verversingskanaal Haagse Bos Zuiderpark Haagse Bos Leidschendam Verversingskanaal Waterpartij Clingendael Park Marlot Voorburg Zuiderpark Bezuidenhout

wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend nijlgans wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend knobbelzwaan kapmeeuw wilde eend kuifeend bergeend wilde eend wilde eend kuifeend grauwe gans blauwe reiger wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend

Aantal 2 1 3 4

4

51

56

werd steeds het botulinumtoxine type C aangetroffen. Door de afdeling Beplantingen van de gemeente Amsterdam zijn van 19juli tot 23 augustus 1971 tellingen verricht op grond waarvan een indruk kan worden verkregen over de omvang van deze sterfte (tabel 4).* Plaatsen, waar zich de grootste sterfte voordeed, waren het Vondelpark met 163, Schellingwouderbreek met 106, Valentijnkade met 47, Flevopark met 30 en de omgeving van de J. Edenbaan met 26 sterfgevallen. Onder de 524 slachtoffers werden 498 wilde eenden geteld, 9 meerkoeten, 2 kapmeeuwen en 15 geleewiekte sierwatervogels (o.a. 1 mandarijneend, 2 carolina-eenden, 3smienten, 1zomertaling, 2 pijlstaarteenden, 1vlekbekeend en 1baikaleend). Tabel4 Overzicht van het aantal gestorven ofernstigverlamde watervogels in Amsterdam van 19juli tot 23augustus 1971. Survey of the number of dead or seriously paralysed waterfowl in Amsterdam observed between 19July and 23August, 1971.

Aantal

19-26 juli

26juli-2 aug.

2-9 aug.

9-16 aug.

16-23 aug.

295

16

162

30

21

Kort na het begin van de botulismusuitbraken in 1971 is de afdeling Beplantingen begonnen met het stelselmatig verwijderen van de kadavers van gestorven watervogels, waarbij vooral de stadsparken nauwkeurig werden geïnspecteerd. Het viel op dat daarna de sterfte beperkt bleef tot wilde watervogels (vooral wilde eenden), terwijl er geen sterfte meer optrad bij de autochtone, geleewiekte sierwatervogels van de stadsparken, hetgeen suggereerde dat met het opruimen van de kadavers ook de bron van het toxine was weggenomen. De sterfte onder wilde watervogels zou daarentegen verklaard kunnen worden met de hypothese dat deze vogels het toxine tijdens het fourageren elders hebben opgenomen, tijdens het preklinische ziektestadium naar de stadsparken zijn gevlogen en daar dan ziek zijn geworden. Waarnemingen in de stadskwekerij voor sierwatervogels wezen in dezelfde richting: er traden namelijk geen nieuwe gevallen van botulismus meer op, nadat het kadaver van een wilde eend, geheel bezet met maden en verborgen onder overhangende takken inhet water drijvend, was verwijderd. In september 1971 verminderde het aantal botulismusgevallen duidelijk en vanaf oktober werden geenziektegevallen meer vastgesteld. *Deze informaties werden ontvangen van de afdeling Beplantingen, Dienst der Publieke Werken,gemeente Amsterdam. 57

In de eerste 3 maanden van 1972 werden opnieuw botulismusgevallen waargenomen, vooral in Amsterdam-Oost in parken en grachten waar de watertemperatuur niet verhoogd was door een thermische waterverontreiniging. Het betrof steeds watervogels die ook op andere plaatsen konden fourageren, zodat niet was vast te stellen waar deze vogels het botulinumtoxine hadden opgenomen. Een overzicht van deze ziektegevallen is gegeven in tabel 5. De diagnose botulismus werd in een aantal ziektegevallen bevestigd (tabel 7); hierbij werd uitsluitend het type C-toxine vastgesteld.

Tabel5 Overzicht van het aantal watervogels, dat in het Ie kwartaal 1972 met symptomen van botulismusisgestorven. Survey of the number of waterfowl, that died in thefirstquarter of 1972 with symptomsof botulism. Tijdvak

Wilde eend

Meerkoet

Zwaan

januari februari maart

8 10 7

2 1 3

1

Waterhoen

Kuifeend

1

1

Kapmeeuw

1

In het 2e kwartaal 1972 werden geen gevallen van botulismus meer opgemerkt, maar in juli, augustus en september 1972 stierven in verschillende grachten en parken opnieuw veel watervogels onder ziekteverschijnselen die op botulismus wezen. In een beperkt aantal gevallen werd bevestigd dat deze vogels aan botulismus waren gestorven (tabel 7). Door de afdeling Beplantingen zijn ook in 1972 tellingen uitgevoerd, zodat weer een indruk kan worden verkregen over de omvang van deze sterfte (tabel 6). Tabel6 Overzicht van het aantal gestorven of ernstigverlamde watervogels in Amsterdam van 10juli tot 18september 1972. Survey of the number of dead or seriously paralysed waterfowl in Amsterdam observed between 10July and 18September, 1972. 10-17 17-24 24-31 31 juli 7-14 juli juli juli -7aug. aug. Aantal 58

9

2

8

9

86

14-21 21-28 28aug. 4-11 aug. aug. -4sept. sept. 66

77

39

148

11-18 sept. 2

Het blijkt dat botulismus in de zomer 1972 vooral is voorgekomen in Amsterdam-Noord; zo werden in de Schellingwouderbreek 111 slachtoffers geteld, in enkele grachten bij de Jisperveldstraat-IJdoornlaan-Alkmaarstraat 72, bij het RioolwaterzuiveringsInstituut Noord 42 en in de poel "de Slochter" 32. Er zijn aanwijzingen dat het verzamelen van dode en zieke vogels hier minder intensief isgeweest. Degrote sterfte in de Ie helft van september doet bovendien vermoeden dat hier bijzondere omstandigheden een belangrijke rol hebben gespeeld. Als zodanig kan aan het effect van thermische pollutie door het Rioolwaterzuiverings Instituut Noord worden gedacht. In het Vondelpark werden nu slechts 20 gevallen van botulismus geteld. De verminderde sterfte in de stadsparken in het algemeen kan vermoedelijk worden toegeschreven aan een verbeterde inspectie, waarbij zieke of gestorven watervogels tijdig werden verzameld. Onder de 446 slachtoffers werden weerhoofdzakelijk wilde eenden geteld, nl. 411 exemplaren; verder 11 knobbelzwanen, 7 meerkoeten, 6 slobeenden, 5 kuifeenden, 2 wintertalingen, 2 kapmeeuwen, 1 blauwe reiger en slechts 1 sierwatervogel, nl.een krooneend. Tabel 7 Gevallen van botulismus in Amsterdam, waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in Amsterdam, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed. Tijdvak

Plaatsaanduiding

Diersoort

1970, september 1971, juli juli augustus augustus augustus augustus september september 1972, januari januari maart maart juli augustus augustus augustus september september september

Sarphatipark Schellingwouderbreek Sloterplas Volkstuinen "Nut en Genoegen" Westerpark Radioweg Artisvijver Badhoevedorp Schellingwouderbreek Archimedesplantsoen Plantsoenen en grachten Amsterdam-Oost Ranonkelkade Volkstuinen "Nut en Genoegen" Vondelpark Schellingwouderbreek Slotermeer Alkmaarstraat Rioolwaterzuiverings Instituut Noord Rioolwaterzuiverings Instituut Noord Jisperveldstraat

wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend pijlstaarteend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend knobbelzwaan knobbelzwaan knobbelzwaan wilde eend wilde eend wilde eend meerkoet wilde eend

Aantal 1 1 3 1 4 4 1 1 2 3 5 1 1 2 1 3 3 2 1 2 42~

59

4.3.3. InHilvarenbeek Op 20 augustus 1970 werd door een jachtopziener voor het eerst abnormale sterfte opgemerkt onder watervogels in een drietal vennen op het landgoed "De Utrecht", nabij Hilvarenbeek. In ongeveer vier weken zijn hier naar schatting enkele duizenden watervogels gestorven. Bij zieke vogels wezen de ziekteverschijnselen op botulismus. De sterfte is in september geleidelijk afgenomen, samenvallend met het verdwijnen vanhet warme zomerweer. Door het "Rijksinstituut voor Natuurbeheer" werd op 26augustus 1970een telling verricht in één van de drie betrokken vennen (nl. het "Goorven"), op grond waarvan een inzicht kan worden verkregen van de vogelsoorten die bij de sterfte waren betrokken (tabel 8). Hierbij werden 361 kadaversgevonden, die te verdelen waren in: 280 skeletten, 70 kadavers met vliegenmaden en 11 verse kadavers. Tabel 8 Overzicht van op 26 augustus 1970 dood aangetroffen watervogels in het Goorven. Survey of dead waterfowl observed in the "Goorven" on 26 August, 1970.

Vogelsoort Wintertaling Wilde eend Kapmeeuw Meerkoet Waterhoen Watersnip Kuifeend Zwarte stern Porseleinhoen

Aantal 148 98 83 11 8 7 4 1 1 361

Het aantal gestorven kapmeeuwen was opvallend hoog. Dit is te verklaren door de omstandigheid dat in deze vennen, die omsloten zijn door gebieden van vochtige heide, elk jaar duizenden kapmeeuwen broeden. In de tweede helft van juli vertrekken deze kapmeeuwen geleidelijk en pas daarna keren de andere vogelsoorten (vooral watervogels) weer in grote aantallen terug. Bijde skeletten waren verhoudingsgewijs veel kapmeeuwen; dit zou er op kunnen duiden, dat de sterfte in 1970in de kapmeeuwenkolonie wasbegonnen. In 1971 werden in de eerste helft vanjuli weer enkele gevallen van botulismus waargenomen bij watervogels, vooral bij talingen en eenden (tabel 9). In de 60

kapmeeuwenkolonie was geen abnormale sterfte voorgekomen en er werden klinisch geen verdachte gevallen vanbotulismusvastgesteld. Erwerden zodoende in 1971 geen aanwijzingen gevonden dat de kapmeeuwenkolonie een directe rol speelde bij de epidemiologie van botulismus bij watervogels in dit gebied. Nadat in 1971 de eerste botulismusgevallen waren opgemerkt, werden door jachtopzieners regelmatig de kadavers van watervogels uit het vennengebied verwijderd, hetgeen goed uitvoerbaar bleek te zijn ondanks het moeilijk toegankelijke terrein. Er werd nadien nog maar een enkel verdacht geval van botulismus waargenomen. In 1972 werden in het vennengebied bij Hilvarenbeek in het geheel geen botulismusgevallen meervastgesteld bij watervogels. Tabel 9 Gevallen van botulismus in Hilvarenbeek, waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in Hilvarenbeek, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed. Tijdvak

Diersoort

1970, augustus augustus augustus september september september 1971, juli juli

kuifeend wintertaling wilde eend wintertaling wilde eend wintertaling wilde eend wintertaling

Aantal 2 3 2 1 1 1 1 4 15

4.3.4. InZuidelijk Flevoland In Zuidelijk Flevoland werd op 24 juni 1971 door vogelliefhebbers voor het eerst abnormale sterfte opgemerkt in een kolonie vanvisdiefjes en kapmeeuwen langs de Oostvaardersdiepdijk tussen Muiderberg en Lelystad ter hoogte vanhet gemaal "De Blocqvan Kuffeler". Er waren naar schatting in dit gebied 4.000 paren kapmeeuwen en 400 paren visdiefjes aanwezig. Op 24 juni werd zeer uitgebreide sterfte bij de jonge visdiefjes waafgenomen, terwijl ook veel volwassen visdiefjes dood werden aangetroffen. Bij de jonge kapmeeuwen werd eveneens vrij veel sterfte vastgesteld. 61

Op 30 juni bleek reeds ongeveer 80% van de jonge kapmeeuwen te zijn gestorven; bij de volwassen kapmeeuwen werd nu ook sterfte vastgesteld. Bij zieke vogels werd het ziektebeeld gekenmerkt door verlammingsverschijnselen. Aanvankelijk werd er een verband gelegd tussen deze sterfte en bespuitingen met herbiciden, die door de Rijksdienst voor de IJsselmeerpolders op wilgenopslag was uitgevoerd. Bij het aanvankelijk ingestelde chemisch-toxicologisch en bacteriologisch onderzoek kon geen oorzaak voor demassalevogelsterfte worden aangetoond. Eerst in een later stadium werd een onderzoek op botulismus ingesteld bij materiaal van 8 kapmeeuwen en 3 visdiefjes, dat bij 4°C was bewaard. Desondanks kon in de inhoud van de digestietractus van een jonge kapmeeuw nog botulinumtoxine worden aangetoond. Bij het onderzoek van de darminhoud van een andere jonge kapmeeuw werden bij de ingespoten muizen verdachte symptomen waargenomen, doch de aanwezigheid van het botulinumtoxine kon in dit geval niet meer met zekerheid worden aangetoond mede door gebrek aan onderzoekingsmateriaal; ten tijde van dit onderzoek werd het toxine echter nogniet geconcentreerd met centriflo membraanfilters. Ondanks de beperkingen, diebijhet onderzoek naar het botulinumtoxine een rol speelden, is, indien ook de Symptomatologie in aanmerking wordt genomen, toch aannemelijk gemaakt dat hier sprake isgeweest van botulismus. Dit gegeven wordt nog gesteund door het feit dat op 29 augustus 1971 in hetzelfde gebied aan de binnenzijde van de Oostvaardersdiepdijk opnieuw grote vogelsterfte werd geconstateerd, evenals ietsnoordelijker vlak bij Lelystadhaven. Bij zieke vogels overheersten klinisch de verlammingsverschijnselen. Er kon nu bij meer vogels worden vastgesteld dat deze aan botulismus waren gestorven (tabel 10), maar ook nu washet aantal onderzochte vogelsslechts een fractie van het totale aantal dode vogels. Een indruk van deze vogelsterfte kan worden verkregen uit tellingen die door enkele vogelliefhebbers zijn verricht en in het oktobernummer van "Het vogeljaar" zijn gepubliceerd (van der Geld, 1971; Osieck en Roselaar, 1971). Op 4 september 1971 werden op 500 m 2 ongeveer 70 dode vogels geteld, verdeeld over 11 vogelsoorten. Vervolgens werden op 17 september over een oeverlengte van 800 m ongeveer 1.700 dode vogels geteld (24 vogelsoorten) en in een waterplas bij het gemaal "De Blocq van Kuffeler" ongeveer 550 vogelkadavers (10 vogelsoorten). Op 24 september leek de sterfte te zijn verminderd: er werden over een oeverlengte van 400 m "slechts" 159 kadavers geteld, verdeeld over 15vogelsoorten. Bij combinatie van deze tellingen blijkt de grootste sterfte te zijn voorgekomen bij de wintertalingen (ongeveer 2.100); er werden vervolgens 113 dode kluten en 71wilde eenden geteld. Bijde gestorven vogels bevonden zich voorts enige tamelijk zeldzaam voorkomende broed- en trekvogels (3 bontbekplevieren, 4 lepelaars, 1poelruiter, 1 porseleinhoen en 5 zwarte ruiters), zodat gesteld kan worden dat dor5r deze sterfte ernstige schade aan de vogelstand was toegebracht. Er is echter geen zekerheid dat ook deze vogels aan botulismus zijn gestorven omdat bij de kadavers geen 62

betrouwbaar onderzoek meer kon worden uitgevoerd. Van de meeste soorten is bovendien de gevoeligheid voor het botulinumtoxine nog onbekend. Na september 1971 werden geen meldingen meer ontvangen overvogelsterfte in dit gebied. In 1972 werden in Zuidelijk Flevoland geen gevallen van botulismus waargenomen, ondanks het feit dat de vogelstand in het getroffen gebied zich weer grotendeels had hersteld. Tabel 10 Gevallen van botulismus in Zuidelijk Flevoland waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in Southern Flevoland, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed. Tijdvak

Plaatsaanduiding

Diersoort

1971, juni augustus augustus augustus augustus september september september september

Oostvaardersdiepdijk Oostvaardersdiepdijk Oostvaardersdiepdijk Oostvaardersdiepdijk Oostvaardersdiepdijk Lelystadhaven Lelystadhaven Oostvaardersdiepdijk Oostvaardersdiepdijk

kapmeeuw wintertaling bergeend wilde eend meerkoet wintertaling kapmeeuw watersnip tureluur

Aantal 1 6 2 1 1 4 2 1 1 19

4.3.5. InGroningen In de stad Groningen kwam in september 1971 sterfte voor bij wilde eenden in het Helperdiepje, waarin koelwater van het Electriciteitsbedrijf voor Groningen en Drente (EGD) werd geloosd. Het ziektebeeld wees op botulismus en dit vermoeden werd bij laboratoriumonderzoek bevestigd (tabel 11). Ook in oktober, november en december werden nog geregeld botulismusgevallen waargenomen. In januari 1972, toen tijdens een vorstperiode nog meer watervogels naar dit tot 20°C verwarmde open water trokken, nam de sterfte verontrustende vormen aan. Hieropbesloot het EGDop 21januari de lozingvan koelwater in dit deel van het koelcircuit te staken, waarna de watertemperatuur snel tot normale waarden daalde: synchroon hiermede kwam er een einde aan de sterfte door botulismus bij watervogels. Van september 1971 tot januari 1972 zijn inhet Helperdiepje naar schatting enkele honderden eenden gestorven. In augustus en oktober 1972 trad botulismus op bij een twintigtal eenden in twee stadsvijvers, waarvan één in de directe omgeving van het EGD ligt. 63

Bijzonderheden over deze 2 kleine botulismusuitbraken konden verder niet worden achterhaald. Tabel 11 Gevallen van botulismus in Groningen, waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in Groningen, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed.

Tijdvak 1971, september december 1972,januari augustus oktober

Plaatsaanduiding Helperdiepje Helperdiepje Helperdiepje Stadsvijver bij EGD Stadsvijver (overloop

Diersoort

riolering)

wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend

Aantal 4 2 3 1 1 11

4.3.6. In Leiden/Voorschoten Naar pas achteraf duidelijk is geworden aan de hand van gegevens, verstrekt door de vogelwacht Rijnland, is in het gebied Leiden/Voorschoten in augustus 1970 een verhoogde sterfte voorgekomen bij watervogels,vooral bij eenden. Het ziektebeeld kwam overeen met botulismus. Over de winter 1970/1971 zijn geen gegevens bekend geworden maar injuli, augustus en september 1971 stierven hier honderden watervogels met dezelfde ziekteverschijnselen. Bij eenden, die in een naburig laboratorium werden onderzocht, werd als ziekte-oorzaak een E. co//-infectie vastgesteld. Er werd echter geen deugdelijk onderzoek opbotulismus ondernomen. In januari 1972 stierven nog steeds wilde eenden met hetzelfde ziektebeeld; nu werden voor het eerst 2wilde eenden bij het Instituut onderzocht, waarbij de diagnose botulismus kon worden gesteld (tabel 12). Analyse van de situatie leerde dat ook in deze omgeving sprake is van een thermische waterverontreiniging, met de Stedelijke Lichtfabriek (SLF) alsbelangrijkste producent vanwarm koelwater. In augustus 1970 werden hier watertemperaturen van 35°C gemeten. De botulismusgevallen in januari 1972 zijn met dit gegeven ook verklaarbaar geworden. In de zomer van 1972 zijn in dit gebied opnieuw tientallen gevallen van botulismus opgetreden. Eind oktober/begin november werd nog botulismus vastgesteld bij 2zwanen en in december bij een muskuseend (tabel 12). 64

Tabel 12 Gevallen van botulismus in Leiden/Voorschoten, waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in Leiden/Voorschoten, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed. Tijdvak

Plaatsaanduiding

Diersoort

1972, januari oktober oktober november december

Voorschoten/Veurseweg Leiden, Rijnsburgersingel Leiden, Rijnsburgersingel Leiden, Rijnsburgersingel Leiden, Rijnsburgersingel

wilde eend wilde eend knobbelzwaan knobbelzwaan muskuseend

Aantal 2 2 1 1 1

4.3.7. Inanderegebieden Sinds 1970zijn een aantal botulismusuitbraken in andere dan reeds genoemde gebieden waargenomen, die echter van beperkte omvang of van korte duur waren. Deze kleinere uitbraken kwamen alle voor inde warme zomermaanden: juni, juli, augustus en september (tabel 13). Een samenhang met de andere hiervoor beschreven grotere botulismusuitbraken is moeilijk met zekerheid aan te tonen; de geografische spreiding van de meeste ziektegevallen zou hier welvoor kunnen pleiten. Ook andere gegevens kunnen tot deze veronderstelling bijdragen. Een duidelijk voorbeeld is het geval van botulismus in Rotterdam, waarbij slechts 1 eend ziek werd aangetroffen in een stadssingel. Het is mogelijk dat dit een trekkende eend is geweest, die het botulinumtoxine elders met name in 's-Gravenhage - had opgenomen. Soortgelijke overwegingen zijn denkbaar bij de gevallen van botulismus in Pijnacker en Delft/Nootdorp, die dan eveneens in relatie met 's-Gravenhage zouden hebben gestaan; de gevallen in Bunschoten/ Eemdijk, Hilversum en Marken zouden zo kunnen samenhangen met de grote botulismusuitbraak in Zuidelijk Flevoland. Debotulismusgevallen in delaatste 3 plaatsen deden zich ook in dezelfde tijdsperiode voor als die in Zuidelijk Flevoland. Geografisch gezien behoort een verspreiding uit Amsterdam echter hier ook tot demogelijkheden. Recente gegevens,betreffende het koelcircuit van de SLF, wijzen er tenslotte op dat er een verband kan zijn geweest tussen de botulismusgevallen inWarmond en de ziektehaard in Leiden/Voorschoten. Bij de botulismusgevallen in Zuilichem (bij Zartbommel) en in de Vecht tussen Nieuwersluis en Loenen aan de Vecht is een samenhang met andere botulismusuitbraken minder aannemelijk. In Zuilichem stierven in een vijver in 65

enkele dagen een twintigtal eenden aan botulismus; opvallend bij deze ziekte-uitbraak was het feit dat deze reeds op 21 juni voorkwam, dus voor alle andere botulismusgevallen in 1971. In de Vecht stierven in augustus en september 1972 enkele honderden watervogels - hoofdzakelijk eenden - aan botulismus. In deze streek speelde een thermische pollutie van het oppervlaktewater evenmin een rol. Een belangwekkende mededeling was dat ratten niet meer werden gezien na het optreden van botulismus. Het is de vraag, evenals in 's-Gravenhage, in hoeverre hier sprake is van een toevallige samenloop van de omstandigheden. Het is denkbaar dat deze ratten eveneens aan botulismus zijn gestorven; een andere mogelijkheid is dat de ratten aan een intercurrente oorzaak zijn gestorven en aannemende dat bij deze ratten dragersvan Cl. botulinum type Cvoorkwamen dat de kadaversdaarna de primaire bron vanhet toxine zijn geworden.

Tabel 13 Gevallen van botulismus in 9 andere gebieden, waarbij de klinische diagnose specifiek werd bevestigd. Cases of botulism in 9 other areas, in which the clinical diagnoses were specifically confirmed.

'

Tijdvak

Plaatsaanduiding

Omvang gesignaleerde Specifieke diagnose bij sterfte Diersoort Aantal

1970, augustus augustus 1971.juni juli augustus

Warmond, Poelmeer Warmond, Poelmeer Zuilichem Bunschoten/Eemdijk Hilversum (Raadhuissingel) Marken R'dam (Witte Dorp) Pynacker Delft/Nootdorp Vecht tussen Loenen en Nieuwersluis

Enkele tientallen 5-10 10-20 onbekend

wiide eend meerkoet wilde eend wilde eend

1 1 2 1

1 eend 0 Enkele tientallen 1 eend 10-20.' Enkele honderden

wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend

1 4 1 1 10

Enkele honderden

wilde eend

5

augustus september september 1972, augustus september

27

66

4.4. SAMENVATTING Sinds augustus 1970 is in 15 gebieden in Nederland bij watervogels botulismus vastgesteld. Bij het optreden van botulismus in 6 gebieden werd een uitgebreid onderzoek verricht in verband met de bijzondere aspecten die zich hierbij voordeden. In twee gebieden, ni. Hilvarenbeek en Zuidelijk Flevoland, kwamen de botulismusgevallen uitsluitend in het warmere jaargetijde voor, dus van juni tot september; hier speelden de klimatologische omstandigheden kennelijk een belangrijke rol. Toch moeten ook andere factoren van invloed zijn geweest: in Hilvarenbeek kwam in 1970 massale sterfte door botulismus voor en in 1971 slechts enkele gevallen, terwijl in Zuidelijk Flevoland in 1971 juist op grote schaal botulismus optrad. De vier andere plaatsen, diebijzondere aandacht kregen,waren 's-Gravenhage, Amsterdam, Groningen en Leiden/Voorschoten, waar degevallen van botulismus voorkwamen in grote bevolkingscentra. De grootste sterfte kwam weer in de warmere zomermaanden voor, maar er bleven hier ook in deherfst en winter nog botulismusgevallen voorkomen. Er werden gegevens verzameld die er op wijzen dat de thermische pollutie van het oppervlaktewater door electriciteitsbedrijven een belangrijke rol speelde. In alle gediagnostiseerde botulismusgevallen werd bij typering met specifieke antitoxinen uitsluitend het botulinumtoxine type C aangetoond. Bij dit onderzoek werd steeds gebruik gemaakt van het antitoxine type C-mink. Bijde individuele diagnostiek van botulismus bij watervogels kunnen zich grote moeilijkheden voordoen, aangezien in een aantal gevallen slechts weinig toxine beschikbaar is voor het diagnostisch onderzoek. Deze moeilijkheden werden zowel bij onderzoek van eenden ervaren als bij zwanen, meerkoeten en kapmeeuwen. Door gebruik te maken van centriflo membraanfilters, bleek het mogelijk een aantal gevallen te diagnostiseren die anders niet waren onderkend. Het is daarom mogelijk dat ook voor 1970 reeds incidenteel een geval van botulismus kan zijn opgetreden, maar door de beperkte diagnostische mogelijkheden niet werd vastgesteld. Het isechter hoogst onwaarschijnlijk dat voor 1970 reeds massale sterfte door botulismus is opgetreden; deze mening werd bij navraag door ornithologen bevestigd. Bij onderzoek van sterfte onder in het wild levende vogels, blijkt botulismus sinds 1970 een belangrijke plaats in te nemen. Op grond van een globale schatting zijn van 1970 tot 1972 tussen 5.000 en 10.000 vogelsaan botulismus gestorven. Van Genderen (1972) stelt dan ook terecht dat bij ernstige vogelsterfte, waarbij een chemische intoxicatie - met name pesticiden - wordt vermoed, in de differentieel-diagnostiek eveneens aan botulismus dient te worden gedacht. 67

HOOFDSTUK V EEN ONDERZOEK NAAR HET VOORKOMEN VAN Cl. botulinum IN VERBAND MET HET OPTREDEN VAN BOTULISMUS BIJ WATERVOGELS

5.1.INLEIDING Om een goed inzicht te verkrijgen in de factoren die bij het ontstaan van botulismus bij watervogels een rol spelen,ishet van groot belanghet voorkomen vanCl. botulinum — speciaalvan type C— in de natuur te kennen. In Nederland istype Caangetoond bij botulismus vanbedrijfsmatig gehouden dieren als paarden, runderen en nertsen; over het voorkomen van type C in de natuur zijn echter geen gegevens bekend. Uit het bescheiden onderzoek van Meyer en Dubovsky (1922b) is gebleken dat type Bin Nederland in de bodem voorkomt, evenalseen ander toxinetype dat met de antitoxinen type Aen Bniet was te typeren. Het is verder onbekend in hoeverre de typen A, D, E en F in Nederland voorkomen. In het hierna te beschrijven onderzoek over het voorkomen vanCl. botulinum is in de eerste plaats gelet op de relatie met het optreden van botulismus bij watervogels.Dit gegeven heeft niet alleen alsleidraad gediend bij de keuze vande onderzochte water- en bodemmonsters, maar ook bij het onderzoek van de verschillende dieren; er is bijzondere aandacht besteed aan het onderzoek van invertebraten, omdat deze als voedselbron van watervogels dienen; bovendien werd Cl. botulinum type C reeds eerder aangetoond bij een sarcophage vliegensoort,Luciliaillustris (Haagsma et al, 1971). In daarvoor geselecteerde gevallen ishet gelukt reinculturen te isoleren vande gevonden toxinetypen.

68

5.2.MATERIALEN ENMETHODIEKEN 5.2.1. Onderzoekvanbodemmonsters De water-, slib- en grondmonsters werden verzameld ingesteriliseerde flessen of in nieuwe, nog nimmer gebruikte, plastic zakken en kartonnen bekers. Een uitzondering hierop vormden degedroogde grondmonsters, die van de "Stichting voor Bodemkartering" en van de "Rijksdienst voor de IJsselmeerpolders" in afzonderlijke papieren zakjes werden ontvangen. Het materiaal werd bij 4°C bewaard, indien de periode tussen de monstername en enten langer dan 48 uur bedroeg. In de meeste gevallen werd het materiaal binnen 24 uur in vloeibare cultuurmedia geënt. Van elk monster werden minstens 2 cultuurbuizen geënt, waarvoor meestal leverbouillon en CMM werden gekozen; van enkele slibmonsters werden echter 2cultuurbuizen met leverbouillon geënt. Per cultuurbuis werd 3 mlwater of ongeveer 2ggrond of slibgeënt. Vanwatermonsters werd de bovenstaande vloeistof geënt, nadat het zwaardere materiaal naar de bodem was gezakt. Dit bezinksel werd dan als een slibmonster onderzocht, indien 2 g kon worden verzameld. Aanvankelijk werd het materiaal zowel zonder voorafgaande verhitting alsna verhitting gedurende 30 minuten bij 60° en bij 70°C, aan de cultuurmedia toegevoegd. Deze verhitting van het te enten materiaal werd nagelaten, nadat gebleken was dat het aantal isolaties van Cl. botulinum type C na verhitting beduidend minderwas. De geënte media werden gedurende 5 tot 7 dagen bij 30°C geincubeerd en daarna werd de aanwezigheid van Cl. botulinum aangetoond door de culturen te onderzoeken opbotulinumtoxinen (zie 3.2.1. en 3.2.2.). In enkele gevallen konden toxische culturen in eerste instantie niet met voldoende zekerheid worden getypeerd; dit werd soms veroorzaakt door de geringe concentratie van het toxine, in andere gevallen doordat in de met toxine-antitoxine behandelde muizen aspecifieke sterfte optrad. Er werd dan getracht de moeilijkheden op te lossen door uit het oorspronkelijke monster opnieuw een aantal cultuurbuizen te enten met wisselende hoeveelheden materiaal (van 2gtot 0,25 g). 5.2.2.Onderzoek vandieren Het onderzoek naar de aanwezigheid vanCl. botulinum invogels, zoogdieren, vissen en invertebraten werd in principe volgens dezelfde methodiek uitgevoerd alsbij het onderzoek van bodemmonsters. Voor onderzoek werden — tenzij anders is vermeld —alleen kadavers geaccepteerd, waarbij geen of nauwelijks waarneembare bederfverschijnselen 69

aanwezigwaren. Bij het post-mortem werden de kadavers steriel geopend. Hiertoe werd de buik nauwgezet geflambeerd, terwijl de messen en scharen steedsin devlamvan een Bunzenbrander werden gesteriliseerd. De te onderzoeken organen werden lege artisgescheiden verzameld in steriele Petrischalen. Bij watervogels werden van elke poot 1of 2 zwemvliezen verzameld, terwijl bij deandere vogelsen zoogdieren 1of 2tenen met denagel werden onderzocht. Elk zwemvlies of elke teen werd in een afzonderlijk groeimedium overgebracht. Als huidmateriaal werd een stukje buikhuid van ongeveer 2 bij 2 cm verzameld, nadat de grotere dekveren waren verwijderd. Deze dekveren werden somsapart onderzocht. Van het maagdarmkanaal werd de inhoud uit de klier- en spiermaag, uit het middelste gedeelte van de dunne darm en uit het rectum verzameld. Bij vogels met een krop of coeca werd bovendien deinhoud van deze organen onderzocht. Bij kleine vogels kon de inhoud uit de diverse delen van het maagdarmkanaal moeilijk apart worden verzameld. In deze gevallen werd de gehele maag of een darmgedeelte na openknippen in de cultuurbuis overgebracht. Zo mogelijk werd steeds ongeveer 2 ginhoud vanhet maagdarmkanaal in het groeimedium geënt. Ook van de lever, de nieren, de milt en de hartspier werd ongeveer 2gweefsel na fijnknippen aaneen cultuurbuis toegevoegd. Het onderzoek bij zoogdieren (vooral katten en ratten) verliep op dezelfde wijze alsbij vogelsisaangegeven. Bij vissen werden de linker- en rechterkieuwen apart onderzocht en van de digestietractus werden de maag en een darmgedeelte met inhoud in hun geheel overgebracht inhet cultuurmedium. De invertebraten werden meestal in een aparte cultuurbuis onderzocht. Alle maden, poppen, vliegen, kevers, slakken en mosselen werden eerst minstens 5 minuten in een zeef met leidingwater gespoeld. Deintacte invertebraten werden daarna in het cultuurmedium overgebracht en met een entnaald fijngewreven. Alleen van maden en poppen, die vanéén kadaver waren verzameld, werden een aantal (10 tot 20) in een mortier of een Griffith tube fijngewreven, waarna met deze suspensies cultuurmedia werden geënt. Als groeimedium werd bij het onderzoek van deverschillende diersoorten op het voorkomen van Cl. botulinum steeds leverbouillon gebruikt, waarbij per monster één cultuurbuis werd geënt. De leverbouillon werd weer 5 tot 7 dagen bij 30° geïncubeerd en daarna volgens eerder aangegeven methoden onderzocht op de aanwezigheid vanCl. botulinum.

70

5.3.RESULTATEN 5.3.1.Voorkomen van Cl. botulinum indebodemvanNederland In verband met de opzet van het onderzoek werden hoofdzakelijk bodemmonsters onderzocht van plaatsen waar vogelsterfte door botulismus was vastgesteld. Ten einde de gegevens, die bij dit onderzoek werden verkregen, beter te kunnen interpreteren, werd een vergelijkend onderzoek uitgevoerd in gebieden met watervogels waar noggeen botulismusbij watervogels waswaargenomen. De bevindingen van deze gebieden werden vervolgens vergeleken met bodemmonsters die willekeurig over het land verdeeld waren verzameld; deze laatste serie zal dan min of meer een beeld geven van de verspreiding van Cl. botulinum in Nederland. 5.3.1.1. Ingebiedenwaarvogelsterfte doorbotulismus wasvastgesteld Het onderzoek naar het voorkomen van Cl. botulinum werd in augustus 1970 op bescheiden schaal begonnen, nadat in 's-Gravenhage en Hilvarenbeek botulismus was vastgesteld bij watervogels. De water-, slib- en grondmonsters werden verzameld op plaatsen waar de grootste sterfte werd waargenomen. Het bleek dat er soms geen goed onderscheid gemaakt kon worden tussen water en slib bij het verzamelen van de monsters; dit was met name het geval in Hilvarenbeek waar tijdens het waden in ondiep water veel materiaal van de bodem werd opgewerveld. De grondmonsters werden op de roestplaatsen vande wilde eenden verzameld, dicht langs de waterkant. In 1971 en 1972 werden op uitgebreide schaal monsters onderzocht. Het accent werd steeds meer gelegd op onderzoek van slib, omdat dit vaker een positief resultaat bleek op te leveren. De gebieden, waar botulismus was vastgesteld, bleken zeer uitgebreid besmet te zijn met Cl. botulinum type C, zoals uit de verzamelde gegevensvan tabel 14 blijkt; in deze milieu's werd bovendien veelvuldig type Eenenkele keren typeB gevonden (respectievelijk 71,6, 14,4 en 3,9% van het aantal onderzochte monsters). De typen B en E kwamen vaak in combinatie met type C voor in hetzelfde monster; dit is,gelet op de sterke besmetting met type C,zeer goed verklaarbaar. In tabel 14 zijn deze typen afzonderlijk weergegeven, zodat het aantal gevonden toxinetypen hoger isdan het aantal positieve monsters. Type B werd overwegend in grondmonsters van de oeverrand aangetroffen, type E meestal in water- en slibmonsters. Cl. tetani werd eveneens in een aantal grondmonsters aangetoond; uit grond van een eilandje inhet Sarphatipark te Amsterdam kon een toxogene reincultuur 71

Tabel 14 Voorkomen van Cl. botulinum in bodemmonsters afkomstig uit gebieden waar botulismus bij watervogels was vastgesteld. Incidence of Cl.botulinum in soil samples from areas where botulism in waterfowl was diagnosed. Plaatsaanduiding

's-Gravenhage Amsterdam Hilvarenbeek Zuidelijk Flevoland Groningen Leiden/Voorschoten Delft/Nootdorp Loenen a/d Vecht

Aantal onderzochte monsters 84 34 72 15 28 5 8* 11 257

Aantal positieve monsters

Toxinetype

c

B

E

58 31 55 12 22 5 3 7

58 30 55 9 22 4 3 3

0 0 5 2 1 0 0 2

6 7 7 7 1 5 1 3

193 (75,1%)

184 (71,6%)

10 (3,9%)

37 (14,4%)

* Uitsluitend watermonsters

van Cl.tetani worden geisoleerd, nadat in de oorspronkelijke leverbouilloncultuur van dit grondmonster dehoge concentratie van 105 LD 50 per 0,5 mlvan het type C-toxine was aangetoond. De bodemmonsters werden in alle jaargetijden verzameld en het bleek dat er geen duidelijke verschillen waren vast te stellen tussen de percentages positieve monsters. Het onderzoek in Hilvarenbeek van augustus 1970 tot oktober 1972is hiervan een duidelijk voorbeeld (tabel 15). De positieve monsters vanjuni 1971 werden verzameldvoor de eerste botulismusgevallen, die pasinjuli voorkwamen. Dit duidt er op dat de type C-sporen in de winter niet verdwijnen, zodat het milieu tot de volgende zomerperiode besmet blijft. Dat type C in een dergelijk milieu lang aanwezig blijft, bleek ook uit de onderzoekingen in 1972, omdat in dit gebied slechtsenkele botulismusgevallen injuli 1971waren vastgesteld. In gebieden met botulismus bij watervogels werd het slibvan enkele plaatsen quantitatief op de aanwezigheid van Cl. botulinum type C onderzocht. Uit de gegevens van tabel 16 blijkt dat op deze plaatsen het slib zeer intensief was besmet, ook als dit slib één jaar na de laatste gevallen van botulismus werd verzameld (Zuidelijk Flevoland). 72

Tabel 15 Voorkomen van Cl. botulinum in Hilvarenbeek in de verschillende jaargetijden. Incidence of Cl.botulinum in Hilvarenbeek in the different seasons.

Tijdvak

1970, september 1971, juni 1971, juli 1971, november 1972, april 1972, oktober

Aantal onderzochte monsters

Aantal positieve monsters

11 10 23 22 15 3 84

Toxinetype C

B

7 8 19 18 12 3

9 ( 64%) 8 ( 80%) 7 18 ( 82%) 12 ( 80%) 3 (100%)

1

67

55

E

1 5 1

2 2

7

5

N

Tijdens de monj . stername botulismus vastgesteld?

12 -

ja neen ja neen neen neen

12

N.T. =geen onderzoek verricht.

Tabel 16 Quantitatief onderzoek van slib uit gebieden met botulismus op Cl. botulinum type C. Aquantitative examination for Cl.botulinum type C in mud from areas with botulism. SlibVerzamelplaats numm er

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Hilvarenbeek Hilvarenbeek Amsterdam 's-Gravenhage 's-Gravenhage Hilvarenbeek Hilvarenbeek Hilvarenbeek Hilvarenbeek Hilvarenbeek Hilvarenbeek Zuidelijk Flevoland Zuidelijk Flevoland Zuidelijk Flevoland

Datum van bemonstering

1971, juni 1971,juni 1971, januari 1971, november 1971, november 1972, april 1972, april 1972, april 1972, april 1972, april 1972, april 1972, juli 1972, juli 1972, juli

Gewichtshoeveelheid slib die in leverbouillon werd geënt 2g

lg

0,5 g

0,1 g

10-15mg

+ + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + — +

+ + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + — + — + — —

+ = Cl.botulinum type C aangetoond. — = Cl.botulinum type C niet aangetoond.

73

Nadat was vastgesteld dat slib van gebieden met botulismus bij watervogels intensief was besmet met Cl. botulinum - speciaal type C- werd in een volgend onderzoek het voorkomen van Cl. botulinum in de omgeving nagegaan. Dit onderzoek vond plaats in Hilvarenbeek in de omgeving van het zogenaamde Talingputje bij het Goorven op 25 november 1971, dus ongeveer 4 maanden nadat de laatste gevallen van botulismus waren vastgesteld. Dit Talingputje werd gekozen omdat hier zeer veel vogels aan botulismus waren gestorven, terwijl er over een korte afstand een grote variatie in de terreingesteldheid voorkomt. In dit gebied werden op een afstand van ongeveer 20 m slib- en grondmonsters verzameld langs twee raaien, die Noord-Zuid en Oost-West liepen (figuur 1).De monsters werden op 5 cm en op 20 cm diepte verzameld met behulp van een grondboor, waarbij steeds in de periferie werd begonnen en geëindigd werd bij het snijpunt van de twee raaien. Het monster werd met een steriele spatel op de juiste diepte uit het midden vanhet uitgeboorde materiaal genomen.

•XÜÉtMbi.

Foto 4 Talingputje bij het Goorven te Hilvarenbeek. "Talingputje" near the Goorven at Hilvarenbeek.

74

w

Drogewal diedoorhet Talingputje loopt

100m

Fig. 1. Talingputje met raaien waarlangs werd bemonsterd. Resultaten van het onderzoek van de monsters genomen op 5 cm diepte. "Talingputje" showing transects along which soil samples were collected. Results of the examination of samples from a depth of 5 cm. E.t. Sph. M.C. J.b. o

= Erica tetralix. = Sphagnum spec. = Molinia coerulea. = Juncus bufonius. = Juncus effusus.

_=_

C B E

= Moerassig gedeelte. = type C aangetoond = type B = type E »

75

Uit de resultaten blijkt, dat Cl. botulinum type C uitsluitend werd gevonden in het bodemslib van het Talingputje en het Goorven;type Cwerd dus niet meer aangetoond zodra het omgevende heide- en bosachtige terrein met overwegend zandgrond werd bereikt. In 2 grondmonsters, die in dit droge terrein op 5 cm diepte werden genomen, werd wel 2 maal type Baangetoond (W7 en 04); het onderzoek verliep negatief bij de andere 9 monsters.Cl. botulinum type B werd in het gebied van het Talingputje ook 2 maal gevonden;inbeide gevallen echter op drogere plekken van het terrein, nl. op 5cm diepte ineen polJuncus effusus (pitrus N5) en op 20 cm diepte in de droge wal die inhet Talingputje isgelegen (N2). Cl. botulinum type E werd in het bodemslib van het Talingputje en het Goorven 5 maal in de monsters van 5cm diepte - steeds in combinatie met type C - aangetoond (W4, Wl, Zl, 05 en punt C) en 1maal op 20 cmdiepte (Wl). Bij een vergelijking tussen monsters, genomen op 5 en op 20 cm diepte, blijken de meer oppervlakkige monsters 18maal een positief resultaat te hebben opgeleverd tegenover 5 maal bij monsters van 20 cmdiepte (W2,Nl, 03,Z2en punt C). Bij een onderzoek van het profiel in het centrum van het Talingputje werd Cl.botulinum in het zand op 40 en 50 cm diepte niet meer aangetoond. Cl. botulinum —speciaal type C - blijkt dus vooral in de sublaag van deze gebieden voor te komen. 5.3.1.2. In gebieden met veel watervogels, waarin geen vogelsterfte door botulismus wasvastgesteld Dit onderzoek werd in augustus 1971 begonnen, nadat was gebleken dat de gebieden met botulismus bij watervogels zeer uitgebreid en intensief met Cl. botulinum type Cwaren besmet. De onderzochte watergebieden werden geselecteerd op het voorkomen van watervogels aan de hand van de directe waarneming van deze vogels tijdens het bemonsteren of omdat het bekende waterwildreservaten zijn, vaak eigendom van de "Vereniging tot behoud van natuurmonumenten in Nederland" of aanverwante instellingen. De water-, slib- en grondmonsters werden op dezelfde wijze verzameld als vermeld isbij 5.3.1.1.;het aantal slibmonsters domineerde hier eveneens. Van alle onderzoekingen is de datum van monstername vermeld, omdat met de mogelijkheid rekening moest worden gehouden, dat vogels of andere dieren deze gebieden zouden hebben besmet, b.v. vanuit de intensief besmette watergebieden waar botulismus reedswasvoorgekomen. Zoals uit tabel 17 blijkt, werden voor deze veronderstelling geen duidelijke aanwijzingen gevonden. Cl. botulinum type Cbleek zowel in 1971 alsin 1972in deze botulismusvrije gebieden slechts zeer weinig voor te komen (4,1%). De positieve monsters waren bovendien - in vergelijking met slibmonsters uit gebieden met botulismus bij watervogels — licht met type C besmet, zoals het beperkte quantitatieve onderzoek (tabel 18)laat zien. 76

Tabel 17 Voorkomen van Cl. botulinum in bodemmonsters afkomstig uit gebieden met veel watervogels waarin geen vogelsterfte door botulismus was vastgesteld. Incidence of Cl. botulinum in soil samples from areas with concentrations of waterfowl, where no clinical cases of botulism were observed. Datum van de monstername

Plaatsaanduiding

1971, augustus Rotterdam augustus Maassluis september Maasland (Vlietlanden) september Oud-Alblas september Oostelijk Flevoland september Oudenhoorn september Ridderkerk september Utrecht september Vuren september Westland oktober De Bilt oktober Roosendaal oktober Bergen op Zoom oktober Akkrum oktober Vollenhove oktober Zwolle e.o. oktober Callantsoog (Zwanenwater) novembeir Ooststellingwerf 1972, februari Hoek van Holland februari Alphen a/d Rijn april Luntershoek april Heumense vennen mei Zuidelijk Flevoland, punt 26 mei IJsselmeerdijk, Lelystadhaven mei Schiermonnikoog mei Sneekermeer juni Pijnacker juni Lelystad, Bronsweg juli Heiloo augustus Heerjansdam november Rotterdam november Rockanje (Quackjeswater)

Aantal onderzochte monsters

Aantal positieve monsters

16 6

3 0

6 2 3 2 2 2 2 4 2 2 2 2 1 4

0 1 0 0 2 0 0 2 0 0 0 1 0 0

5 1 4 3 3 6

Toxinetype

c

B

E N.T. L.T.

1

_

-

2

-

-

-

1

-

-

-

-

1

-

1

1

1

-

-

-

1

3 0 4 1 1 2

-

-

3

-

4

8

8

1 4 7 1 25 1 1 7

0 2 6 0 8 0 1 1

6

0

141

-

-

-

-

1

1

1 1

_ _

-

-

8

-

-

1

-

-

1 6

_ -

_ -

2

-

7

-

-

-

1

-

-

1

-

-

46 6 8 30 2 1 (32,6%) (4,2%>(5,6%)(21,2%)

N.T. =geen onderzoek verricht. L.T. = muizen, ingespoten met de cultuur van dit monster, vertoonden verschijnselen van botulismus; het toxine kon echter niet worden getypeerd, omdat de toxiciteit van de cultuur genng was en verloren ging.

Tabel 18 Quantitatief onderzoek van slib uit gebieden met watervogels, waar geen sterfte door botulismus was vastgesteld. A quantitative examination for Cl. botulinum type C in mud from areas with waterfowl, where no cases of botulism were diagnosed.

SlibVerzamelplaats nummer

1 2a 2b

Lelystad, Bronsweg Lelystad, Bronsweg Lelystad, Bronsweg

Datum van bemonstering

juni 1972 juni 1972 juni 1972

Gewichtshoeveelheid slib die in leverbouillon werd geënt 2g

lg

+ + +

+

0,5 g

0,1 g 10-15mg

Van de plaatsen waar Cl. botulinum type C voorkwam, kunnen de volgende bijzonderheden worden vermeld. In Rotterdam werd type Cin de Hazelaarsloot te Hillegersberg gevonden, die hoofdzakelijk door eenden wordt bevolkt. Inhet Westland werd type Caangetoond in een kanaal bij Kwintsheul. Dit kanaal staat in verbinding met de's-Gravenhaagseboezem, waartoe ook het verversingskanaal behoort. Er waren slechts weinig watervogels in dit gebied. Bij Heumen kwam type C voor in het Wychense ven, een oude afgesloten rivierarm; ditvenis, evenals de andere vennen bij Heumen, rijk aan vele soorten waterwild. TypeC werd op Schiermonnikoog bij het westelijke strand gevonden in een gebied met enige vegetatie, waar veel bergeenden werden gesignaleerd tijdens de monstername. In het terrein aan de Bronsweg bij Lelystad, dat langs een raai werd bemonsterd, kwam type C 2 maal voor. In dit terrein kwam een grote variatie in de bodemgesteldheid voor, doordat een tamelijk dunne laagzand was gestort op de klei van de vroegere IJsselmeerbodem. In 1971 was hier een kolonie van kapmeeuwen en visdiefjes aanwezig, terwijl ook veel andere vogelsoorten werden waargenomen; type Cwerd binnen deze vogelkolonies gevonden. Cl. botulinum type E werd in dit gebied 7maal aangetoond, steeds in monsters die grotendeels uit kleiwaren samengesteld. Het gebied bij punt 26 in Zuidelijk Flevoland, ten Noorden van de Eem gelegen, was sterk besmet met type E (alle 8 monsters). De oorspronkelijke IJsselmeerbodem blijkt, zoals ook reeds in tabel 14waste zien, opveel plaatsen besmet te zijn met type E; de hierna in deel 5.3.1.3. te beschrijven onderzoekingen zullen dit verder bevestigen. Door het verhoudingsgewijs vrij grote aantal monsters uit Oostelijk en Zuidelijk Flevoland is het percentage monsters met type E(20,4%)vrij hoog uitgevallen. Uit dit onderdeel van het onderzoek blijkt dat Cl. botulinum type Ben Ein de gebieden met watervogels waar geen vogelsterfte door botulismus was 78

vastgesteld, ongeveer even vaak werd gevonden als in de gebieden waar wel botulismus bij watervogels was voorgekomen. Het grote verschil is echter dat type Cin de eerstgenoemde gebieden weinig voorkwam (4,1%). maar uitgebreid en intensief bleek voor te komen in de gebieden met botulismus bij watervogels (71,6%).

5.3.1.3.In willekeurige bodemmonsters Voor dit onderdeel van het onderzoek werden vanaf augustus 1971 slib- en grondmonsters op verschillende plaatsen in Nederland verzameld. Deze bodemmonsters waren samengesteld uit verschillende grondsoorten, zowel afkomstig van gerijpte als van ongerijpte gronden; het waren verder gebieden waar tijdens het bemonsteren geen watervogels werden gezien, terwijl de situatie van het terrein er op wees dat concentraties van watervogels ook niet waren te verwachten. Deresultaten zijn samengevat in tabel 19. Dit onderzoek werd aangevuld met 203 grondmonsters van de "Stichting voor Bodemkartering" te Wageningen. Demeeste monsters (169) waren voorjuli 1970 verzameld en gaven dus een indruk van de situatie voordat botulismus bij watervogels was vastgesteld; de 34 resterende monsters waren later verzameld, van november 1970 tot januari 1972. De grond was vanaf het moment van de monstername droog bewaard bij kamertemperatuur en de resultaten van dit onderzoek zijn daarom apart weergegeven (tabel 20). Cl. botulinum type C kon, zoals uit de tabellen 19 en 20 blijkt, slechts in enkele gebieden in de bodem worden aangetoond. Het monster bij Windesheim (Overijssel) bestond uit slib van een smalle sloot. Uit het onderzoek van de collectie monsters van de "Stichting voor Bodemkartering" (Stiboka) blijkt verder dat type Cvóór het massaal optreden van botulismus bij watervogels ook reeds in de bodem van Nederland voorkwam, nl.in 4,1%van het aantal monsters. De plaatsen, waarin type Cvoor 1970werd gevonden, waren gerijpte gronden in Denekamp, Diepenveen, Milsbeek, Ruurlo en Weerselo en ongerijpte gronden (2 maal) in Oude Zeug(N.H.). In een bodemmonster, dat door Stiboka in Ruurlo werd verzameld, werd voor de eerste maalCl. botulinum type Aaangetoond (tabel 20).Dit toxinetype werd daarna niet meer gevonden, zodat kan worden vastgesteld dat type A in Nederland veelminder frequent voorkomt dan de typen B,Cen E. In tabel 19 valt verder het hoge percentage monsters met Cl. botulinum type E op. Bij nadere analyse blijken deze gebieden vooral in het voormalige IJsselmeer te liggen; dit gebied blijkt dus, zoals reeds eerder werd gesteld, sterk besmet te zijn met type E. Invergelijkbare maritieme gebieden alsde Waddenzee en de Lauwerszee, werd type E eveneens gevonden. Type E werd ook aangetoond in 4 van 68 bodemmonsters, die door de "Rijksdienst voor de IJsselmeerpolders" in Oostelijk en Zuidelijk Flevoland waren verzameld, voordat 79

Tabel 19 Onderzoek van bodemmonsters op Cl. botulinum, verzameld vanaf augustus 1971. Examination for Cl. botulinum in soil samples, collected from August, 1971onwards.

Plaatsaanduiding

Akkrum Amersfoort Appelsga Boskoop Gilze-Rijen Groningen Heino Hilvarenbeek Lauwerszee Luntershoek Rhedensche heide Nunspeet Rotterdam Schiermonnikoog, duinen Schiermonnikoog,wad Ulvenhout Veluwe (oerbank) Vollenhove Windesheim (0)

Aantal onderzochte monsters

Aantal positieve monsters

1 2 2 1 2 3 1 24 4 3 3 2 4

0 1 0 0 0 0 1 2 2 0 0 0 0

2 2

4 3

0 2 1 0 1 1 0 0 1 0 0 3

_ -

8 8

0 0

10

2

Wvhp wyiic

Usselstein Willemstad Zwinderen Zeist Scheveningen Valkenswaard, visvijvers Liskes, visvijvers Valkenhorst, visvijvers Lelystad, kavel 98en99 Lelystad, visvijvers

Toxinetype C

B

E

-

_ 1 2

_ —

_ —

-

-

-

1

-

1

-

'_

2

2

1

-

1

— -

I

3

_ -

_ -

-

-

-

-

0

-

-

-

-

17 20

11 13

-

1

-

10 13

-• -

135

39 (28,8%)

1 (0,7%)

9 (6,6%)

28 (20,7%)

1

1

-

L.T. = muizen, ingespoten met de cultuur van dit monster, vertoonden verschijnselen van botulismus; het toxine kon echter niet worden getypeerd, omdat detoxiciteit vande cultuur gering wasenverloren ging.

80

L.T.

Tabel 20 Onderzoek van bodemmonsters opCl. botulinum, door de "Stichting voor bodemkartering" vanaf 1953verzameld endroogbewaard bij kamertemperatuur. Examination for Cl. botulinum in soil samples, collected and preserved by the "Stichting voor bodemkartering" from 1953onwards.

Jaar van monstername

1953 1954 1955 1957 1958 1964 1965 1969 1970 1971 1972

Aantal onderzochte monsters 20 19 50 3 10 3 22 42 6 23 5 203

Aantal positieve monsters 4 3 4 1 0 3 0 4 0 2* 0 21 (10,3%)

Toxinetype C

B

E

A

_ -

4 3 2

_ ~ -

_ -

2 1

-

-

2

1

-

-

2

1

1

1

-

-

1 (0,5%)

1

2

--

-

-

8 (3,9%)

13 (6,4%)

1 (0,5%)

'• In 1grondmonster werd, ook bijherhaling,zowel type B alstypeCaangetoond.

het IJsselmeer droogviel;type Ewashier dusalaanwezig,voor dat de rijping van deze sedimentatiegronden begon. Het relatief lage percentage (5,9%) ismisschien te verklaren door het feit dat deze monsters in gedroogde toestand waren bewaard. In de 203 droog bewaarde monsters van "Stiboka" werd type E immers ook slechts 1maal aangetoond, nl.in een bodemmonster dat in 1969 bij Sittard was genomen. Dit wekt de indruk dat debacteriesporen van type Etegen deze wijze van bewaren minder goed bestand zijn dan de sporen van type B enC, die immers nog in bodemmonsters van 19 respectievelijk 18 jaar oud werden aangetoond. De tabellen 19 en 20 laten verder zien dat het percentage monsters, waarin type B voorkwam, overeenkomt met de percentages die in de gebieden met watervogels werden gevonden (tabellen 14en 17). De geographische spreiding van Cl.botulinum in willekeurige grondmonsters is weergegeven in tabel 21;hieruit isde normale situatie in Nederland af te lezen zonder dat deze beïnvloed werd door botulismusuitbraken. Het blijkt dat, met inachtname van het ongelijk aantal monsters per provincie, de verdeling in Nederland betrekkelijk gelijkmatig is te noemen, met uitzondering van Oostelijk en Zuidelijk Flevoland, waar Cl. botulinum type E relatief frequent werd gevonden. w.

Tabel 21 Geografische spreiding van Cl. botulinum in Nederland in willekeurige bodemmonsters. Geographie distribution of Cl. botulinum in soil samples throughout the Netherlands. Provincie

Aantal onderzochte monsters

Friesland Groningen Drente Overijssel Gelderland Utrecht N.-Holland Z.-Holland Zeeland N.-Brabant Limburg 0. en Z. Flevoland

Aantal positieve monsters

Toxiinetype

c

B

E

A

9 6 14 56 59 8 42 14 11 75 7 37

3 1 3 8 6 1* 3 3 0 7 3 24

0 0 0 4 2 0 2 0

0 0 3 3 3 0 1 3

3 1 0 1 0 0 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0

-

-

-

-

0 1 0

7 1 1

0 1 23

0 0 0

338

62 (18,3%)

9 (2,7%)

22 (6,5%)

29 (8,6%)

1 (0,3%)

* L.T. (zie onder tabel 17).

Als bijzonderheid kan tenslotte nog worden vermeld dat bij de gevolgde methode van onderzoek Cl.tetani ook 11maal (5,4%)werd gevonden in de 203 bodemmonsters van "Stiboka". Bij een meer op de isolatie van Cl. tetani gerichte methode van onderzoek had dit percentage zeker noghoger kunnen uitvallen. 5.3.2.VoorkomenvanCl. botulinum bijdieren Als leidraad bij het onderzoek naar het voorkomen van Cl. botulinum bij dieren diende de betekenis, die deze dieren — zowel vertebraten als invertebraten zouden kunnen hebben bij de etiologie en epidemiologie van botulismus bij watervogels. Daarom werden in eerste instantie vogelsonderzocht die aan botulismus leden of waren gestorven. Dit onderzoek werd later in de gebieden waar botulismus was vastgesteld, uitgebreid met het onderzoek van vogels die aan intercurrente oorzaken waren gestorven en van normale,gezonde watervogels. Deze resultaten werden vergeleken met het onderzoek vanvogelsuit gebieden waargeen botulismus wasvastgesteld. In dit deel van het onderzoek werden ook enkele zoogdieren betrokken, in 82

het bijzonder katten en ratten, omdat van deze dieren bekend is dat zij een rol spelen bij het optreden van botulismus bij andere dieren als b.v. paarden en runderen. In sommige gebieden trad vissterfte op in een periode dat botulismus bij watervogels voorkwam. Dit werd de aanleiding ook vissen in het onderzoek te betrekken. Verder werden veel invertebraten als maden, poppen, zoöphage vliegen en andere insecten als ook verschillende weekdieren om uiteenlopende redenen op G. botulinum onderzocht. 5.3.2.1. Bijvogels,afkomstig uitgebieden waarbotulismus wasvastgesteld Dit onderzoek ving aan in 1970 bij 9 watervogels (4 wilde eenden, 3 wintertalingen, 1 slobeend en 1 kuifeend), die in Hilvarenbeek aan botulismus waren gestorven. Bij deze vogels kon Cl. botulinum in de lever en in de dunne darm niet worden aangetoond. Dit resultaat suggereerde dat bij botulismus van watervogels sprake zou zijn van een intoxicatie, waarbij geen of althans niet meer aantoonbare aantallen kiemen of sporen van Cl. botulinum zouden worden opgenomen. Deze bevindingen weken echter af van degegevensdie inde Verenigde Staten bij "Western duck sickness"waren verzameld;het onderzoek van watervogels op Cl. botulinum werd daarom in 1971 en 1972 voortgezet. Aanvankelijk werden in 1971 alleen de lever en de dunne darm onderzocht van 34 watervogels (20 wilde eenden, 7wintertalingen, 3kapmeeuwen. 1zwaan, 1 nijlgans, 1 meerkoet en 1 kuifeend), die in Hilvarenbeek, 's-Gravenhage en Zuidelijk Flevoland aan botulismus waren gestorven of in het eindstadium van de ziekte verkeerden. Cl.botulinum werd nu wel gevonden bij deze vogels;tabel 22 laat zien dat het percentage positieve bevindingen bij aan botulismus gestorven

Tabel 22 Onderzoek van watervogels met botulismus op Cl. botulinum ;onderzoek in 1971. Examination for Cl. botulinum in 1971 in waterfowl that were suffering from botulism or had died.

Lever Onderzocht Aan botulismus lijdende watervogels Aan botulismus gestorven watervogels

Dunne darm

positief

% Onderzocht

positief

4

0

0

11

6

55

16

9

56

19

14

74

83

watervogels hoger lagdan bij aan botulismus lijdende vogels. Bij typering werdin alle gevallen type Cgevonden. Deze resultaten werden de aanleiding het onderzoek verder uit te breiden, waarbij van een groot aantal vogels veel meer organen opCl. botulinum werden onderzocht, ten einde derol die dezevogelsbij de etiologie en epidemiologie van botulismus spelen, nader te kunnen analyseren. Het onderzoek beperkte zich niet tot watervogels waarbij het onderzoek op botulismus positief verliep,maar er werden nu ook intercurrente sterfgevallen en gezonde vogels in onderzoek genomen. De watervogels met botulismus waren afkomstig uit Amsterdam, Groningen, 's-Gravenhage, Loenen aan de Vecht, Delft/Nootdorp en Leiden/Voorschoten. Er werden geen verschillen vastgesteld tussen de onderzochte vogels van deze uiteenlopende gebieden. Er werden per vogel 11 organen onderzocht en het bleek dat deze botulismuspatiënten vaak zeer uitgebreid besmet waren met Cl. botulinum (tabel 23). Cl. botulinum kon bij 22 botulismuspatiënten (43%) in de parenchymateuze organen + hartspier en bij 40 gevallen (78%) in de digestietractus worden aangetoond; in totaal waren 45 patiënten (88%) in één of meer inwendige organen en 36 (71%) uitwendig - op dezwemvliezen en buikhuid - besmet. Dit betekent dat een zeer hoog percentage van de botulismuspatiënten bij de etiologie en epidemiologie van botulismus een belangrijke rol kunnen spelen.De kadavers van deze vogels zullen immers in belangrijke mate bijdragen tot de contaminatie van de bodem met Cl.botulinum, terwijl met name elk inwendig besmet kadaver een potentiële nieuwe toxinebron is,waarmede de cyclusvan de ziekte kan worden gecontinueerd. Het werkelijke verloop van de botulismusuitbraak zal verder sterk afhankelijk zijnvandiverseecologische omstandigheden, waarvan de omgevingstemperatuur vermoedelijk de belangrijkste factor is (hoofdstuk 9). Bij 22 botulismuspatiënten (43%) werd Cl. botulinum dus minstens in één van de parenchymateuze organen + hartspier aangetroffen; bij 4 wilde eenden, waaronder een levend voor onderzoek ontvangen wilde eend, waren zelfs alle 4 organen positief. Van deze 22 botulismusgevallen waren 6 watervogels levend aangevoerd, zodat het onderzoek op Cl. botulinum onmiddellijk na de euthanasie plaatsvond. De resultaten van het onderzoek van deze groep botulismusgevallen, in het bijzonder van de groep van de 6 hiervoor genoemde levend aangevoerde vogels, duiden er op dat Cl. botulinum, in tegenstelling tot de veel verbreide mening, wel invasieve eigenschappen zou kunnen bezitten waarbij het micro-organisme zich soms reeds ante mortem in het lichaam verspreidt. Erkon niet worden vastgesteld in welke mate tijdens de agonie een verspreiding van Cl. botulinum plaatsvond vanuit de digestietractus. Deze mogelijkheid waszeker aanwezig, omdat bij 40 botulismuspatiënten (78%) de digestietractus met 84

Tabel 23 Voorkomen van Cl. botulinum bij watervogels, afkomstig uit gebeden waar botulismus was vastgesteld. Incidence of Cl. botulinum in waterfowl from areas where botulism was diagnosed. Aantal onderzo hte

Aantal gevallen waarin Cl. botulinum werd gevonden Lever

Milt

Nier

10 2 1 1 0

6 3

8b)

-

Hart

Slokdarm

2

6 1

6 3

17 ia)

-

-

-

1 0 0

vogels

A. Botulismuspatiënten Wilde eend Knobbelzwaan Grauwe gans Meerkoet Blauwe reiger

41 6 2 1 1

0

0

0

0

Maag Dunne Coeca da m

19 4 2 0 0

24 4 2 0

Rec- Tenen Buik- Par. Diges- Uittum of huid Org.+ tiewenzw.vl. hart tractus dig

2ib) 4 2 0 0

25c ' b ) 1 3 3 5 2 1 0 0

51

B. Intercurrente ziektegevallen Wilde eend Kuifeend Meerkoet Kapmeeuw Andere vogels

11 2 1 10 13

6 7 14 1 4

33 5 2 0 0

29 5 2 0

36 22 40 (43%) (78%) (71%)

2 0 0 0 1

0

2

0

0

-

-

-

-

0 0

0 0

0

-

0 0

2 0 0 0 3

2 0 0 0 3

2a)

0 0

-

2 0 0 0 3

3 0 0 2 0

1 0 0 0 1

37

C. Gezonde vogels Wilde eend Meerkoet Kapmeeuw Fuut Andere vogels

18 2 1 1 0

2 0 0 0 1 3 (8%)

1 2 5 0 3

-

1 0

2 0

0

1 1 1 0 0

0 0 1 0 1

1 1 1 1 0

0 3

-

1 0

2 1 0 1 1

1 3 0 0 2 c)

2 3 2 0 1

32

1 2 5 0 3

6 0 0 0 6

3 0 0 2 1

12 6 (32%) (16%)

3 5 2 1 1

2 4 2 0 2

11 10 12 (34%) (37%) (31%)

—: niet onderzocht. Parorg.=paren hymateuze rganen. Zw.vl = zwemvlezen onderzoek van inker en echterpoot bij elkaar geteld. Inallegevallen werd Cl. botulinum typ' Caangetoond behalve: a) Cl. botulinum type B1maalinde maagvan een zwaan en 1maalindecoeca van een wildeeend aangetoond. b) Clbotulinum type E 1maalindenier hetre;tum enop dezwemvhezenvan beide poten vaneen wilde eend aangetoond. c) Bovendien werd Cl. tetaniop depoten van een wilde eend en een kraai aangetoond.

Cl. botulinum besmet bleek tezijn. Het hoge percentage watervogels, waarbij Cl. botulinum opde zwemvliezenof buikhuid konworden aangetoond, is verklaarbaar omdat bijeerder onderzoek reeds wasvastgesteld dat de bodem vande gebieden waar botulismus optrad, intensief besmet wasmet Cl. botulinum (tabel 14). Bij detypering, dievan alle positieve culturen werd uitgevoerd, bleek inbijna alle gevallen Cl. botulinum type Caanwezigtezijn. In2gevallen werd echter een ander toxinetype aangetoond, nl. bij een zwaan uitAmsterdam, waarbij in de 85

maag Cl. botulinum type B werd gevonden en bij een wilde eend uit 's-Gravenhage waarbij in de nier, het rectum en op de zwemvliezen van beide poten Cl. botulinum type E voorkwam. Bij de zwaan bleek elders in de digestietractus (dunne darm, coecum en rectum) wel Cl. botulinum type C aanwezig te zijn. Bij dewilde eend werd Cl. botulinum type Cniet aangetroffen, hoewel deze eend aan het botulinumtoxine type Cwasgestorven. Bij voortgezet onderzoek kon met reeds eerder beschreven methodieken Cl.botulinum typeE in reincultuur worden geïsoleerd uit de sterk verontreinigde oorspronkelijke leverbouilloncultuur van de nier van deze eend. Cl. botulinum type Ben typeE lijken verder bij de epidemiologie en de etiologie vanbotulismus bij watervogels geen rol van betekenis te spelen. Er dient hier echter reeds de aandacht te worden gevestigd op het feit dat de besmetting van botulismuspatiënten met de typen B en E uit oogpunt van de volksgezondheid als een zeer ongewenste situatie is te beschouwen; in de kadavers van deze vogels is immers een postmortale productie van B- en E-toxine mogelijk, terwijl tevens een ernstige contaminatie kan optreden vanhet milieumet de sporenvanCl. botulinum type Ben E. Een belangwekkende vraag is verder hoe lang watervogels besmet kunnen blijven met Cl. botulinum type C. Er werd getracht eniginzicht in dit probleem te verkrijgen door een onderzoek van 10 wilde eenden, die als botulismuspatiënten uit Delft/Nootdorp werden ontvangen. Dat deze eenden aan botulismus leden, werd bevestigd door onderzoek van de 4ernstigste ziektegevallen van deze groep. De resterende 6 minder zieke eenden werden in een stal ondergebracht, die dagelijks grondig werd schoongemaakt. De eenden, die de beschikking hadden over korrelvoer en leidingwater, werden na 3 tot 13 dagen onderzocht opCl. botulinum (tabel 24). Uit het onderzoek blijkt dat wilde eenden, die aan botulismus leden, nog minstens gedurende 2 weken besmet blijven met Cl. botulinum type C. Er schijnen bovendien individuele verschillen voor te komen, zoals blijkt uit de vergelijking van de eenden 3 en 4 met de eenden 5en 6. Bij de laatste 2 eenden waren klinisch geen ziekteverschijnselen meer vast te stellen, zodat deze eenden dusalsklinisch gezonde smetstofdragers waren te beschouwen. Zoals uit tabel 23 blijkt, werd Cl. botulinum ook bij de intercurrente ziektegevallen gevonden.Dewatervogelsvandeze groepwaren meestal afkomstig uit watergebieden waar ten tijde van het onderzoek botulismus heerste, zoals 's-Gravenhage en Amsterdam — waar de meeste gevallen vandaan kwamen — en Groningen, Zuidelijk Flevoland en Loenen aan deVecht. Alleen in Hilvarenbeek waren gedurende de laatste 9 maanden geen gevallen van botulismus meer vastgesteld. De groep "andere vogels" (tabel 23 ad B), die verzameld was in parken en 86

Tabel24 Onderzoek van herstellende botulismuspatiënten opCl. botulinum typeC. Examination of waterfowl recovering from botulism for Cl. botulinum typeC.

Eend Proefdag Lever

1 2 3 4 5 6

n.t.

3 4 5 6 10 13

Onderzoek op Cl. botulinum van Milt

Nier

Hart

Slok- Maag darm

— —

—

— —

+

—

—

-

+

-

—

+

+

+

— —

+ +

—

+

n.t.

—

—

+ +

+

+

+

-

—

—

—

—

—

Dunne Coeca Rec- Zwem- Buik- Aantal tum vlie- huid positieve darm zen organen

+

+ + — —

—

+ + —

3 5 0 0 7 3

Cl.botulinum type Caangetoond. Onderzoek verliep negatief, geen onderzoek verricht.

plantsoenen te 's-Gravenhage, bestond uit 1 lijster, 1 vink, 1 fazant en 10 spreeuwen. Bij alle vogels verliep het onderzoek op het botulinumtoxine negatief. In de meeste gevallen kon wel een andere ziekte-oorzaak worden aangetoond, zoals een infectie met P.multocida (bij de spreeuwen), pseudotuberculosis, aspergillosis, pericarditis, jicht, loodintoxicatie door hagelkorrels, corpus alienum en cachexie.Het percentage gevallen, waarbij Cl. botulinum werd gevonden, is duidelijk lager dan bij de groep van de botulismuspatiënten. Het voorkomen van Cl. botulinum op de zwemvliezen en dehuid waste verwachten, nadat was aangetoond in welke mate deze gebieden met Cl. botulinum zijn besmet (tabel 14). Het vrij hoge percentage vogels(32%)met Cl. botulinum in de digestietractus is om dezelfde reden plausibel. Verder zou de aanwezigheid van Cl.botulinum in parenchymateuze organen (8%) er weer op kunnen wijzen dat dit micro-organisme invasieve eigenschappen bezit. De Cl. botulinum-cultuien werden in bijna alle gevallen alstype Cgetypeerd; er was slechts één uitzondering, nl. de cultuur uit eenvan de coeca van een wilde eend uit 's-Gravenhage, waarin type Baanwezig bleek te zijn. Uit het onderzoek blijkt dat, naast botulismuspatiënten, ook vogels die aan intercurrente ziekten lijden, een rol kunnen spelen in de verspreiding van Cl. botulinum type C naar nog onbesmette gebieden. Uit de gebieden, waarbotulismusbij watervogelswasopgetreden, werden ook gezonde vogels onderzocht op het voorkomen van Cl. botulinum. Alle vogels waren afkomstig uit 's-Gravenhage, uitgezonderd de fuut en dekapmeeuwen, die 87

resp. uit Delft/Nootdorp en Hilvarenbeekkwamen Vijf meerkoeten, vier eenden en de fuut werden levend ontvangen, zodat het onderzoek onmiddellijk na de euthanasie kon worden verricht De overige vogels werden voor d't onderzoek door jagers geschoten en daarna binnen 24 uur onderzocht. De groep "andere vogels"bestond uit 2fazanten, 1zwarte kraai en 1 kauw De resultaten van het onderzoek zijn in tab"l 23 ad Cweergegeven. Het blijkt dat in de gebieden, waar botulismus voorkwam, een hoog percentage van de gezonde vogels — speciaal van de watervogels — besmet was met Cl. botulinum type C. Deze gezonde smetstofdragers zullen daarom eveneens een belangrijke rol kunnen spelen in de epidemiologie van botulismus bij watervogels. Cl. botulinum type C kan door deze vogels immers gemakkel'jk naar onbesmette gebieden worden verspreid, terwijl bij intercurrente sterfte dekadavers van deze vogels een potentiële bron vanhet botuhnumtoxine zijn. Dezemogelijkheid doet zich ook nog een jaar na het optreden van de laatste botuhsmusgevallen voor, zoals blijkt uit het onderzoek van dekapmeeuwen in Hilvarenbeek, dat in meien juni 1972 plaatsvond. De laatste geval'en van botuismus waren nl. in juli en augustus 1971 voorgekomen, zodat via deze gezonde smetstofdragers botulismus in een volgende zomer bij bepaalde ecologische omstandigheden kan recidiveren. Het hoge percentage gezonde smetstofdragers in een vogelpopulatie, afkomstig uit een gebied waar botulismus wasvastgesteld, istevens het motief geweest op grond waarvan bij het diagnostisch onderzoek geenbetekenis werd toegekend aanhet voorkomen vanCl. botulinum (4.2 1.) 5.3.2.2. Bij vogels, afkomstig uit gebieden waarbotulismus niet was vastgesteld Nadat was aangetoond dat ingebieden, waar botulismus was opgetreden,veel vogels besmet waren met Cl. botulinum, werd in 1972 getracht eveneens een onderzoek in te stellen bij vogelsdiewaarschijnlijk niet in contact waren geweest met debotulismusgebieden. Deze laatste voorwaarde bleek de mogelijkheden van het onderzoek aanzienlijk te beperken, omdat nu vogelsuit andere delen vanhet land, zo ver mogelijk van de botulismusgebieden gelegen, moesten worden onderzocht. Het bleek aanvankelijk zeer moeilijk te zijn voldoende van deze vogels voor onderzoek ter beschikking te krijgen (tabel 25 ad A). Zodoende werden ook vogels voor onderzoek geaccepteerd, afkomstig van plaatsen die soms zelfs betrekkelijk dicht bij de botulismusgebieden waren gelegen. Vogels die binnen een arbitrair ingestelde afstand van 20km van de botulismusgebieden afkomstig waren, zijn daarom in tabel 25 apart vermeld. In deze tabel iseveneens apart vermeld het onderzoek van een grote groepvogelsdie afkomstig waren uit een kolonie vankapmeeuwen en visdiefjes in de omgevingvan Lelystad. Bij alle vogels verliep het onderzoek op botulismus negatief, zodat het hier ook intercurrente sterfgevallen betrof. Bij de vogels van Poortugaal werd een parathionvergiftiging vastgesteld (afd. toxicologie), terwijl aspergillosis, acuut trauma of cachexie bij demeeste andere vogels de doodsoorzaak bleek te zijn. 88

<SP

Fig. 2. Gebieden met ernstige botulismusuitbraken Gebieden met minder ernstige botulismusuitbraken, genoemd in tabel 13. Herkomst vogels van onderzoek op Cl. botulinum, genoemd in tabel 25,groep A. » » » » „ i> » » tabel 25, groep B. = Lelystad. Areas with serious outbreaks of botulism. Areas with less serious outbreaks ot botulism mentioned in tabel 13. Origin of birds examined for CI. botulinum, mentioned in table 25,group A. >> •• •• •• •• table 25 group B. = Lelystad.

Tabel 25 Voorkomen van Cl. botulinum bij vogels, afkomstig uit gebieden waar botulismus niet was vastgesteld. Incidence of Cl.botulinum in birds from botulism-free areas.

Plaats van herkomst

A. Buiten straal van 20 km Dalfsen Yerseke Alkmaar Schiermonnikoog Jutphaas Harderwijk Zwolle Ameland

B. Binnen straal van 20 km Naaldwijk Vlaardingen Schiedam Poortugaal

Aantal waarbij Cl. botulinum type C werd aangetoond

7 wilde eenden 4 wilde eenden 2 wilde eend 1 wilde eend 1 waterhoen 1 kapmeeuw 19a) 2 b)

0 0 0 0 0 0 3 0

37

3

1 wilde eend 1 wilde eend 13d)

0 1 0 11

17

12

2 c)

e

C. Lelystad

n.t. : Par.org.: Zw.vl. : a) b) c) d) e)

Soort en aantal onderzochte vogels

39 >

2

Cl. botulinum aangetoond in

Bijzonderheden

Par.org.

Digestietractus

Zw.vl. + buikhuid

0 0 1 0 0 0 2 0

0 0 0 0 0 0 2 0

0 0 1 0 0 0 0 0

n.t. 1 0 9

0 1 0 8

n.t. 1 0 6

2

3

1

Een eend met type E. Cl. tetani op de huid. 2 kolganzen en 1meerkoet met type C

{ 1 meerkoet met type B.

Een reiger met type C en E. Diverse vogels met type C.

Een kapmeeuw met type B. Een stormmeeuw met type Cen E. Een kapmeeuw met type C. Een kolgans met type B.

niet onderzocht. parenchymateuze organen. zwemvliezen; onderzoek van linker- en rechterpoot bij elkaar geteld. 12 meerkoeten, •kolganzen, 1rietgansen 2 torenvalken 1eidereend en 1 rotgans. 1wilde eend en blauwe reiger 1wilde eend, 1waterral, 1 leeuwerik, 1 fazant, 1 merel, rietgors, 1 spreeuw, 2vinken, 2 huismussen en 2 ringmussen. 2 dodaarzen, 1 kluut, 1 fazant, 1scholekster, 1stormmeeuw, 1 graspieper, 17 kapmeeuwen 7 visdiefjes, 2 houtduiven, 2 kolganzen 1 spreeuw, 1grauwe gans, 1goudplevier en 1ongedetermineerde vogel.

De resultaten van dit onderzoek (tabel 25) dienen voorzichtig te worden geïnterpreteerd omdat de meeste vogels zich, vooral tijdens de trek, over grote afstanden kunnen verplaatsen. Bij de watervogels van groep A werd Cl.botulinum type C 3 maal (8,1%) gevonden: bij 2kolganzen in de lever respectievelijk in een der coeca en bij een meerkoet in de lever, dehartspier en de nieren. In de hartspier en op de huid van een eend uit Alkmaar werd bovendien type E aangetoond en in één der coecavan een meerkoet uit Zwolle type B. Het gebied waar de vogels uit groep C werden verzameld, lag binnen de arbitrair ingestelde afstand van 20 km, gerekend vanaf de plaatsen waar eenjaar eerder (1971) in Zuidelijk Flevoland botulismus was opgetreden. De vogels van dit gebied bij Lelystad zijn in tabel 25 apart van de groepen A en Bvermeld, 90

omdat daar in 1972 veel onderzoek werd verricht, waarbij dit terrein achteraf kan worden beschouwd als een controlegebied met veel watervogels zonder dat er botulismus is opgetreden. In groep Cwerd Cl botulinum type C slechts bij twee vogels (5,1%) in een orgaan aangetoond, nl. eenmaal in de lever van een jonge kapmeeuw en eenmaal in de hartspier van een stormmeeuw. Bij dezelfde stormmeeuw werd Cl.botulinum type E eveneens aangetoond in de maag, de dunne darm en het rectum. Verder werd bij deze groep Cl. botulinum type B gevonden in de maag van een kapmeeuw en bij een kolgans inhet rectum en op een der zwemvliezen. Bij de populatie vogelsuit dit gebied bleek type Cduseven vaak aanwezig te zijn als de typen Ben E. Dit vormt het grote verschil met de vogels, afkomstig uit de gebieden waar botulismus was vastgesteld; bij deze populatie vogelsdomineerde immerstype Cheel duidelijk (tabel 23). Uit deze resultaten (tabel 25, groep A en C) mag met enige reserve worden geconcludeerd, dat vogels slechts sporadisch met Cl. botulinum type C zijn besmet, indien deze vogels geen contact hebben gehad met de botulismusgebieden. Een onderzoek van watervogels, verzameld voor het optreden van botulismus in 1970,zou deze conclusie belangrijk hebben kunnen ondersteunen. De resultaten van het onderzoek van de vogelsuit groep B(tabel 25) moeten onder veel voorbehoud worden gehanteerd. Het wasimmers niet meer na te gaan in hoeverre deze vogels in contact waren geweest met de nabij gelegen botulismusgebieden. Van de groep vogels uit Poortugaal zou men dit haast wel verwachten; het percentage met type C besmette vogels was niet alleen hoog (85%), maar pervogelbleken ook veel organen positief te zijn. Alleen bij detwee ringmussenkon Cl. botulinum type C niet worden aangetoond. Degroepvogels uit Poortugaal was aan een acute parathionvergiftiging gestorven, zodat in feite gesteld mag worden dat deze vogels voor hun dood gezonde smetstofdragers waren. Uit de lever van de wilde eend werd volgens eerder beschreven technieken (3.2.2.2.) een reincultuur vanCl. botulinum type Cverkregen, die de eigenschappen van eennormale, toxogene stam bleek te bezitten. 5.3.2.3. Bijdiversezoogdieren Deze groep dieren werd onderzocht om de kennis van het voorkomen van Cl. botulinum in Nederland te vergroten, mede in verband met de etiologie en epidemiologie vanbotulismus bij watervogels. Ratten werden in het onderzoek betrokken omdat op twee plaatsen — 's-Gravenhage en Loenen aan deVecht — waswaargenomen dat deze dieren kort voor of tijdens het optreden van botulismus bij watervogels waren verdwenen. Alleratten werden levend gevangen. Katten werden onderzocht omdat deze dieren in verband worden gebracht 91

met het optreden van botulismus bij paarden en runderen;het botulinumtoxine zou meestal gevormd worden in het kadaver van een kat, die in het hooi of in kuilvoer was terechtgekomen. Deze veronderstelling kan alleen juist zijn, indien een gedeelte van de kattenpopulatie besmet is met Cl. botulinum type C. De katten werden onderzocht nadat zij aan andere ziekten waren gestorven. Enkele konijnen en een haas werden in onderzoek genomen, omdat deze in het buitenland wel worden genoemd als de bron van het botulinumtoxine, o.a bij botulismus van fazanten. Uit tabel 26 blijkt dat bij deze zoogdieren verscheidene smetstofdragers voorkwamen, waarbij Cl. botulinum zowel in de parenchymateuze organen alsin de digestietractus werd aangetroffen. Het is opvallend dat uitsluitend Cl botulinum type Cwerd aangetroffen. Bij bisamratten werd Cl. botulinum type C ook op de huid en de poten aangetoond, een bevinding die in verband met de leefwijze van deze dieren wel plausibel is te noemen. De besmette bisamrat uit Hilvarenbeek werd in de omgevingvanhet Goorven geschoten. Uit de levervan debruine rat uit Lelystad, debisamrat uit Hilvarenbeek en de haas uit Poortugaal werden reinculturen van Cl. botulinum type C geïsoleerd volgens reeds eerder beschreven methodieken (3.2.2.2.), deze culturen bleken normale toxogene eigenschappen te bezitten. 5.3.2.4 Bij vissen In augustus 1971 kwam in het verversingskanaal te 's-Gravenhage vissterfte voor, hetgeen leidde tot een locale ophoping van dode vissen. De sterfte werd toegeschreven aan de slechte kwaliteit van het water, in het bijzonder aan het lage zuurstofgehalte. Een aantal dode vissen werd op Cl. botulinum onderzocht, omdat deze een gunstig groeisubstraat voor dit micro-organisme zouden kunnen vormen. Het onderzoek werd 'n 1972 voortgezet met enkele vissen die dood in het Flevomeer werden gevonden, langs de dijk van Zuidelijk Flevoland. Zoals uit tabel 27 blijkt, werd Cl. botulinum type Caangetoond in de4 dode palingen, die uit het verversingskanaal afkomstig waren. Bijlater onderzoek zou blijken dat in deze palingen ook vrij hoge concentraties vanhet botulinumtoxine type C voorkwamen. Alhoewel het onderzoek bij de andere vissen uit het verversingskanaal negatief verliep, werd met dit onderzoek toch aangetoond dat visseneen rol kunnen spelen bij deverspreiding vanCl. botulinum type C. Bij een baars uit het Flevomeer werd Cl. botulinum type Egevonden. Dit feit behoeft geen verwondering meer te wekken, omdat bij het bodemonderzoek van het voormalige IJsselmeer reeds was gebleken, dat type E in dit gebied veel voorkomt. 92

-G

o o is. •o o o Q

E •^ — . o cd « ra c ra o o cd

't/ï

«J

e

0) T3 O O

"U5 •o

C 03

£ E '5 O e SraS . S a

3 CU

=3

a»

+

Ä

• * - *

i :• r :•

i -a

6 E

•rt

I I

3

G O

o c

M

ra

û

S

i

I I

ca •a

SE

+ 111

^3 cv

2 s«

++ i i

ta o

~+++

S

si

c

j I I+

5 c 3

11 •O

I I

•-

+++ I I

3

, . w a>

& _ •5 * C C M e g g s

« « A

Eu

5S SI

i l -5 C B 5 c « « « ça > >

o .2

£ è 9 9 139r-süï-c «

oy > £

Cd

g

•a JS fe O 3

S

o

cd £ • GS - Ü

* j (D

-H

r-j

~-

T3 C O

5

^ j

« oS

cj O. +J

c

<

o

a>

T3 C O

•3

N i-i

^ CJ

ta

oo o cd e cd o 00 e O ca cd ' c j e u O o

m

* ^: oo 5

-

o o

O •*

tu

o. > >, >,^4> 5 O

s

— >n

3

.c 3

3 .S •G, 3

O 0• < » -*«. O

-o

N


c

O O Sb E

ü

5 «

c3 O

93

a

>, S-

d c d d + I

+ I I I I I

E :^> ,0 0 S 3 .C

V5

C

c c c c

S

3 "S .e 0 •0

Ö E 73

1 0 -0 ^ j


3 .H 5

> C — (O 1> E

0 M

O O

>

•* o o o — o

<0 C

u

3

'Ü c ^t fN X <

^

M

-

T3

c o

T3

c o o

g'g.E^

hl

O O

2cd tr « 0 O » —

a . J-: > X)

v<

«5

« «

-Û

O

e

:= S -o 3 3 c S a o

a> u (U to ÖO OU GO W) fl IV ! l R .C -C J= -C

ts E 0

c ca> cÜ cu u

> > >>

!9 (Q C9 n

E E

0 > > 0 0s« 9c« 9ys c« 0 E E M

1«

tM

0

I-.

CD

E

94

+ I

5.3.2.5. Bijinvertebraten In het onderzoek werden enkele soorten invertebraten betrokken, enerzijds omdat deze tot het voedselpakket van watervogels behoren en zodoende een rol kunnen spelen bij de besmetting van watervogels met Cl. botulinum, anderzijds omdat bepaalde insecten in relatie staan met putride kadavers. De onderzochte invertebraten behoorden tot de klasse van de insecten (Insecta) en tot de klasse van de weekdieren (Mollusca); van de Insecta werden tweevleugeligen (Diptera) en kevers (Coleoptera) op Cl. botulinum onderzocht, van deweekdieren een aantal zoetwaterslakken en mosselachtigen. Insecta Van de orde der Diptera werden maden en poppen van zoöphage vliegen en volwassen vliegen onderzocht, van de orde der Coleopteraenkele keversoorten die als "doodgravers" bekend staan (Necrophorus investigatoren TV. humator). Tijdens de botulismusuitbraak in 1970 in Hilvarenbeek werden van 28 kadavers van watervogels maden verzameld. Van 10 tot 15 maden van één kadaver werd een suspensie gemaakt, die daarna op Cl botulinum werd onderzocht. Het onderzoek verliep bij alle 28 monsters positief. Op dezelfde wijze werd Cl. botulinum aangetoond in twee groepen maden, die in 1972 waren verzameld tijdens botulismusuitbraken in Delft/Nootdorp en in Loenen aan de Vecht. Het onderzoek verliep daarentegen negatief bij 5monsters maden, diein 1972 in Lelystad werden verzameld van kadaversvan kapmeeuwen in een gebied waar geen botulismus wasvastgesteld. Een gedeelte van de maden, die in 1970 in Hilvarenbeek waren verzameld, werd op runderlever via het popstadium tot volwassen vliegen gekweekt. Bij determinatie bleken 2 soorten vliegen aanwezig te zijn: Lucilia illustris en Calliphora erythrocephala (de blauwe vleesvlieg). In één van de 2 groepen poppen en in één van 11 L. illustris vliegen kon Cl.botulinum type C nog worden aangetoond. Dit lijkt er op te wijzen dat in enkele gevallen type C-sporen tot na demetamorphose persisteren;volwassen vliegen die uit met Cl.botulinum besmette maden zijn gegroeid, zouden aldus kunnen bijdragen in de verspreiding vanCl. botulinum type C. Dit gegeven werd in 1972 nader onderzocht door in 2 gebieden volwassen insecten op Cl. botulinum te onderzoeken. Voor dit doel werd een vliegenval opgesteld in een gebied waar botulismus voorkwam - Delft/Nootdorp - en in een gebied bij Lelystad waar geen gevallen van botulismus voorkwamen gedurende de proefperiode; het terrein bij Lelystad was een kolonie van kapmeeuwen en visdiefjes, die reeds eerder in 5.3.1.2. werd beschreven. De insecten werden gelokt met gekookte runderlever, waarvan vooraf het onderzoek op Cl. botulinum negatief was verlopen. Met dit voedsel werden vooral insecten gevangen, die sensibelwaren voor geputrificeerd, organisch materiaal. 95

O

»O

*3 > O «

o

•a

o o <4-i

13

g-

c

O

Û

CA

SO O

e u

•a 0 0

Z

<*-i

*ï> Q c

:—'? X)

w

+


I

—< o G 00 m m

I

I O O O

u

a

>> w *

V

c

| *H o

o

0

H

W!

3

a V3

00 fs

,0

k*

u

3

ra

0 X>

C

e

u

s V5

ra

H

>3 s e

0 M

u j ;

c u :•a

s

c 0

« n O ^ - O O O

"3 c

sS

0

<

0.

i O < N < N 0 0 ^ - r 0 O O ^ - ^ < N

0 -a

.C 3 O S :d DO

0 > 0 « 0 0 ^ 0 « O O V ï * 0 » 0

« 3 =3

Ç M

3 •a CA

C

O

0

g

S .g

S 3

.c

0 "3

0

-0

<J

^. O .* '-*CO

O

O O N

eu O C 4>

fc-*o U

•a

ai 96

5Q.

•3

!

es

•8

<j

.3

5Q.

C


.iz

.3

.3

a «u

P^-

I © ^-
a>

0

a» C/5

2

I

!-• % > O O

t/î

*j <j

,o» V

O S.

-c

4> tOS

!U

•SV.

.2S

U ï ^ ü î;'o J ü ü

•8

O O

CA

De vliegenval in Delft/Nootdorp werd 11 augustus 1972 met medewerking van de gemeentelijke plantsoenendienst in een besloten, parkachtig terrein opgesteld, 1 week nadat hier de eerste gevallen van botulismus bij watervogels waren voorgekomen. De insecten werden in augustus elke week verzameld, maar in september en oktober, toen er geen botulismusgevallen meer werden waargenomen, elke 2 weken. Het bleek dat er verschillende soorten insecten aanwezig waren, waarbij L. illustris, C.erythrocephala en Hydrotaea dentipes sterk domineerden. Door Dr. Th. van Leeuwen (Zoölogisch museum der Universiteit van Amsterdam) werden in de groep "overige soorten" (tabel 28), die in augustus waren verzameld, de volgende soorten gedetermineerd: Cynomyia mortuorum, Muscina assimilis, Ophyra leucostoma, Hylemyia nigrimana, Pollenia rudis, Hydrotaea occulta, Fanniinae spec, enPhaeoniinae spec. Van de meeste soorten is bekend dat de larven (maden) coprophaag of zoöphaag zijn, dus met name in kadavers leven. Deinsecten werden gedood door ze 2 tot 3 dagen bij —20°C te bewaren en daarna opCl. botulinum onderzocht met behulp van reeds eerder beschreven methodieken (5.2.2.). Het bleek dat in augustus, tijdens het optreden van botulismus bij watervogels, veel insecten besmet waren met Cl.botulinum, zowel met type C, type Ealsmet type Cen Esamen (tabel 28). In september en oktober - in een periode waarin geen gevallen van botulismus meer werden waargenomen - werd Cl. botulinum niet meer aangetoond, alhoewel in september 113 en in oktober 44 Diptera werden onderzocht, nl. 71L. illustris. 48C. erythrocephala,21H.dentipes en 17van de groep "overige soorten". In Lelystad werd de vliegenval reeds op 30 juni 1972 geplaatst. Het onderzoek werd op dezelfde wijze uitgevoerd als in Delft/Nootdorp. Deinsecten werden om de 7 tot 14 dagen verzameld, waarbij bleek dat bijna uitsluitend L. illustris, C erythrocephala en Necrophorus spec, aanwezig waren. Vergeleken met Delft/Nootdorp ontbraken hier in het onderzoek H.dentipes en "andere soorten" Diptera omdat deze slechts sporadisch werden verzameld. In het vogelrijke gebied werden tijdens de inspecties van het terrein geregeld dode vogels gevonden in verschillende stadia van decompositie; het betrof vooral kapmeeuwen en visdiefjes. Desondanks werd Cl. botulinum bij de onderzochte insecten slechtsenkele malen aangetoond, zoalsin tabel 29 isweergegeven. Deze resultaten passen bij het beeld dat tijdens het onderzoek in Delft/ Nootdorp werd verkregen, nl.dat slechts zeer weinig insecten met Cl.botulinum besmet zijn, indien in de omgevinggeen gevallen van botulismus voorkomen.

97

Tabel 29 Onderzoek op Cl. botulinum van insecten in een gebied bij Lelystad, waar geen botulismus werd waargenomen. Incidence of Cl.botulinum in insects in a botulism-free area near Lelystad.

Verzamelperiode

1972, juli

augustus

september

oktober

Insecten soort

L. illustris C. erythrocephala N. investigator L. illustris C. erythrocephala N. investigator L. illustris C. erythrocephala N. investigator L. illustris C. erythrocephala C. mortuorum N. investigator N. humator

Aantal onderzochte dieren

Aantal positieve dieren

Toxinetype C

E 0

40 2 5 42 5 18 37 14 6 13 11 12 8 1

4 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

4

214

5 (2,3%)

4 (1,9%)

0

1

1 (0,5%)

Mollusca In de gebieden waar botulismus bij watervogels was vastgesteld, werden in 1971 en 1972 zoetwaterslakken en enkele mosselachtigen verzameld voor onderzoek opCl. botulinum. De onderzochte species behoren vermoedelijk voor het merendeel tot het voedselpakket van de verschillende watervogels. De weekdieren werden meestal apart voor dit onderzoek verzameld, maar waren in enkele gevallen uit slibmonsters afkomstig. Bij het onderzoek waren de meeste weekdieren nog in leven; in een aantal gevallen waren in de schelp echter nog slechts restanten van de gestorven gastheer aanwezig. De determinatie van de Molluscawerd verricht door Dr. H.J. Over, Centraal Diergeneeskundig Instituut, afdeling Parasitologie, te Lelystad. Van het onderzoek is in tabel 30 een overzicht gegeven, waaruit blijkt dat in een hoog percentage (38,4%) van de levende en dode Mollusca,Cl. botulinum type Ckon worden aangetoond. Van de soorten, die in grotere aantallen werden 98

O O O O

l

I O O O O

o o o o

I

I I o o —o

à? r*i i o ~-< ^

I

I

I — ' C N O O
S .» S

( N i o — . ^ O O O — <

OJ ~

O

O

CD 00

s o ci; > fc" « S O

t-H

CD

XI

CD

( N c n - t C N r t C O ' - ^ ^ - ^ O ^

,g •a

CD

3

1 3

o

.O

0

c 00 ca

^

= 5

c T3 c O u o JD -o _CD H>

CA

>

cd

S

2

>

•O O

o •ö

c •o T 3 c c t= u o O CD CD
> «

> > > — ex 0

g

.^ ^ 5

•3 -3 3 ^j

3N j

2 2 •Si


X 3

*

'•£

(1)

2 2 -a 3 3 3

•a c 5U

55§§

F o h £cd u-o <3

£1

CD Cd

ca cd

ca cd C ca ca M

c

« -C .^ c

•S s "3 2 o *

e 3

cu to

'CA

> .5

CD

OCd 'S

t/3

G CD

cd cd

t-H

-û

^< < < < 'S *&. * a &
CU

cd

cd

cd

l-r

H E E S CD CD

>u > > > >o CD

e cd cd "2 CD T 3 • a

C/l

c/T jd

D

o

a

s:

S -4

E E E E e ed V3

Ç» Ä.

-§

5

T3

g

S c

CU

QQ

>

g

».

3. .g c

c

CD

cS cd C

M

11

3

p\

"o

S B E E cd cd cd

ca T3

rsi

O

Qq

3>

çt

•5

•a c o
Û Q O

E

< < O

-o cd

CD' •o cd

c« 3

3

CD

CD

cd

cd

c a _j

C

c

-1

•a c "o

T3

J3

3

> > u o EE r* r* "03 "S

3 3 "5 '3 N N

o cd

cd

cd

cd

c d c d c d E S S E S E S . H ,

JJ S

99

—

3

es

E

n cd

3 o

<

2 S

4-1

_&

fc*

O T3 O.

-22

.0

«—» m c i

*0
is
en V 0

£

Ê Vi

3 ÖD

tr C

~B 0

3 S

*o *o*o C G C 4> 0) 0)

> >>

_4> _0> J U

-s:

S-a

XI

o S

££

a = -S S S a

&£a

II > s

II1

i ^0 •S 3

(U

CD
o>

a>

£ 0

a

Ä

0 0

Ä s

^ EE

EE

100

CT-

onderzocht, verliep alleen bij Lymnaea ovatahet onderzoek negatief. Cl.botulinum type Bwerd slechts eenmaal gevonden; het is daarentegen opvallend dat type Einhet geheelniet voorkwam inhet onderzochte materiaal,hoewel in deze biotopen type Ebij dit onderzoek welherhaaldelijk werd gevonden. Op dezelfde wijze werden ook een beperkt aantal Molluscaonderzocht uit gebieden, waar geen botulismus bij watervogels was vastgesteld; het merendeel werd verzameld uit het Flevomeer bij Oostelijk Flevoland. Zoals uit tabel 31 blijkt, is de besmettingsgraad met Cl. botulinum in deze groep duidelijk lager. In het kader van dit onderzoek werd ook aandacht besteed aanMollusca die in zout water leven.Uit de Waddenzee bij Schiermonnikoog werden in mei 1972 14levende mosselen — de consumptiemossel Mytilus edulis— onderzocht. Dit onderzoek werd aangevuld met 28 monsters mosselen die door het "Onderzoek Station voor deZeevisserij"te DenHelder voor de Nederlandse kust waren verzameld tussen maart 1971 en april 1972. Een aantal mosselenvan één verzamelplaats was door de medewerkers van dit station vermalen tot een verzamelmonster, dat daarna bij -20°C werd bewaard. In tegenstelling tot alle Tabel 32 Onderzoek van mosselen (Mytilus edulis), verzameld voor de Nederlandse kust tussen maart 1971 en mei 1972. Examination for Cl. botulinum in mussels (Mytilus edulis), collected on different sites on the coast of the Netherlands between March 1971 and May 1972. Plaats van herkomst

Holwerd De Cocksdorp Balgzand Petten Umuiden Hoek van Holland Wemeldinge Vlissingen Hansweert Nieuwstad Schiermonnikoog

Aantal onderzochte monsters 3 3 2 3 3 3 3 3 3 2 14 42

Aantal positieve monsters 0 1 0 1 1 0 1 ia) 1 0 3 9 (21,4%)

Toxinetype C

B

E

_

_

_

0

0

1

1 0

0 0

0 1

-

-

-

0 0 0

1 0 1

0 0 0

-

-

-

0

3

0

1 (2,4%)

5 (11,9%)

2 (4,8%)

a) In de cultuurmedia van dit monster was botulinumtoxine aanwezig, dat echter niet kon worden getypeerd omdat de toxiciteit van de media snel verloren ging.

101

andere onderzoekingen bij vertebraten en invertebraten, werden van elk monster gemalen mosselen 3 cultuurbuizen met leverbouillon geënt. De resultaten van deze onderzoekingen zijn weergegeven in tabel 32. Het blijkt dat deze consumptiemosselen besmet kunnen zijn met de 3 toxinetypen van Cl.botulinum, die in Nederland zijn geïsoleerd. Cl.botulinum type B werd het meest gevonden en type Cslechts eenmaal;type E neemt een intermediaire plaats in. 5.3.3. IsolatievanO. botulinum inreincultuur De isolatie van Cl. botulinum uit ernstig verontreinigd materiaal levert, zoals reeds eerderwerdvermeld, grotemoeilijkheden openisalleenmet enige kansop succes mogelijk, indien het materiaal voldoende kiemen en sporen van Cl. botulinum bevat. Daarom werd slechts in een beperkt aantal gevallen getracht Cl. botulinum in reincultuur te isoleren met methodieken, die reeds in 3.2.2.2. werden beschreven. Als voedingsmedia werden vooral leverbouillon en HIS gebruikt, omdat hiermede debeste resultaten werden bereikt. 5.3.3.1.Cl. botulinum typeC Van Cl. botulinum type Cwerden vooral reinculturen geïsoleerd uit materiaal dat afkomstig was van belangrijke botulismusuitbraken. De stam uit Hilvarenbeek (HV 1970) werd geïsoleerd uit een gekweekte Lucilia illustris-vlieg. De overige type C-stammen werden geïsoleerd uit de organen van vogels en zoogdieren, zowel van watervogels die aan botulismus waren gestorven als van dieren die als latente kiemdrager moeten worden beschouwd (tabel 33). De isolatie van toxogene C-stammen in reincultuur uit de ophopingsculturen vande organen van deze dieren leverde nog tal van moeilijkheden op, omdat ook deze ophopingsculturen ernstig verontreinigd waren met andere Clostridien die op vaste voedingsbodems niet of nauwelijks waren te onderscheiden van toxogene type C-stammen. Indien een karakteristiek kolonietype op de vaste voedingsbodems werd waargenomen, bleken hiervan veel kolonies bij nader onderzoek nontoxisch te zijn en een klein aantal slechts zwak toxisch, d.w.z. slechts ongeveer 1 MLD per 0,5 ml leverbouillon te bevatten. De isolatie werd verder bemoeilijkt omdat het kolonie-aspect vanCl. botulinum type Csteeds aan kleine variaties onderhevig was, hetgeen vooral samenhing met de groeicondities in het anaërobenvat. Tijdens het onderzoek bleek dat er bovendien tussen de diverse type C-culturennogkleine onderlinge verschillen waren. In een aantal gevallen — Hilvarenbeek, 's-Gravenhage en Amsterdam — werd getracht type C in reincultuur uit slib te isoleren, zonder dat dit een positief resultaat opleverde. De indruk bestond dat type C de competatieve groei met andere Clostridienverloor in deze zeer ernstigverontreinigde ophopingsmedia. 102

Tabel 33 Overzicht van de Cl. botulinum-stammen die in reincultuur werden geïsoleerd. List of the Cl. botulinum strains isolated in pure culture.

Toxine- Aanduiding van Plaats van herkomst Geïsoleerd uit type de geïsoleerde stam

c c c c c c c c c c

HV 1970 75965

Hilvarenbeek Poortugaal

Lucilia illustris Lever van een wilde eend

80414 80671 81290

Amsterdam Delft/Nootdorp Groningen

B

83218 84381 75617 78158 78807 WB 1971

Leiden Leiden Lelystad Hilvarenbeek Poortugaal 's-Gravenhage

E E A

69361 81509 78638

Lelystad 's-Gravenhage Ruurlo

Milt van een knobbelzwaan Lever van een wilde eend Lever en milt van een wilde eend Lever van een knobbelzwaan Hart van een muskuseend Lever van een bruine rat Lever van een bisamrat Lever van een haas Slib uit een verzamelbekken Slib uit een visvijver Nier van een wilde eend Lemige zandgrond

Eventuele ziekte- of doodsoorzaak

Parathionvergiftiging Botulismus Botulismus Botulismus Botulismus Botulismus Geen, gezond Geen, gezond Pneumonie

Botulismus

5.3.3.2.Cl. botulinum typeE Er werden 2 reinculturen geïsoleerd van Cl. botulinum type E. Stam 69361 werd geïsoleerd uit slib van een visvijver in Lelystad. In een serie monsters uit deze vijver werd type E — voor zover bekend — voor het eerst in Nederland aangetoond. Dit werd het argument om te trachten dit type in reincultuur te isoleren, hetgeen na een langdurig onderzoek gelukte, nadat ook in dit gevalde verontreiniging met andere Clostridien talvanmoeilijkheden had veroorzaakt. Later werd nog een tweede reincultuur van type E, stam 81509, uit de nier van 1 wilde eend geïsoleerd. Deze eend, afkomstig uit het Zuiderpark te 's-Gravenhage, was gestorven aan botulismus (type C-toxine aangetoond). Het onderzoek van de organen op Cl. botulinum type Cverliepnegatief, maar in het rectum, in de nieren en op de zwemvliezen van beide poten werd wel O.botulinum type E aangetoond. De isolatie geschiedde volgens dezelfde methodieken alseerder isvermeld voor type C. 5.3.3.3.Cl. botulinum typeB Van Cl. botulinum type B werd één reincultuur geïsoleerd uit slib van een 103

verzamelbekken voor drinkwater (zie 10.4). Aanvankelijk werd het slib,voordat devloeibare ophopingsculturen werden geënt, gedurende 30 minuten bij 80°C of hoger verhit. Het bleek echter dat deze temperatuur voor de meeste type B-sporen van dit monster te hoog was, omdat hierna slechts enkele weinig toxische culturen werden verkregen. Het te onderzoeken materiaal werd daarom gedurende 30 minuten bij 65°C verhit, zoals ook steeds bij de isolatie van type C en E was geschied. Na onderzoek van zeer veel subculturen kon uiteindelijk een toxogene reincultuur van type B worden geïsoleerd. 5.3.3.4. Cl. botulinum typeA Uit het grondmonster waarin Cl.botulinum type A werd aangetoond, werd getracht een reincultuur te verkrijgen met methodieken die reeds eerder zijn vermeld. Het gelukte type A reeds uit de eerste serie subculturen te isoleren op HIS, diebij 30°C waren geïncubeerd. De resultaten van het onderzoek van de culturele, biochemische en serologische eigenschappen van de geïsoleerde Cl. botulinum-stzmmen zullen in eenapart hoofdstuk worden besproken (hoofdstuk 8). 5.4. SAMENVATTING In dit onderzoek is aangetoond dat Cl. botulinum type A, B, C en E in Nederland in de bodem voorkomen. De percentages waarin de laatste 3 toxinetypen werden gevonden, bleken inwillekeurigverzamelde bodemmonsters en in bodemmonsters, die uit botulismusvrije watergebieden met veel watervogels afkomstig waren, ongeveer gelijk te zijn (tabel 34). Deze percentages benaderen vermoedelijk het meest degemiddelde situatie in Nederland. Menkan hoogstens stellen dat type C in watergebieden iets vaker werd aangetroffen; hierbij dient met de mogelijkheid rekening te worden gehouden dat enkele van deze gebieden, waarin type C werd aangetoond, na 1970 besmet kunnen zijn. Het onderzoek van de seriegrondmonsters van Stiboka heeft echter bewezen dat Cl. botulinum type C ook voor 1970 - dus voor de ernstige botulismusepidemieën bij watervogels - reeds verspreid in de bodem voorkwam. Cl. botulinum type D en F werden in dit onderzoek niet gevonden, terwijl type A slechts 1 maalwerd aangetoond. Een vergelijking met de omliggende West-Europese landen is slechts op beperkte schaal mogelijk. Meyer en Dubovsky (1922b) vonden in bodemmonsters uit België, Zwitserland, Denemarken en Engeland uitsluitend Cl.botulinum type B. Stableforth en Galloway (1959) vermelden echter dat Haines in Engeland Cl. botulinum type A ook had vastgesteld en wel in 5% van de bodemmonsters. Johannsen (1963) vond in waterrijke gebieden (meren, vijvers, 104

rivieren) in Zweden in 167 monsters overwegend Cl. botulinum type E, in 70% van de bodemmonsters; type B en type C kwamen beide slechts 1maal voor (0,6%), de andere toxinetypen werden door hem niet aangetroffen. In de USSR - inclusief het in Azië gelegen gebied - werd bij een groot opgezet onderzoek door Kravchenko en Shishulina (1967) in 4.242 bodemmonsters de volgende verdeling van de gevonden toxinetypen vermeld: Cl. botulinum type A 0,87%, type B2,9%,type C0,21%,type D0,02%en type E6,5%. In het algemeen kan worden geconcludeerd dat in de meeste Europese landen de toxinetypen B en Ehet meest voorkwamen, terwijl de typen Aen Csoms ook werden gevonden; een beeld dus zoals dat bij het onderzoek in Nederland eveneens werd aangetroffen in de botulismusvrije gebieden en de willekeurig verzamelde grondmonsters. In gebieden in Nederland, waar botulismus bij watervogels was opgetreden, werden de typen B en E ongeveer in dezelfde mate aangetroffen. Het grote verschil was echter dat deze gebieden zeer intensief besmet bleken te zijn met Cl. botulinum type C (tabel 34). Deze besmetting was 1jaar nadat de laatste gevallen vanbotulismus warenvoorgekomen, nogniet merkbaar afgenomen. Tabel 34 Voorkomen van Cl. botulinum in de bodem. Incidence of Cl.botulinum in soil.

Herkomst van de monsters

Gebieden met botulismus Botulismusvrije vogelgebieden Willekeurige bodemmonsters Stiboka

Aantal onderzochte monsters

Aantal positieve monsters

C

B

E

A

257

193

71,6

3,9

14,4

0

4,2 0,7 3,9

5,6 6,6 6,4

21,2 20,7 0,5

0 0 0,5

141 135 203

46* 39 21

Toxinetype in procenten

* Drie positieve culturen werden niet getypeerd, zie tabel 17.

Indien dieren — zowel vertebraten als invertebraten — werden onderzocht, kwam eenzelfde verdeling te voorschijn. In de gebieden waar botulismus was opgetreden bleken niet alleen de watervogels, die aan botulismus waren gestorven of lijdende waren, ernstig besmet te zijn met Cl. botulinum type C,maar ook veelgezonde vogelsenvogels die aan intercurrente ziekten waren gestorven. Dezebesmetting strekte zich ook uit tot zoogdieren, vissen, in het water levendeMollusca en delarvale stadia van zoöphaag levende Insecta. Tijdens een uitbraak van botulismus bij watervogels, 105

bleken de volwassen stadia van deze insecten niet alleen veelvuldig met type Cte zijn besmet, maar zelfs nogvaker met type E.Cl. botulinum type Cblijkt in deze gebieden ubiquitair voor te komen, waarbij een relatie bodem-dier aanwezig lijkt te zijn. De typen B en E komen hier eveneens ubiquitair voor, maar de relatie bodem—dier is veel minder duidelijk; met name type Ehad dan vaker bij vogels,zoogdieren, vissen enMollusca moeten worden gevonden (tabel 35). In de gebieden, waar botulismus niet was waargenomen, bleken dieren eveneens besmet te kunnen zijn met Cl. botulinum type B,Cof E,alhoewel het aantal besmette dieren verhoudingsgewijs veel geringer was. Bij zoogdieren en vogels kwam type Crelatief wat meer voor, wat er opzou kunnen duiden dat dit type bij deze dieren gemakkelijker kan persisteren. Bij een nader onderzoek bleken wilde eenden minstens 14dagen met type Cbesmet te kunnen blijven. In Mollusca, speciaal de consumptiemossel M. edulis, werd Cl.botulinum type B relatief vaak aangetoond. Tabel 35 Voorkomen van Cl. botulinum bij dieren in gebieden waar botulismus bij watervogels was opgetreden en in botulismusvrije gebieden. Incidence of Cl. botulinum in animals in areas where botulism in waterfowl had occurred and in botulism-free areas.

Diersoort en herko imst

A. Gebieden met botulismus Vogels Zoogdieren Vissen Dipfera Mollusca

B. Botulismusvrije gebieden Vogels* Zoogdieren Vissen Diptera Mollusca

106

Aantal onderzochte monsters

Aantal positieve monsters

Toxinetype C

B

E

120 17 25 75 57

78 4 4 28 23

76 4 4 13 22

3 0 0 0 1

1 0 0 22 0

294

137

'119 (40,5%)

4 (1,4%)

23 (7,8%)

76 16 3 214 59

9 4 1 5 10

3 0 0 0 5

2 0 1 1 2

368

29

8 (2,2%)

6 (1,6%)

5 4 0 4 2 15 (4,1%)

Samenvattend kan worden geconcludeerd dat er voor de verspreiding van Cl. botulinum tal van mogelijkheden aanwezig zijn;vogels lijken hierbij een grote rol te spelen. Cl.botulinum type C zal vooral worden verspreid vanuit de intensief besmette watergebieden, waar botulismus bij watervogels is voorgekomen.

107

H O O F D S T U K VI EEN ONDERZOEK NAAR HET VOORKOMEN VAN HET BOTULINUMTOXINE IN VERBAND MET HET OPTREDEN VAN BOTULISMUS BIJ WATERVOGELS

6.1. INLEIDING Botulismus is een specifieke intoxicatie, waarbij reeds eerder gevormd botulinumtoxine oraal wordt opgenomen. Deze definitie is ook algemeen aanvaard voorbotulismus bij watervogels. Slechts Boroff en Reilly (1962) menen op grond van hun onderzoekingen dat een toxinevormingde novo ook mogelijk is, omdat zij herhaaldelijk Cl.botulinum aantoonden in de lever van aan botulismus lijdende vogels. Indien men aanneemt dat botulismus bij watervogels wordt veroorzaakt door de opname van "preformed" toxine, betekent dit dat het botulinumtoxine ook in de natuur involdoende hoge concentraties met behulpvan proeven op muizen moet kunnen worden aangetoond, zodat watervogels een letale dosis ervan kunnen opnemen. Deonderzoekingen, diehierna zullen worden beschreven,waren vooral hierop gericht, waarbij, in overeenstemming met gegevens uit de literatuur, bijzondere aandacht werd besteed aan putride, dierlijk materiaal en aanhet voorkomen van het toxine inwater en slib.

6.2.MATERIALEN ENMETHODIEKEN Het botulinumtoxine werd in de kadavers van vertebraten aangetoond met methodieken die reeds in 3.2.1. zijn beschreven. Het onderzoek van maden, verzameld van putride kadavers, geschiedde volgens dezelfde principes. Van één kadaver werden 10 grote of 15 kleinere maden gedurende minstens 5 minuten in een zeef met stromend leidingwater 108

gespoeld, vervolgens in een mortier of Griffith tube fijngewreven en met een bekende hoeveelheid bouillon verdund tot een injiceerbare suspensie, die gedurende 15 minuten bij 3.000 rpm werd gecentrifugeerd. Aspecifieke sterfte bij de muizen werd voorkomen door aan het te onderzoeken materiaal meer penicilline en streptomycine toe te voegen,nl.van elk 2.000 Eper ml, terwijl het inoculum 0,25 inplaatsvan 0,5 ml bedroeg. Het onderzoek vanbepaalde aantallen poppen en zoöphage vliegen geschiedde op dezelfde wijze. Water en slib, dat op botulinumtoxine werd onderzocht, was verzameld op plaatsen waar degrootste sterfte door botulismus bij watervogelsvoorkwam. Het materiaal werd na centrifugeren gedurende 5 minuten bij 1.000 rpm op botulinumtoxine type C onderzocht. Dezelfde water- en slibmonsters werden tevens opCl. botulinum onderzocht. Voor de productie van het botulinumtoxine in water en slib onder experimentele omstandigheden werden uitsluitend monsters genomen, waarvan was aangetoond dat zij intensief besmet waren met Cl. botulinum type C. Monsters van 10 tot 15 ml werden bij 30°C geïncubeerd, waarna op verschillende tijdstippen een controle op de productie van botulinumtoxine plaats vond. De concentratie van het botulinumtoxine werd steeds vastgesteld door de MLD te bepalen, zoals reeds in 3.2.3. werd beschreven. In de eerste 3 experimenten werden geen maatregelen genomen het zuurstofgehalte van de geïncubeerde water- en slibmonsters te verminderen. In een vierde experiment met 4 series van 14 slibmonsters wasdit wel het geval.In deeerste seriewerd de opname van zuurstof uit de lucht voorkómen, door de slibmonsters af te dekken met paraffine-olie. De tweede, derde en vierde serie slibmonsters werden onder anaërobe omstandigheden geïncubeerd volgens de methode van Mcintosh en Fildes. De derde en vierde serie werden, in tegenstelling tot deeerste en tweede serie slibmonsters, verrijkt met blokjes leveruit leverbouillon resp.vleespartikels uitCMM. De resistentie van het botulinumtoxine type C in slib werd bepaald in het Talingputje te Hilvarenbeek met behulp van toxine van stam HV 1970. Een dertigtal cultuurbuizen met leverbouillon en CMM werden met deze stam geënt en gedurende 6 dagen bij 30°C geïncubeerd. Na deze periode werd de bovenstaande cultuurvloeistof afgegoten en werden in Griffith tubes van de blokjes lever uit één leverbouillon cultuur en van de vleespartikels uit een CMM-cultuur een 10%suspensie (w/v) in bouillon gemaakt. Nacentrifugeren en het maken van tienvoudige verdunningen werd de concentratie van het botulinumtoxine zowel van de blokjes als van de vleespartikels bepaald op 104 MLD per 0,5 g. De resterende blokjes lever en vleespartikels werden over buizen van 108 x 14 mm verdeeld - waarbij dehoeveelheid perbuis overeenkwam met de inhoud van 1 cultuurbuis — en vervolgens gedurende 6 dagen bewaard bij -20°C. Op 5 april 1972 werden deze buizen inhet Talingputje geplaatst, nadat 109

elke buis tot de helft met ter plaatse verzameld water en slib was aangevuld en zorgvuldig met een plastic stop was afgesloten. Deze buizen met botulinumtoxine bevonden zich in een rek op een beschaduwde plaats iets onder de waterlijn. Direct na plaatsing werd 1 buis met blokjes lever en 1 buis met vleespartikels medegenomen voor controle van de toxineconcentratie. De toxineconcentratie werd vervolgens aanvankelijk elke 2 weken bepaald, na 3 maanden echter eens per 4 weken. Het onderzoek vond steeds direct na aankomst van de 2 buizen plaats. Van de bovenstaande vloeistof werd de concentratie van het botulinumtoxine in MLD per 0,5 ml bepaald, nadat dit vloeibare materiaal gedurende 5 minuten bij 3.000 rpm was gecentrifugeerd en 1.000 E penicilline en 1.000 E streptomycine was toegevoegd. De blokjes lever en de vleespartikels werden vervolgens verzameld, nauwkeurig gewogen en met bouillon in een Griffith tube tot een 10%suspensie (w/v)verwerkt; daarna werd op analoge wijze de concentratie van het botulinumtoxine in MLD per 0,5 g bepaald. Van debovenstaande vloeistof en de 10%suspensiesvan de blokjes leverende vleespartikels werd tevens depH gemeten. De luchttemperatuur en de temperatuur van het slib en het water in het Talingputje werd 's morgens om 9 uur gemeten op de dagdat debuizen werden verzameld (fig. 3). De veldproef met wilde eenden werd op 11 september 1970 in Hilvarenbeek begonnen, op plaatsen waar degrootste sterfte door botulismus voorkwam. Hier werden 40 gekortwiekte wilde eenden uitgezet in 5 grote kooien zonder bodem en met zijwanden van wijdmazig gaas. Demeeste kooien waren zogeplaatst, dat een gedeelte van de omheinde ruimte uit drooggevallen slib bestond, terwijl in het resterende gedeelte met ondiep water de eenden tijdens het fourageren gemakkelijk de bodem konden bereiken, zodat er voldoende gelegenheid was voedsel uit het water en het bodemslib op te nemen. Er vond verder enige bijvoedering plaats met mais.Tijdens deproefperiode werden in de omgevingvan de 3 kooien in het Talingputje (fig. 1) nog watervogels met botulismus aangetroffen, evenals kadavers in verschillende stadia van ontbinding die soms met maden waren bezet. Het experiment werd na4weken afgesloten. 6.3. RESULTATEN 6.3.1. Onderzoek vankadaversvanvertebraten Met dit kwantitatieve onderzoek werd beoogd aan te tonen dat in putride kadavers van vogels, zoogdieren en vissenhoge concentraties vanhet botulinumtoxine kunnen worden aangetroffen, zodat deze kadavers een belangrijke rol kunnen spelen in deepidemiologie van botulismus. Als leidraad bij de beoordeling van de concentratie van het toxine kan het 110

gegeven dienen, dat in toxogene culturen vanCl. botulinum type C concentraties van 104 tot 106 MLDper ml voorkomen. 6.3.1.1. Vanwatervogels In hoofdstuk 4 werd bij het diagnostisch onderzoek beschreven dat in de weefsels van verse kadavers van watervogels, die aan botulismus zijn gestorven, over het algemeen lage concentraties van het botulinumtoxine werden vastgesteld; meestal bleek nauwelijks 1 MLD per 0,5 ml van het te onderzoeken materiaal aanwezig te zijn. In hoofdstuk 5 werd echter reeds vermeld, dat watervogels, die aan botulismus zijn gestorven, veelvuldig met Cl. botulinum type Cbesmet zijn. Een postmortale productie van het botulinumtoxine in deze kadavers wasdusin principe mogelijk. Tijdens botulismusuitbraken in 's-Gravenhage, Hilvarenbeek, Amsterdam en Delft werd daarom van enkele min of meer putride kadaversvan watervogels de concentratie van het botulinumtoxine in enkele organen bepaald. Uit tabel 36 blijkt dat de concentratie van het toxine hierin zeer hoge waarden kan bereiken. Van de meeste kadavers was de ouderdom onbekend, met uitzondering echter van de zwaan uit Amsterdam en de eend uit Hilvarenbeek waarvan bekend was dat zij 3 dagen voor het onderzoek met verschijnselen van botulismus waren gestorven. Van de eend uit park Clingendael kan als bijzonderheid worden vermeld dat deze in een vijver ronddreef, waarvan de temperatuur van het water 19°Cbedroeg. Tabel 36 Bepaling van de concentratie van het botulinumtoxine type C in putride kadavers. Assay of the concentration of botulinum toxin type C in putrefying cadavers of waterfowl. Datum

Herkomst

Diersoort

Toxineconcentratie in MLD per g Lever

1970, augustus 1972, juli juli juli augustus 1972, augustus augustus n.t.: *

's-Gravenhage Hilvarenbeek Hilvarenbeek Hilvarenbeek 's-Gravenhage* Amsterdam Delft/Nootdorp

wilde eend wilde eend wintertaling wintertaling wilde eend knobbelzwaan wilde eend

1 x 10 6 6 x 10 3 6 x 10 2 6 x 10 3 5 x 10 1 4 x 10 4 6xl04

Inhoud di- Skelet-musgestietractu s culatuur n.t. 1 x 10 7 1 x 10 8 1 x 10 6 6 x 103 2xl04 2xl05

n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. 2xl04

geen onderzoek verricht. park Clingendael.

111

6.3.1.2.Vanzoogdieren Bij het onderzoek van enkele putride kadavers van katten, die in hooi of voordroogkuil waren terechtgekomen en een rol hadden gespeeld bij het optreden van botulismus bij paarden of runderen, bleek dat ook in deze kadavers een hoge concentratie van het botulinumtoxine type C aanwezig kan zijn. Zo werd in geval 26656 in de restanten van een grotendeels gemummificeerde kat 2 x 104 MLD per g weefsel aangetroffen, in geval 61884 in detritus uit de buikholte van de kat 2 x 105 MLD per gweefsel en in geval 84124 in de lever van een kat 5 x 104 MLD per g. (Meer bijzonderheden van deze gevallen van botulismus zijn in hoofdstuk 8.2 vermeld.) Het is niet gelukt kadavers van zoogdieren (ratten, katten), die een rol bij het optreden van botulismus bij watervogels zouden hebben kunnen spelen, voor onderzoek ter beschikking te krijgen. Met bovengenoemde onderzoekingen is echter voldoende aangetoond dat de productie van het botulinumtoxine niet alleen behoeft plaats te vinden in de putride kadaversvan watervogels;dit zal immers ook kunnen geschieden in de kadavers van zoogdieren, die latent besmet zijn met Cl. botulinum type C (tabel 26). 6.3.1.3.Vanvissen In hoofdstuk 5 werd reeds beschreven dat in 4 dode palingen uit het verversingskanaal te 's-Gravenhage Cl. botulinum type C werd aangetoond. Een 20% suspensie (w/v) van de ingewanden werd eveneens op botulinumtoxine onderzocht. De snelle, specifieke sterfte van demuizen in de toxineneutralisatietest duidde op de aanwezigheid van veel type C-toxine, waarvan de concentratie echter pas 4 dagen later kon worden bepaald; in 3 palingen werd nog een toxineconcentratie van 103 MLD per g ingewanden vastgesteld, terwijl in de4e paling geen toxine meer was aan te tonen. Het materiaal was,in tegenstelling tot de algemene regel, bewaard bij 4°C en het is plausibel dat hierdoor botulinumtoxine verloren is gegaan. Alhoewel dus geen betrouwbare concentratie van het toxine kon worden bepaald, is met dit onderzoek toch aangetoond dat ook in dodevissen de vormingvan botulinumtoxine type Cmogelijk is. In dezelfde periode werden ook 12 karpers, 7 voorns en 1bliek, eveneens afkomstig uit het verversingskanaal, op botulinumtoxine onderzocht. Het onderzoek verliep negatief, een resultaat dat in overeenstemming is met het negatief verlopen onderzoek van dezevissen opCl. botulinum (tabel 27). 6.3.2. Onderzoek vaninvertebraten Dit onderzoek had betrekking op maden en poppen van L. illustris en C erythrocephala en opzoöphageDipteradie ineen vliegenval werden gevangen. De maden waren verzameld in augustus 1970 in Hilvarenbeek, dus in een periode waarin veel watervogels aan botulismus stierven. Van putride kadavers 112

van 13 wilde eenden en 15 wintertalingen werden 28 monsters maden arbitrair ingedeeld in grote en in kleine maden, die daarna binnen 24 uur op botulinumtoxine werden onderzocht. Dit onderzoek verliep bij 27 monsters positief waarna bij typering steeds het type C-toxine werd vastgesteld. Van 3 positieve monsters stierf maar 1van de 2 muizen, zodat de toxineconcentratie van deze suspensies slechts 1 LD 50 per 0,25 ml bedroeg. Van de overige monsters stierven beide muizen en van deze groep werd vervolgens van 15 willekeurig gekozen monsters de MLD per 0,25 ml madensuspensie bepaald, met behulp waarvan de gemiddelde toxineconcentratie per made kon worden berekend. Uit tabel 37 blijkt dat de toxineconcentratie in deze maden zeer hoge waarden kan bereiken; deze bedroeg in de grote maden van eendekadavers gemiddeld 70.370 MLDper made. Tabel 37 Concentratie van het botulinumtoxine type C in maden van zoöphage vliegen. Concentration of botulinum toxin type C in maggots of zoophagous flies.

Type made

Groot Groot Groot Groot Groot Groot Klein Klein Klein Groot Groot Groot Groot Groot Klein

Diersoort waaruit de maden werden verzameld wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wilde eend wintertaling wintertaling wintertaling wintertaling wintertaling wintertaling

Gemiddelde toxineconcentratie in MLD per made 2 x 10 5 2 x 10 5 2 x 10 4 2 x 10 3 2 x 10 2 2 x 10 1 1.3 x 10 1 1,3 x 10 1 1,3 x 10° 2 x 10 2 2 x 10 2 2 x 10 1 2 x 10° 2 x 10° 1.3 x 10°

Van elk der 28 monsters maden werden 10tot 15maden verder gekweekt op stukjes runderlever. Een gedeelte van deze maden werd na 4 dagen onderzocht op botulinumtoxine. Hierbij bleek slechts 1 monster, waarvan de gemiddelde toxineconcentratie eerst 2 x 105 MLD had bedragen, nog ongeveer 1MLD per made te bezitten. Demaden van de andere monsters hadden zich kennelijk reeds bevrijd van het toxine. Dit resultaat duidt er op dat het botulinumtoxine niet in deze zoöphaag levende maden werd gevormd, maar dat het toxine met het 113

voedsel door de maden passief werd opgenomen uit de putride kadavers. Deze mening werd bevestigd door de negatieve bevindingen bij het toxine-onderzoek van kunstmatig gekweekte en in hetveld (Hilvarenbeek) verzamelde poppen.De maden van dit onderzoek konden worden geïdentificeerd, doordat het gelukte uit 24 monsters maden vliegen te kweken; deze werden als L. illustris en C.erythrocephala gedetermineerd (Dr. Th.van Leeuwen). Zoöphage vliegen werden eveneens op botulinumtoxine onderzocht, nadat deze verzameld waren in een vliegenval, die in Delft/Nootdorp tijdens het optreden van botulismus bij watervogels en in Lelystad in een botulismusvrij gebied stond opgesteld (zie 5.3.2.5.). In 3 mengmonsters van 50 exemplaren van L. illustris, in Lelystad verzameld op 20juli, 26juli en op 1augustus 1972,verliephet onderzoek negatief;andere •zoöphage vliegen werden hier niet onderzocht omdat zij niet voldoende beschikbaar waren. In Delft/Nootdorp werden op 15 augustus 1972 mengmonsters van 30 exemplaren van L. illustris, C.erythrocephala en H dentipes onderzocht. Het onderzoek verliep negatief bij C.erythrocephala, maar muizen ingespoten met materiaal van de 2 andere monsters, vertoonden specifieke ziekteverschijnselen na 24 to 48 uur. Alleen vanL. illustris wasvoldoende materiaal aanwezigvoor de typering van het toxine; het bleek dat hier sprake was van het type C-toxine, doch dat de hoeveelheid toxine zeer gering was. Per L. illustris-vliegwas gemiddeld slechts 0,2 MLDtoxine aanwezig.Het onderzoek op botulinumtoxine verliep negatief bij 2mengmonstersvan 50exemplaren vanL. illustris,die op 25 augustusen op 1 september werden onderzocht. 6.3.3. Onderzoek van waterenslib In een onderzoek naar het voorkomen van het botulinumtoxine werden ook water en slib betrokken. Ter vergelijking met gegevens uit de literatuur werd getracht het toxine hierin direct aante tonen. Dit onderzoek werd later gevolgd door experimenten, waarbij de productie van het botulinumtoxine in water en slib onder laboratoriumomstandigheden werd nagegaan. In een apart onderzoek werd onderzocht hoelang het botulinumtoxine kan persisteren in eenbiotoop,waarin botulismus bij watervogels was opgetreden. 6.3.3.1.Verzameldingebiedenmetbotulismus Bij ernstige uitbraken van botulismus werden vanaf 1970water en bodemslib verzameld op plaatsen, waar de meeste watervogels waren gestorven. Dit materiaal werd binnen 24 uur na het verzamelen op toxine onderzocht. In een zeer hoog percentage van deze monsters werd, zoals reeds in hoofdstuk 5 is beschreven, Cl.botulinum type C aangetoond. Het onderzoek op botulinum114

toxine verliep echter steeds negatief, met uitzondering van één monster uit 's-Gravenhage (tabel 38). Dit monster, bestaande uit water en bodemslib, was verzameld in de directe omgeving van een verregaand in ontbinding verkerend kadaver van een fazant, die daar langs de oeverrand in ondiep water dreef. Het onderzoek op Cl.botulinum verliep in dit bodemmonster eveneens positief. In water en slib op 2mvanhet kadaver werd geentoxine meergevonden,wat er op zou kunnen wijzen dat de toxineconcentratie in het eerder genoemde monster gering was;de exacte concentratie werd echter niet nader bepaald. Tabel 38 Onderzoek van water en slib op het voorkomen van botulinumtoxine type C. Incidence of botulinum toxin type Cin water and mud.

Plaats en jaar van onderzoek Hilvarenbeek, 1970 Hilvarenbeek, 1971 's-Gravenhage, 1970 's-Gravenhage, 1971 Groningen, 1971 Amsterdam, 1971 Amsterdam, 1972 Delft/Nootdorp, 1972

Aantal onderzochte monsters 12 33 1 15 13 11 4 8

Aantal positieve monsters 0 0 0 1 0 0 0 0

97

De conclusie van dit onderzoek is, dat het massaal optreden van botulismus bij watervogels in Nederland niet wordt veroorzaakt door de opname van het botulinumtoxine met water of slib met het daarin normaal voorkomende plantaardig of dierlijk voedsel. 6.3.3.2. Productie van het botulinumtoxine onder experimentele omstandigheden In dit onderzoek werd de vorming van botulinumtoxine type C in water en slib, afkomstig uit botulismusgebieden van Amsterdam, Hilvarenbeek en 's-Gravenhage,nagegaan. In een eerste experiment kon gedurende 30 dagen incuberen bij 30°C in 2 water- en 2 slibmonsters geen productie van botulinumtoxine worden vastgesteld. In een tweede experiment werden 6water- en 6slibmonsters eerst gedurende 21 dagen op dezelfde wijze geïncubeerd. Toen bleek dat in deze serie evenmin toxine werd gevormd, werden aan de water- en slibmonsters een variabele 115

hoeveelheid blokjes lever (1 tot 5), afkomstig uit cultuurbuizen met leverbouillon, toegevoegd. Na deze verrijking van het medium bleek pas een geringe productie van botulinumtoxine tot stand te komen in 3water- en 3 slibmonsters, die na 7 dagen aantoonbaar was. De bepaling van de concentratie van het botulinumtoxine geschiedde na 12 dagen, waarbij bleek dat in 1monster 2 x 1 0 MLD per ml aanwezig was, terwijl in de 5 andere positieve monsters minder toxine was gevormd. Na 44 dagen was nog maar in 1water- en 1 slibmonster toxine aan te tonen. In een derde experiment werden 4 water- en 4 slibmonsters verrijkt met 5 levende exemplaren vanLymnaea truncatula.Deze slakken stierven al spoedigna het begin van de incubatie en induceerden een sterke bacteriële groei. Er kon echter gedurende de proefperiode van 14 dagen geen productie van botulinumtoxine in deze monsters worden vastgesteld. In het vierde experiment werd in de eerste en tweede serie van 14 slibmonsters, die niet met dierlijk materiaal waren verrijkt, gedurende een proefperiode van 21 dagen geen productie van botulinumtoxine vastgesteld. In de met blokjes lever, maar vooral in demet vleespartikels verrijkte slibmonsters, was dit welhet geval. Bij de eerste controle na 7dagen wasalleen in 11 monsters met vleespartikels botulinumtoxine gevormd; de hoogste toxineconcentratie bedroeg 2 x 103 MLD per ml. Na 14en 21 dagen was in de derde serie slechts1 monster met leverblokjes positief (1 MLD per ml) en 8 monsters met vleespartikels (hoogste MLD2x 103 per ml). De resultaten van deze 4 experimenten duidden er op dat een vorming van botulinumtoxine type C in water en slib, dat intensief besmet is met Cl. botulinum type C,zeer onwaarschijnlijk is:devorming van toxine kwam zelfs nog maar in betrekkelijk geringe mate tot stand als water en slib, verrijkt met dierlijk materiaal zoals blokjes lever en vleespartikels, onder anaerobe omstandigheden werden geihcubeerd. 6.3.3.3. Resistentie vanhetbotulinumtoxine inslib Deresistentie vanhet botulinumtoxine type Cinslibwerd bepaald, omdat dit gegeven een belangrijke rol kan spelen in de etiologie en de epidemiologie van botulismus bij watervogels. Het botulinumtoxine bleek bij degegeven proefomstandigheden zeer resistent te zijn, zowel in de blokjes lever als in de vleespartikels (tabel 39). Vanaf 8 weken was de concentratie van het toxine in de vleespartikels en in de bijbehorende bovenstaande vloeistof meestal 1 log. hoger. Dit zou kunnen samenhangen met dehogere pH diehierin steedswerd gemeten (tabel 40). De blokjes lever bleven tot het einde van de proef goed herkenbaar; bij de vleespartikels werd dit na 8 weken steeds moeilijker en wasbijmenging met slib niet geheel tevoorkomen. Uiteindelijk moesten na 7maanden het slib uit debuis en de niet meer te onderscheiden vleespartikels gezamenlijk als 1 monster 116

worden onderzocht. Dit kwam ook tot uitdrukking in detoxineconcentraties die werden gevonden: de concentratie in debovenstaande vloeistof bleef vanaf de7e maand 1log.hoger alsin de "vleespartikels".

»ver in

.. v

j

2C ••/—''•-.

"i

:s-

3

O

ft\ ft '"'\ •.^//

_

y*r'J

^j^

vC

'V

-

24

25 /e

iO

32

}4

)6

20 /9

Fig. 3. Verloop van toxineconcentration en van de temperaturen van lucht, water en slib, tijdens het onderzoek van de resistentie van het botulinumtoxine in slib van het Talingputje bij Hilvarenbeek. Toxin concentrations and the air, water and mud temperatures over the course of the investigation of the resistance of the botulinum toxin in mud from "Talingputje" near Hilvarenbeek. * Gemiddelde van vleespartikels en bovenstaande vloeistof. ** Gemiddelde van leverblokjes en bovenstaande vloeistof.

Nadat ook tijdens het warme zomerweer geen daling was opgetreden in de concentratie van het botulinumtoxine, werd op 3 oktober 1972 een kleine modificatie in de proefopzet aangebracht met als doel de omstandigheden, waaronder het toxine in een natuurlijk biotoop zal verkeren, iets beter te imiteren. Daartoe werd de totale inhoud van 7 buizen met blokjes lever en slib overgebracht in 7 linnen zakjes (z.g. kaasdoek), die verder op dezelfde wijze bij de resterende buizen in het Talingputje werden geplaatst. De concentratie van het botulinumtoxine in deze blokjes lever werd op gelijke wijze bepaald als is aangegeven voor de lever in de buizen. Uit tabel 39 blijkt dat ook na deze modificatie de resistentie van het botulinumtoxine in een dergelijk milieu zeer grootis. 117

O X> (1) •o

0) t= l-l

> (W

c

£

*>

CU

T3

W U.

S

tù

13

N C

._ +2 o.

E

51
'

o o o o o o o o o o o o o

M

a> c

« a.

•S, «

I = SCU Tol

H

a,

O

^_» O

a

x: T3 e

S Ä x>

X> C

O

M

xi >

E -5

o o o o o o o o o o o o

=e a. Q S

c -* «S

o1)

> O c

T3

> U

_l

O X)

i„

N

S c o

3 5 •* 3 -O c ?g

'S

S,2-S Ë? » t->

3 G«

g 3 m

O

118

tu tu a> c

C\ in a> co

„ e s

E E.2, .2,3.S,3

6

3 * 3

S3

O

11 ti f= X> X>

3H

o. t; o

a> a>


a>

0>

Tabel 40 Overzicht van de pH-waarden tijdens het onderzoek naar de resistentie van het botulinumtoxine. Table of the pH-values observed during the investieation into the resistance of the botulinum toxin.

Tijdsduur van het onderzoek in weken

4 6 8 10 12 16 20 24 28 32 36

pH in de buis InVie blokjes lever

6,9 7,5 6,9 6,5 7,3 6,6 7,1 7,7 6,8 7,3 7,3 gem. 7,1

met lever In de bovenstaande vloeistof 6,1 6,4 6,1 6,2 6,8 6,4 7,0 7,3 6,2 8,1 6,7 gem. 6,7

pH in de buis In de vleespartikels

7,4 7,4 7,5 7,9 7,5 7,8 7,5 8,0 7,4 7,1 7,5 gem. 7,5

met vlees In de bovenstaande vloeistof 8,0 8,2 8,1 8,2 7,5 7,8 7,7 8,4 7,7 7,9 8,0 gem. 7,9

p H i n de blokjes lever geplaa tst in een limten zakje

_ 6,9 7,3 7,1 gern • 7,1

Na 9 maanden, bij de voorlopige afsluiting van dit onderzoek, waren de concentraties van het toxine nog even hoog alsbij het begin van dit experiment. Dit betekent dat een dergelijk gebied zeer langdurig met botulinumtoxine besmet kan blijven, zodat daar toevallig fouragerende watervogels nog na vele maanden aan botulismuskunnen gaan lijden. 6.3.4. Veldproef metwildeeenden Vijftien dagen nadat de wilde eenden in de kooien waren geplaatst, werd in één der kooien in het Talingputje een eend gezien met typische verschijnselen van botulismus. Deze eend stierf na een ziekteduur van 4 dagen en onderzoek van het kadaver bevestigde, dat dit dier aan botulinumtoxine type C was gestorven. Bij de overige 39 eenden werden geen ziekteverschijnselen vastgesteld, zodat de proef op 10oktober 1972 werd beëindigd. Het resultaat van dit onderzoek is alseen bevestiging te zien van de conclusie die reedsgetrokken werd bij het onderzoek vanwater enslib.

119

6.4. SAMENVATTING Bij dit onderzoek werd tijdens het optreden van botulismus bij watervogels een zeer hoge concentratie van het botulinumtoxine type C aangetroffen in putride kadavers van watervogels enin de daarin aanwezige maden van zoöphage vliegen. Deze maden schijnen het toxine oraal op te nemen; indien groeiende maden daarna in een toxinevrij substraat gaanleven,verliezen deze maden het toxine in enkele dagen, hetzij door inactivatie in de darmtractus, of door uitscheiding met de excreta. Er waren dus geen aanwijzingen dat het botulinumtoxine zichin de maden ontwikkelde. In de poppen van zoöphage vliegen werd geen botulinumtoxine aangetoond en in de volwassen zoöphage vliegen tijdens een uitbraak van botulismus een nauwelijks aan te tonen concentratie van het type C-toxine. Deze vliegen zullen als bron van het botulinumtoxine geen rol hebben kunnen spelen; het lijkt aannemelijk dat deze vliegen het toxine hebben opgenomen tijdens hun contacten met toxische kadavers. In dode vissen (palingen) en zoogdieren (katten) is eveneens een belangrijke vorming van het botulinumtoxine type Cmogelijk, doch de rol van de kadavers van deze dieren lijkt bij het massaal optreden van botulismus bij watervogels vooralsnogvan geen betekenis te zijn. Er werd een groot aantal monsters water en slib op botulinumtoxine onderzocht. Slechts in 1geval - water uit de directe omgeving van een putride kadaver — werd toxine type Caangetoond. Door experimenteel onderzoek in het laboratorium werd bovendien aannemelijk gemaakt dat in water en slib uit de gebieden met botulismus geen productie van botulinumtoxine tot ontwikkeling komt, ook niet bij anaërobe omstandigheden. Zelfs deverrijking van dezemedia met dierlijk, organisch materiaal leidde slechts tot een geringe toxinevormingvan maximaal 2 x 1 0 MLD per ml. Pas bij incubatie van deze verrijkte media in een anaëroob milieu werden hogere toxineconcentraties vastgesteld van maximaal 2 • x 103 MLDper ml. De resultaten van deze onderzoekingen werden bevestigd bij een veldproef met 40 wilde eenden, die in grote kooien waren gehuisvest. Het is daarbij mogelijk geweest, dat de eend die aan botulismus stierf, besmet is door toxisch materiaal dat door het wijdmazige gaasdekooi is binnengedreven. Het botulinumtoxine type C, onder experimentele omstandigheden in een milieu gebracht waarin ernstige mate botulismusbij watervogelswas opgetreden, bleek zo stabiel te zijn dat zelfs na 9 maanden nog geen daling van de concentratie van het toxine waarneembaar was. Hogere zomertemperaturen hadden hieropgeen invloed, evenmin alsvariaties in de pH van 6,1 tot 8,4. In het licht alkalische milieu van de vleespartikels was de concentratie zelfs ongeveer 1 log. hoger, alhoewel vermeld wordt dat de toxiciteit beter gehandhaafd blijft in 120

een zuur milieu (Prévôt en Brygoo, 1953). Het onderzoek heeft aangetoond dat een milieu, dat tijdens een botulismusuitbraak door een opeenhoping van toxische kadaversmet type C-toxine isgecontamineerd, gedurende vele maanden voor fouragerende watervogels een potentieel gevaar kan vormen.

121

H O O F D S T U K VII DEGEVOELIGHEID VAN EENDEN VOOR HET BOTULINUMTOXINE

7.1. INLEIDING Een goede kennis van de gevoeligheid van watervogels — met name van wilde eenden - voor de verschillende toxinetypen, isvan veelbelang om het inzicht in deetiologie en deepidemiologie van botulismusbij watervogels te vergroten. Over de gevoeligheid van wilde eenden voor het botulinumtoxine type Czijn echter slechts enkele gegevens bekend. Gunnison en Coleman (1932) vermelden de gevoeligheid van pijlstaarteenden bij orale applicatie, uitgedrukt in subcutane MLD voor caviae, terwijl Boroff en Reilly (1959) in hun summier onderzoek werken met de orale LD 50 voor muizen. Deze beide maten zijn minder gebruikelijk en daarom zal in dit onderzoek de gevoeligheid worden weergegeven in de thans algemeen aanvaarde intraperitoneale LD 50 voor muizen (zie 2.1.6.). De gevoeligheid van eenden werd niet alleen voor het type C-toxine bepaald, maar ook voor 3 andere toxinetypen; type Ben Eomdat deze in Nederland vrij veel bleken voor te komen (hoofdstuk 5) en type Aomdat sommige vogelsvoor dit type gevoelig zijn (Burke, 1919;Prévôt en Brygoo, 1953;Pesce de Fagonda en Sardi, 1967). Verder werd het effect van de applicatie van multipele, subletale doses nagegaan, zowel in verband met het optreden vanhet "Behring phenomeén"als voor debestudering van andere immunologische reacties. 7.2.MATERIALENENMETHODIEKEN De wilde eenden waren in een eendenkooi gevangen. De volwassen vogels wogen tijdens deproeven 0,9 tot 1,2 kg. De Khaki Campbell eenden waren op het Instituut gefokt. Voor de 122

experimenten werden volwassen exemplaren gebruikt met een lichaamsgewicht van 1,4tot 1,9 kg. De Peking eenden waren alsjonge vogels aangekocht. De eenden werden op verschillende leeftijden gebruikt, waardoor de lichaamsgewichten varieerden van 1,3 tot 2,5 kg. De caviae waren afkomstig van de instituutsfokkerij en wogen bijde aanvang van deexperimenten 350-400g. De applicatie van het botulinumtoxine per os geschiedde bij de eenden met behulp van een speciale,gebogen canule, waarmede het toxine rechtstreeks inde oesophagus werd gebracht zodat geen toxine verloren kon gaan. Het totale volume van de vloeistof dat werd toegediend, was per experiment steeds gelijk (5-10 ml), door aan kleine volumen toxine aangepaste hoeveelheden runderbouillon toe tevoegen. De botulinumtoxinen werden verkregen door groei van Cl.botulinumculturen in het medium volgensCardella gedurende 5dagen bij 30°C, waarna de cultuur 15 minuten bij 3.000 rpm werd gecentrifugeerd. Het type C-toxine was afkomstig van stam HV 1970, van de stam van Dinter enKuil (type C-mink)en van stam 81290; het A-toxine van stam NCTC 7272; het B-toxine van stam NCTC 7273 en het E-toxine van stam NCTC8266. Delaatste 3culturen werden in 1963 ontvangen uit Engeland (National collection of type cultures, Central public health laboratory, Londen). De botulinumtoxinen werden afgedekt met paraffine-olie en in kolfjes van 100ml bij4°C bewaard. Deconcentratie van het botulinumtoxine werd in elk kolfje nauwkeurig bepaald in LD 50 per ml, zoals reedsin 3.2.3.werd beschreven. Het gehalte aan toxineneutraliserende antistoffen bij eenden werd als volgt onderzocht: in puntvormige buisjes werd 0,5 ml onverdund, niet geïnactiveerd eendeserum samengebracht met 0,5 ml van een toxineverdunning die 16 LD 50 C-mink toxine per 0,25 ml bevatte. Het mengsel werd na even schudden gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd, waarna het toxineneutraliserend vermogen vanhet eendeserum werd bepaald doorhet mengsel intraperitoneaal in te spuiten bij 2 Swiss Random muizen van 18 tot 20 g. Indien de muizen aan botulismus stierven betekende dit dat in het eendeserum per ml minder dan 64 anti-LD50 toxineneutraliserende antistoffen aanwezig waren. Als controle diende eenzelfde test met normaal paardeserum. Bij onderzoek van dit toxine-paardeserum mengsel bleek hierin na afloop van de incubatie bij 37°C nog slechts 4 LD 50 aanwezig te zijn, in plaats van de te verwachten 16 LD 5 0 . Indien eenzelfde daling bij de eendesera heeft plaatsgevonden - b.v. door de incubatie bij 37°C — dan betekent dit dat het gehalte aan toxineneutraliserende antilichamen permleendeserum eigenlijk ten opzichte van 16LD 50 toxine werd bepaald.

123


3

3

ï= f= 3 3 O O X) X I

c e <ü u

C

•*


00 00

O XI

.. eta t/i T3 £» o. S

3

c

S J1 3 3

ä 8.

u

N

3 3 3 3 00 00

ZZ Z

3 £

O

(U

u

» ._ 3 3

£ ca M -O

XI cu 00 X)

'S > > S3 S Ja

S oo ca <ü

zÜ

6

o o .o c c

X)

cd ca

CL,

O.

'3 '5

t/3

3 3

— .

i « i> S c

3

E E ui

ca

OU . C

O0 ' N

0Û
N

> fc dû O o eu

£3 «

-o e o

vi co C

o o

"H

a> (U j«i • o T3 V o cd N • a T3

>.

rt

i-i

3 3 3 c C 3 3 3 Ui 00 00 3 3 * • t
**

«

z

o o

°c o o o oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo o ©p p p o p p p p p p p

c "3 •o o c -o

u 2 CU

N N m st)

v,

-H*cfsor-r-r^m

"O *o

*= TJ

<s

O

W

gcgccg 222SS'5xS'S'S S.S-S.Eoooooo

ooo o o é ó ó ó o CJ\ 0> CJN C7\ 0*\ 0>>

5> > > > > > — ' —

124

7.3.RESULTATEN 7.3.1. Gevoeligheid voorhet type C-toxine De gevoeligheid voor het botulinumtoxine type C werd bepaald bij wilde eenden, KhakiCampbell eenden enPeking eenden. Wildeeenden De gevoeligheid van wilde eenden bij orale applicatie werd aanvankelijk voor type C-mink toxine en HV 1970-toxine bepaald. Uit tabel 41 blijkt dat de gevoeligheid voor beide typen C-toxinen gelijk was, waarbij de MLDvoor wilde eenden bij orale applicatie op ongeveer 630.000 LD 50 per kg lichaamsgewicht kon worden bepaald. Later werd de gevoeligheid van wilde eenden voorhet botulinumtoxine stam 81290 onderzocht, door aan 2 wilde eenden gedurende 3 opeenvolgende dagen 120.000 LD 50 per os toe te dienen. Opde tweede dag,na 240.000 LD 50 ,leden beide eenden reeds in geringe mate aan botulismus en met de derde toxine-applicatie werd reedsdeletale dosisbereikt (tabel41). Wilde eenden schijnen voor het toxine van Cl. botulinum type Cstam 81290, welke stam uit de lever van een aan botulismus lijdende eend werd geïsoleerd, ietsgevoeliger te zijn. Khaky Campbelleenden De gevoeligheid van Khaky Campbell eenden bij orale applicatie werd uitsluitend bepaald met het C-mink toxine. Uit tabel 42 blijkt dat deze eenden Tabel 42 Gevoeligheid van Khakv Campbell eenden voor het hotnlinumtoxine type C-mink. Sensitivity of Khaki Campbells to botulinum toxin type C. Eend

96 89 85 87 90 95 86 91 88 94 92

Toxinedosis in L D ^ Q Ziekteverloop 21.500 215.000 215.000 215.000 430.000 430.000 645.000 645.000 860.000 860.000 1.075.000

Gezond gebleven. Na 24 uur geringe parese, na 48 uur hersteld. Na 48 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus. Binnen 18 uur gestorven aan botulismus.

125

iets gevoeliger waren voor het botulinumtoxine type C dan wilde eenden. De MLD voor Khaky Campbell eenden werd bij orale applicatie op ongeveer 130.000 LD 50 per kglichaamsgewicht bepaald. Pekingeenden Degevoeligheid vanPekingeenden werd aanvankelijk bepaald met het C-mink toxine. Het bleek dat deze eenden bij orale applicatie veelminder gevoeligwaren voor het botulinumtoxine dan wilde eenden en Khaky Campbell eenden (tabel 43). De eenden wogen tijdens dit experiment 1,3 tot 1,4 kg, zodat de MLD voor het C-mink toxine op ongeveer 3.300.000 LD 50 per kg lichaamsgewicht werd bepaald. Naar aanleiding van deze resultaten werdin eenvolgend experiment eveneens deMLDbij intramusculaire toedieningvan het C-mink toxine bepaald (tabel 43). De Peking eenden wogen nu 1,8 tot 2,0 kg, zodat de MLD bij intramusculaire applicatie op ongeveer 170.000 LD 50 per kg lichaamsgewicht werd bepaald; deze waarde lag zelfs nog hoger dan de orale MLDvan Khaky Campbell eenden. Na de isolatie van Cl.botulinum type C stam 81290 werd de orale gevoeligheid van Pekingeenden voor het type C-toxine eveneens onderzocht met het toxine van deze stam. Het bleek dat Peking eenden voor dit toxine veel gevoeliger waren (tabel 43). De eenden wogen 1,9-2,0 kg, zodat de MLD voor het C-toxine van stam 81290 op ongeveer 316.000 LD 50 per kg lichaamsgewicht werd bepaald. Peking eenden zijn dus voor dit toxine 10 maal zo gevoelig als voor het C-mink toxine. 7.3.2.Gevoeligheidvoortoxinetypen A, B enE Bij de bepaling van de gevoeligheid voor het botulinumtoxine type Aen type Bwerden Peking eenden van ongeveer 2,5 kggebruikt, waarbij debeide toxinen uitsluitend oraal werden toegediend. Uit tabel 44blijkt dat Pekingeenden per os weinig gevoelig waren voor het type B-toxine, maar dat degevoeligheid voor het type A-toxine nog ietsgroter wasdanvoorhet type C-mink toxine: deMLDvan het type A-toxine bedroeg per kglichaamsgewicht 1.280.000 LD 50 enwasvoor het type C-mink toxine bepaald op 3.300.000 LD 50 per kg lichaamsgewicht. Het ziekteverloop week vooral met het type B-toxine duidelijk af van het ziekteverloop, dat bij het type C-toxine waswaargenomen. Deeerste symptomen werden pas na verscheidene dagen zichtbaar en de ziekte had daarna een zeer slepend verloop, zodat eend 256 pas na 21 dagen volledig was hersteld en eend 257 na 30 dagen. Ook eend 259, die type A-toxine had gekregen, waspasna 35 dagen geheel hersteld. De gevoeligheid voor het type E-toxine werd bepaald bij Peking eenden en wilde eenden. De toxiciteit van het E-toxine werd verhoogd door een 126

c

CD OC «1 T3

C

C

G

tu bû cd T3

C CD bû cd T3

iO

*0

un

W)

en C C

cd

cd

G

C

oo es

•a

»o »o cd

C

C CD CD 00 bû c« cd T3 X J

CD

«

2 2 2 2 CD "« 'S 'SCA CA m

•«

c« M

c JD CA

G

s CJ CA

C

G

13

CA

» jU CA

C

C

O

J=

CD

E CA

CA

c

"eu CA

3

0)

o. o o

> CD

3CD

bÛ

•a c

o w

O Cu X) >»

S

1

td

ed

t-4

"C
3

3

-<J- ^1( N
cd

cd

3

**

g £: CU d e g es eu


CN cd

o

M

CA tu

u

H)

h* > 3

t-i

3 3

cd

cd

cd

CD &û

ra «

CU bû

C O

T3 ON

CA

3

3

cd C

3

g g g CA

CA

X 3

'Xi — 3 3

O O O eu Xi - Û X) -C G c c eu

'S

bû

cd cd

cd cd

ed ed

C cU

C tu

C CU

> > O > O O I-*

[A

CA

CD

CD

ki

M

t-H

3 3 C Ol (N

3 3

3 3

3 3

r*

,—i

r» r-


Tj
cd

cd

cd

Ë

eu D û bo b û

bû

o

<3<3;2

D

*äCA3 ^H

CD


CD OD C<J

c C -a 2

U

bû cd

CA

'l-l

CU

C

•a T3 \D VO

5«

c CD

c

> JÜ > eu 3 &3 T3 T3 3

bû

3 3

3

•
cd Û,

bû X3

"rsfr ( N <* (N

3 zzzzzz z

N

eu

G tu

(A CU

3

• *

x

cd cd

C

CU

"t*u« CO t— > > > > 3 3 3 3
3

> OD

O -»-J

e<3

C3

CD

"53 2 t« >-i *ä3 eu

CA

Ë S g g t cd

2

O X> CD G CA

CA

I-I

g g

C

£ Ä

2CJ

> %> > c ff c C

3 CA

G

M

O X> CU CD G CA Où bû cd cd C C (A

cd

tu

3

*ô3

2o 2o 2CJ SA

^

C

c

J£

M

cd 3 G CD OC cd "Ö

U,

)-<

CU

T3

2 "ëSA3

eu a) CU CU X J = J= x:

C


;Z Z Z Z

(U

CD

4=

.C J=

C JD

c C .H Jû

*CD CA

CA

_c

G

3o

CA

U

>

>

bû

c C

CD

CA

C

X 3

t-i CD CA

00 C

cd

eu

rt > > S, 3 > > 3eu > 3 où 3

TeD

CD

l-l

CD

CD

3

•* (N

cd

•a

e o Kl

tu

3 3

00 • *

cd

CA

CA

xi Xi 3

3

O O O X) X) X) C c c

CA

'ë s E E C cd

3

3

g E E

CA

2o 2CJ

Ui eu

g g

3

*CD

cd cd

cd

C

G

CD

CD

£

> O > O

o CA

CA

CA

CD

CD CU OC b û

l-i

t-H

bû

3

•o

C 00 O Tf cd ep

Z OZ Z O

cd cd C eu

cd

3 3

CD bû

3 3

3 3

^~

CN < N r^ t-»

(N

zzz

Q -J

_ O _O _O _ o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o p p q o p q p p p p p o p p p o p o q q p o ö ö ö d ö d ö d d ó ó d ö ö ó ö ö d ö ö ö ö o O

O O O O O O O O O ^ H T t ^ r s e » ( N u - ) O O T f O ' o O » n O m s o ^ u n o o i n ^ - H i n o o H M M vi - ^ ^ H t N c n ^ ^ o r - c »

O

1—i«N
— m

'-H

01) X J

c o M

o

— * y - i r - » x > w - ) r - - o c x ) O N ^ - r - o o \ 0 < N T t r s — * o o ^ . o c o v £ > o o ^ o c o ^ o ^ e ^ o c 7 \ r - o o o o r - - r - r - ( N ( N M t N M f N N n M N ( N ( N ( N i N f S « - - c -

I s - « ^ V) O

r^~ r- r- r- r-

Ô cd ^ d

S

C

3

E

D.

a'

<.

cd

cd

cd

cd ed cd cd cd cd ed ii 2 cd

^

3

3

3

3

E E E E E

e d e d c d ç d c d c d c d c d e d c d c O c d e d i 3 i j ü ü -£J c d c d c d e d c d c d c d c d

00000000022222200000000 ^ ^ -ü -^ ^:

ccçcc

^:^ ^

ËË"E'SEEEE'S"EESE cec f2

cd

~o — o o— o a33

ÙÔÙÙÙÙÙÙÙÙÙÙOÙÙ

ccc

G CCJiC^OOCÎ\C7sc7\0\ 2 ' J 2 f N ( N N N C N C S C N f N

ooooooooooaooooo

127

Tabel44 Gevoeligheid vanPeking eenden voor het botulinumtoxine type Aen type B bij orale applicatie. Sensitivity ofPekins to botulinum toxin type Aand type B after oral application.

Toxinetype

Eend

Type A-toxine Type A-toxine Type A-toxine Type A-toxine Type B-toxine Type B-toxine Type B-toxine

259 243 241 249 255 256 257

Toxinedosis in LD^g 640.000 1.600.000 3.200.000 6.400.000 640.000 6.400.000 10.560.000

Ziekteverloop Na24uurgeringe paralyse, zeer traag hersteld. Gezond gebleven. Na24uurgestorven aanbotulismus. Na30uurgestorven aanbotulismus. Gezond gebleven. Na 11 dagen paralyse, zeer traag hersteld. Na6 dagen paralyse, zeer traag hersteld.

behandeling met trypsine (zie 3.2.1.). Dathet aantal LD 50 vande toxinedosis desondanks laag bleef, wordt veroorzaakt door de omstandigheid datmuizen,in vergelijking met het type A-,B-enC-toxine, relatief minder gevoelig zijn voor het E-toxine (Dolman enMurakami, 1961). Omdat bij eenden perosmethet E-toxine geen ziekteverschijnselen konden worden opgewekt, werd het onderzoek aangevuld meteen parenterale applicatie van het toxine, ten einde demogelijke invloed vaneenslechte resorbtie uithet maagdarmkanaal uit te sluiten. Uit tabel 45 blijkt dat desondanks methet E-toxine bij deze eenden geen ziekteverschijnselen konden worden opgewekt.

Tabel 45 Gevoeligheid vaneenden voor het botulinumtoxine tvpe E. Sensitivity of ducks to botulinum toxin type E.

Type eend Peking eend Peking eend Peking eend Peking eend Wilde eend Wilde eend Wilde eend

128

Toxinedosis in L D J Q

Applicatie

13.200 192.000 32.000 192.000 192.000 32.000 192.000

Peros Peros Intramusculair Intramusculair Peros Intramusculair Intramusculair

Ziekteverloop Gezond gebleven. Gezond gebleven. Gezond gebleven. Gezond gebleven. Gezond gebleven. Gezond gebleven. Gezond gebleven.

7.3.3. Optredenvanhet "Behringphenomeen" Het effect van de toediening van multipele, subletale doses toxine werd onderzocht bij muizen, caviae en Peking eenden. Het botulinumtoxine, dat afkomstig was van stam C-mink, werd bij muizen en caviae subcutaan toegediend, bij Peking eenden oraal. De MLD bij subcutane applicatie werd bij muizen op 3,2 LD5g bepaald, bij caviae op 32 LD 5 Q. Muizen en caviae 10 muizen en 10 caviae ontvingen multipele doses van 1/10 MLD toxine, zoals is aangegeven in tabel 46. Bij deze dieren ontwikkelden zich reeds na enkele toxine-injecties lichte verlammingsverschijnselen van het locomotieapparaat, die geleidelijk duidelijker werden. De muizen en caviae stierven uiteindelijk na een ziektebeeld dat gekenmerkt wasdoor een algemene paralyse, zonder dat de respiratoire moeilijkheden opvallend waren geweest. De voedselen wateropname was enkele dagenvoor de dood bijna geheel verdwenen. Er trad pas sterfte op als de som van de multipele subletale doses ongeveer 1 MLD bedroeg, wat er op duidt dat de sterfte werd veroorzaakt door een accumulatie van het botulinumtoxine. Er werden geenverschijnselen van sensibilisatie, die bij het "Behring phenomeen" optreden, waargenomen. Pekingeenden Voor dit onderzoek werden 2 groepen van 5 Peking eenden gebruikt, die, verdeeld over een periode van 3 weken, 15 doses C-mink toxine per os ontvingen. Aan groep A werd steeds 1/10 MLDtoegediend - nl. 320.000 LD 50 - a a n groep B1/100 MLD. In groep Bzijn geen ziekteverschijnselen waargenomen. In groep Atraden in de derde week bij 3eenden lichte verlammingsverschijnselen op: bij één eend op de 16e dag, nadat het dier 11/10MLDhad ontvangen en bij 2eenden op de 19e dag nadat zij 14/10 MLD hadden ontvangen. De symptomen waren niet progressief en verdwenen nadat de eenden vanaf de 21e dag geen botulinumtoxine meer kregen toegediend. De andere 2eenden vangroep Ableven gezond, ondanks het feit dat zij 15/10MLDtoxine hadden ontvangen. De conclusie kan zijn dat er bij dit onderzoek geen aanwijzingen werden gevonden die het bestaan vanhet "Behring phenomeen", zoalsdat door Matveev in 1959bij muizen en caviae werd beschreven, bij eenden bevestigen. 7.3.4. Immunologische aspecten Het ontstaan van een effectieve immuniteit na het herstel van botulismus werd bij 2 wilde eenden onderzocht. Deze 2 eenden, die in een experiment 224.000 LD 50 botulinumtoxine type C-mink per os hadden gekregen waarvan 129

Q Q

o o o o o o o o o o o o o o oooo o

CL)

e3

o

I«

Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q QQQQQ _)_)_l_l_l,J_lJ_)i_l_l_l

SSSSS

cd

*-H~HmTj-Tfr~-r-~r~c--ooooooooooo

3 •O T3 *o *o *o +-* •*-*

•o c

•O -O <-> ~

~

-M * -

e S I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

!

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I I

I

I

I

I

I

I I

O

w

c o. *

§2

«2 E x E

•S 3

II e -° 3

SS 'S

°

1 3

•O "O -o • " +•• I

•« 'zi

H«J *ëd »O ••-' 3

I

I

I

I

•O

I I

flflfl

f

H-. < -

f

*.

•< «

|

I

|

I <-•

•§-°

•o

c

S o

•2 .a cd O.

£> 3

2 o. Z5 cd

CD

I

S* =»

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I -

I

I

I

I

C X

I ~

s s.&a ca

c o •d 0) c o E e •o »3 CU on o o 3

Q

-4-»

§3 •° •§ -S

ia M 5

•o

a H4

S »-H (N m r t u-i vo ir~

V 3 C A M W 1 W ! < A C A C A V 3 C A . ; cd 2

O

130


ß

S

d

cd n

A

' 3- '£3 1 a2 'S a i 3S a« i' 3i 13 2 ' 31 - >c d> c* d >r t *•c d*• c*•d > i - w B f>d > c d c d c B

1

E

e

•^3

X O

3 O .£>

o

e

^H

61)

e

rt

zij na 2 tot 4 dagen spontaan warenhersteld, werden 12dagenlater onderzocht op toxineneutraliserende antistoffen. Toen het onderzoek van het bloedserum negatief verliep, kregen de 2 eenden de volgende dag weer een subletale dosis botulinumtoxine per os (320.000 LD 5 0 ) met als gevolg dat zij opnieuw aan botulismus gingen lijden. De dieren herstelden na 1tot 3dagen,waarna 9dagen later 1 en 2 MLD resp. (645.000 en 1.128.000 LD 50 resp.) per os werd toegediend. Beide eenden succombeerden thansbinnen 48 uur enbleken dusnog vollediggevoelig te zijn voor botulismus. Het onstaan van toxineneutraliserende antistoffen werd tevens onderzocht bij de 10 Peking eenden, die gebruikt waren bij het onderzoek betreffende het optreden vanhet "Behring phenomeen". Aan dezeeenden wasin 3weken per os 15 x 1/10 resp. 1/100 MLD botulinumtoxine type C-mink toegediend. Het bloedserum werd 3 en 31 dagen na de laatste applicatie van het toxine onderzocht op toxineneutraliserende antistoffen. Dit onderzoek verliep geheel negatief, ook bij de 3 eenden die in de 3e week geringe verschijnselen van botulismushadden vertoond. Beide onderzoekingen wijzen er op dat het botulinumtoxine type C bij eenden geen aantoonbare immuniteit opwekt, zodat eenden, die in een met toxine besmet gebied subletale doses van het toxine opnemen, nog gevoelig blijven voor een minimum letale dosis.

7.4. SAMENVATTING In de onderzoekingen van dit hoofdstuk werd eerst de gevoeligheid van eenden voor verschillende botulinumtoxinen bepaald, terwijl verder enkele immunologische aspecten werden onderzocht, die kunnen optreden nadat eenden het botulinumtoxine type Chebben opgenomen. Zowel wilde eenden, Khaky Campbell eenden alsPekingeenden bleken per os gevoelig te zijn voor het botulinumtoxine type C; de gevoeligheid varieerde per species vrij sterk, waarbij vooral de grotere ongevoeligheid van Peking eenden voor het type C-mink toxine opvallend was. Er bleek echter een duidelijk verschil in gevoeligheid voor de botulinumtoxinen van de verschillende type C-stammen aanwezig te zijn, waarbij wilde eenden, maar vooral Peking eenden, gevoeliger waren voor het type C-toxine van stam 81290. Voor het meest virulente type C-toxine bedroeg de orale MLD per kg lichaamsgewicht voor Khaky Campbell eenden 130.000 LD 5 0 , voor Peking eenden 316.000 LD 50 en voor wilde eenden 360.000 LD 5 0 . Het onderzoek naar de gevoeligheid voor het botulinumtoxine type A en B, dat bij Peking eenden werd uitgevoerd, weesuit dat dezeeenden weiniggevoelig zijn voor het type B-toxine; voor het type A-toxine bedroeg de MLD per os 1.280.000 LD 50 per kg lichaamsgewicht. Het klinische herstel van botulismus, 131

veroorzaakt door de toxinetypen A en B,bleek opvallend trager te verlopen dan bij type C. Met het type E-toxine werden bij wilde eenden en bij Peking eenden geen ziekteverschijnselen opgewekt, noch na orale noch na intramusculaire applicatie. Het bleek dat er geen effectieve immuniteit wasontstaan bij wilde eenden na het herstel van botulismus, terwijl na de orale toediening van multipele subletale dosesvan het botulinumtoxine type Cevenmin toxineneutraliserende antistoffen konden worden aangetoond bij Peking eenden. Bij muizen, caviae en Peking eenden werd tenslotte een onderzoek ingesteld naar het voorkomen van het "Behring phenomeen", dat zou optreden na de applicatie van multipele subletale doses van het botulinumtoxine. Bij het type C-toxine werd dit phenomeen van sterk verhoogde gevoeligheid voor het toxine, die zou worden veroorzaakt door sensibilisatie, niet waargenomen. De proefdieren succombeerden pas nadat ongeveer 1 MLD van het type C-toxine was toegediend, wat er opwijst dat hier sprake isvan een accumulatie van het toxine.

132

HOOFDSTUK

VIII

MORFOLOGISCHE, CULTURELE, BIOCHEMISCHE EN SEROLOGISCHE ONDERZOEKINGEN VAN DE GEISOLEERDE CL. BOTULINUM STAMMEN 8.1 INLEIDING Bij de identificatie van Cl. botulinum speelt het geproduceerde toxine de belangrijkste rol. De onderverdeling van Cl. botulinum berust op serologische verschillen tussen de botulinumtoxinen, zodat men thans 6typen onderscheidt. Tussen deze 6 typen blijken bij verder,bacteriologisch onderzoek eveneens morfologische, culturele en biochemische verschillen te bestaan,hoewel er ook eigenschappen zijn die de diverse toxinetypen gemeen hebben. Ook bij één toxinetype kunnen nog opvallende verschillen bestaan. Zo zijn bij type B en type F proteolytische en nonproteolytische stammen beschreven; de Europese B-stammen zouden overwegend nonproteolytisch zijn en de in Amerika geïsoleerde B-stammen steeds proteolytisch. De Europese B-stammen vertoonden daarentegen een grotere saccharolytische activiteit. Bij Cl.botulinum type Cbestaat omtrent deverschillende eigenschappen veel onduidelijkheid, hetgeen vooral samenhangt met de verwarring die er heerst bij de onderverdeling van type Cin de subtypen Ca en Cß.DeC/3-stamvan Seddon bleek geen saccharolytische activiteit te bezitten, terwijl deinAmerika geïsoleerdeCa-stammen welenkele koolhydraten omzetten (Gunnison enMeyer, 1929b). Depositie die dein Europa geïsoleerde C-stammen innemen,istamelijk onduidelijk. De in Frankrijk geïsoleerde en bij het "Instituut Pasteur" te Parijs getypeerde stammen bleken steeds van het type Cj3 te zijn (Prévôt en Brygoo, 1953), waarbij de typering plaats vond met het antitoxine C-Pasteur. Bulatova et al (1967) vermelden dat enkele in de USSR bij nertsen geïsoleerde stammen ook van het type C/3zouden zijn. Deze auteurs beschrijven bovendien dat zij geen toxogene reinculturen van type C konden verkrijgen en menen dat de verontreiniging met bepaalde symbionten noodzakelijk is voor de productie van het botulinumtoxine. Segner et al (1971) zagen enkele verschillen in de saccharoly133

tische activiteit tussen C-stammen die in Amerika uit maritieme sedimenten waren geïsoleerd en Europese C-stammen dievanhet vasteland afkomstig waren. Geheel nieuwe inzichten zijn naar voren gebracht door onderzoekingen waarbij de rol werd onderzocht, die bacteriophagenbijdetoxiciteit van type C-en type D-stammen spelen (Eklund et al, 1971; Eklund en Poysky, 1972). Het verschil tussen Ca en Cj3 zou samenhangen met de aanwezigheid van een bacteriophaag CE0. Een toxische Cl. botulinum type Ccultuur, waarin deze phaag als een prophaag voorkomt, zou alsCaworden getypeerd omdat de toxinefactor ^ sterk domineert. Bij verlies van de CE/3-bacteriophaag wordt de stam nontoxisch of er resteert nog iets C2-toxine dat vooral na trypsinisatie is aan te tonen. Een dergelijk cultuur zou dan alsCßworden getypeerd. De auteurs onderzochten niet de culturele en biochemische eigenschappen van deverschillendeCl. botulinum-stammen, diebij dezeexperimenten ontstonden. Het onderscheid tussen Ca en Cj3wordt nog extra bemoeilijkt omdat van de in het buitenland verkrijgbare type Cantisera niet wordt opgegeven,welke antitoxinen aanwezig zijn. Het onderzoek van Jansen (1971) heeft aangetoond, dat het Internationale Standaard type C antitoxine uit Kopenhagen zowel toxinefactor Ci alsC2bevat en bovendien nogingeringe mate factor D.Jansen (1971) en Eklund en Poysky (1972) vermelden bovendien dat de samenstelling van de cultuurmedia invloed heeft op de verhouding waarin de toxinefactoren gevormd worden. Uitgaande van deze gegevens werden een aantal onderzoekingen uitgevoerd naar de eigenschappen van de in Nederland geïsoleerde Cl. botulinum-stammen. 8.2 MATERIALEN ENMETHODIEKEN De herkomst van de meeste Cl. botulinum-stammen is reeds vermeld in tabel 33.Type C-stammen, die kort voor en tijdens dit onderzoek in gevallenvan botulismus bij andere dieren werden geïsoleerd,werden ter vergelijking eveneens in onderzoek genomen. Deherkomst van deze C-stammen wasalsvolgt: Stam 26656 werd in 1968geïsoleerd bij een gevalvan botulismus bij paarden in Zeeland; zowel uit het kadaver van de kat als uit de levervan een der gestorven paarden werd een reincultuur verkregen. Stam 43065 werd in 1969 geïsoleerd uit de lever van een rund uit de omgeving van Bergen op Zoom; vermoedelijk was hier sprake van botulismus, doch het botulinumtoxine kon niet worden aangetoond. Stam 61884 werd in 1971 geïsoleerd uit spierweefsel van een rund, dat gestorven wasaan botulismusin de omgevingvan Alkmaar. Stam 74902 werd in 1972 geïsoleerd bij een geval van botulismus op een groot pluimveebedrijf in Ulvenhout uit de lever van een kip. Stam 84124 werd in 1972 geïsoleerd bij een geval van botulismus bij runderen in Drente; uit de lever van een der runderen werd een reincultuur ver134

kregen. Behalve deze in Nederland gei'soleerde C-stammen werden ook nogin onderzoek genomen de Cl. botulinum type C-mink cultuur, dievan Dinter en Kuiluit Zweden werd ontvangen en 2 culturen die uit Londen uit de "National collection of type cultures" afkomstig waren, nl stam NCTC 8548, die type Cßen stam NCTC 8264,die type Cawerd genoemd. De eigenschappen van de in Nederland gei'soleerde type A-, type B-en type E-stammen (tabel 33), werden vergeleken met een type A-, type B- en type E-stam die uit dezelfde collectie afkomstig waren, nl NCTC 7272 (type A), NCTC 7273 (type B)en NCTC 8266 (type E). Alle culturen werden nauwkeurig op reinheid onderzocht door met elke stam minstens 3 passages op HIS (sporadisch op BHR) en in leverbouillon te maken, waarbij van de vaste voedingsmedia steeds 5 kolonies werden geënt in leverbouillon en de volgende HIS geënt werd uit de meest toxogene van de 5 leverbouillonculturen. Van alle type C-stammen werden zo sterk toxogene culturen verkregen met een toxineconcentratie van minstens 104 en meestal van 2x 105 MLDper ml. Voor de samenstelling van de voedingsmedia, die bij het onderzoek van de morfologische, culturele en biochemische eigenschappen werden gebruikt, kan worden verwezen naar hoofdstuk 3. Na hittefixatie van de aan de lucht gedroogde bacteriepreparaten werd de kleuring volgens Gram uitgevoerd volgens richtlijnen van het Rijks Instituut voor de Volksgezondheid: 1 minuut kleuren met eengefiltreerde kristalvioletaniline-oplossing; afspoelen met water; 1 minuut behandelen met de lugoloplossing; afspoelen met ethanol (gehalte tenminste 95%); gedurende 1 minuut ontkleuren met ethanol (gehalte tenminste 95%);afspoelen met water; 1 minuut kleuren met een 0,2%waterige fuchsine-oplossing. De kristalvioletoplossing met pH 8 werd alsvolgt bereid: 0,2 gkristalviolet (Merck) oplossen in 10ml ethanol 96%; 3,2 g aniline p.a. mengen met 90ml gedestilleerd water, krachtig schudden gedurende 15 minuten en door een nat filter filtreren;daarnahet anilinewater mengen met de kristalvioletoplossing. De samenstelling van de lugoloplossing luidde: 1 gjodium, 2g kaliumjodide en 300 mlgedestilleerd water. Bij het serologisch onderzoek werd gebruik gemaakt van botulinumtoxine type F van de originele Langeland-stam (Maller en Scheibel, 1960). Deze stam werd ontvangen van M.W.Eklund, Pacific Fishery Products Technology Center, te Seattle.Met type D-toxine kon geen onderzoek worden verricht aangezien van dittypenietdebeschikkingkonwordenverkregenovereentoxogenestam. Verder was het botulinumtoxine type A afkomstig van stam NCTC 7272,het B-toxine 135

van stamNCTC7273enhet E-toxine vanstam E-8266. De botulinumtoxinen werden verkregen door groei van Cl.botulinum-c\i\turen in het medium volgens Cardella gedurende 5 dagen bij 30°C, waarna de cultuur 15 minuten bij 3.000 rpm werd gecentrifugeerd. Detoxinen werden, afgedekt door paraffine-olie, bij 4°C bewaard in kolfjes van 100ml.De concentratie van het botulinumtoxine werd in elk kolfje nauwkeurig bepaald in LD50 per ml,zoalsreedsin 3.2.3 werd beschreven. Het Internationale Standaard type C antitoxine werd uit Kopenhagen ontvangen. Dit gevriesdroogde antiserum werd opgelost in 5ml aqua destillata, zodat het toxine-neutraliserend vermogen 20.000 MLD per ml zou bedragen. Dit antitoxine werd met dereedsvermelde antitoxinen C-mink en C-Pasteur in het serologisch onderzoek betrokken. Het Ca-stam NCTC 8264 antitoxine werd verkregen door immunisatie van2 konijnen. Het toxoid werd op dezelfde wijze bereid als het C-mink toxoid (zie 3.1.2.1.), waarna de konijnen met stijgende hoeveelheden toxoid werden ingespoten. Het antiserum werd verzameld nadat vastgesteld wasdat de antitoxische werkzaamheid van debeide seravoldoende hoogwas. De specificiteit van het C-mink antitoxine werd alsvolgt onderzocht: 0,25 ml onverdund C-mink antitoxine werd in puntvormige buisjes samengebracht met 0,25 ml van een toxineverdunning, die slechts 4 tot 16 LD50 van de te onderzoeken toxinen type A, B, E of F bevatte. Het mengsel werd na even schudden gedurende 60 minuten bij 37 Cgezet, waarna het toxine-neutraliserend vermogen werd bepaald door per muis 0',5 ml van het mengsel intraperitoneaal in te spuiten. Er werden per toxineverdunning 4 Swiss Random muizen van 18 tot 20ggebruikt. Indien neutralisatie vanhet botulinumtoxine plaatsvond, werd dit toxine-neutraliserend vermogen (TNV) uitgedrukt in anti-LD5Qper mldoor toepassing van de berekening volgens Reed en Muench (1938).Alscontrole diende eenzelfde test met normaal paardeserum. Op soortgelijke wijze werd het TNV van het C-mink antitoxine vergeleken met het C-Pasteur antitoxine en met het Internationale Standaard type C antitoxine. Van deze antitoxische serawerden nu tienvoudige serumverdunningen in aqua destillata gemaakt, waarna 0,25 ml serumverdunning werd samengebracht met 0,25 mlvaneen type C-toxineverdunning dievan 16tot 54 LD50toxine per 0,25 ml bevatte. De incubatie geschiedde eveneens gedurende 60 minuten bij 37°C en er werden per serumverdunning 4 muizen gebruikt. DeTNV werd weer in anti-LÜ5oper ml uitgedrukt. Op dezelfde wijze werd het TNV van het C-mink antitoxine onderzocht ten opzichte van de C-toxinen van de in Nederland geïsoleerde Cl. botulinum typeC culturen en van de toxinen van Cj3-stam NCTC 8548 en Ca-stam NCTC 8264. Ook nu werd deTNV uitgedrukt in anti-LÜ5oper ml.

136

8.3. RESULTATEN 8.3.1. Morfologische, culturele enbiochemische eigenschappen 8.3.1.1. Cl.botulinum type C Bij de beoordeling van de morfologische en culturele eigenschappen dient steeds rekening te worden gehouden met deomstandigheden waaronder de groei heeft plaatsgevonden. Als belangrijkste kunnen worden genoemd de incubatietijd, de incubatietemperatuur, de samenstelling van het voedingsmedium en de kwaliteit van de anaërobe omstandigheden. Voor dit onderzoek werd Cl. botulinum type C op HIS en BHR gedurende 48 uur bij 37°C in een anaëroben-vat geihcubeerd. Op HIS bleek het kolonie-aspect nogaf te variëren, waarbij als uitersten de volgende kolonietypen waren te onderscheiden: 1) Een deel van de C-stammen groeide hierop met tamelijk platte,vrijwel kleurloze kolonies zonder een verheven centrum, een fijn gegranuleerd kolonieoppervlak en met slechts kleine uitlopertjes langs de rand van de kolonie. Ruim losliggende kolonies hadden meestal een doorsnede van 4 tot 5mm (Foto 5).*

Foto 5 Cl. botulinum type C stam HV 1970. Kolonietype 1, groei op HIS na een incubatieperiode van 48 uur bij 37°C. Vergroting 10 x. Cl. botulinum type C strain HV 1970. Colony type 1, grown on HIS for 48 hours at 37°C. Magnification 10 x. * De foto's van kolonies van Cl. botulinum -culturen werden genomen met een techniek die beschreven is door Johannsen (1964).

137

2) Een ander deelvan de C-stammen groeide opHISmet zeer ongelijke kolonies, doordat deze stammen neiging tot zwermen vertoonden; de kolonieranden waren zeer onregelmatig met talloze zeer fijne, gekrulde uitlopers, waardoor de grootte en de vorm van de kolonies sterk varieerde;erwerden vaakmicrokolonies waargenomen; het kolonie-oppervlak was tamelijk oneffen zonder dat een verheven centrum was te bemerken; de kolonies waren eveneens vrijwel kleurloos (Foto 6).

Foto 6 Cl. botulinum type C stam 61884. Kolonietype 2, groei op HIS na een incubatieperiode van 48 uur bij 37°C. Vergroting 10 x. Cl. botulinum type C strain 61884. Colony type 2, grown on HIS for 48 hours at 37°C. Magnification 10 x.

Veel C-stammen vertoonden een kolonie-aspect dat tussen deze uitersten in lag; de verschillen tussen kolonietype 1en 2 werden bovendien enigszins beïnvloed door devochtigheidsgraad van de voedingsbodem. Dit verschil in kolonietype was bij groei op BHR gedeeltelijk verdwenen.De groei van de C-stammen was hierop iets weelderiger, de kolonies waren meer verheven en hadden meestal een doorsnede van 4 tot 6mm;de kolonieranden vertoonden kleine uitlopertjes, waarbij somsweer de neiging tot zwermen waste bespeuren; het kolonie-oppervlak was zeer fijn gegranuleerd en de kolonies waren ietsmeer glimmend (Foto 7). Zowel op HISalsop BHRwerd hémolyse waargenomen. Bijsommige C-stammen was na 48 uur noggeenvolledige opheldering aanwezig,bij andere stammen wasditwelhetgeval.Nalangerbebroedenwasbijalle C-stammen (3-hemolysewaar 138

Foto 7 Cl. botulinum type C stam 61884. Groei op BHR na een incubatieperiode van 48 uur bij 37°C. Vergroting 10 x. Cl. botulinum type C strain 61884. Grown on BHR for 48 hours at 37°C. Magnification 10 x.

te nemen, die zich tot even buiten dekolonies uitbreidde. In leverbouillon, CMM en FEM groeiden de C-stammen allen op dezelfde wijze, zowel bij 30° als 37°C. Gedurende de eerste dagen trad sterke groei op met veel gasvorming. Na enkele dagen nam dezegasvorming duidelijk af en na5 tot 7 dagen was de bovenstaande vloeistof vrijwel helder geworden. In deze periode werden ook reeds de hoogste toxineconcentratiesvastgesteld. De stukjes lever, vleespartikels en "egg meaf'-partikels vertoonden ook na langer incuberen geen verschijnselen die op proteolyse wezen. De morfologie van type C werd onderzocht na groei gedurende 2 dagen bij 37°C op HIS. In preparaten die volgens Gram zijn gekleurd, werden tussen de diverse C-stammen geen wezenlijke verschillen waargenomen. Cl. botulinum type C was een vrij groot Gram-positief staafje met afgeronde uiteinden,waarbij veel metachromasie was waar te nemen; er zijn na 48 uur vaak reeds veel Gramnegatieve staafjes en schimmen van bacteriën aanwezig. De staafjes lagen meest apart, maar er werden ook korte ketens waargenomen. Erwerden slechtsweinig bacteriesporen gezien; deze lagen subterminaal of terminaal (Foto 8). Een toename van het aantal sporen bleek meestal samen te hangen met een afname van de toxiciteit van de cultuur. De resultaten van het onderzoek naar de biochemische eigenschappen zijn weergegeven in tabel 47. Type C bleek ook in het medium volgens Löffler geen proteolytische activiteit te bezitten. Gelatine werd meestal wel vervloeid, al139

**** » V

Foto 8 C/. botulinum type C stam 80671. Kleuring volgens Gram. Vergroting 1200 x. Cl. botulinum type C strain 80671. Gram's strain. Magnification 1200 x.

hoewel de incubatieperiode soms tot 18 dagen moest worden verlengd.Dereacties van de lakmoesmelk vertoonden verschillen; bij de meeste C-stammen werden geen veranderingen gezien, maar enkele stammen vertoonden zuurvormingmet coagulatie van de caseïne. In het medium volgens Kligler kon geen vorming van H2S worden aangetoond, maar met behulp van een papiertje gedrenkt in loodacetaat was bij een aantal stammen in CMMweleen geringevormingvan H2Svast te stellen. De saccharolytische activiteit bleek zich tot enkele koolhydraten te beperken. De groei van de C-stammen in de koolhydraatmedia verliep trager dan bij deBen E-stammen. De incubatieperiode werd daarom bij de C-stammen verlengd tot 15 dagen, waarbij een eerste onderzoek na 6 dagen plaatsvond. Uit tabel 47 blijkt dat alleen glucose en ribose door alle C-stammen werden omgezet. Een minimale pH van 4,70werd gemeten inde glucose bij stam HV 1970.Bij inositol verliepdefermentatie vaaklangzamerenbij2C-stammen wasde omzetting onvolledig (pH tussen 6,0 en 6,2). Maltose, fructose en mannose werden door de meeste C-stammen eveneens omgezet, maar er waren ook stammen waarbij dit onvolledig (pH tussen 6,0 en 6,2) of zelfs geheel negatief verliep. Fermentatie van glycerine, melibiose en galactose kon bij de meeste C-stammen niet worden aangetoond; bij enkele stammen werd echter wel een dubieuze of positieve reactie vastgesteld. In de andere onderzochte koolhydraten werd geen zuurvorming waargenomen. 140

2 '2

-H + + +

I +1 I

+ ++ + ++++ +++

£1

'S,

S

00 I

i

I

i

i + +1 +

i

i

1 1 1

+

o

•a «

+ + + +I+ + + + + +

I

•ö ^

+ + + + + + + + + +I+ + + + +

3 O u

M X) C 3 O C

« E E

+ + + +I+ + + +

't/i

+ +1 + + +

G

«5

'S U £! / î 4J

&U

>>

+ + + + + + + + +

S 3 .g S 3 3 •S

I + + + + +

> i

C 2

+ ++++++++++++++

-C

O O. -O

SC

-a

+ +++++ C

ca

~5

y .2

t> tu C u i>

•a c

rt ÏÏ-sitf c(U

i

o

i

I

I

2& ~

J3

EE o13 •2 2

SS a

>

u o

5

s ä "o 2 o •a 'S + + + + + + +

I +

+ + + + + + T3

<-i . oc V un
—« c^ c* — oc — o in vo x (N —' ir> o J jg M -^— *-~ ^ ^ i ^ ^ oQ »*- » ^ 2 ce oc oc

r-^

ëë Z Z

X X a. a. +

H

I

S

8.3.1.2. Cl.botulinum typeB De morfologische en culturele eigenschappen van type B, stam WB 1971, werden minder intensief onderzocht als die van type C,omdat de belangstelling vooral uitgingnaar de biochemische eigenschappen. Q Degroeivan stam WB1971 bleek op HISen BHRbeter bij 30°C dan bij 37 C te zijn, zodat de eigenschappen van deze stam bij 30°C werden onderzocht. Stam WB 1971 vormde op deze voedingsmedia kolonies die enigszins met het Ie kolonietype van de C-stammen overeenkwam (Foto 9). De uitlopers van de kolonie waren over het algemeen meer afgerond, terwijl er ook kolonies met

£?': &

'»jf-

_

9" -*»- —* • » . _

r £-.*S^:-

^

Foto 9 O. botulinum type B stam WB 1971. Groei op HIS na een incubatieperiode van 48 uur bij 30°C. Vergroting 15 x. Cl. botulinum type B strain WB 1971. Grown on HIS for 48 hours at 30 C. Magnification 15 x.

geheel gladde randen voorkwamen. De stam vertoonde na 48 uur tot 72 uur ß-hemolyseopHIS en op BHR. Het kolonietype kwam goed overeen met typeB stam NCTC 7273. Bij groei in leverbouillon, CMM en FEM werden geen verschijnselen waargenomen die op proteolyse wezen. De groei was in deze media zeer goed met veelgasvorming,diena enkele dagenverminderde. Stam WB1971 bleek bij de kleuring volgens Gram eveneens tamelijk Gram-labiel te zijn. De staafjes lagen meest apart en vertoonden veel overeenkomst met type C. Er werden weinig sporen aangetroffen. De resultaten van het biochemische onderzoek zijn weergegeven in tabel 48 en zijn vergeleken met de eigenschappen Van de B-stam NCTC 7273. Het blijkt dat er tussen beide stammen enkele duidelijke verschillen aanwezigwaren.Dein 142

Nederland geïsoleerde stam WB 1971 bleek nonproteolytisch te zijn, terwijl de saccharolytische activiteit veel groter was. De stam kan gekarakteriseerd worden als een typische Europese B-stam, die grote overeenkomst vertoonde met de oorspronkelijke stam van van Ermengem. De eigenschappen van stam NCTC 7273 kwamen overeen met dievan de meeste Amrikaanse B-stammen (Gunnison en Meyer, 1929b).

Tabel48 Biochemische eigenschappen vanCl. botulinum typeAenB;incubatiegedurende 6dagenbij 30°C.Vergelijking vanstam 78638 enstam WB1971metandere type A-en B-stammen. Biochemical characteristicsofCl.botulinum typeAand B;incubation for6daysat30°C. Comparison ofstrain 78638 and strainWB1971 with other type A-and B-strains. CI. botulinum type A 78638 NCTC 7272 Proteolyse Lakmoesmelk H2S-vorming Gelatine vervloeiing Glucose Sucrose Maltose Fructose Glycerine Dextrine Salicine Inositol Adonitol Sorbitol

+ coagulatie en digestie ++ + +

CI. botulinum type B StamWB 1971 NCTC 7273

+ coagulatie en digestie + + +

-

-

+

+ +

± -

-

+ + + + + + +

Stam 162*

+ coagulatie en digestie ++ + +

+ +

± -

+

-

+

±

+ + +

±

n.t. at. + + + + + + +

+ +

Bijdereactiesvan dekoolhydraten betekent: + : pHlager dan6,0;indicator werdgeel; ± : pHtussen6,0en6,2;indicatorvertoonde mengkleuren; - : pHboven 6,2;indicator werd blauwgroen. Dereactiewasnegatief met stam 78638,NCTC7272,WB1971enNCTC7273inlactose, mannitol,dulcitol,galactose,inuline,arabinose,raffinose, mannose,rhamnose,xylose,ribose enmelibiose. *Dezegegevenszijn overgenomen vanGunnison enMeyer(1929''). Stam 162zou overeenkomen met deoorspronkelijke stamvan van Ermengem. 143

8.3.1.3. Cl. botulinum type A De morfologische, culturele en biochemische eigenschappen van de in Nederland geïsoleerde stam 78638 kwamen overeen met stam NCTC 7272. Bij de kleuring volgens Gram werden vrij veel terminaal en subterminaal gelegen sporen gezien. Beide stammen groeiden goed op HIS en BHR, zowel bij 30° als bij 37°C, waarbij het kolonietype enigszins overeenkwam met type B (Foto 10). Na 48 uur vertoonden de voedingsbodems ß-hemolyse onder en direct rondom de kolonies. In leverbouillon, CMM en FEM traden na enkele dagen verschijnselen

Tabel49 Biochemische eigenschappen van Cl. botulinum type E;incubatie gedurende 7 dagen bij 30°C.Vergelijking vandestammen 69361 en 81509 met stam NCTC8266. Biochemical characteristics of Cl. botulinum type E;incubationfor 7daysat 30°C. Comparison of the strains69361 and 81509 with strain NCTC8266. Stam 69361

Stam NCTC 8266

X

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Sorbitol Mannose Glycerine

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Adonitol

+

+

+

Ribose Dextrine

+

+

+

+

Arabinose

±

-

± -

Proteolyse Lakmoesmelk H2S-vorming Gelatine vervloeiing Glucose Sucrose Maltose Fructose

-

Stam 81509

ietszuurvorming

X

Bijdereactie van dekoolhydraten betekent: pH lager dan 6,0;indicator werdgeel; pH tussen 6,0 en6,2;indicator vertoonde mengkleuren; pH boven 6,2;indicator werd blauwgroen. betekent: gelatine pasna 14dagenvervloeid. Dereactie wasnegatief inlactose, mannitol, dulcitol galactose, inuline, inositol, raffinose,rhamnose, salicine,xylose en melibiose. 144

;*VN

V*

Foto 10 Cl. botulinum type A stam 78638. Groei op HIS na een incubatieperiode van 48 uur bij 30°C. Vergroting 12,5 x. Cl. botulinum type A strain 78638. Grown on HIS for 48 hours at 30°C. Magnification 12,5 x.

van proteolyse op. De resultaten van het biochemisch onderzoek zijn weergegeven in tabel 48.Desaccharolytische activiteit bij 30°C blijkt overeen te komen met een proteolytische type Bcultuur (stam NCTC 7273). 8.3.1.4. Cl.botulinum typeE De morfologische, culturele en biochemische eigenschappen van de beide in Nederland geïsoleerde E-stammen 69361 en 81509, werden vergeleken met Estam NCTC 8266. Er werden uitsluitend toxogene culturen van de 3 E-stammen in onderzoek genomen. De groei van de E-stammen bleek op HIS en BHR bij 30°C beter te zijn dan bij 37°C, zodat het onderzoek bij een incubatietemperatuur van 30°C plaatsvond. De morfologische en culturele eigenschappen van de 3 type E-stammen bleken goed met elkaar overeen te komen. De kolonies op HIS en BHR waren veel kleiner dan bij type Ben type C, terwijl de randen meestal glad waren of slechts enkele korte uitlopertjes bezaten (Foto 11).Na48 tot 72 uur vertoonden dezevoedingsbodems0-hemolyseonderenrondom dekolonies. Degroeiinleverbouillon, CMM en FEM verliep onder zeer veel gasvorming, veel sterker dan bij type C. Er werden geen verschijnselen van proteolyse waargenomen, ook niet na langer incuberen. 145

Foto 11 Cl. botulinum type E stam NCTC 8266. Groei op HIS na een incubatieperiode van 48 uur bij 30°C. Vergroting 15 x. Cl. botulinum type E strain NCTC 8266. Grown on HIS for 48 hours at 30°C. Magnification 15 x.

Bij de kleuring volgens Gram bleken ook de type E-stammen tamelijk Gramlabiel te zijn. De staafjes waren over het algemeen kleiner dan bij type Cen type B. Er werden duidelijk meer, meestal vrijliggende sporen waargenomen (Foto 12).

Foto 12 Cl. botulinum type E stam 81509. Kleuring volgens Gram. Vergroting 1200 x. Cl. botulinum type E strain 81509. Gram's strain. Magnification 1200 x.

146

De resultaten van het biochemische onderzoek van de 3E-stammen zijn weergegeven in tabel 49. Het blijkt dat er slechts ondergeschikte verschillen voorkwamen bij de fermentatie van enkele koolhydraten. 8.3.2. Serologisch onderzoek 8.3.2.1. Specificiteit vanhet C-mink antitoxine Het C-mink antitoxine bleek tegenover A-, B-, E- en F-toxine geen toxineneutraliserend vermogen te bezitten,ook niet als 0,25 ml onverdund C-mink antitoxine tegenover zeer geringe concentraties van resp. 5 en 4 LD50 toxine werd onderzocht (tabel 50). Dit betekent dat de specificiteit van het C-mink antitoxine zeker aan de te stellen eisen heeft voldaan: bij de typering van de botulinumtoxinen bevatte 0,5 ml van het toxine-antitoxine-mengsel immers steeds slechts 0,05 ml antitoxine (3.2.1.). Tabel 50 Onderzoek naar de specificiteit van het C-mink antitoxine. Determination of the specificity of the C-mink antitoxin. Hoeveelheid C-mink antitoxine

Toxinetype en concentratie

Sterftecoefficiënt van de muizen*

0,25 ml onverdund „

16 LD50 A-toxine

4/4 4/4 4/4

..

10 5

.. ..

0,25 ml onverdund „

16 LD50 B-toxine 4 »

4/4 4/4

0,25 ml onverdund

16 LD50 E-toxine 5 »

4/4 4/4

16 LD50 F-toxine'

4/4 4/4 4/4

.. 0,25 ml onverdund

„ ..

8 4

» ..

TNV in anti-LD5Q per ml.

* Teller : aantal gestorven muizen; Noemer: aantal ingespoten muizen.

8.3.2.2. Vergelijkend onderzoek van C-mink antitoxine met enkele andere type C-antitoxinen Het doel van dit onderzoek wasmeer inzicht te verkrijgen in de antigeenstruc147

tuur van het C-mink toxine en antitoxine. Daartoe werd het TNV van het C-mink antitoxine vergeleken met enkele andere type C-antitoxinen in een kruisimmuniteitstest.Deresultaten zijn weergegeven in de tabellen 51 en 52. Tabel 51 Kruisimmuniteitstest tussen type C-mink en type C-Pasteur; toxineneutraliserend vermogen in anti-LD5Q per ml. Cross-immunity test of type C-mink and type C-Pasteur; toxin neutralizing capacity in antiLD50 per ml. Toxinetype Antitoxine C-mink C-Pasteur

C-mink

C-Pasteur

64.000* 640.000*

51.200** 512.000**

* :TNV bepaald met 50 LD50 C-mink toxine. ** : TNV bepaald met 40 LD50 C-Pasteur toxine.

Tabel 52 Kruisimmuniteitstest tussen type C-mink en subtype Ca, stam NCTC 8264; toxineneutraliserend vermogen in anti-LD5Q per ml. Cross-immunity test of type C-mink and subtype Ca, strain NCTC 8264; toxin neutralizing capacity in anti-LDso per ml.

Antitoxine C-mink Ca, stam NCTC 8264, partij I Ca, stam NCTC 8264, partij II

C-mink

Toxinetype Ca, stam NCTC 8264

64.000lJ 67.840 2 ) 67.840 2 )

30.720 3 ) 20.480 4 ) 20.480 4 )

i

' TNV bepaald met 50 LD50 C-mink toxine. ' TNV bepaald met 53 LD50 C-mink toxine. 3) TNV bepaald met 24 L D 5 0 Ca, stam NCTC 8264 toxine. 4) TNV bepaald met 16 L D 5 0 Ca, stam NCTC 8264 toxine. 2

Het blijkt dat de antitoxische werkzaamheid van het type C-Pasteur antitoxine 10 maal zo groot was als van het C-mink antitoxine, maar dat het TNV van de 2antitoxinen tegenover het homologe enhet heterologe botulinumtoxine verder gelijk was. Dit betekent dat er geen wezenlijke verschillen zijn tussen de antigeenstructuur van het C-mink toxine en het C-Pasteur toxine;hetzelfde kan worden gesteld van de 2 antitoxinen. 148

Uit tabel 52 blijkt dat er evenmin wezenlijke verschillen werden gevonden tussen de toxinen en antitoxinen van type C-mink en het subtype Ca, stam NCTC 8264. De kleine verschillen in TNV,die in de tabel 51en 52 zijn vermeld, werden veroorzaakt door de omstandigheid dat de hoeveelheid toxine die inde neutralisatietesten werd gebruikt,niet steedspreciesgelijk waren. Bij onderzoek van het Internationale Standaard type Cantitoxine bleek het TNV van dit antitoxine tegenover het C-mink toxine 466.400 anti-LDso te bedragen, een waarde die nog iets hoger was dan de door de producent aangegeven antitoxische werkzaamheid. Dit resultaat duidt er op dat er eveneenseen grote mate van overeenkomst is tussen deantitoxinen type C-mink en het Internationale Standaard type C. Het TNV van het C-mink antitoxine werd eveneens tegenover het C/3-toxine van stam NCTC 8548 bepaald;deze waarde bleek 58.880 anti-LDso te bedragen, hetgeen betekent dat het TNV van C-mink antitoxine tegenover het Ca- en het Cß-toxine van gelijke orde is. Dit duidt er op dat er tussen de toxinen van Ca-stam NCTC 8264 en C/3-stam 8548 geen verschillen in antigeen structuur bestaan, zodat het niet mogelijk is met behulp van deze 2 type C-stammen de stam C-mink in te delen bij subtype Ca of subtypeC/3. 8.3.2.3 Vergelijkend onderzoek vanC-minkantitoxine metbotulinumtoxinevan Nederlandse type C-stammen Van de resultaten van dit onderzoek isin tabel 53een overzicht gegeven.Het blijkt dat het TNV van het type C-mink antitoxine tegenover deze C-toxinen steeds van dezelfde grootte was, behalve bij stam 26656, stam 84381 en stam 78158. In tabel 53 is bij deze 3 stammen het gemiddelde van 2 of 3 toxineneutralisatietesten aangegeven, waarbij de testdosis van het botulinumtoxine wisselde van 23 tot 107 LD50. Het TNV tegenover deze 3 botulinumtoxinen bleek zelfs hoger te zijn alsvoor het homologe C-mink toxine. Het TNV van het C-Pasteur antitoxine tegenover het toxine van deze 3stammen werd eveneens bepaald. Bij testdosis van het botulinumtoxine van 54resp. 53 LD50 bleek het TNV voor stam 26656 nu 691.200 anti-LD^o per ml te bedragen,voor stam 84381 en stam 78158 wasdit 678.400 anti-LDso per ml. Deze waarden waren daarmede gelijk aan die van het C-mink toxine en ook aan die vanhet homologe C-Pasteur toxine (tabel 51).

149

Tabel 53 Toxineneutraliserend vermogen van het C-mink antitoxine tegenover de botulinumtoxinen van Nederlandse type C-stammen. Toxin neutralizing capacity ot the C-mink antitoxin against the botulinum toxins of Dutch type C-strains.

CI. botulinum type C-stam

Herkomst

75965 80671 81290 84381 80414 83218 HV 1970 74902 26656 43065 61884 84124 75617 78158 78807

wilde eend wilde eend wilde eend muskuseend knobbelzwaan knobbelzwaan L. illustris kip paard rund rund rund bruine rat bisamrat haas

TNV in anti-LD5o per ml.

67.840 51.200 51.200 544.000* 67.840 69.120 64.000 51.200 331.520* 53.760 60.160 67.840 30.720 204.850* 51.200

Testdosis van het botulinumtoxine in LD50 per 0,25 ml. 53 40 40 32 en 53 53 54 50 40 27, 40 en 107 42 47 53 24 23, 53 en 59 40

Het TNV van het C-mink antitoxine tegenover het homologe C-mink toxine bedroeg 64.000 antr-LD5o per ml. * De gemiddelde waarde van 2 respectievelijk 3 toxineneutralisatietesten.

8.4. SAMENVATTING In dit hoofdstuk werden morfologische, culturele, biochemische en serologische onderzoekingen met de in Nederland geïsoleerde Cl.botulinum-stammen verricht, waarbij een vergelijking plaatsvond met enkele buitenlandse stammen. Bij het culturele onderzoek van de type C-stammen bleek enige variatie inhet kolonietype aanwezig te zijn, dat vooral was toe te schrijven aan een verschil in neiging tot zwermgroei. De biochemische eigenschappen van de type C-stammen kwamen tamelijk goed overeen met de beschrijvingen die in de Verenigde Staten van type Ca werden gegeven (Gunnison en Meyer, 1929 b ; Dolman en Murakami, 1961; Segner et al, 197l a ). Vooral de saccharolytische activiteit doet de Nederlandse type C-stammen afwijken van het type Cj3stam Seddon, die geen enkele kool150

hydraat vergistte (Gunnison en Meyer, 1929b). De Nederlandse type C-stammen vertoonden onderling vrij geringe verschillen in de biochemische eigenschappen, die niet in relatie stonden met deherkomst van de stammen. Er waren met name geen verschillen tussen stammen die uit watervogels of uit zoogdieren waren geisoleerd en evenmin tussen stammen die uit gevallen van botulismus waren geisoleerd of uit dieren die gezonde kiemdrager waren. De Nederlandse type C-stammen bleken serologisch een zeer nauwe verwantschap te bezitten, omdat het TNV van het C-mink antitoxine tegenover de toxinen van deze stammen van gelijke grootte was. Slechts 3 type C-stammen, stam 26656, 84381 en 78158, weken ietsaf; tegenoverhet C-Pasteur antitoxine werd echter geen verschil inTNV gevonden. In een kruisimmuniteitstest bleken de antigene componenten vanhet C-mink antitoxine gelijk te zijn aan dievan het C-Pasteur antitoxine en ook aan dievan2 bij het Instituut bereidde Ca-antitoxinen van stam NCTC 8264. De antigene componenten van het C-mink toxine bleken ook overeen te komen met het Internationale Standaard type C antitoxine en met het toxine vanC0-stamNCTC8548. De eindconclusie kan zijn dat het niet mogelijk wasde inNederland geïsoleerde type C-stammen in te delen bij het subtype Ca of C/3.De resultaten van het onderzoek wijzen er echter op dat de type C-stammen, die onderzocht werden, alle tot eenzelfde type behoren met een gemeenschappelijke dominerende toxinefactor. Publicaties van Jansen (1971) en Eklund en Poysky (1972) maken aannemelijk dat dit toxinefactor Ci is,de belangrijkste toxinefactor van subtype Ca. De biochemische eigenschappen van de geïsoleerde type C-stammen pleiten hier eveneens voor. De biochemische eigenschappen van de in Nederland geïsoleerde Cl.botulinum type Bwezen uit dat deze stam WB1971 een nonproteolytische, typische Europese B-stam is, die grote overeenkomst vertoont met de oorspronkelijke stam van van Ermengen. De biochemische eigenschappen van de 2in Nederland geïsoleerde Cl. botulinum type E stammen bleken slechts geringe onderlinge verschillen te vertonen. De essentiële eigenschappen kwamen overeen met type E stam NCTC 8266 en met de eigenschappen die in de literatuur worden aangegeven (Dolman en Murakami, 1961). Evenzo kwamen de biochemische eigenschappen van de Nederlandse Cl. botulinum type Astam 78638 nauw overeen met type Astam NCTC 7272.

151

H O O F D S T U K DC DE INVLOED VAN DE TEMPERATUUR BIJ HET OPTREDEN VAN BOTULISMUSBIJWATERVOGELS 9.1. INLEIDING Uit de beschrijving van de gevallen van botulismus bij watervogels inhet buitenland blijkt dat deze steeds voorkwamen in de warme zomermaanden. Dit is plausibel omdat de vermenigvuldiging van Cl. botulinum en de vorming vanhet botulinumtoxinegebonden isaan bepaalde temperatuurgrenzen. In Nederland werden de eerste botulismusgevallen bij watervogels in juli en augustus 1970 waargenomen, dus eveneens in de warmste periode van het jaar. Sindsdien is echter gebleken dat botulismus bij watervogels ook voorkwam inde herfst- en wintermaanden. Deze gevallen werden met name gesignaleerd in 's-Gravenhage, Amsterdam, Groningen en Leiden/Voorschoten (hoofdstuk 4). Het onderzoek was er op gericht de etiologie van deze gevallen te verklaren. In hoofdstuk 6 werd reeds aangetoond dat de grootste concentraties vanhet botulinumtoxine in de kadavers van watervogels werden gevonden. Een sterke ontwikkeling van het toxine kan echter alleen bij bepaalde,vrij hoge, temperaturen plaatsvinden. Indien een kadaver inhet water drijft, wordt de temperatuur ervan vooralbepaald doordetemperatuurvanhet omringendewater.De temperatuur in een kadaver dat op de grond ligt, zal vooral bepaald worden door de luchttemperatuur. In verband hiermede werden gegevens verzameld over de water- en luchttemperaturen tijdens het optreden van botulismus en werd in het laboratorium de productie van het botulinumtoxine bij lagere temperaturen onderzocht. 9.2. MATERIALEN ENMETHODIEKEN De productie van botulinumtoxine bij lagere temperaturen werd onderzocht met Cl. botulinum type Cstammen die reeds in hoofdstuk 8 zijn beschreven. Deze stammen werden gei'ncubeerd in een broedstoof waarvan de temperatuur nauw152

keurig kon worden gehandhaafd met behulp van een contactthermometer. Het was in sommige gevallen nodigde broedstoof in een gekoelde ruimte te plaatsen. Als cultuurmedia werden leverbouillon en gemodificeerde FEM*gebruikt, waarbij van elke type C-stam per medium 1cultuurbuis met 0,2 ml van een toxinevrije sporesuspensie werden geënt. Deze nontoxische sporesuspensies werden als volgt verkregen: de type C-stammen werden in leverbouillon geënt en gedurende 5 dagen bij 30 Cgei'ncubeerd,waarna de culturen werden gecentrifugeerd nadat de blokjes lever waren verwijderd; het sediment werd verzameld en het botulinumtoxine werd vervolgens hierin geïnactiveerd door dit materiaal gedurende 30 minuten bij 80°C te verhitten. Deze bewerking was noodzakelijk omdat verhitten gedurende een kortere tijd of bij een lagere temperatuur het toxine niet in alle gevallen bleek te inactiveren. Stam 26656 wasbij controle, in tegenstelling tot alle andere sporesuspensies, zelfs na deze verhitting nog niet altijd vrij van actief botulinumtoxine; éénmaal bevatte de verhitte,sporesuspensie van 26656 namelijk nog 10MLDper ml. Het vermogen van de verhitte sporesuspensies nog voldoende toxine te vormen, werd gecontroleerd door van iedere type C-stam een cultuurbuis met leverbouillon te enten, die na eenincubatieperiode van 6dagen bij 30 Copgroei en toxineproductie werd gecontroleerd. Het toxogene vermogen bleek bij alle type C-stammen door deze bewerkingen niet te zijn verminderd. De productie van het botulinumtoxine bij lagere temperaturen werd op gezette tijden gecontroleerd, waarbij de concentratie van het toxine in MLD per 0,5 ml cultuurmedium werd bepaald. De culturen werden tijdens deze handelingen in een bak met smeltend ijsgezet om elke ongewenste temperatuurstijging van de culturen te voorkomen. 9.3. RESULTATEN 9.3.1. Productievanbotulinumtoxine type Cbijlageretemperaturen. De productie van het botulinumtoxine type Cwerd onderzocht bij 10,12,5, 15 en 20°C. Bij 10°C werd gedurende een incubatieperiode van 90 dagen in leverbouillon en in FEM geen groei en geen toxineproductie vastgesteld. Dit onderzoek werd verricht met dezelfde 8type C-stammen, die ook bij 15en 20 C zijn onderzocht. Bij 12,5, 15 en 20°C bleek wel botulinumtoxine te worden geproduceerd;de concentraties zijn weergegeven in de tabellen 54,55 en 56. In FEM werd bij 12,5 Cgeen toxine gevormd. Deze waarneming isechter niet met die van de andere FEM-en leverbouillonculturen te vergelijken, omdat FEM * Op grond van ongepubliceerde gegevens van Eklund (1972) werd per liter medium 5 g glucose en 5 gammoniumsulfaat toegevoegd in plaats van 10 g.

153

Tabel 54 Toxineproductie van Cl. botulinum type C bij 12,5°C in leverbouillon. Toxin production of Cl.botulinum type C in liver broth at 12,5°C. Type C-stam 3

11

20

Toxineconcentratie in MLD per 0,5 ml na . . . dagen 99 39 56 63 70 77 10 0 ' 7

26656 43065 80414 80671 75965

10 2

10 2

10 3

100,7 10 1 , 7

10*

100,7

119

133

10 3

10 1

10'

10'

10 O,7

10 1 10 0 ' 7 10 2

•: geen botulirrumtoxine aangetoond in 0,5 ml cultuurvloeistof (1 :5 verdund).

Tabel 55 Toxineproductie van Cl. botulinum type C bij 1 5°C in leverbouillon en FEM. Toxin production of Cl.botulinum type C in liver broth and FEM at 15°C. Type C-stam

Toxineproductie in MLD per 0,5 ml na . . . dagen

A. Leverbouillon

15

26656* 43065 80414 80671 75965 HV 1970 61884 C-mink

-

10° 10 J

-

10"

22

30

10' 10 1 10 3

J

37

44

52

66

10 10 2 10 4 10' 10 3 10 2 10 3

J

10 10 2 10'' 10 J 10 3 10 2 10 3 10 0,7

J

10 10 J 10" 10 3 10 J 10 J 10 10'

J

10 10" 10" 10 3 10° 10' 10° 10'

10 3 10 3 10 s 10 4 10 3 10 3 10 4 10 2

10J

10* 0,7 10 10 2

10 1

10 2

10" 10 1

10" 10 3

10" 10 3

10 J 10 J

10" 10"

100'7

10 3

10 2

10 3

10" 10-5 10 4

10 3 10" 10 4 10 2

10" 10 J 10 4 10 J

10" 10' 10 s 10 J

10" 10 3 10 5 10 5

B. FEM 26656* 43065 80414 80671 75965 HV 1970 61884 C-mink

10'0,7

: In de sporesuspensie van 26656 werd nog iets botulinumtoxine aangetoond (10 MLD per ml). : geen botulinumtoxine aangetoond in 0,5 ml (1 :5 verdund).

154

in dit geval geen glucose en ammoniumsulfaat bevatte. Het kan wel een aanwijzing zijn dat de toevoeging van deze ingrediënten belangrijk is. In leverbouillon werd door 3 van de 5 onderzochte type C-stammen betrekkelijk weinig botulinumtoxine gevormd (tabel 54). In vergelijking met de orale MLD voor wilde eenden kunnen deze toxineconcentraties alsongevaarlijk worden bestempeld. Bij 15 C werd door alle 8 stammen in leverbouillon botulinumtoxine gevormd. In FEM werd echter door de stammen 80671 en 80414 ook na 66 dagen geen toxine geproduceerd (tabel 55). De toxineproductie verliep in vergelijking met de culturen bij 12,5 C sneller en er werden veelhogere toxineconcentraties bereikt. Bij stam 75965 werd na 37 dagen een maximum concentratie van 200.000 MLDper mlvastgesteld. Dit zou kunnen betekenen dat bij zeer gunstige omstandigheden reeds bij 15°C in de natuur toxineconcentraties bereikt kunnen worden van omstreeks één MLDvoor wilde eenden. Bij 20°C werd - met uitzondering van stam 80414 - zowel in leverbouillon als in FEM botulinumtoxine gevormd (tabel 56). De toxineproductie verliep aanmerkelijk sneller dan bij 15°C, zodat na 9 dagen bij één stam reeds een Tabel56 ToxineproductievanCl. botulinum typeCbij20°Cinleverbouillon enFEM. Toxin production ofCl. botulinum typeCin liver broth and FEMat 20°c. TypeC-stam A. Leverbouillon 26656 43065 80414 80671 75965 HV 1970 61884 C-mink

Toxineproductie inMLDper0,5 mlna ...dagen 14

21

34

10" 104

10" 104

10" 103

10D 10 4

10J 103 103 103 103

10° 104 103 105 103

10° 104 10 4 104 10 4

10° 103 104 10s 104

10J 10 4 10 4 10s 104

10" 102

io-

103 103

10D 103

103 103

10" 102 103 102

10" 104 103

10J 104 103 103 103

10J 10 4 103 10 4 103

10J 10 4 103 103

10' 101

J

10 102

10" 101 102 101

B.FEM 26656 43065 80414 80671 75965 HV1970 61884 C-mink

101

103

10'

:geen botulinumtoxine aangetoond in0,5 ml(1:5verdund).

155

30C(Control« 15 C )

12,5C. 96 10210811« 120126132 dagen.

Fig. 4. Toxineproductie van Cl. botulinum type C bij 12,5, 15, 20 en 30°C in leverbouillon. Gemiddelde toxineconcentratie van de stammen die in tabel 54, 55 en 56 zijn vermeld. Toxin production of Cl. botulinum type Cat 12,5 - 15 -20 and 30°C in liver broth. Average toxin concentration of the strains mentioned in tabel 54, 55 and 56.

toxineconcentratie van 200.000 MLD per ml werd vastgesteld. Zowel bij 15 C als bij 20°C werd de concentratie van200.000 MLDper ml slechts bij enkele stammen vastgesteld. De toxineproductie zalechter groter zijn naarmate de temperatuur meer boven 20°C stijgt. Als vergelijking kunnen de controlebuizen dienen, die bij 30°C werden geincubeerd; na 6 dagen werden bij 4 van de 8 stammen reeds toxineconcentraties van 200.000 MLD per ml gevonden, bij de overige 4 stammen minimaal 20.000 MLD per ml. Bijdezelfde stammen werden regelmatig toxineconcentraties van 200.000 MLD per ml vastgesteld, indien de cultuurmedia geënt werden met onverhit cultuurmateriaal. 9.3.2. Milieutemperaturen in gebieden waar botulismus bij watervogels isoptreden In de inleiding is reeds het bijzondere feit vermeld dat in sommige gebieden ook in de herfst- en wintermaanden nog gevallen van botulismus bij watervogels voorkwamen. Bij het onderzoek naar de samenhang tussen de milieutemperaturen en het optreden van botulismus bij watervogels zullen deze gebieden afzonderlijk worden behandeld. 9.3.2.1. Ineennatuurlijk milieu Voor dit deel van het onderzoek werden alleen van de ziekte-uitbraken in Hilvarenbeek en Zuidelijk-Flevoland gegevens verzameld. Van de kleinere botulismusuitbraken, die in tabel 13 werden vermeld, zijn nl slechts weinig ecologischegegevens bekend. 156

Hilvarenbeek In tabel 57 is voor de zomermaanden een overzicht gegeven van de luchttemperaturen in 1968 tot 1972 in Gilze-Rijen, het dichtst bij Hilvarenbeek gelegen meetstation van het KNMI. Het blijkt dat de gemiddelde overdagtemperaturen in juni 1970, even voordat hier de eerste gevallen van botulismus voorkwamen, zeer hoog waren. Het in mindere mate optreden van botulismus in 1971 en het geheel wegblijven in 1972 is niet te verklaren met lagere gemiddelde overdagtemperaturen in die jaren. Tabel57 Gemiddelde overdagtemperaturen* in°Cin Gilze-Rijen en Lelystad. Average temperaturesin the daytimein °Cat Gilze-Rijen near Hilvarenbeek and at Lelystad. Gilze-Rijen 1968 1969 1970 1971 1972

mei

juni

juli

12,4 14,6 14,9 15,4 13,4

17,2 17,2 19,8 15,7 15,4

17,6 20,1 17,6 19,4 18,9

Lelystad augustus 18,1 19,1 18,9 18,6 17,1

mei

juni

juli

augustus

11,7 13,4 14,2 13,7 12,5

16,8 16,5 18,8 14,8 14,5

17,3 19,3 17,1 18,2 18,2

17,9 19,1 18,4 17,8 16,7

*Waarnemingen om 8,14 en 19uur. Devermelde waarden indejaren 1971 en 1972zijn naarvoorschrift van het KNMI gecorrigeerd. De temperaturen van het water en het slib in de ondiepe zones langs de oevers van de vennen waren in de zomer van 1970 eveneens hoog opgelopen. Hoewel een continue serie waarnemingen ontbreekt, kan dit worden afgeleid uit incidentele metingen op 27 augustus. Bij luchttemperaturen van 23°C overdag werden in ondiepe oeverzones watertemperaturen van ongeveer 30 C gemeten. Op diepere plaatsen in de vennen was de temperatuur van het water 22 C. In 1971 werden alleen op 17 juni temperaturen gemeten: bij een luchttemperatuur van 15°C bleek de temperatuur van ondiep water in het Talingputje 14°C te bedragen. Een indruk van het verloop van de temperaturen van lucht, water en slib in 1972 kan worden verkregen uit metingen die ten behoeve van het onderzoek van de resistentie van het botulinumtoxine zijn verricht (fig. 3, hoofdstuk 6). Zuidelijk Flevoland Tijdens het optreden van botulismus in Zuidelijk-Flevoland in 1971 zijn geen water- of slibtemperaturen gemeten. Voor het verkrijgen van een'indruk over de rol die de temperatuur heeft gespeeld, staan alleen de luchttemperaturen ter beschikking, die in het dichtbij gelegen meetstation in Lelystad zijn verzameld 157

(tabel 57). Het blijkt dat deze waarden in 1971, toen in juni en in augustus/ september in Zuidelijk-Flevoland botulismus bij watervogels voorkwam, geen belangrijke verschillen vertonen met dewaarden van de omringende jaren. 9.3.2.2. In gebieden waar sprake isvaneen thermische waterverontreiniging Tijdens het diagnostisch onderzoek van de botulismusgevallen in 's-Gravenhage, Amsterdam, Groningen en Leiden/Voorschoten (hoofdstuk 4) bleek dat dezevooral voorkwamen in bepaalde waterpartijen. Bij nader onderzoek bleek dat hier de watertemperaturen verhoogd waren door thermische pollutie met koelwater. Voor dit deel van het onderzoek werden gegevens van lucht- en watertemperaturen verzameld, ten einde een beter inzicht te verkrijgen in de rol die deze thermische pollutie van het oppervlaktewater bij het optreden vanbotulismusbijwatervogelshad gespeeld. 's-Gravenhage In tabel 58 is voor de zomermaanden een overzicht gegeven van de luchttemperaturen in 1968 tot 1972 in Naaldwijk, een nabijgelegen meetstation van het KNMI. Hieruit blijkt dat de gemiddelde overdagtemperaturen in juni 1970 zeer hoog waren en dus, alsin Hilvarenbeek, een gunstige omstandigheid zijn geweest tijdens het optreden van de eerste gevallen van botulismus in 's-Gravenhage. Tabel58 Gemiddelde overdagtemperaturen* in°CinNaaldwijk en OudeWetering Averagetemperaturesin thedaytimein °Cat Naaldwijk near theHagueand atOudeWetering nearAmsterdam andLeiden. Naaldwijk

1968 1969 1970 1971 1972

mei

juni

juli

11,8 13,9 14,2 14,4 13,0

16,6 16,3

17,3 19,0 17,1 18,6 18,2

19,1 14,9 14,6

Oude Wetering augustus 18,1 19,0 18,7 18,3 16,8

mei

juni

juli

11,9 14,0 14,7 15,0 13,2

16,9 16,9 19,6 15,4 15,0

17,5 19,5 17,5 19,1 18,5

* Zie tabel 57.

Ondanks de iets lagere gemiddelde overdagtemperaturen in de zomers van 1971 en 1972 - vooral in juni - , bleven er in 's-Gravenhage botulismusgevallen voorkomen. Dit duidde er op dat er nog één of meer andere predisponerende omstandigheden aanwezig waren, met name in het verversingskanaal waar de meeste gevallen van botulismus werden gelocaliseerd. Het bleek dat dit water158

augustus 18,2 19,0 18,7 18,6 16,9

g

T3 C cd O.

-In

tD ca

J3

>

M

S

G CJ

O

ca

tu

o

^

a

C

°

Oeu

tu

•

a>

» . 6C S

c

c S

» c m .

.£=.5s.Sgç'3

o

N j - N c N .w * c O N c *o- 0e * - > s ' - ' > ' ^ _ ! 0 * - «- 0O> -Mi OOT gS •g" , c*

-o "
—M

So

-H S rf £ j S C/5
G» M
^i.

& ~H ^ ? M Ü ' S O ' K

U tu

O

o.

•o c

>,

U P.

>.

H

H

o

gj> S

ua

o. * -S 3 g3 "s

E o X)

3

«*-< o o Xi o G e o; kH

3

«

c

tu TJ

« £

=s CJ

o

o

Û.JC

o

o

o

o

o

o

••->

-H

WJ

^_, c

0> X

'—1

Xi

c

> V)

o

o

o

3

*o c u • ^

ftO T3
o es

o u m

O. >->

s°_

'5k'Eb

•a

o o o ü

c o o

ww

tu tm

5;^

ON

c

M

« -a

2 "3

a> « c »

§-°

I5 .•2 = E

2 '3

•o c

2 c

.S

<=

^3

3

's«

" -s s •S 3 fc

« fc

es

OH

« >

W) C 1-4

ni

f; d>

>

00

s CU

sa c (H

(U

!*, > >s

JG tu au

>< 3

tf

VH

M

•fc,

•fe,

<£ o

.e o se a

O c

159

pand van de andere waterpartijen afweek door een aanmerkelijk hogere watertemperatuur, veroorzaakt door de lozing van koelwater van het Gemeentelijk Energiebedrijf. Uit gegevens van het Hoogheemraadschap Delfland bleek dat vanaf 1965 het temperatuurverschil tussen water dathetkoelcircuit binnenkwam en uitstromend water steeds groter werd. In 1970 werden in juni reeds watertemperaturen van 29°C in het koelcircuit gemeten. Deze temperaturen zijn ruimschoots voldoende voor een snelle productie van het botulinumtoxine waarbij hoge toxineconcentraties kunnen worden bereikt. Bij incidentele metingen in 1971 en 1972 bleek dat de watertemperaturen in het verversingskanaal nog hogere waarden bereikten. Ter vergelijking zijn enkele temperaturen vermeld van andere waterpartijen in 's-Gravenhage (tabel 59). Ook op grotere diepte bleven de watertemperaturen in het verversingskanaal zeer hoog, zoals uit metingen op 1.300m afstand van het Gemeentelijk Energiebedrijf op 23 augustus 1971bleek: op 1mwerd 36 Cgemeten en op 2m diepte nog 34,5 C. Deze afzonderlijk hoge temperaturen, als gevolg van thermische pollutie door het Gemeentelijk Energiebedrijf, vormden ongetwijfeld een zeer gunstigeomstandigheid bij de productie van botulinumtoxine. De periode, waarin in het verversingskanaal watertemperaturen boven 20°C voorkwamen, strekte zich in 1971 en 1972 bovendien uit van omstreeks 1mei tot omstreeks 15 november (tabel 60); dit kan een verklaring vormen voor het feit dat ook in september, oktober en november nog gevallen van botulismus bleven voorkomen bijwatervogels. Uit diverse metingen* in 1971 en tweewekelijkse metingen in 1972 blijkt tevens dat depH niet, maar de zuurstofgehalten van het verversingskanaal wel enige afwijkingen vertoonden. De pH varieerde in 1971 van 7,5 tot 7,9 en in 1972van 7,7 tot 8,1. In een vijver in de duinen, die gedeeltelijk gevoed werd met kwelwater en voor de temperatuurwaarnemingen als referentiepunt diende,varieerde de pH in dezelfde periode van 7,6 tot 8,7. De zuurstofgehalten in het verversingskanaal schommelden in 1971van 3,1 mgper liter op 28 september tot 6,7 op 17 november en in 1972 van 2,8 mg per liter op 26 juli tot 6,9 op 12 december. Bij het referentiepunt waren de zuurstofgehalten beduidend hoger,de laagste waarde bedroeg 6,6 mg per liter op 26juli 1972 en de hoogste waarde 15,4 op 10 februari 1972. In het algemeen streeft men inhet oppervlaktewater naar zuurstofgehalten vanminstens 5mgper liter. Amsterdam Uit tabel 58 blijkt dat de gemiddelde overdagtemperaturen in Oude Wetering (tussen Amsterdam en Leiden) weinig afweken van Naaldwijk en Gilze Rijen. * Deze gegevens werden welwillend ter beschikking gesteld door de Gemeentelijke Geneeskundige- en Gezondheidsdienst te 's-Gravenhage.

160

Toch kwamen in 1970 in Amsterdam slechts enkele gevallen van botulismus voor. In 1971 en 1972, toen de gemiddelde overdagtemperaturen met name in juni lager waren, werden echter in Amsterdam zeer veel gevallen van botulismus bij watervogels vastgesteld, vergelijkbaar met de aantallen die in 's-Gravenhage in 1970 werden aangetroffen (hoofdstuk 4). Deze gegevens wezen er op dat in Amsterdam het optreden van botulismus niet direct afhankelijk was van hoge

Tabel 60 Watertemperaturen in°C inhet verversingskanaal te 's-Gravenhage in 1971en 1972. Water temperaturesin°Cin thecooling-watercircuit of the electric power station in the Hague in 1971 and 1972. Veenkade bij

Dstum 1971, 121222842821 1724821 1972, 1226102371529129251326112521 1167-

inlaat van GEB 3 4 4 7 8 9 10 11 11 12 12 1 1 2 2 3 3 3 4 5 5 6 7 8 8 9 11 11 12

12 13 16 26 24 21 20 14 11,5 11 12 14 11 14 12 13 13 14 15,5 19,5 19 17 26 24 22 19 17 13 12

Newtonstraat, bij uitlaat van GEB 21,5 22 25 35 32 30 27 22 23 20 23 25 22 24 20 22 22,5 22 21,5 26,5 28 25 31 27 29 28 26 19 20

Groothertoginnelaan, 900 m van GEB

Referentiepunt, duinvijver

19 18 23 32 28,5 28 23 20 19,5 16 19 22 18 21 16 18 20 18 19 24,5 24 23 28 27 27 25 22 16 17

4 6 7 4 1,5 3 3,5 6 6 7,5 10 15 15 16 20 18,5 18 14 10 6 7

Detemperaturen werden 'smorgens tussen 9en 10uur gemeten opeen diepte van 30cm. 161

luchttemperaturen in de zomermaanden, zodat ook hier een andere predisponerende omstandigheid aanwezig moest zijn. In analogie met 's-Gravenhage werd gezocht naar plaatsen met hogere watertemperaturen door thermische pollutie, die inderdaad op verscheidene punten in de stad werden aangetroffen. In het overzicht in tabel 61 zijn ter vergelijking enkele waterpartijen vermeld, waar geen temperatuurverhogende invloeden aanwezigwaren. Het blijkt dat ook in Amsterdam verwarmd koelwater een belangrijke rol kan spelen bij de epidemiologie van botulismus bij watervogels. In tegenstelling tot 's-Gravenhage is de situatie minder overzichtelijk, omdat in Amsterdam thermische pollutie in meerdere over de stad verspreid liggende waterpanden voorkomt. Toch zijn er ook inAmsterdam aanwijzingen dat hierbij in de eerste plaats aan de electriciteitscentrale dient te worden gedacht; uit tabel 61 blijkt dat de grootste temperatuurstijging in de Diemerplas werd gemeten, terwijl bij nadere informatie bleek dat deze centrale in het voorjaar van 1970 met de eerste productie-eenheid wasgestart en in oktober 1970 met de tweede eenheid. Groningen In de stad Groningen ontwikkelde zich in januari 1972 een bijzondere situatie, toen tijdens een vorstperiode veel watervogels aan botulismus stierven (hoofdstuk 4). De ziekte was gelocaliseerd in het Helperdiepje, waarin koelwater van het Electriciteitsbedrijf voor Groningen en Drente (EGD) werd geloosd. Dichtvriezen van de watergebieden in de omgeving deed de trek vanwatervogels naar het Helperdiepje toenemen. Tijdens dit winterweer werden in het Helperdiepje nog watertemperaturen van 20°C gemeten (tabel 62). Toen de sterfte verontrustende vormen ging aannemen, besloot de directie van het EGDop 21januari, na advies te hebben ingewonnen, de lozing van koelwater in dit deel van het koelcircuit te staken. De watertemperaturen in het Helperdiepje daalden hierna snel tot normale waarden en synchroon hiermede verdween de sterfte door botulismus. Door dit verloop werd de relatie tussen thermische waterverontreinigingen het optreden van botulismus wel zeer duidelijk gedemonstreerd. Leiden/Voorschoten Bij de gevallen van botulismus, die zich in 1970, 1971 en 1972 in Leiden/ Voorschoten hebben voorgedaan, werden alleen in het laatste jaar incidenteel gegevens verzameld. De ziekte was hier voornamelijk gelocaliseerd in de Rijnsburgersingel, een onderdeel van het koelcircuit van het Gemeentelijk Energiebedrijf, waar in de zomer van 1972 watertemperaturen van 35 C werden gemeten. Mede in analogie met de gegevensdie in dehiervoor genoemde steden werden verzameld, mag ook in Leiden worden verondersteld dat er een nauwe relatie tussen deze thermische waterverontreiniging en het optreden van botulismus bij watervogels heeft bestaan. 162

~ 5 « — ~ ra Sö «

1> . ~ '*O 0) 73

'N

'O £

tu

0

o

o

tu

O

73

.H 'N

.S

D

0Û

o CJ c ^o M O

£3

sè "3 u O

- i a.

-J

c

.s j2

1

O f= •o

tu

tu

c

si) c

c u o

N

u

N

2. aj

c 1) o

y 3

«O s O £

.2

(J

.£ N

o

J5

D c c o> C tu NJ rt O "5 o * o ? C £ -J

C

ÜJ

u

OJ

u

C

ra C
'3 ]u

it

73

'3 'G

c

-u 1* 0

O ïï

c

15

c S3

c «>

•—

CJ 'J N — 1) O y " y - J D _J "o -J >

_'>

N

c

o

ÔÖ

5 E

0)

E

fc XiO

S°

»O

«

-*

—

>o

oo

oo

o

^3 -3 O £> C

;c.> (IJ

rt

>

C V

3

U

ä ï »

o

Oft

+- C J3 'S 3 X ) T3

.—, V5

c

>

C

.2

6Ü *0 Cl SÜJ

u

& o

O u

ar. < /: 'S, O •O

o o

a a

tu

y

>s

'3 O.

S (u Q

3

—, c

^7 O M

o -c; .S - c« uw .3

*o C;/! £ , * o a:

E

en

O

o

z M.

M.

>

_M-

=

Z

^

j-^

Q

=

O

x>^

ç

163

-a" *Xö3

o o Z
c

•o c o

^

p-

^

o M

o M

o M

Où C

^

c

^

o S M£ g

o

Dû 00 O Û ^ -*-" rt • C • C • C '

cd

> O

39 1.aQ O

"S O '5 Q NO '5 Ö O o d o ü o ü o HO -J W J W bJ U -J ä t ü

uw

>0)

ca ca c

X) Ü0

S .si» 4) CU

'3 •o

> =3

4>

•o

XI :^

S" 5

- i

u

a.

>.

c 0> O Ü

u

&, >>

H

a

a

>> H

>. H

H•

!?§ a t/i

CO ON b-

„ r-

•S E

12

S E3

8. <-> s .s

•TN

t«

00

3 <~


ë§ •>

£3

( N -ff* e- * h

J= -a

ON

~* -3 - 1 * ca

•=> 3

S-o eS 5o > 'S 00*0 60 o u o J= — o to O

'5c'so o o

3

6S

3

cN

cd t-i

O. U

E

0

0>

•o b. 0> u 'E

e

0> td

•o c

£

o o o»

so c

«M

CN

CN

(N

CN

(N

m (N

cr>

O

o CN

CN

E Cd ca

.s

a •3

•S. a

"3 S

S

1 3 Q Ü U

Ó. 0>

=5 Q o

•2

d. "3 _

c

se

ca e

b-

ca ca

a E

sf

O

gs s£

•ó

t; o .C G

g? *u X

'S o. u o =3 a 3- .S

>x 5-S J is-S «

E

M m

^ "2 '5 •o e

ca

f^ë o .ts u 3

oo ui2

164

w

> -o

L-1

0 ~ •n 00 u C

CA

Ä

~T û . 00 o • ^ <£ cd o *

o

ca

cd

« -o O.

°s s«

-o

cd

IE

o o

z

*

X s*

9.4. SAMENVATTING In dit hoofdstuk is de invloed nagegaan, die de temperatuur heeft bij het optreden van botulismus bij watervogels. Daartoe werd eerst de productie van botulinumtoxine type C in reinculturen bij lagere temperaturen onderzocht. Bij IOC werd geen toxine gevormd, terwijl bij 12,5 C de toxineproductie slechts gering was: als hoogste concentratie werd voor het eerst na 77 dagen 2.000 MLDper ml vastgesteld. Bij 15°C werd door alle 8 onderzochte stammen botulinumtoxine gevormd. Het toxine werd sneller gevormd en de toxineconcentraties waren aanmerkelijk hoger. Een maximum concentratie van 200.000 MLDper mlwerd voor het eerst na 37 dagen gevonden. Bij 20 Cverliep de toxineproductie aanmerkelijk sneller zodat bij stam 61884 na 9dagen reeds een concentratie van 200.000 MLDper mlwerd aangetoond. In het tweede gedeelte van dit hoofdstuk is een overzicht gegeven van de lucht- en watertemperaturen, die in de gebieden met botulismus bij watervogels werden vastgesteld. In Hilvarenbeek en Zuidelijk Flevoland, waar de ziekte voorkwam in een natuurlijk biotoop, werd het optreden van botulismus beïnvloed door de klimatologische omstandigheden, met name door de temperatuur. De ziekte trad hier alleen in de warmere zomermaanden op. In 4 andere gebieden werd een relatie aangetoond met een thermische waterverontreiniging, die vooral door electriciteitscentrales met ongunstig gesitueerde koelwatercircuits werd veroorzaakt. Een bijzonder gevolg van deze thermische pollutie was, dat in deze gebieden ook in de herfst- en wintermaanden nog sterfgevallen bij watervogels door botulismus bleven voorkomen.

165

HOOFDSTUK X BESPREKINGVANDERESULTATEN 10.1. DEETIOLOGIEVANBOTULISMUS BIJWATERVOGELS Uit de resultaten vanhet diagnostisch onderzoek,weergegeveninhoofdstuk 4, blijkt dat botulismus bij watervogels in Nederland door een intoxicatie met het botulinumtoxine type Cwordt veroorzaakt. De botulinumtoxinen type A,B en E werden bij dit diagnostisch onderzoek nimmer aangetoond, alhoewel Cl. botulinum type A, B en E blijkens de onderzoekingen die in hoofdstuk 5 werden beschreven, wel in Nederland voorkomen. De definitieve diagnose berustte steeds op het aantonen van het botulinumtoxine. Bij het onderzoek van gestorven vogels moet worden benadrukt dat een betrouwbare diagnostiek alleen mogelijk is bij verse kadavers. Uit de resultaten van het onderzoek blijkt immers duidelijk dat bij bepaalde omstandigheden rekening moet worden gehouden met een postmortale toxineproductie in de kadavers van vogels, waarbij reeds bederfverschijnselen waarneembaar zijn. Het bleek dat Cl. botulinum type C niet alleen in de digestietractus en de parenchymateuze organen van vogels die aan botulismus leden of waren gestorven kon worden aangetoond, maar ook bij gezonde vogels of bij vogels die aan andere ziekten waren gestorven. Bij vogels die aan botulismus waren gestorven,werden Cl. botulinum type B en E eveneens enkele malen aangetoond. Deze laatste gevallen illustreren wel zeer duidelijk dat de diagnose op het aantonen van het toxine dient te steunen, omdat bij dezevogelsgelijktijdig botulinumtoxine type Cen Cl. botulinum type Bof Ewerd vastgesteld. Bij het diagnostisch onderzoek (hoofdstuk 4) bleek vooral bij gestorven vogels - waarbij het toxine in de leverof in de digestietractus moet worden aangetoond de hoeveelheid toxine die voor het onderzoek beschikbaar is, in sommige gevallen zeer gering te zijn. Het is dan ook niet uitgesloten dat vóór 1970 reeds 166

incidenteel een geval van botulismus bij enkele watervogels isvoorgekomen, dat echter door de beperkte diagnostische mogelijkheden niet werd onderkend (van der Schaaf, pers.mededeling). Moeilijkheden bij de diagnostiek kunnen ook de oorzaak zijn geweest dat in het verleden sterfte bij watervogels aan de aanwezigheid van bloedzuigers(Theromyzon tessulatum) werd toegeschreven, vooral alsdeze in de neusholten werden aangetroffen en daarbij een bemoeilijkte luchtpassage hadden veroorzaakt. In enkele proeven, uitgevoerd bij het Zoölogisch Laboratorium der Universiteit en de Afdeling Beplantingen van de gemeente Amsterdam, ondervonden gezonde, jongeen volwassen eenden echter geen nadeel van deze bloedzuigers. Waarnemingen tijdens het optreden van botulismus wezen er voorts op dat watervogels -- vooral wilde eenden — die aan botulismus lijden, wel gemakkelijk secundair geïnfecteerd raken met Theromyzon tessulatum. Williams (1970) en Keymerer al (1972) beschouwen deze soort eveneens als een facultatief parasitair levend organisme. De mening van Büchli (1924)enRollinsonefa/ (1950), dat bijjonge eenden een infectie met Theromyzon tessulatum wel fataal zou kunnen verlopen, dient dan ook nader te worden bevestigd, waarbij met name botulismus dient te worden uitgesloten. Algemeen wordt ook bij watervogels aangenomen dat botulismus veroorzaakt wordt door de opname van reedsgevormd (preformed) toxine.Tijdens dit onderzoek werden geen aanwijzingen gevonden die tegen deze mening pleiten; bij de bespreking van de epidemiologie van botulismus zalhier uitgebreider op worden ingegaan. Boroff en Reilly (1962) meenden dat bij vogels ook sprake zou kunnen zijn van toxinevorming "de novo", op grond van het feit dat zij in de leversvan watervogels die aan botulismus warengestorven,herhaaldelijke/, botulinum type C aantoonden. Minervin (1967) komt tot eenzelfde mening naar aanleiding van ervaringen bij de behandeling van botulismus bij de mens en spreekt van het "toxico-infectieuze" karakter van botulismus. Hij isoleerde Cl. botulinum uit de lever, milt en andere organen van botulismuspatiënten, maar veronderstelt dat een toxinevorming "de novo" in de digestietractus zou plaatsvinden. Daarom adviseert Minervin curatief antitoxine per oste verstrekken. De resultaten van dit onderzoek (hoofdstuk 5) wijzen niet op een toxinevorming "de novo", omdat Cl. botulinum type C ook bij gezonde watervogels werd gevonden en bij watervogels die aan andere ziekten waren gestorven, niet alleen in de gebieden waar botulismus optrad maar ook incidenteel in gebieden waar botulismus nimmer was voorgekomen. Bovendien is bij een toxinevorming "de novo" moeilijk te verklaren waarom in een gebied met een natuurlijk biotoop botulismus alleen in de zomer optrad, omdat in deze gebieden ook in de winter nog watervogels voorkwamen, waarbij Cl. botulinum type Cinde parenchymateuze organen of in de digestietractus werd aangetoond. Het zou ook mogelijk kunnen zijn dat botulismus ontstaat doordat toxine van sporen van Cl.botulinum, na opname van toxische sporen uit een ernstig gein167

fecteerd milieu, in het lichaam vrijkomt door lysis van de sporewand. De resultaten van het onderzoek van Suzuki et al (1971) met Cl. botulinum type A pleiten hiertegen, aangezienzijvaststelden dat de sporewand niet werd aangetast door bacteriolytisch werkende enzymen (b.v. lysozymen) van lichaamsvloeistoffen. Het botulinumtoxine bleek pas vrij te komen door inwerking van lysozymen als toxische sporen eerst door leucocyten waren gephagocyteerd. Vegetatieve kiemen bleken wel gevoelig te zijn voor de directe werking van lysozymen. In de Verenigde Staten wordt algemeen aangenomen dat botulismus bij watervogels door het toxine van Cl. botulinum type Cawordt veroorzaakt (Jensen en Gritman, 1967).Van botulismusgevallen bij watervogels, die vanaf 1965 in Europa zijn beschreven, wordt door de verschillende auteurs geen uitspraak over het subtype gedaan. Het onderzoek van de biochemische en serologische eigenschappen van de 15 type C-stammen die in Nederland in reincultuur werden geïsoleerd, wijst er op dat deze stammen een eenheid vormen met één gemeenschappelijke, dominerende toxinefactor. Naar aanleiding van de publicaties"van Jansen (1971) en Eklund en Poysky (1972) mag worden verondersteld dat dit de toxinefactor Ci zal zijn, de belangrijkste toxinefactor van subtype Ca. De verwarring rond type Ca en Cj3is ontstaan sinds Pfenninger (1924) en Gunnison en Meyer (1929t")aantoonden dat het antitoxine van stam Seddon het toxine van dé Amerikaanse Ca-stammen niet neutraliseerde. Na de onderzoekingen van Jansen (1971), Eklund e?a/(1971) en Eklund en Poysky (1972) zou dit kunnen worden verklaard door aan te nemen dat de type C-stam van Seddon door verlies van haar prophaag CE0 niet meer in staat wasde toxinefactor Cj te produceren, zodat in de culturen van deze stam nog slechts toxinefactor Cj aanwezig was. De antisera die hiermede werden verkregen, bevatten alleen antitoxine C2, waarmede de toxinen Cj en C2 die door de Ca-stammen werden geproduceerd, niet konden worden geneutraliseerd. Het verlies van de prophaag CEß, dat bij type C-stammen in vitro vaak schijnt op te treden, leidt door het ontbreken van de belangrijkste toxische component (Cj) tot het ontstaan van culturen die veelal nontoxisch of zwak toxisch zijn. Dit zou worden veroorzaakt door het feit dat in deze culturen toxinefactor Cj meestal aanwezig is als een protoxine dat alleen na trypsinisatie is aan te tonen. Eigen onderzoek, vooral met stam 74902, leerde dat de saccharolytische activiteit van sommige zwak toxische en nontoxische culturen gering kan zijn, zodat de biochemische eigenschappen overeenkwamen met de beschrijvingen die Gunnison en Meyer (1929") van de stam Seddon en 2 andere C0-stammen gaven. De biochemische eigenschappen van de reinculturen van de 15 in Nederland geïsoleerde zeer toxische type C-stammen kwamen daarentegen overeen met de beschrijvingen die van de Amerikaanse Ca-stammen worden gegeven (Gunnison en Meyer, 1929";Dolman en Murakami, 1961 ; Segner et al, 1971a). Dat er een immunologische overeenkomst tussen de type C-stammen van de Verenigde Staten en Nederland bestaat, is ook aannemelijk te maken met een 168

gegeven uit de praktijk. Tot 1970 werden de nertsen in Nederland met volledig succes gevaccineerd tegen botulismus met een vaccin dat bij het Centraal Diergeneeskundig Instituut, afdeling Rotterdam, werd geproduceerd met behulp van Cl.botulinum type C-mink. Sinds 1970 worden de nertsen in Nederland echter gevaccineerd met een uit de Verenigde Staten gei'mporteerd vaccin enhet blijkt dat de protectie tegen botulismus met dit vaccin in Nederland even goed isalsin de Verenigde Staten. Een definitieve uitspraak over de toxische componenten van de Nederlandse type C-stammen is pas mogelijk, indien een onderzoek zou kunnen plaatsvinden met monospecifieke antisera, zoals die door Jansen (1971) en Eklund et al (1972) zijn bereid. 10.2. DEEPIDEMIOLOGIEVAN BOTULISMUS BIJWATERVOGELS Bij het ontstaan en het verloop van botulismus bij watervogels speelt deMLD voor de verschillende watervogels een zeer belangrijke rol, evenals de concentratie waarin het botulinumtoxine kan voorkomen. Uit de onderzoekingen beschreven in hoofdstuk 7 blijkt, dat de MLD voor volwassen wilde eenden - die meestal ongeveer 1kg wegen — voor het meest virulente toxine op 360.000 LD50 werd bepaald. Dit betekent dat, indien gevallen van botulismus bij watervogels voorkomen, in het gebied hoge concentraties van het botulinumtoxine type Caanwezigmoetenzijn. Deze hoge toxineconcentraties werden niet in water en slib van dezegebieden aangetroffen, welechter in kadavers en in maden die zichhierin hadden ontwikkeld. Vooral in kadaversvan watervogels werden soms zeer hoge concentraties van het type C-toxine vastgesteld. Watervogels als wilde eenden, talingen, zwanen en ganzen leven echter hoofdzakelijk van plantaardig voedsel en het isdaarom onwaarschijnlijk dat deze vogels rechtstreeks toxisch materiaal van deze kadavers zullen opnemen. Deze opname zal wel kunnen plaatsvinden als in het water drijvende kadavers, na volledige decompositie, in kleine deeltjes op de bodem terecht komen. Alsdit in ondiep water geschiedt, zullen watervogels tijdens het fourageren dit toxische materiaal gemakkelijk met ander voedsel opnemen. Het isdenkbaar dat op deze wijze botulismus op beperkte schaal optreedt, maar het is onwaarschijnlijk dat zo in korte tijd massale sterfte door botulismus optreedt, tenzij in een dergelijk gebied sprake is van een ernstige overbevolking van watervogels, waarbij de bodem door voedselgebrek bij het grondden zeer intensief wordt afgezocht. Daarom dient ernstig rekening te worden gehouden met de mogelijkheid dat maden van zoöphage vliegen, die zich in toxische kadavers hebben ontwikkeld, een belangrijke rol spelen bij de overdracht van het botulinumtoxine. Vanaf de eerste botulismusgevallen in 1970 ismeermalen vastgesteld dat watervogels deze maden gaarne consumeren, niet alleen als deze op het water ronddrijven, maar ook rechtstreeks van het kadaver. Uit het onderzoek beschreven in hoofdstuk 6 blijkt 169

dat 2 maden reeds 1MLD voor wilde eenden kunnen bevatten. De toxineconcentratie bleek in kadavers in sommige gevallen nog veel groter te zijn, zodat minder dan 1 gweefsel reeds 1 MLDvoor wilde eenden herbergde. Dat kadavers,speciaal van watervogels die aan botulismuswaren gestorven,de bron van het botulinumtoxine type Cwaren, werd bevestigd door het feit dat het opruimen van deze kadavers in 's-Gravenhage en Hilvarenbeek een waardevolle bestrijdingsmaatregel bleek te zijn, alhoewel het vaak moeilijk uitvoerbaar was,ook in de grote steden, tijdig alle kadavers te verzamelen. De aanwezigheid van kadavers in verschillende stadia van decompositie, isin de natuur op zichzelf reeds als een afwijkende omstandigheid te beschouwen. Indien een biologisch evenwicht aanwezig is tussen de verschillende diersoorten, zullen zieke en verzwakte exemplaren reeds tijdig door hun natuurlijke vijanden worden geëlimineerd. Het is zodoende denkbaar dat de teruggang van de roofvogelstand in grote delen van onsland (vooral door bestrijdingsmiddelen in de land- en tuinbouw) indirect een rol heeft gespeeld bij het ontstaan van botulismusbij watervogels buiten degrote steden. Uit het onderzoek weergegeven in hoofdstuk 5 is gebleken dat met name in de botulismusgebieden veel vogelsbesmet waren met Cl. botulinum type C, zelfs nog 1jaar nadat de laatste gevallen van botulismus waren vastgesteld. In zulke gebieden kan botulismus bij watervogels bij ongunstige ecologische omstandigheden gemakkelijk recidiveren; in enkele gebieden werd dit in 1971 en 1972 inderdaad waargenomen. Er is geen zekerheid dat watervogels ook vóór 1970 reeds besmet waren met type C. Cl. botulinum type C is echter wel in grondmonsters aangetoond, die voor 1970 waren verzameld. Voor 1970 was bovendien reeds vastgesteld dat botulismus bij nertsen en paarden door type Cwerd veroorzaakt. Het is zodoende te verwachten dat ook vóór 1970reeds incidenteel vogels en kleine zoogdieren besmet waren met type C. De eerste gevallen van botulismus in 1970 in 's-Gravenhage en Hilvarenbeek zouden dan zijn te verklaren door aan te nemen dat bij ongunstige ecologische omstandigheden voldoende botulinumtoxine isgevormd in kadaversvan zulke besmette dieren. Uit het onderzoek beschreven in hoofdstuk 7 blijkt dat eenden, die van botulismus zijn hersteld of oraal multipele subletale doses van het botulinumtoxine hebben opgenomen, geen serologisch aantoonbare immuniteit bezaten. Het verloop van een botulismusuitbraak lijkt dusniet te worden beïnvloed door een zich ontwikkelende immuniteit bij de autochtone watervogels. Er werden evenmin aanwijzingen gevonden dat eenden na de opname van multipele subletale doses door sensibilisatie gevoeliger werden voor het botulinumtoxine. Het bleek dat er wel een accumulatie van het botulinumtoxine plaats vond, waarbij bij Pekingeenden de opname van 5x 1/16MLD per week na 16 tot 19 dagen symptomen van botulismus veroorzaakte. Indien dit gegeven ook voor andere watervogels geldt, dan is hieruit te berekenen dat voor het optreden van botulismus een dagelijkse opname van minstens 25.000 LD50 van het meest virulente 170

botulinumtoxine nodig is. Bij het onderzoek naar de resistentie van het botulinumtoxine in de vrije natuur bleek dat in dierlijk materiaal als lever- en vleespartikels een dergelijke concentratie van het toxine gedurende minstens 9maanden aanwezig kan blijven (figuur 3). Bij botulismusuitbraken onder watervogels in de Verenigde Staten en Australië is eveneens aandacht besteed aan de rol van kadavers en sarcophage vliegen (Kalmbach, 1932; Richardson, 1965).Uit de literatuur blijkt verder dat kadavermateriaal eveneens de bron van het botulinumtoxine is geweest bij gevallenvan botulismus bij paarden, runderen, schapen, en vogels als kippen en fazanten. Alhoewel botulismus niet besmettelijk is, kunnen bij vogels toch gemakkelijk secundaire ziektegevallen optreden (Kalmbach, 1930). Pullar (1934) en Quortrup en Holt (1940) meenden dat in water en slibvan botulismusgebieden voldoende botulinumtoxine aanwezig zou zijn om botulismus bij watervogels te veroorzaken. Zij vonden nl plaatsen tijdens een massale sterfte bij watervogels door botulismus, waar in water of slib botulinumtoxine was aan te tonen. De concentratie van het toxine werd echter slechtseen enkele maal bepaald: Pullar toonde per ml water 1 MLD voor caviae per osaan, terwijl QuortrupenHolt plaatsenvondenwaar 10ml water reedseen voor eenden letale dosis toxine bevatte. Het toxine werd gevonden op plaatsen waar zich in ondiep water grote massa's rottend plantaardig en dierlijk materiaal hadden verzameld, meestal na langdurige perioden van droogte bij een dalende waterspiegel. Deze onderzoekers hebben niet nagegaan in hoeverre het hier toxine zou kunnen betreffen, dat afkomstig was van kadavers van gestorven watervogels, die zich tussen en in de onmiddellijke omgevingvan deze rottende materie bevonden. De milieu's, waar in Nederland botulismus bij watervogels voorkwam,weken af van de omstandigheden, zoals die in de Verenigde Staten en Australië zijn beschreven. De resultaten van de productie van botulinumtoxine onder experimentele omstandigheden en van de veldproef met wilde eenden, vormen verder een bevestiging van de veronderstelling, dat de productie van botulinumtoxine buiten de kadavers van watervogels en eventueel kleine zoogdieren b.v. ratten, geen rol van betekenis speelt bij de epidemiologie van botulismus bij watervogels in Nederland. 10.3. DE INVLOED VAN THERMISCHE WATERVERONTREINIGING BIJ HETOPTREDENVAN BOTULISMUS BIJWATERVOGELS Bij dit onderzoek bleek de temperatuur van het milieu de belangrijkste ecologische factor te zijn. In de gevallen waarbij de pH of het zuurstofgehalte van een waterpand tijdens een botulismusuitbraak werd bepaald, bleken deze geen opvallende afwijkingen te vertonen. Uit het onderzoek dat in hoofdstuk 9 is beschreven, blijkt dat bij 20°C na relatief korte tijd reeds hoge concentraties van het botulinumtoxine kunnen zijn 171

gevormd. Na 6 dagen werden reeds concentraties van 20.000 LD50 per ml cultuurmedium gevonden, een waarde die hoog genoeg isom botulismus te veroorzaken door accumulatie van het toxine in het lichaam. Na9 dagen werd bij 20 C een toxineconcentratie van 200.000 LD50per ml cultuurmedium gevonden, een toxineniveau waarbij de directe orale opname van een letale dosisvan het botulinumtoxine zonder meer mogelijk is. Naarmate de optimale temperatuur van 30 C dichter wordt benaderd, zaleen dergelijke hoge concentratie van het botulinumtoxine sneller worden bereikt. Het onderzoek weergegeven in hoofdstuk 6, wijst er bovendien op dat in putride kadavers hogere concentraties van het botulinumtoxine bereikt kunnen worden dan met reinculturen in voedingsmedia, zoals die bij het experimentele onderzoek (hoofdstuk 9) werden gebruikt. Daarom is een watertemperatuur van 20°C zeker hooggenoegom een snelleenhoge productie van het botulinumtoxine te waarborgen in kadavermateriaal, dat zich in dit water bevindt. Naarmate de temperatuur verder beneden 20°C daalt, zal de productie van het botulinumtoxine langzamer verlopen. Onder experimentele omstandigheden werd bij 15 Cpas na 30 dagen een toxineconcentratie van 20.000 LD50per ml bereikt. Het isonwaarschijnlijk dat bij een dergelijke temperatuur nog sterfte van enige omvang door botulismus bij watervogels zal optreden. Deze veronderstelling wordt ook door de praktijk bevestigd. In NoordAmerika en Australië isuitsluitend sterfte door botulismus bij watervogelsin het warme jaargetijde vastgesteld (Kalmbach, 1930, 1935 en 1968; Pullar, 1934; Grubb, 1964; Martinovich ei al, 1972). Hetzelfde geldt voor de botulismusgevallen, die in Europese landen werden vastgesteld gedurende de laatste jaren (Niléhn en Johannsen, 1965; Muller, 1967a en 1972; Blandford et al, 1969; Keymerefa/, 1972;Roberts etal,1972). Dat in een natuurlijk biotoop 'szomers bij voldoende hoge lucht- en watertemperaturen niet frequenter botulismus bij watervogels voorkomt, zal vooral zijn toe te schrijven aan het feit dat veelalniet aan alle essentiële voorwaarden is voldaan. Op grond van dit onderzoek blijkt de aanwezigheid van kadavermateriaal dat besmet is met Cl. botulinum type Cen de aanwezigheid van zoöphage vliegen van grote importantie te zijn. Volstrekt afwijkend van de situatie in het buitenland is echter het feit dat in Nederland in de jaren 1970, 1971 en 1972 ook in deherfst en in de winter nog gevallen van botulismus voorkwamen. Het onderzoek, dat in de hoofdstukken 4 en 9 is beschreven, heeft aangetoond dat deze gevallen het gevolg zijn van een thermische pollutie door koelwater van electriciteitscentrales in ongunstig gesitueerde koelcircuits. In deze waterpanden met een sterk verhoogde watertemperatuur zal bij aanwezigheid van een gunstige voedingsbodem, een snellere en grotere productie van botulinumtoxine plaatsvinden. Dit warmere water zalbovendien in het koude jaargetijde een extra aantrekkingskracht uitoefenen op watervogels, waardoor onevenredig grote aantallen watervogels leven in een klein 172

gebied. De gevolgen van een dergelijke ontwikkeling zijn wel zeer duidelijk aan het licht gekomen in Groningen door degevallen van botulismus injanuari 1972. Hoezeer de situatie in Nederland afwijkt van de in het buitenland beschreven botulismusgevallen, blijkt ook uit het feit dat in een koelere zomer als 1972 botulismus vrijwel uitsluitend voorkwam in de grote steden en de directe omgeving, waarbij in 's-Gravenhage, Amsterdam en Leiden na 1970 sprake was van eenrecidiefin2opeenvolgendejaren.Dezegebiedenzijn ookeenpotentieel gevaar voor andere waterwildgebieden omdat zowel de bodem als de daar levende dieren (vooral watervogels) in ernstige mate besmet zijn met Cl. botulinum type C, zodat migrerende watervogels andere natuurgebieden met Cl.botulinum typeC kunnen besmetten. In warmere zomers is nu ook in deze natuurgebieden de mogelijkheid aanwezig dat zicheen botulismusuitbraak gaat ontwikkelen. Indien dit waterwildreservaten en andere vogelgebieden zou betreffen, isernstige schade aan de fauna (vooral aan watervogels) te verwachten, waarbij speciaalhet verlies van kostbare en zeldzame soorten inhoge mate zou zijn te betreuren. De ernst van de situatie wordt echter niet alleen veroorzaakt door het verlies van watervogels en de daarmede samenhangende onrust bij ornithologen en andere personen die met dezevogelsterfte worden geconfronteerd. Veel ernstiger is het feit dat botulismus bij watervogels is aan te merken als een duidelijk waarneembare indicator vooreen steeds toenemende milieuverontreiniging waarvan een voortschrijdende ontwrichting van het biologisch evenwicht één der gevolgen is. De toenemende thermische pollutie is een zeer bedenkelijk aspect omdat in Nederland in de nabije toekomst de koelcapaciteit van alle grotere oppervlakte wateren zal zijn benut, indien aan de door Went (1970) en Keiler (1970) gestelde voorwaarden moet worden voldaan. Bij het optreden van botulismus bij watervogels zijn ten aanzien van de rol die koelcircuits van electriciteitscentrales spelen, slechts enkele preventieve maatregelen aan te geven. Een afdoende maatregel zou zijn er voor te zorgen dat de temperatuur van het water in het koelcircuit beneden 20 C blijft, 's Zomerszal deze grens echter, onder invloed van de klimatologische omstandigheden, zeker worden overschreden. Het is daarom van belang tevens enkele secundaire maatregelen aan te geven, die eveneens een gunstig effect kunnen sorteren, nl het tijdig verzamelen van zieke en gestorven dieren, het uitbaggeren van ondiepe gedeelten van het koelcircuit en te zorgen voorgoed beschoeide walkanten langs het gehele circuit. Andere maatregelen, zoalsde therapeutische behandeling met een hoogwaardig immuunserum of de preventieve vaccinatie met een toxoidvaccin,lijken vooralsnog weinig praktisch. Overigens moet worden gesteld dat niet alle botulismusgevallen, die in de herfst en winter voorkomen, zijn toe te schrijven aan de rechtstreekse gevolgen van thermische waterverontreiniging. Er deden zich in de herfst'en winter van 1971 en 1972 ook enkele gevallen voor in vijvers met normale watertemperatuur; hierbij was met zekerheid bekend dat het watervogels - meest ganzen en 173

zwanen - betrof, die nimmer dat gebied hadden kunnen verlaten. Het ontstaan van deze botulismusgevallen iste verklaren door aan te nemen dat de watervogels botulinumtoxine hebben opgenomen dat reeds in de voorafgaande zomer bij hogere temperaturen was gevormd. Bij het onderzoek dat in hoofdstuk 6 is beschreven, is reeds gebleken dat de resistentie van het botulinumtoxine voldoende groot is om gedurende verscheidene maanden aanwezig te blijven zonder dat een aantoonbaar verlies van de concentratie van het toxine optreedt. Hierbij dient nog te worden opgemerkt dat de hiervoor bedoelde gevallen uitsluitend zijn gesignaleerd in waterpanden waar in de voorafgaande zomer reedsverscheidene gevallen van botulismus waren voorgekomen, zoals het Zuiderpark in 's-Gravenhage en het Vondelpark in Amsterdam. 10.4. VOLKSGEZONDHEIDSASPECTEN BIJ HET OPTREDEN VAN BOTULISMUS BIJWATERVOGELS Tot nu toe was in Nederland het voorkomen bekend van Cl. botulinum type Ben type C. Door het type B-toxine zijn in Nederland enkele ziektegevallen bij de mens vastgesteld (Clarenburg en Fijen, 1937; Schoonhoven van Beurden en Clarenburg, 1937). in dit onderzoek (hoofdstuk 5) werd het voorkomen van type B en Cbevestigd, maar het bleek dat Cl. botulinum type A en E in Nederland eveneens voorkomen', type A werd slechts sporadisch gevonden, doch type E tamelijk frequent, met name in waterrijke gebieden (tabel 35). De mens is,behalve voor type B, ook zeer gevoelig voor de toxinetypen A en E. In verband met deze nieuwe gegevens zou men thans kunnen veronderstellen dat de ernstige botulismusepidemie bij Nijmegen (Bekker, 1944; Enneking, 1944) door botulinumtoxine type E is veroorzaakt. Het geisoleerde toxine kon nl niet worden getypeerd met de toen ter beschikking staande antitoxinen type Aen B;van de thans in Nederland gevonden toxinetypen . waarvoor de mens zeer gevoelig is, blijft aldus per exclusioiiem type E over. Dat varkensham het toxische voedsel vormde, behoeft hiermede niet in strijd te zijn, omdat ook andere auteurs gevallen vermelden, waarbij type E-toxine in ham of andere vleesproducten werd aangetoond (Meyer, 1956;Matveev etal, 1967). Cl.botulinum typeC. Bij de beoordeling van de gevaren voor de volksgezondheid, die verbonden zijn aan het massaal optreden van botulismus bij watervogels, is van fundamenteel belang de vraag in hoeverre de mens gevoelig isvoor het botulinumtoxine type C. Dolman en Murakami (1961) bespreken vrij uitvoerig 2 gevallen van botulismus bij de mens die aan type C werden toegeschreven. Men kan echter stellen dat de diagnose in deze gevallen niet volledig betrouwbaar isgeweest: er was wel sprake van een op botulismus wijzend ziektebeeld, maar er kon geen 174

botulinumtoxine bij de 2 patiënten worden aangetoond. Dat toch werd aangenomen dat deze patiënten aan een intoxicatie met type Chadden geleden,werd gebaseerd op het feit dat de aanwezigheid van Cl. botulinum type Cwerd aangetoond in de maaginhoud van één der patiënten en in het andere geval in het verdachte voedsel. Matveev et al (1967) vermelden in hun overzicht, betreffende de epidemiologie van botulismus in Rusland, dat gedurende de laatste 2 jaar 2 gevallen van botulismus bij demens door type Czijn veroorzaakt. Debetrouwbaarheid vande diagnostiek is in deze gevallen niet te beoordelen, omdat verdere gegevens ontbreken. Dat de mens een zekere gevoeligheid voor het type C-toxine kan bezitten,is misschien ook te concluderen uit proeven die Dolman en Murakami (1961)voor dit doel met rhesusapen hebben verricht. Bij orale applicatie bleek de MLDvoor deze apen per kg lichaamsgewicht in intraperitoneale muizen MLD, voor type B 180, voor type A650,voor type Cßen E 1.500tot 2.500,voor type F 50.000 tot 75.000 voor type Ca 100.000 tot 250.000 en voor type D 600.000 te bedragen. Het verschil tussen het Ca- en het Q3-toxine is opvallend groot. Over de gebruikte type C-stammen wordt vermeld dat de Ca-stam afkomstig was uit de Verenigde Staten uit gevallen van botulismus bij watervogels en de C/3-stam uit Europa (Instituut Pasteur te Parijs) uit een gevalvan botulismus bij paarden. Het is duidelijk dat, indien er van wordt uitgegaan dat de menseen zekere,zij het geringe, gevoeligheid heeft voor het type C-toxine, een uitbreiding van het aantal gevallen van botulismus bij watervogels als zeer ongewenst voor devolksgezondheid is te beschouwen. Watergebieden, waar botulismus voorkwam, zijn tevens recreatiegebieden; aan een ernstige contaminatie van deze gebieden met botulinumtoxine en met Cl. botulinum type C zijn dan reeds direct gevaren verbonden. Cl.botulinum type A, B enE De situatie wordt nog bedenkelijker indien in ogenschouw wordt genomen dat ook detypenBen Ein deze gebieden veelvuldig werden aangetoond, zowel in de bcdem als bij de in dit gebied levende dieren en bij aan botulismus gestorven watervogels. Na afsluiting van het onderzoek dat in hoofdstuk 5 is beschreven, bleek ook type A te kunnen voortkomen bij watervogels die aan botulismus zijn gestorven: uit een wilde eend die in januari 1973 in Leiden aan botulismus was gestorven, werd nl. Cl. botulinum type A uit de parenchymateuze organen en hartspier geisoleerd. Indien de kadavers van watervogels niet tijdig worden vernietigd, zal niet alleen een sterke besmetting van deze gebieden met Cl.botulinum type C plaatsvinden, maar ook met de typen B, E en A. Een verdere verspreiding vanuit deze gebieden is op vele manieren denkbaar, o.a. via zoöphage vliegen (hoofdstuk 5). Mocht hierbij voor menselijke consumptie bestemd voedsel worden besmet met Cl. botulinum dan is dit als hoogst ongewenst te 175

beschouwen: de vorming van botulinumtoxine is dan immers afhankelijk gewordenvandezorgwaarmede dit voedsel verder zalworden behandeld(Forster et al, 1965). Drinkwaterbedrijven Bij het optreden van botulismusbij watervogels dient de volksgezondheid ook nog opeen geheel andere wijze in discussie te worden gebracht, omdat inéén van de grote steden botulismus is voorgekomen in duinpannen die in gebruik waren voor de drinkwatervoorziening. De waterbassins, gelegen in een afgesloten natuurgebied in de duinen, trekken veel watervogels aan. In 1971, toen in 's-Gravenhage steeds meer gevallen van botulismus buiten het verversingskanaal bleken voor te komen, is ook in deze duinpannen sterfte onder watervogels door botulismus vastgesteld. In water en slib van deze bassins werd bij herhaling Cl.botulinum type C aangetoond. Het was niet te vermijden dat in deze duinpannen kadaversvan aan botulismus gestorven watervogels terecht kwamen. Het monster water uit een gebied met botulismus, waarin botulinumtoxine werd aangetoond (tabel 38), was afkomstig van één van deze duinpannen uit de onmiddellijke omgevingvan het geputrificeerde kadaver van een fazant. Desterfte door botulismus verdween in september, toen de lucht- en watertemperaturen daalden. In 1972 isde ziekte hier niet opnieuw gesignaleerd. Rechtstreeks gevaar voor de volksgezondheid door de aanwezigheid van type C-toxine in het drinkwater isonaannemelijk, omdat het water uit de duinpannen nog de zandlagen van de bodem van deze pannen moet passeren en daarna een behandeling met norit ondergaat. Bovendien zal er een enorme verdunning van het toxine optreden door de snelle doorstroming van het water, die nodig isom aan debehoefte van drinkwater te voldoen. Een ander probleem is echter dat de resistente sporen van Cl. botulinum type Cde zandlagen van de duinpannen zouden kunnen passeren. Deze sporen zouden dan met het water in een grote verzamelkom terecht komen. Het water wordt hieruit overkiezel-enzandfiltersgeleid,alvorenshetwordt afgegeven aande buizen van het drinkwaternet naar de stad. In de bovenste laagvan de zandfilters vindt een biologische reiniging plaats, waarbij normaliter alle vegetatieve kiemen worden geëlimineerd. Er is echter geen zekerheid dat dit ook gebeurd met clostridiumsporen. Een distributie van Cl. botulinum type C sporen via het drinkwaternet van een grote stad dient echter wel alseen zeer ongewenste ontwikkeling te worden aangemerkt. In het kader van dit onderzoek kwamen nog geheel andere feiten aan het licht. Bij het vervolgen van de besmetting met Cl. botulinum type C over het terrein van een drinkwaterbedrijf, werd ook de verzamelkom onderzocht omdat in dit open waterbekken kuifeenden werden gesignaleerd. Slib van de bodem van deze kom bleek niet besmet te zijn met type C,maar wel met Cl. botulinum type B. In sommige slibmonsters wasde besmetting zeer intensief, zodat 10mgmate176

riaal reeds voldoende wasvoor het verkrijgen van een toxische ophopingscultuur. Het slib van de bodem van dit waterbekken wordt ter reiniging op gezette tijden opgezogen en verwijderd, maar Cl. botulinum type Bbleef ook na dit procesnog aantoonbaar in het bodemslib. Uit één van deze slibmonsters werd een zeer toxogene stam van type Bin reincultuur geisoleerd (stam WB 1971, tabel 33). Als besmettingsbron werd bij verder onderzoek het omringende grasveld aangewezen, nadat type Bin de bodemmonsters werd aangetoond, met name in monsters van regengoten die naar de verzamelkom liepen. Een besmetting via het aangevoerde water kon niet worden aangetoond, terwijl een vermeerdering van type B in het bodemslib van de verzamelkom zeer onwaarschijnlijk was in verband met de lage temperatuur, alhoewel het slib wel anaëroob was. Door de lokalisatie zouden de type B-sporen het drinkwaternet eerder kunnen bereiken dan de type C-sporen die in de duinpannen voorkwamen. Bij onderzoek werd type C niet, maar type Bwel aangetoond in 2van 3onderzochte zandfilters. Het onderzoek op Cl.botulinum van 101 drinkwater, geconcentreerd door filtratie, verliep negatief. Bij de aanleg van nieuwe drinkwaterterreinen - waarbij men open waterbassins aanlegt om gebruik te kunnen maken van filtratie van het water door zandlagen van de bodem van deze bassins — dient men zich bewust te zijn van de aspecten die zijn verbonden met het aantrekken van watervogels naar dezegebieden. Dit onderzoek heeft aangetoond dat in de zomermaanden het optreden van botulismus bij watervogels als een reële mogelijkheid dient te worden beschouwd. Landbouwhuisdieren Het is mogelijk dat de volksgezondheid ook nog op een andere wijze ingevaar wordt gebracht. De ernstige infectie van het milieu met Cl.botulinum type C, die optreedt bij een massale sterfte van watervogels door botulismus,zou nl tot gevolg kunnen hebben dat het aantal gevallen van botulismus bij landbouwhuisdieren ook gaat toenemen. Sterfte door botulismus werd bij deze dieren tot 1970 in Nederland slechts een enkele keer met zekerheid vastgesteld;zowerd in de laatste 10 jaar één geval bij paarden (Cysouw en Tesink, 1968; Haagsma, 1968)en één geval bij runderen (Haagsma, 1969)aangetoond. In de laatste 2jaar is het aantal gevallen verhoudingsgewijs toegenomen; er werd een geval bij runderen vastgesteld in 1971 (Koopman et al) en daarna gevallen bij runderen, heideschapen en mestkuikens (Haagsma, 1972). Bij de gevallen van het paard en het rund bleek de bron van het botulinumtoxine typeChet kadaver vaneen kat te zijn, die in het hooi ofde voordroogkuilwasterechtgekomen. Bijhet optreden van botulismus bij enkele schapen werd de herkomst van het toxine niet aangetoond en dat was eveneens het geval bij de zeer grote en langdurige sterfte bij mestkuikens op een bedrijf in de omgevingvan Breda. In dit laatste geval konden slechts 2 gemummificeerde kadavertjes van zeer jonge kuikentjes worden onder177

zocht. Het bleek dat dit bedrijf zeer ernstig besmet wasmet Cl. botulinum type C, een besmetting die leek te zijn veroorzaakt doordat de hokken werden schoongemaakt met water uit de Chaamse beek, die - zoals later onderzoek aantoonde - ter plaatse besmet was met Cl. botulinum type C. Evenals bij gevallen van botulismus bij watervogels (hoofdstuk 5) bleken ook mestkuikens, die aan botulismus leden of waren gestorven,in de parenchymateuze organen en in de digestietractus besmet te zijn met Cl. botulinum type C. Uit de lever van één der kuikens werd stam 74902 geisoleerd (zie 8.2.). Omdat de kuikens tijdelijk ook nog met Cl. botulinum besmet drinkwater hebben gekregen, is het te verwachten dat bij degeslachte mestkuikens die van het bedrijf afkomstig waren, een beduidend aantal karkassen met Cl. botulinum type C waren besmet en als zodanig deconsument zullen hebben bereikt. Deze botulismusuitbraak illustreert wel het duidelijkst de ongewenste gevolgen van een voortgaande besmetting van het leefmilieu van mens en dier in Nederland met Cl.botulinum, zowel met type Calsmet de andere toxinetypen. Een bezinning op de gedurende de laatste 3jaar veranderde situatie lijkt daarom alleszins noodzakelijk.

178

SAMENVATTING EN CONCLUSIES De resultaten van een uitvoerig onderzoek naar de etiologie en de epidemiologie van botulismus bij watervogels in Nederland zijn in dit proefschrift weergegeven. De ernstige gevallen van botulismus, die in 1970 werden vastgesteld, vormden de aanleiding tot een nader onderzoek; dit concentreerde zich vooral op de vragen: 1) Hoe is de verspreiding van de verschillende typen van Cl. botulinum in Nederland? 2) Onder welke omstandigheden heeft een zodanige vorming van het botulinumtoxine plaats, dat massale sterfte bij watervogels en eventueel andere dieren het gevolgkan zijn? 3) Iser een relatie met bepaalde vormen van milieuverontreiniging? 4) Welke zijn de consequenties voor de volksgezondheid? In hoofdstuk 2 wordt in een algemeen gedeelte een overzicht gegeven vande literatuur, waarbij achtereenvolgens worden behandeld: historisch overzicht en gegevens over het voorkomen van botulismus, de etiologie met de belangrijkste bacteriologische kenmerken, de Pathogenese,de Symptomatologie van de ziekte, de post-mortem bevindingen, de diagnostiek en de prophylactische en therapeutische mogelijkheden. In een apart gedeelte worden daarna de literatuur over de etiologie en de epidemiologie van botulismus bij watervogels samengevat. De meeste gegevens hebben betrekking op onderzoekingen die in de dertiger jaren in de Verenigde Staten zijn uitgevoerd. Uit het literatuuronderzoek bleek dat pas in de laatste jaren in Europa enkele gevallen van botulismus bij watervogels zijn vastgesteld. Men bleek algemeen van mening, dat bij watervogels - evenalsbij andere dieren en de mens - botulismus ontstaat door de opname van reeds gevormd ("preformed") toxine-. In hoofdstuk 3 worden de materialen en methodieken beschreven, die in dit onderzoek zijn gebruikt. Voor de groei van Cl.botulinum invloeibare voedings179

media werden leverbouillon, cooked meat medium, fortified egg meat medium en het medium volgens Cardella gebruikt. De kweek opvaste voedingsbodems geschiedde op hartinfuus-schapebloedagarplaten, brain heart runderbloedagarplaten en glucose-runderbloedagarplaten in een anaërobenvat volgens de principes van Mcintosh en Fildes. De Cl.botulinum antitoxinen waren afkomstig vanhet "Instituut Pasteur" te Parijs en het "Center for Disease Control" te Atlanta. Erwerd bovendien gebruik gemaakt van een type C-antitoxine, dat voor dit onderzoek werd bereid met behulp van anatoxine (toxoid) van Cl. botulinum type C-mink (Dinter en Kuil). Als proefdieren voor het aantonen van het botulinumtoxine werden Swiss Random muizen van 18 tot 20ggebruikt. De typering vanhet botulinumtoxine geschiedde volgens richtlijnen van het "Center for Disease Control" te Atlanta. Tijdens het onderzoek werd een methodiek uitgewerkt, die het mogelijk maakte botulinumtoxinen met behulp van centriflo membraanfilters (Amicon) te concentreren. Deze methodiek bleek van grote waarde bij het aantonen en typeren van geringe hoeveelheden toxine. In hoofdstuk 4wordt een onderzoek gegeven van de botulismusgevallen diein Nederland in 1970, 1971 en 1972 bij watervogels zijn vastgesteld. Vóór 1970 wasde ziekte niet onderkend. Bij de diagnostiek bleken de klinisch waarneembare ziekteverschijnselen, waarbij de verlammingsverschijnselen op de voorgrond traden, belangrijke aanwijzingen te kunnen verschaffen. Bijhet post-mortem werden geen pathognomonische laesies waargenomen. Wilde eenden, die aan botulismus hadden geleden, waren in enkele gevallen besmet met bloedzuigers (Theromyzon tessulatum). Deze parasieten kunnen alssecundaire infectie aanleiding hebben gegeven tot een bemoeilijkte luchtpassage in de neusholte. De definitieve diagnose berustte steeds op het aantonen van het botulinumtoxine, dat bij typering in alle gevallen type Cbleek te zijn. In vrij veelgevallen bleek de hoeveelheid toxine in het bloedserum of de leversuspensie, die voor de diagnostiek beschikbaar was, nauwelijks 1MLDvoor muizen te zijn. In sommige gevallen waarbij nogminder toxine aanwezig was,werd het botulinumtoxine met succes geconcentreerd met behulp van centriflo membraanfilters. Bij levende botulismuspatiënten werden de beste resultaten verkregen bij onderzoek van het bloedserum. Bijgestorven vogelsleverde de diagnostiek somsmeer moeilijkheden op, omdat men dan was aangewezen op het onderzoek van de lever en de digestietractus. In dit onderzoek is geen diagnostische waarde toegekend aan de isolatie van Cl. botulinum. Achteraf bleek dit juist te zijn omdat het oorzakelijke microorganisme ook wel bij dieren,waarbij een andere doodsoorzaak werd vastgesteld, bleek voor te komen. Het optreden van botulismus werd in 6 gebieden aan een uitgebreider onder180

zoek onderworpen in verband met de bijzondere aspecten die zich hierbij voordeden. Twee botulismusuitbraken traden in natuurgebieden op, nl in Hilvarenbeek en in Zuidelijk Flevoland. De4andere botulismusgevallen kwamen voor in parken, vijvers en grachten van de steden 's-Gravenhage,Amsterdam, Groningen en Leiden. In deze laatste gebieden werden ook nog gevallen van botulismus vastgesteld in de herfst en in de winter. De bijzondere ecologische aspecten,die aan het optreden van botulismus in deze gebieden waren verbonden, zijn in hoofdstuk 9 beschreven. Ook in 9 andere gebieden werden in de zomermaanden gevallen van botulismus gesignaleerd. De geographische ligging van deze gebieden en het tijdstip waarop de ziekte optrad, doen vermoeden dat het meestal secundaire gevallen betrof, die verband hielden met de eerder genoemde 6 bijzondere botulismusgebieden. In hoofdstuk 5 zijn de resultaten vermeld vanhet onderzoek dat tot doel had het voorkomen van Cl. botulinum na te gaan in verband met het optreden van botulismus bij watervogels. Daartoe werden een groot aantal bodemmonsters en diverse dieren - zowel vertebraten alsinvertebraten — in onderzoek genomen. In de gebieden waar botulismus bij watervogels was voorgekomen, bleek water maar vooral slib veelvuldig en intensief besmet te zijn met Cl. botulinum type C. Op de walkanten was de grond op de roestplaatsen van de watervogels eveneens vaak besmet met Cl. botulinum type C. Naast type C werden in deze botulismusgebieden ook de typen Ben E aangetoond (tabel 14).Eenjaar nade laatste gevallen van botulismus waser noggeen vermindering vast te stellen inde besmettingsgraad van de bodem van dezegebieden met type C. In bodemmonsters, verzameld in vogelgebieden waar geen botulismus was voorgekomen, werd Cl. botulinum type C slechts in enkele slibmonsters gevonden (tabel 17). Deze monsters bleken bij kwantitatief onderzoek bovendien veel minder intensief te zijn besmet dan in de botulismusgebieden. De typen B en E werden in de botulismusvrije vogelgebieden relatief even vaakgevonden als in de botulismusgebieden. Het voorkomen van Cl. botulinum in de bodem van vogelgebieden waar botulismus wel of niet was voorgekomen, werd tenslotte vergeleken met slib-en grondmonsters, die verspreid over Nederland werden verzameld op plaatsen waar geen concentraties van watervogels werden gezien. Type Cwerd bij dit onderzoek slechts in 0,7% van de monsters gevonden, terwijl de typen B en Eweerin dezelfde percentages voorkwamen als in de vogelgebieden (tabel 19). Het optreden van botulismus bij watervogels, blijkt dus te leiden tot een intensieve besmetting van deze gebieden met Cl. botulinum type C.Type Cwasechter ook al voor 1970,dusvoor de eerste ernstige gevallen van botulismus bij watervogels, in Nederland in de bodem aanwezig, zoalsbleek uit een onderzoek van gedroogde bodemmonsters (tabel 20). Bij het onderzoek van deze collectie werd ook 181

voor het eerst in één monster Cl.botulinum type A aangetoond. De geographische spreiding van Cl. botulinum op grond van het onderzoek in willekeurig verzamelde bodemmonsters is weergegeven in tabel 21;het is hierbij opvallend dat type E relatief frequent werd gevonden in de bodem van het voormalige IJsselmeer. Naast bodemmonsters werd ook een groot aantal dieren op Cl. botulinum onderzocht. Het onderzoek concentreerde zich vooral op watervogels, doch ook andere vogels, zoogdieren, vissen en diverse invertebraten werden in het onderzoek betrokken. Watervogels, die aan botulismus leden of waren gestorven, bleken besmet te zijn met Cl.botulinum type C(tabel23adA). Bij43%van de botulismuspatiènten kon type Cin de parenchymateuze organen enhartspier worden aangetoond en bij 78%in de digestietractus. Bij 71% werd type Cuitwendig — op de zwemvliezen en de buikhuid — gevonden. Sporadisch werd bij een watervogel,die aan botulismus was gestorven, Cl. botulinum type Bof E in de inwendige organen aangetoond. Vogels die in deze botulismusgebieden aan andere ziekten waren gestorven, bleken in mindere mate besmet te zijn met Cl. botulinum type C(tabel 23adB). Gezonde vogels uit de botulismusgebieden, die speciaal voor dit onderzoek waren verzameld, bleken eveneens besmet te zijn met Cl. botulinum type C (tabel 23ad C).Het percentage waszelfs ietshoger dan bij de andere ziektegevallen. Het voorkomen van Cl.botulinum bij vogels uit de botulismusgebieden werd vergeleken met vogels, die zo ver mogelijk van deze gebieden verwijderd werden verzameld. Bij deze vogels werd type C slechts in een enkel geval aangetoond (tabel 25 ad A en C). Kennelijk zijn watervogels en andere vogels normaliter slechtsineengeringpercentage met Cl. botulinum type Cbesmet. Detypen B en Ewerden bij deze vogelseveneens aangetoond. Kleine zoogdieren als de bruine rat,bisamrat,woelrat,kat enhaas, afkomstig uit verschillende plaatsen in Nederland, bleken eveneens besmet te kunnen zijn met Cl. botulinum type C(tabel 26). Er werden ook een aantal vissen onderzocht. In 4 palingen, uit een botulismusgebied afkomstig, werd Cl. botulinum type C aangetoond en in 1baars uit een botulismusvrijgebied type E. Van de invertebraten werden Insecta (Diptera en Coleoptera) enMollusca (zoetwaterslakken en mosselachtigen)inhet onderzoek betrokken. Maden van de zoöphage vliegen L. illustrisen C. erythrocephala,verzameld van kadavers van watervogels tijdens een uitbraak vanbotulismus,bleken steeds besmet te zijn met Cl. botulinum type C. In maden van zoöphage vliegen uit botulismusvrije gebieden werd daarentegen Cl. botulinum type C niet aangetoond. Zoöphage vliegen, die in een vliegenval werden verzameld ineen gebied waar 182

botulismus bij watervogels voorkwam, bleken eveneens besmet te zijn metCl. botulinum, zowel met type Calsmet E(tabel 28).Cl. botulinum werd niet meer aangetoond bij deze vliegen nadat de sterfte door botulismus was opgehouden. Zoöphage vliegen, op dezelfde wijze en in dezelfde periode verzameld in een botulismusvrij gebied, bleken slechts sporadisch besmet te zijn met Cl.botulinum, waarbij eveneens de typen Cen Ewerden aangetoond (tabel 29). In Mollusca, die tot het voedselpakket van de watervogels zouden kunnen behoren en die verzameld waren in botulismusgebieden, werd veelvuldig Cl. botulinum type C aangetoond (tabel 30); type B werd 1maal aangetoond en type E nimmer. In botulismusvrije gebieden werd bij deze Mollusca slechts 1 maalCl. botulinum type Cgevonden (tabel 31). In mosselen (Mytilus edulis), die voor de Nederlandse kust in de Noordzee en de Waddenzee werden verzameld, werd zowel Cl. botulinum type B, C als E aangetoond, waarbij type Bdomineerde (tabel 32). In de tabellen 34 en 35 wordt tenslotte een samenvattend overzicht gegeven van het voorkomen van Cl. botulinum in degebieden met en zonder botulismus bij watervogels. Het grote verschil is, dat de gebieden waar botulismus isvoorgekomen, zeer intensief besmet zijn met Cl. botulinum type C.De typen B,CenE blijken in beide gebieden ubiquitair voor te komen, waarbij een tamelijk nauwe relatie bodem-dier aanwezig lijkt te zijn. In een aantal geselecteerde gevallen werd getracht Cl. botulinum in reincultuur te isoleren. In verband met het feit dat botulismus bij watervogels door type Cwordt veroorzaakt, werd de meeste aandacht aan de isolatie van stammen van dit type geschonken. Van de typen A, B en E werden echter ook enkele reinculturen geïsoleerd (tabel 33). In hoofdstuk 6 wordt het onderzoek beschreven dat gericht wasop het voorkomen van het botulinumtoxine type Cin de natuur. Indien men immers aanneemt dat botulismus bij watervogels wordt veroorzaakt door de opname van "preformed" toxine, betekent dit dat het toxine in de natuur involdoende hoge concentraties aanwezig moet zijn. Tijdens het optreden van botulismus bij watervogels werden deze hoge concentraties aangetroffen in putride kadavers van watervogels — die bij sterfte van enige omvang steedsvoldoende aanwezig zijn — en in de daarin aanwezige maden van zoöphage vliegen (tabel 36 én 37).Ook in de kadavers van kleine zoogdieren (katten) en vissen (paling) bleek een belangrijke vorming van botulinumtoxine type Cmogelijk te zijn. Poppen en volwassen zoöphage vliegen bleken als bron van het botulinumtoxine type Cgeen rol te spelen. Dit toxine werd evenmin aangetroffen in water en slib, dat verzameld was op de plaatsen waar zich bij watervogels de grootste sterfte door botulismus voordeed (tabel 38). Slechts in 1monster water uit de directe omgeving van een geputrificeerd kadaver van een fazant werd type Ctoxine aangetoond. Botulinumtoxine type Cbleek evenmin te worden gevormd 183

indien water en slib uit de botulismusgebieden, die intensief besmet waren met Cl. botulinum type C, onder experimentele omstandigheden bij de optimale temperatuur van 30° werd gei'ncubeerd.Pasnadat deze monsters verrijkt werden met dierlijk materiaal in de vorm van lever- en vleespartikels, bleek een geringe productie van botulinumtoxine type Ctot stand te komen. Erwerd geen toxineproductie vastgesteld, indien zoetwaterslakken (Lymnaea truncatuld) werden toegevoegd. Dat water en slib niet de bron vanhet botulinumtoxine was,bleek ook uit de resultaten van een veldproef met 40 wilde eenden, die in grote kooien met wijdmazig gaas in een gebied met de grootste sterfte door botulismus waren geplaatst. Slechts 1 wilde eend stierf na 15dagen aan botulismus. Het botulinumtoxine type C, onder experimentele omstandigheden in een milieu gebracht waar in ernstige mate botulismus bij watervogels was opgetreden, bleek zo stabiel te zijn dat zelfs na 9maanden noggeen dalingvan de concentratie van het toxine waarneembaar was.Hogere zomertemperaturen en variatiesin de pH van 6,1 tot 8,4 hadden hierop geen invloed (tabel 39 en 40). Met dit onderzoek werd aangetoond dat een milieu, dat tijdens een botulismusuitbraak door een opeenhoping van toxische kadaversmet botulinumtoxine isgecontamineerd, gedurende vele maanden voor fouragerende watervogels een potentieel gevaar kan vormen. De gevoeligheid per os van wilde eenden, Khaki Campbell eenden en Peking eenden voor de botulinumtoxinen type A, B,C en E is in hoofdstuk 7beschreven. Er bleek enig verschil te bestaan in gevoeligheid voor de botulinumtoxinen van de 3 onderzochte Cl. botulinum type C stammen. Voor het meest virulente type C-toxine bedroeg de orale MLD per kg lichaamsgewicht voor KhakiCampbell eenden 130.000 LD50, voor Peking eenden 316.000 LD50 en voor wilde eenden 360.000 LD 5 0 (tabel 41,42 en 43). Voor botulinumtoxine type A waren Peking eenden ook gevoelig, de MLD per os bedroeg 1.280.000 LD50 per kg lichaamsgewicht. Voor type B-toxine waren deze eenden vrijwel ongevoelig (tabel 44). Het klinische herstel van botulismus bij deze toxinetypen verliep, in vergelijking met type C, opvallend traag. Met type E konden geen ziekteverschijnselen worden opgewekt, ook niet na de intramusculaire applicatie van 192.000 LD50toxine (tabel 45). De MLD voor eenden voor het botulinumtoxine type C werd niet verlaagd, indien het toxine in multipele subletale doseswerd toegediend. Bij deze applicatiewijze zou een grotere gevoeligheid kunnen optreden door sensibilisatie (Behring phenomeen). Dit phenomeen werd evenmin bij muizen en caviae waargenomen. De proefdieren succombeerden pas nadat ongeveer 1 MLD van het botulinumtoxine was toegediend, wat er op wijst dat er sprake was van een 184

accumulatie van het toxine en niet van een sensibilisatie. Nâ het herstel van botulismus bleken wilde eenden geen effectieve immuniteit te bezitten, zelfs niet voor 1MLDtoxine.Evenmin konden toxineneutraliserende antistoffen worden aangetoond na de oraletoedieningvanmultipele subletale doses botulinumtoxine type C. In hoofdstuk 8 worden demorfologische,culturele, biochemische en serologische eigenschappen van de in Nederland geïsoleerde Cl. botulinum-cuhuren beschreven. De morfologische en culturele eigenschappen werden onderzocht op hartinfuus-schapebloedagarplaten en op brain heart runderbloedagarplaten, waarbij de type C-stammen bij 37°C werden geincubeerd en de typen A, B en E bij 30°C. Er vond bij alle typen een vergelijking plaats met stammen uit de "National Collection of type Cultures" te Londen. Bij het culturele onderzoek vande type C-stammen op vaste voedingsmedia bleek er nog al enige variatie in het kolonietype aanwezig te zijn. Deze variatie was vooral toe te schrijven aan een verschillende neiging tot zwermgroei (zie foto's). Debiochemische eigenschappen van de type C-stammen zijn weergegeven in tabel 47.Desaccharolytische activiteiten kwam tamelijk goed overeen met de beschrijvingen die in de Verenigde Staten van type Ca werden gegeven en doet de Nederlandse type C-stammen afwijken van het type Cß stam Seddon, die geen enkele koolhydraatvergistte (Gunnison and Meyer, 1929b). De Nederlandse type C-stammen vertoonden onderling slechts geringe biochemische verschillen, die onafhankelijk waren van de herkomst van de stammen. Deze type C-stammen bleken ook immunologisch een nauwe verwantschap te bezitten, omdat het toxineneutraliserend vermogen van het C-mink antitoxine tegenover de toxinen van alle stammen van geüjke potentie was (tabel 53). In een kruisimmuniteitstest bleken de antigene componenten van dit C-mink antitoxine gelijk tezijn aan die vanhet C-Pasteur antitoxine (tabel 51), terwijl verder onderzoek er op wees dat deze ook nauw overeenkwamen met die van het Internationale Standaard type Cantitoxine. Het wasniet mogelijk de Nederlandse type C-stammen door vergelijking met 2stammen uit de "National collection of type Cultures" (Ca-8264 en Cß-8548), in te delen bij subtype Ca of Cß.De resultaten van het onderzoek van de biochemische en serologische eigenschappen wijzen er echter op dat al deze type C-stammen een eenheid vormen met één gemeenschappelijke, dominerende toxinefactor. Publicaties van Jansen (1971)en Eklund en Poysky (1972) pleiten er voor dat dit de toxinefactor Q is, de belangrijkste toxinefactor van subtype Ca. De in Nederland geïsoleerde Cl. botulinum type Bstam WB 1971 bleek een nonproteolytische, typische Europese B-stam te zijn, die biochemisch grote overeenkomst vertoonde met de oorspronkelijke stam van vanErmengem (tabel 48). 185

De culturele en biochemische eigenschappen die bij de in Nederland geïsoleerdeCl. botulinum type Aen Estammen werden vastgesteld, kwamen overeen met de beschrijvingen die in de literatuur worden gegeven (Dolman en Murakami, 1961). In hoofdstuk 9 is de invloed beschreven, die de temperatuur heeft bij het optreden van botulismus bij watervogels. Bij een aantal Cl.botulinum type C-stammen van verschillende herkomst werd de productie onderzocht van botulinumtoxine bij lagere temperaturen. Bij 10°C werd geen toxine gevormd, maar bij 12,5°Cwerd door 3van de 5stammen wel een geringe hoeveelheid toxine gevormd. Dit toxine was echter pas na 56 dagen aantoonbaar, waarbij eerst na 77 dagen een hoogste toxineconcentratie van 2.000 MLD per ml werd gevonden (tabel 54). Bij 15°C werd door alle 8 onderzochte stammen botulinumtoxine gevormd, dat vanaf de 15e dagaantoonbaar was. Na 37 dagen werd bij één stam een hoogste toxineproductie van 200.000 MLD per ml bereikt (tabel 55).Bij 20°C verliep devormingvan botulinumtoxine aanmerkelijk sneller, zodat na 9 dagen reeds een toxineconcentratie van 200.000 MLDper ml werd vastgesteld (tabel 56). Deze gegevens zijn van groot belang bij de verklaring van de etiologie en de epidemiologie van botulismus, zoals dat in de jaren 1970, 1971 en 1972 in Nederland bij watervogels werd gediagnostiseerd. In 2gebieden, Hilvarenbeek en Zuidelijk Flevoland, kwam botulismus alleen in de zomermaanden voor. De ziekte trad hier op in een natuurlijk biotoop, en het voorkomen leek in hoge mate afhankelijk te zijn van de klimatologische omstandigheden, met namevan de temperatuur. In 4 andere gebieden bleken de klimatologische omstandigheden echter niet de belangrijkste factor te zijn. In 's-Gravenhage, Amsterdam Groningen en Leiden werd een relatie aangetoond met een thermische waterverontreiniging, die vooral door electriciteitscentrales met ongunstig gesitueerde koelwatercircuits werd veroorzaakt. Een overzicht van watertemperaturen in deze gebieden is gegeven in de tabellen 59, 60 en 61.Een bijzonder gevolg van deze thermische pollutie was dat in deze steden ook in de herfst- en wintermaanden nog sterfgevallen bij watervogels door botulismus voorkwamen. In Groningen trad de grootste sterfte zelfsop injanuari 1972 tijdens een korte vorstperiode. Dit was toe te schrijven aan de concentratie van watervogels in het verwarmde kanaalwater doordat elders,speciaal langs de oevers,geen open water aanwezigwas. Kort samenvattend kan op grond van de resultaten van dit onderzoek het volgende worden geconcludeerd: 1) In Nederland komen Cl: botulinum type A, B, Cen Evoor.Van deze typen blijkt type Aslechtszeer sporadisch voor te komen. 2) In gebieden, waar botulismus bij watervogels is voorgekomen, is de bodem 186

3)

4)

5)

6)

7)

8)

intensief besmet met Cl. botulinum type C. Buiten deze gebieden wordt type Cslechtsweinigin de bodem aangetroffen. In gebieden, waar botulismus bij watervogelsvoorkomt, zijn veel watervogels en andere dieren - zowel vertebraten als invertebraten - besmet met Cl. botulinum type C; er is een nauwe relatie bodem-dier aanwezig. Buiten deze gebieden zijn slechts weinig dieren met type Cbesmet. Cl.botulinum type B en Ekomen in degebieden,waar botulismus is voorgekomen, zowel in de bodem als bij dieren voor; hierdoor kunnen voor de volksgezondheid bedenkelijke situaties ontstaan. Botulismus bij watervogels ontstaat door de orale opname van botulinumtoxine type C, dat gevormd wordt in kadavers van watervogels die veelal eveneens aan botulismus zijn gestorven. Maden van zoöphage vliegenvervullen een belangrijke rol bij de overdracht van het toxine. Eenden zijn bij orale opname van het botulinumtoxine niet alleen gevoelig voor type C, maar ook voor type A. De orale MLD voor wilde eenden van het botulinumtoxine type Cisrelatief groot,nl.minimaal 360.000LD5Q. In Nederland blijkt het optreden van botulismus bij watervogels in enkele grote steden samen te hangen met een thermische pollutie van het oppervlaktewater door locale electriciteitscentrales. Onderzoekingen met in reincultuur geïsoleerde Cl. botulinum type C stammen wijzen er op dat deze behoren tot subtype Ca.

187

SUMMARYANDCONCLUSIONS

This thesis contains the results of extensive research into the etiology and epidemiology of botulism in waterfowl in the Netherlands. The seriouscasesof botulism diagnosed in 1970prompted further research,which centred particularly on the following questions: 1) What is the incidence of the various types of CI. botulinum in different parts of the Netherlands? 2) In what circumstances is sufficient botulinum toxin formed to causewidespread mortality among waterfowl, and possibly other fauna? 3) Isbotulism connected with certain forms of environmental pollution? 4) Whateffects doesit haveon public health? Chapter 2 opens with a general section containing asummary of the relevant literature, and deals successively with the history of botulism and itsincidence, with its etiology and main bacteriological characteristics, its pathogenesis and symptomatology, and with post-mortem findings, diagnosis and how the disease can be prevented and cured. Then follows a separate section dealing briefly with the literature on the etiology and epidemiology of botulism in waterfowl. Most of the data relate to investigations carried out in the United States in the 'thirties'. Study of the relevant literature has shown that it wasnot until recent years that afew casesof botulism in waterfowl were diagnosed in Europe.Thegeneral view wasfound to be that the disease had been caused - asit isin man and other animals - by the ingestion of "performed" toxin. Chapter 3containsdescriptionsof the materials and methods employed in the research. For cultivating Li. botulinum in liquid nutrients, the media used were liver bouillon, cooked meat medium, fortified egg meat medium and Cardella's medium. Cultures on solid nutrient media were streaked on heart infusion sheep blood agar plates, brain heart ox blood agar plates and glucose ox blood agar plates,and incubated in an anaerobicjar by Mcintosh and Fildes's method. The CI. botulinum antitoxins came from the "Pasteur Institute" in Parisand the "Center for Disease Control" in Atlanta. A type C antitoxin was also used, 188

which had been prepared for this research with anatoxin (toxoid) fromCI. botulinum type C-mink (Dinter and Kull). The experimental animals used to demonstrate the presence of botulinum toxin were Swiss Random mice weighing from 18 to 20 g. The types of botulinum toxin were classified in accordance with guidelines received from the "Center for Disease Control" in Atlanta. During the investigation a method was worked out by which the botulinum toxins could be concentrated, using Amicon centriflo membrane filters. It was found to be very useful for detecting and classifying small quantities of toxin. Chapter 4 contains a survey of the casesof botulism in waterfowl diagnosed in the Netherlands in 1970, 1971 and 1972.The disease wasnot identified until 1970. When diagnosing,it wasfound that the clinically observable symptoms (mainly paralysis) could provide important clues. No pathognomonic lesions were observed during post-mortems. A few mallards that had suffered from botulism were found to be infected with leeches (Theromyzon tessulatum). Secondary infection by these parasites may have impeded the passage of air in the nasopharynx. The definitive diagnoses were based on the presence of botulinum toxin, which in all cases was classified as type C. In quite a number of instances the quantity of toxin in the blood serum or liver suspension available for diagnosis was barely one minimum lethal dose for mice. In some cases where even less toxin was present.thebotulinumtoxinwassuccessfully concentrated bymeansof centriflo membrane filters. Whenliving botulism patients were involved, the best results were obtained by examining blood serum. In the case of dead birds diagnosis was more difficult, because only the liver and the digestive tract could be examined. In the present investigation no diagnostic value was attached to the isolation of CI.botulinum. Later this has been justified, since the causative micro-organismwasalso found in animals known tohave died from other causes. In six areasthe incidence of botulism wasmade the subject of more extensive investigation on account of the special circumstances inwhich it occurred. There were two outbreaks of the disease in nature reserves, viz. in Hilvarenbeek and Southern Flevoland, and four in parks, ponds and canalsin The Hague,Amsterdam, Groningen and Leiden, where cases of botulism were diagnosed even in autumn and winter. The peculiar ecological circumstances surrounding the incidence of botulism in those areasare described in Chapter 9. In nine other areas, cases of botulism were reported in the summer months. In view of the geographical position of the areas concerned and the moment at which the disease occurred, they are thought to have been secondary cases connected with the six special botulism areasalready referred to. 189

Chapter 5 contains the results of the research carried out into the incidence of CI.botulinum in connection with the occurrence of botulism in waterfowl. To this end a large number of soil samples and various animals,both vertebrates and invertebrates, were examined. In areas where cases of botulism in waterfowl had occurred, water — and to an even greater degree mud — was frequently found to beheavily infected with CI. botulinum type C. On canal banks the soilwhere the waterfowl roosted was often found to be infected with CI. botulinum type C.Types B and Ealsowere demonstrated in these botulism areas(Table 14).Aslongastwelve months after the last cases of botulism had occurred, no decline could be observed in the degree to which the soil of these areaswasinfected with type C. In soil samples collected in areas where botulism had not occurred in waterfowl, CI.botulinum type C wasonly found in a few mud samples (Table 17). When subjected to a quantitative examination, these samples were moreover found to be far lessheavily infected than the mud in the botulism areas.TypesB and E were found with relatively equal frequency in botulism-free bird areasand the botulism areas. Lastly, a comparison was made between the occurrence of CI. botulinum in the soils of bird areas where botulism had or had not occurred, and in mud and soil samples collected from various places all over the Netherlands where there were no concentrations of waterfowl. During this investigation, type C was found in only 0.7% of the samples, whereas types Band Eoccurred once again in the same percentages as in the bird areas (Table 19). The incidence of botulism in waterfowl has been found to cause intensive infection of these areaswith CI. botulinum type C. However, even before 1970 — the year in which the first serious outbreaks of botulism in waterfowl occurred - examination of dried soil samples had revealed the presence of type C (Table 20).It waswhen examining one of the samples from this collection that CI.botulinum type A was first found. Table 21 shows the geographical distribution of CI.botulinum found when examining a random collection of soil samples. The researcher was struck by the relatively frequent presence of type Ein the soil of what used to be Lake Yssel. Not only soil samples but a large number of animals,too,were tested for CI. botulinum. The tests were mainly carried out on waterfowl, but also included other birds,mammals,fish and various invertebrates. Waterfowl that were suffering from botulism or had died of it were found to be heavily infected with CI.botulinum type C (Table 23 A). In 43% of the botulism patients type C was found in the parenchymatous organs and the cardiac muscle, in 78%in the digestive tract, and in 71%externally, on the webs of their feet and the skin of the belly. Now and again CI. botulinum type B orE was demonstrated in the internal organs of an aquatic bird that had died of botulism. 190

Birds in these botulism areasthat had died of other diseaseswere found to be infected to alesser degree with CI. botulinum type C(Table 23B). Healthy birds from the botulism areas,which had been collected expressly for the investigation, were also found to be infected with CI.botulinum type C (Table 23C). The percentage was in fact rather higher than that in birds suffering from other diseases. The occurrence of CI. botulinum in birds from the botulism areas was compared with that in birds collected asfar away aspossible from those areas.In the latter, type Cwas only found sporadically (Table 25,Aand C).Obviously, only a small percentage of waterfowl and other birds are normally infected with CI. botulinum type C.Types Band Ewere also found in these birds. It was also found that small mammals such asthe brown rat,musk-rat, water vole, cat and hare, brought from various places in the Netherlands, might be infected with CI. botulinum type C(Table 26). Anumber of fishes were also examined. CI. botulinum type C was found in four eels brought from a botulism area, and type E in one perch from a botulism-free area. Insects (Diptera and Coleoptera)and molluscs (freshwater snailsand bivalves) were included in the examination of the invertebrates. Maggots of the zoophagous flies L. illustris and C. erythrocephalataken from cadavers of waterfowl during an outbreak of botulism were found in all cases to be infected with CI. botulinum type C.On the other hand,CI. botulinum typeC wasnot found in the maggots of zoophagous flies from botulism-free areas. Zoophagous flies caught in afly-trap in an area where botulism was prevalent among waterfowl were also found to be infected with CI. botulinum typesCand E (Table 28). CI. botulinum was no longer found in these flies, once the waterfowl stopped dyingof botulism. Only occasionally were zoophagous flies collected in the same manner and in the same period in abotulism-free area found to be infected with CI.botulinum, again including typesCand E(Table 29). CI.botulinum type C was frequently found in molluscs, which might form part of the waterfowls' food intake and which were brought from botulism areas (Table 30); type B wasfound in one instance,and type Enot at all.In botulismfree areas, CI. botulinum type C was only found in these molluscs once (Table 31). CI.botulinum types B, Cand E were found in mussels (Mytilus edulis)collected in the North Sea on the coast of the Netherlands and in the Wadden Sea, type Bpredominating (Table 32). Tables 34 and 35 give a survey of the incidence of CI. botulinum in waterfowl in areas with and without botulism. The great difference is that the areas where botulism has occurred are very heavily infected with CI. botulinum type C. Types B,C and Eare found throughout both types of area,and there appears 191

to be afairly close soil/animal relation. An endeavour was made in a number of selected cases to isolate CI. botulinum in a pure culture.Since the disease in waterfowl iscaused by type C, efforts were directed chiefly at isolating culteres of this type. Of types A, B and E, however, only afew pure cultures were isolated (Table 33). Chapter 6 contains a description of the investigation into the occurrence of botulinum toxin type Cin nature. For if it is assumed that botulism in waterfowl is caused by the ingestion of "preformed" toxin, it follows that the toxin must be present in nature in sufficiently high concentrations.Whenbotulism was prevalent in waterfowl, these high concentrations were found in putrid waterfowl - of which there are always sufficient when mortality isconsiderable — and in the maggots of zoophagous flies contained therein (Tables 36 and 37).It was found that there could also be considerable botulinum toxin (type C) formation in the cadaversof small mammals(cats) and fishes (eels). Pupae of zoophagous flies and adult flies were found not to be a source of botulinum toxin type C. Nor was this toxin encountered in mud and water collected in the places where botulism mortality among waterfowl was highest (Table 38). Only in a single sample of water from the direct environment of the decomposed cadaver of a pheasant was type C toxin found. It was also discovered that botulinum toxin type C was not formed if samples of mud and water from the botulism areas,heavily infected with CI. botulinum type C,were incubated under experimental conditions at the optimum temperature of 30°C. Not until the samples were enriched with animal material in the form of liver and meat particles did a slight production of botulinum toxin type Coccur.No toxin production was observed if freshwater snails(Lymnaeatruncatula) were added. The fact that mud and water was not the source of the botulinum toxin also became evident from the results of a field experiment with 40 mallards, which had been put into large cages with wide-meshed netting in one of the areaswith the highest botulism mortality. Only one mallard died of botulism, after 15 days. Botulinum toxin type C, transferred under experimental conditions to an environment where there had been a severe outbreak of botulism amongwaterfowl, proved so stable that even after nine months there was no appreciable decline in the concentration of the toxin. High summer temperatures andvariations in the pH from 6.1 tot 8.4 had no effect on it (Tables 39 and 40). The experiment showed that an environment contaminated with botulinum toxin by an accumulation of toxic cadavers during an outbreak of botulism may be a potential danger to foraging waterfowl for many months. The sensitivity per os of mallards, Khaki Campbellsand Pekins to botulinum 192

toxins of types A, B,C and E is described in Chapter 7. There wasfound to be some difference in their sensitivity to the botulinum toxins of the threeCI. botulinum type Cstrains examined. The oral MLD of the most virulent typeC toxin per kg of body weight was 130.000 LD50 for Khaki Campbells, 316.000 LD 5 0 for Pekins and 360.000 LD 5 0 for mallards(Tables41,42 and 43). Pekins were also sensitive to botulinum toxin type A, the MLD per osbeing 1.280.000 LD50 per kg of body weight, but they were virtually insensitive to type Btoxin (Table 44). Clinical recovery from botulism due to these typesof toxin wasnoticeably slower than from that due to type C. No symptoms of disease could be induced by means of type E, even after intramuscular administration of 192.000 LD5Qtoxin (Table 45). The MLD of botulinum toxin type C for ducks was not lowered if the toxin was administered in multiple sublethal doses — a mode of administration that can cause greater sensitivity through sensitization (Behring's phenomenon) - nor was this phenomenon observed in mice and guinea pigs. The experimental animals did not succumb until about 1MLD of the botulinum toxin had been administered, which shows that there can be said to havebeen accumulation of the toxin rather than sensitization. After recovering from botulism, mallards were found to possess no effective immunity, even to 1MLD of toxin. Nor could toxin-neutralizing antibodies be found after oral administration of multiple sublethal doses of botulinum toxin type C. The morphological, cultural,biochemical and serological characteristics of the CI.botulinum cultures isolated in the Netherlands are described in Chapter 8. The morphological and cultural characteristics were examined on heart infusion sheep blood agar plates, the type Cstrainsbeingincubated at 37°C and typesA, B and E at 30°C. All types were compared withstrainsfrom the National Collection of Type Cultures in London. Cultural examination of the type Cstrains on solid nutrient media revealed that there was a noticeable variation in colony types, due mainly to differing swarm growth tendencies (see photographs).The biochemical characteristics of the type C strains are shown in Table 47. The saccharolytic activity corresponded more or lessthe description given of type Ca in the United States, and distinguished the Dutch type C strains from the Seddon type Cßstrain, which did not ferment a single carbohydrate (Gunnison and Meyer. 1929b). There were only slight biochemical differences between the Dutch type C strains, and they were unrelated to their origin. These type C strains were also found to exhibit a close immunological relationship, because the C-mink antitoxin wasequally effective in neutralizing the toxins of all strains (Table 53). In a cross-immunity test, the antigenic components of the C-mink antitoxin proved to be equal to those of the C-Pasteur antitoxin (Table 51), while further tests indicated that they also corresponded closely to the Inter193

national Standard type C antitoxin. Comparison with two strains from the National Collection of Type Cultures(Ca-8264 and C0-8548)did not enable the Dutch type C strain to be classed under subtype Ca or Cß. Nevertheless, the results of investigations into their biochemical and serological characteristics indicate that all these type C strains constitute a unity having a common, predominant toxin factor. Publications by Jansen (1971) and by Eklund and Poysky (1972) contain the suggestion that this toxin factor is Ci, the principal toxin factor of subtype Ca. The CI.botulinum type B strain WB 1971 isolated in the Netherlands was found to be a non-proteolytic, typically European B strain that showed great biochemical similarity to the originalVan Ermengem's culture (Table 48). The cultural and biochemical characteristics observed in the CI.botulinum type A and E strains isolated in the Netherlands allied with the descriptions givenin the literature on the subject (Dolman and Murakami, 1961). The effect of temperature on the incidence of botulism in waterfowl is described in Chapter 9. Research has been carried out on the production of botulinum toxin at low temperatures by anumber ofCI. botulinum type Cstrainsof differing origin.No toxin was produced at 10°C, but three of the five strains produced a small quantity at 12.5°C. However, not until 56 days later could the presence of the toxin be demonstrated, and it was 77 days before a maximum toxin concentration of 2.000 MLD per ml was found (Table 54). At 15°C the eight strains examined all produced botulinum toxin, the presence of which could be demonstrated from the 15th day. After 37 days, one strain had achieved a maximum toxin production of 200.000 MLD per ml (Table 55). At 20°C, botulinum toxin was produced much more rapidly, a toxin concentration of 200.000 MLD per ml being reached after nine days(Table 56).These figures go far towards explaining the etiology and epidemiology of botulism as diagnosed among waterfowl in the Netherlands in the years 1970, 1971 and 1972.In two areas, viz. Hilvarenbeek and Southern Flevoland, botulism only occurred in the summer months and in natural biotopes, and its incidence seemed to be largely dependent on climatic conditions,especially temperature. In four other areas, however, climatic conditions were not found to be the main ecological factor. In The Hague, Amsterdam, Groningen and Leiden a relation was found to exist between botulism and thermal pollution, caused especially by power stations with badly placed cooling-water circuits. Readings of water temperatures in these areas are given in Tables 59, 60 and 61.A remarkable effect of thermal pollution was that even in the autumn and winter months there were cases of waterfowl dyingof botulism in these towns.In fact, in Groningen the highest mortality occurred in January 1972 during a short period of frost. This was attributable to the congregation of waterfowl in the 194

heated canal water because there was no open water elsewhere, especially not along the banks. Briefly, then, the results of this research prompt the following conclusions: 1) CI. botulinum types A,B,Cand Eare found in the Netherlands, though type Aisvery rare. 2) The soil is heavily infected with CI. botulinum type C in areas where botulism has occurred in waterfowl. Elsewhere, little type C isfound in the soil. 3) Many waterfowl and other animals - vertebrates and invertebrates — are infected with CI. botulinum type Cin areas where there is botulism among waterfowl; there is a close soil/animal relation. Elsewhere, only few animals are infected with type C. 4) CI.botulinum types B and E are found, in soil and animals alike, in areas where botulism has occurred. They could therefore become a hazard to public health. 5) Botulism in waterfowl is caused by oralingestion of botulinum toxin typeC formed in cadavers of waterfowl, many of which have died of botulism. Maggotsof zoophagous flies play an important role in transmitting the toxin. 6) Ducks ingesting botulinum toxin orally are sensitive to type A as well as to type C. The oral MLDof botulinum toxin type Cfor mallards islarge,i.e.at least 360.000 LD 5 0 .• 7) The incidence of botulism in waterfowl in a few large towns in the Netherlands seems to be connected with thermal pollution of the surface water by local power stations. 8) Research on CI. botulinum type C strains, isolated in pure culture, indicates that they belong to subtype Ca.

195

LITERATUUR AKKERMANS, J.P.W.M.: Ziekten bij de nerts in Nederland. Tijdschr. Diergeneesk., 86, 799, (1961). ANONYMUS: Botulism in the United States. C.D.C. vet. Publ. Health Notes, 10, January, (1964). ANONYMUS: Wildlife disease and parasites. Wildlife research problems programs progress, U.S. Dept. Interior, Research publ., 23, (1965). AVFRY, R.J., DOLMAN, C E . , STROVELL, P.L. and WOOD, A J . : A natural outbreak of Clostridium botulinum type C intoxication in ranch mink arising from pork liver. Can. J. comp. Med. vet. Sei., 23, 203, (1959) BEHRING, E. VON: Die Gewinnung der Blutantitoxine und die Classificirung der Heilbestrebungen bei ansteckende Krankheiten. Dtsch. med. Wschr., 19, 1253, (1893). BEIERS. P.R. and SIMMONS, G.C.: Botulism in pigs. Austral, vet. J., 43, 270, (1967). BEKKER, J.H.: Botulisme in Hees. Ned. Tijdschr. Geneesk., 88, NN VII, 69, (1944). BENGSTON, I.A.: Preliminary note on a toxin producing anaerobe isolated from the larvae of Lucilia caesar. Public Health Rep., 37, 164, (1922). BENNETTS, H.W. and HALL, H.T.B.: Botulism of sheep and cattle in Western Australia: Its cause and its prevention by immunization. Austral, vet. J., 14, 106, (1938). BLANDFORD, T.B., ROBERTS, T.A. and ASHTON, W.L.G.: Losses from botulism in mallard duck and other waterfowl. Vet. R e c , 85, 541, (1969). BLANDFORD. T.B. and ROBERTS, T.A.: An outbreak of botulism in broiler chickens. Vet. Rec, 87, 258,(1970). BOROFF, D.A. and REILLY, J.R.: Studies.of the toxin of Clostridium botulinum. V. Prophylactic immunization of pheasants and ducks against avian botulism. J. Bact., 77, 142,(1959). BOROFF, D.A. and REILLY. J.R.: Studies of the toxin of Clostridium botulinum. VI. Botulism among pheasantsand quail, mode of transmission, and degree of resistance offered by immunization. Int. Arch. Allergy, 20, 306. (1962). BREED, R.S., MURRAY, E.G.D. and SMITH, N.R.: Bergey's manual of determinative Bacteriology. 7th, ed., Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1957. BUCHLI, K.: Bloedzuigers in de neusholte van eenden. Tijdschr. Diergeneesk., 5 1 , 135, (1924). BULATOVA, T.I., MATVEEV, K.I. and SAMSONOVA, V.S.: Biological characteristics of CI. botulinum type C strains isolated from minks in the U.S.S.R. Proc. 5th. int. Symp. Food Microbiol., 391, (1967). Chapman and Hall, Ltd., London. BURKE, G.S.: The occurence of Bacillus botulinus in nature. J. Bact., 4, 541, (1919). BURKE, G.S.: Studies on the thermal death time of spores of CI. botulinum. J. inf. Dis., 32, 433,(1923).

196

BURKE, V., ELDER, J.C. and PISCHEL, D.: Treatment in botulism. Arch. int. Med., 27, 265,(1921). CARDELLA, M.A., DUFF, J.T., GOTTFRIED, C. and BEGEL, J.S.: Studies on immunity to toxins of Clostridium botulinum. IV. Production and purification of type C toxin for conversion totoxoid.J. Bact., 75, 360, (1958). CLARENBURG, A. en F1JEN, J.N.: Voedselvergiftiging door Bacillus botulinus type B. Ned. Tijdschr. Geneesk., 8 1 ,4806, (1937). COLEMAN, G.E. and MEYER, K.F.: Some observations on the pathogenicity of B. botulinus. J. inf. Dis., 3 1 ,622, (1922). CYSOUW, C.J. en TES1NK, J.: Twee gevallen van botulisme bij het paard. Tijdschr. Diergeneesk., 93, 1547,(1968). ÜINTER, Z. und KULL, K.E.: Aktive Immunisierung gegen den Botulismus beim Nerz. Nord. Vet. Med., 2, 906, (1950). DINTER, Z. und KULL, K.-E.: Über einen Ausbruch des Botulismus bei Fasanenküken. Nord. Vet.-Med.,6, 866, (1954). DINTER, Z. und KULL, K.-E.: Über die Empfänglichkeit des Nerzes für die BotulinusToxine A und C. Nord. Vet.-Med., 7, 549, (1955). DOBBERSTEIN, J. und PIENING, C . Botulismus bei Schwanen. Berl. tierärztl. Wschr., 35, 549,(1933). DOLMAN, C E . and MURAKAMI, L.: Clostridium botulinum type F with recent observation on other types. J. inf. Dis., 109, 107, (1961). DOUTRE, M.P. et CHAMBON, J.: Le botulisme des ruminants et des équidés au Sénégal et en Mauritanie; conséquence pathologique des troubles nutritionnels. Vile Journées Médicales de Dakar, Janvier 1971. DUBOVSKY, B.J. and MEYER, K.F.: An experimental study of the methods available for the enrichment, demonstration and isolation of B. botulinus in specimens of soil and its products, in suspected food, in clinical and in necropsy material. I. J. inf. Dis., 31,501,(1922 a ). DUBOVSKY, B.J. and MEYER, K.F.: The occurence of the spores of B. botulinus in Belgium, Denmark, England, The Netherlands and Switzerland. VI. J. inf. Dis., 31, 600, (1922 b ). DUCHEN, L.W. and STRICK, S.J.: The effect of botulinum toxin on the pattern of innervation of skeletal muscle in the mouse. Quart. J. exp. Physiol., 53, 84, (1968). DUFF, J.T., WRIGHT. G.G. and YARINSKY, A.: Activation of CI. botulinum type E toxin by trypsin. J. Bact., 72, 455, (1956). EKLUND, M.W., POYSKY, F.T. and WIELER, D.: Demonstration and isolation of CI. botulinum type F from the pacific coast of the United States. Proc. 5th. Int. Symp. Food Microbiol., 433, (1967). Chapman and Hall, Ltd., London. EKLUND, M.W., POYSKY, F.T., REED, S.M. and SMITH. CA.: Bacteriophage and the toxigenicity of Clostridium botulinum type C. Science, 172, 480, (1971). EKLUND, M.W. and POYSKY, F.I.: Activation of a toxic component of Clostridium botulinum types C and Dby trypsin. Appl. Microbiol., 24, 108, (1972). ENNEK1NG, J.A.M.J.: Botulisme in Hees. Ned. Tijdschr. Geneesk., 88, NN. VII, 65. (1944). ERMENGEM, E. VAN: Untersuchungen über Fälle von Fleischvergiftung met Symptomen von Botulismus. Zentralbl. Bakt. I. Orig.. 19. 442, (1896). ERMENGEN, E. VAN: Ueber einen neuen anaëroben Bacillus und Seine Beziehungen zum Botulismus. Zeitschr. für Hyg. Inf., 26, 1, (1897). FAY. L.D., KAUFMANN, O.W. and RYEL, L.R.: Mass mortality of water-birds in Lake Michigan 1963-'64. Publication no. 13, Great Lakes Res. Div., The Univ. Michigan. Ref in: Proc. 5th. int. Symp. Food Microbiol., 400, (1967). Chapman and Hall, Ltd., London.

197

FISH, N.A., MITCHEL, W.R. and BARNUM, D.A.: A report of a natural outbreak of botulism in pheasants. Can. vet. J., 8, 10, (1967). FJOLSTAD, M. and K.LUND, T.: An outbreak of botulism among ruminants in connection with ensilage feeding. Nord. Vet.-Med., 21, 609, (1969). FOSTER, E.M., DEFFNER, J.S., BOTT, T.L. and MCCOY, E.: Clostridium botulinum food poisoning. J. Milk Food Technol., 28, 86, (1965). GELD, J. VAN DER: Talloze dode vogels in de polder Zuidelijk Flevoland. Het Vogeljaar, 19,602,(1971). GENDEREN, H. VAN: Research on side-effects of pesticides and related compounds. Concluding remarks. TNO-Nieuws, 27, 631, (1972). GERW1NG, J., DOLMAN, C E . and KO, A.: Mechanism of tryptic activation of Clostridium botulinum type E toxin. J. Bact., 89, 1176, (1965). GEWIN, J.: Botulisme, casuistische mededelingen. Ned. Tijdschr. Geneesk.,62, 89, (1918). GILTNER, L.T. and COUCH, J.F.: Western duck sickness and botulism. Science, 72, 660, (1930). GRAHAM, R. and BRUECKNER, A.L.: Studies in forage poisoning. The relation of B. botulinus to forage poisoning or cerebrospinal meningitis in horses. J. Bact., 4, 1, (1919). GRAHAM, R. and ERIKSEN, S.: Experimental botulism in dogs. J. inf. Dis., 3 1 , 402, (1922). GRAHAM, R. and BOUGHTON, I.B.: Clostridium botulinum type C associated with a limberneck-like disease in chickens and ducks. J. Am. vet. med. Ass., 64, 723, (1924). GROSS, W.B. and SMITH, L.D.S.: Experimental botulism ingallinaceous birds.Av.Diseases, 15,716,(1971). GRUBB, W.B.: Avian botulism in Western Australia. Austral. J. exp. Biol., 42, 17,(1964). GUNDERSON, M.F.: Presence of Clostridium botulinum in livers of birds not affected with botulism. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 30, 747, (1933). GUNDERSON, M.F.: Insects as carriers of Clostridium botulinum. J. Bact., 30, 333, (1935). GUNNISON, J.B. and MEYER, K.P.: The occurence of nontoxic strains of CI. parabotulinum. J. inf. Dis.,45, 79, (1929 a ). GUNNISON, J.B. and MEYER, K.P.: Cultural study of an international collection of Clostridium botulinum and parabotulinum. J. inf. Dis.,45, 119, (1929 ). GUNNISON, J.B. and COLEMAN, G.E.: Clostridium botulinum type C associated with western duck disease. J. inf. Dis., 5 1 ,542, (1932). GUNDERSON, M.F.: Presence of Clostridium botulinum in livers or birds not affected with botulism. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 30, 747, (1933). HAAGSMA, J.: Ziekten bij de nerts (Mustela vison) in Nederland. Diergeneesk. Memorandum, 12.259,(1965). HAAGSMA, J.: Twee gevallen van botulisme bij het paard; rubriek: Ingezonden. Tijdschr. Diergeneesk., 93, 1689, (1968). HAAGSMA, J.: Niet gepubliceerde gegevens, (1969). HAAGSMA, J., OVER, H.J., SMIT. TH. en HOEKSTRA, J.: Een onderzoek naar aanleiding van het optreden van botulismus bij watervogels in 1970 in Nederland. Tijdschr. Diergeneesk., 96, 1U72, (1971). HAAGSMA, J.: Niet gepubliceerde gegevens, (1972). HAUGE, S.: Cases of botulism in Norway in the course of the last 5-6 years Ret": Vet. Bull., 40. 832. (1970). Orig.: Norsk Vet. Tidsskr.. 5. 259. (1970) HAWKYARD, P.A.: Botulism in farm mink. Brit. Pur Farmers Gaz., 15, 20, (1965).

198

HENNING, M.W.: Animal disease in South Africa; 3th. ed. Johannesburg, Central New Agency, 515, 1956. HIRSCH, A. and GRINSTED, E.: Methods for the growth and enumeration of anaerobic spore-formers from cheese, with observations on the effect of nisin. J. Dairy Res., 21, 101,(1954). HOBMAIER, M.: Dick disease caused by the toxin of CI. botulinum type C. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 28, 339, (1930). JANSEN, B.C.: The toxic antigenic factors produced by Clostridium botulinum types C and D. Onderstepoort J. vet. Res., 38, 9 3 , (1971). JANSEN, B.C. and KNOETZE, P.C.: Tryptic activation of Clostridium botulinum type C/3 toxin. Onderstepoort J. vet. Res., 38, 237, (1971). JENSEN, W.J. and GRITMAN, R.B.: An adjuvant effect between CI. botulinum types C and E toxins in the mallard duck (Anas platyrhynchos). Proc. 5th. Int. Symp. Food Microbiol.. 407,(1967). JOHANNSEN, A.:Clostridium botulinum in Sweden and the adjacent waters. J. appl. Bact., 26,42,(1963). JOHANNSEN, A.: A simple method for isolation and photography of Clostridium botulinum colonies from surface cultures on agar plates. Acta vet. Scand., 5, 1, (1964). JOHANNSEN, A.: Botulism hos hund. Nord. Vet. Med., 17, 680, (1965). JORDAN, E.O.: Food piosoning. Chicago, 1917; ref. in Topley and Wilson's principles of bacteriology and immunity, 4th. ed,. Edward Arnold Ltd., London, 1957. KALMBACH, E.R.: Western duck sickness produced experimentally. Science, 72, 658, (1930). KALMBACH, E.R.: Progress in western duck sickness studies. Science, 75, 57, (1932). KALMBACH, E.R.: Will botulism become a world-wide hazard to wild fowl? J. Am. vet. med. Ass.,87, 183,(1935). KALMBACH, E.R.: Type C botulism among wild birds - A historical sketch. Sport, Fisheries and Wildlife, Report no. 110 (1968). KAUFMANN, O.W.and FAY, L.D.: CI. botulinum type E toxin in tissues of dead loons and gulls. Q. Bull. Mich. St. Univ. agric. Exp. Stn., 47, 236, (1964). Ref: Proc. 5th. int. Symp. Food Microbiol., 400, (1967). Chapman and Hall, Ltd., London. KELLER, K.J.: Lozing van koelwater in de toekomst. Water, 54, 435, (1970). KEYMER, I.F., SMITH, G.R., ROBERTS, T.A. and HEANEY, S.I.: Botulism as a factor in waterfowl mortality at St. James's Park, London. Vet. R e c , 90, 112, (1972). KOOPMAN, J.J., REUS, A.J. en HAAGSMA, J.: Een geval van botulisme bij runderen. Tijdschr. Diergeneesk., 96, 1396, (1971). KRAVCHENKO, A.T. and SHISHULINA, L.M.: Distribution of Cl. botulinum in soil and water in the U.S.S.R. Proc. 5th. int. Symp. Food Microbiol., 13, (1967). Chapman and Hall, Ltd., London. LAMANNA, C : The most poisonous poison. Science, 130, 763, (1959). LAMANNA, C. and SAKAGUCHI, G.: Botulinal toxins and the problem of nomenclature of simple toxins. Bact. Reviews, 35, 242, (1971). LEE, W.U. and RIEMANN, H.: The genetic relatedness of proteolytic Clostridium botulinum strains. J. gen. Microbiol. 64. 85. (1970). MARTTNOVICH, D.. CARTER, M.E., WOODHOUSE, D.A. and MCCAUSLAND, J.P.: An outbreak of botulism in wild waterfowl in New Zealand. New Zeal. vet. J.. 20, 6 1 , (1972). MASON, J.H. and ROBINSON, E.M.: The antigenic components of the toxins of CI. botulinum Cand D. Onderstepoort J. vet. Res., 5, 65, (1935).

199

MATVEEV, K.I.: Effect of sublethal doses of botulinal toxin on the organism following multiple administrations. Zhurnal Mikrobiol., 30, 71, (1959). MATVEEV, K.I., NEFEDJEVA, N.P., BULATOVA, T.I. and SOKOLOV, I.S.: Epidemiology of botulism in the U.S.S.R. Proc. 5th. int. Symp. Food Microbiol., 1. (1967). Chapman and Hall, Ltd., London. MCINTOSH, J. and FILDES, P.: A new apparatus for the isolation and cultivation of anaerobic micro-organisms. Lancet, I, 768, (1916). MEYER, K.F., and DUBOVSKY, B.J.: The distribution of the spores of B. botuhnus in the United States. IV. J. inf. Dis., 31, 592, (1922 a ). MEYER, K.F. and DUBOVSKY, B.J.: The occurence of the spores of B. botulinus in Belgium, Denmark, England, The Netherlands and Switzerland. VI. J. inf. Dis., 31, 600,(1922 b ). MEYER, K.F. and GUNNISON, J.B.: European strains of CI. botulinum. J. inf. Dis.,45, 96, (1929 a ). MEYER, K.F. and GUNNISON, J.B.: Botulism due to home canned Bartlett pears. J. inf. Dis.,45,135,(1929 b ). MEYER, K.F.: Food poisoning. New Engl. J. Med., 249, 765, (1953). MEYER, K.F.: The status of botulism as a world health problem. Bull. World Health Org., 15,281,(1956). MINtlRVIN, S.M.: On the parenteral-enteral method of administering serum in cases of botulism. Proc. 5th. int. Symp. Food Microbiol., 336, (1967). Chapman and Hall, Ltd., London. MOLLER, V. and SCHEIBEL, L: Preliminary report on the isolation of an apparently new type of CI. botulinum. Acta Path. Microbiol. Scand., 48, 80, (1960) MULLER, J.: Experimental type C botulism in horses. Nord. Vet.-Med., 14, (Suppl. 2),21, (1962). MÜLLER, J.. Equine and bovine botulism in Denmark. Bull. Off. int. Epiz., 59. 1379, (1963). MULLER, J.: First outbreaks of botulism in wild ducks in Denmark. Ref: Vet. Bull., 38, 508, (1968). Orig.: Medlemsbl. danske Dyrlaege-forening, 50, 887, (1967 a ). ML1LLER, J.: On the occurence of CI. botulinum type C beta in the livers of slaughter animals in Denmark. Bull. Off. int. Epiz., 67, 1473, (1967 b ). MULLER, J.: Pers. mededeling, 1972. NILÉHN, P.O. och JOHANNSEN, A.: Ett utbrott av aviar botulism. Nord. Vet.-Med., 17, 685,(1965). OS1ECK, E.R. en ROSELAAR, C S . : Massale vogelsterfte in Zuidelijk Flevoland. Het Vogeljaar, 19,604,(1971). PESCE DE FAGONDE, A. en SARDI, H.F.: Botulismo aviar, primär caso comprobado en la Républica Argentina. Bull. Off. int. Epiz., 57, 1479, (1967). PFENNINGER, W. Toxico-immunologic and serologic relationship of B.botulinus, type C, and B.parabotuhnus. "Seddon". J. inf. Dis., 35, 347, (1924). PIGOURY, 1..,CHABASSOL, C. et STELLMANN. C : Technique sensible de détection dans l'eau de la toxine botulique C précipiu'; ptîr le methanol. Bull. L'acad. vet. France, 38.319,(1965). PREVOT, A.R. et BRYGOO, E.R.-. Nouvelles recherches sur le botulisme et ses cinq types toxiniques. Ann. Inst. Pasteur, 85. 544, (1953). PULLAR, E.M.: Enzootic botulism amongst wild mrds. Austr. vet. J.. 10 128, (1934). QUORTRUP, E.R. and HOLT, A.L.: Detection of potential botulinus-toxinproducing areas in western duck marshes with suggestions for control. J. Bact.. 4 1 , ibi. (194U). QUORTRUP. b.R. and SUDHEIMER, R.L.: Some e.-ologicul relations of Pseudomonas aeruginosa to Clostridium botulinum tvpe C. J. Bact.. 45. 551. (1943).

QUORTRUP, E.R. and GORHAM, J.R.: Susceptibility of furbearing animals to the toxins of Clostridium botulinum types, A, B,Gand E. Am. J. vet. Res., 10, 268, (1949). REED, L.J. and MUENCH, H.: Asimple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg., 27. 493, (1938). RICHARDSON, J.H., BREWER, G.L. and HOLDEMAN, L.V.: Type C Clostridium botulinum intoxication in domestic ducks in Georgia. J. Am. vet. med. Assoc, 146, 737, (1965). R1EMANN, H. and GEN1GEORGIS, C : Detection of bacterial toxins in foods. Handbook World vet. Congr., 1, 104,(1971). ROBERTS, T.A., KEYMER, I.F., BORLAND, E.D. and SMITH, G.R.: Botulism in birds and mammals in Great Britain. Vet. R e c , 9 1 , 11. (1972). ROBINSON, E.M.: The bacteria of the Clostridium botulinum Cand D types. 16th. Rep. D.V.S., 107,(1930). ROLLINSON, D.H.L., SOLIMAN, K.N. and MANN, K.H.: Deaths in young ducklings associated with infestations of the nasal cavity with leeches. Vet. R e c , 62, 225, (1950). SAKAGUCHI, G.. SAKAGUCHI, S. and KONDO, H.: Rapid in vivo and in vitro determinations of Clostridium botulinum type E toxin in food. Handbook World vet. Congr., 1, 108,(1971). SCHOONHOVEN VAN BEURDEN, A.J.R.E. en CLARENBURG, A.: Botulisme in Nederland. Ned. Tijdschr. Geneesk., 8 1 ,6024, (1937). SEDDON, H.R.: Bulbar paralysis in cattle due to the action of a toxieonenic Bacillus, with a discussion on the relationship of the condition to forage poisoning (botulism). J. comp. Pathol Tber . 35, 147,(1922). SEGNER, W.P., SCHMIDT, C F . AND BOLTZ, J.K.: Enrichment, isolation and cultural characteristics ol marine strains of Clostridium botulinum Type C. Appl. Microbiol., 22, 1017,(1971 a ). SEGNER, W.P., SCHMIDT, C F . and BOLTZ, J.K.: Minimal growth temperature, sodium chloride tolerance, pH sensitivity and toxin production of marine and terrestrial strains of Clostridium botulinum type C. Appl. Microbiol.. 22. 1025. (1971 b ). SEGNER, W.P. and SCHMIDT, C F . : Heat resistance of spores of marine and terrestrial strains of Clostridium botulinum type C Appl. Microbiol., 22, 1030, (1971). SHAW, R.M. and SIMPSON, G.S.: Clostridium botulinum type C in relation to duck sickness in the province of Alberta. J. Immunol., 32, 79, (1936). SIMMONS, G.C. and TAMMEMAGI, L.: CI. botulinum type Das a cause of bovine botulism in Queensland. Austr. vet. J., 40, 123, (1964). SMITH, L.D., DAVIS, J.W. and LIB1Œ, K.G.: Experimentally induced botulism in weanling pigs. Am. J. vet. Res., 32, 1327,(1971). STABLEFORTH. A.W. and GALLOWAY, I.A.: Infectious diseases of animals. London, Butterworth, 1959. STARIN, W.A. and DACK, G.M.: Pathogenicity of CI. botulinum. J. inf. Dis., 36, 383, (1925). STERNE, M. and THOMSON, A.: The isolation and identification of Clostridia from pathological conditions of animals. Bull. Off. int. Epiz., 59, 1487, (1963). STEVENSON, J.W. and GIRVIN, G.T.: The effect of botulinum toxin on the bacterial acetylation of choline. 6e Congr. intern. Microbiol., vol. 2, Sezione VII-XVI, 583, (1953). SUZUKI, J.B., BOOTH, R., BENFDIK, A. and GRECZ, N.: Pathogenesis of Clostridium botulinum type A: Study of in vivo toxin release by implantation of diffusion chambers containing spores, vegetative cells, and free toxin. Infection and 1mm., 3, 659.(1971). 2 o i

TANNER, F.W. and TANNER, L.P.: Food-borne infections and intoxications. 2th. ed. The Garrard Press, Champaign, Illinois (1953). THEILER, A. and ROBINSON, E.M.: Der Botulismus der Haustiere. Zeitschr. für Infkr., 31, 165.(1927). TOWNSEND, C T . : Comparative studv of nontoxic and toxic strains of Clostridium parabotulinum. J. inf. Dis., 45, 87, (1929). VALLEE, A., KREGUER, A. et EYQUEM, A.: Botulisme canin: Première souche isolée en France. Bull. Acad. Vét., 29,419, (1956). WENT, J.J.: Water als koelmiddel voor electriciteitsopwekking en de daaraan verbonden problemen. H 2 0 , 3, 68, (1970). WILKINS, S.D. and DUTCHER, R.A.: Limberneck in poultry. J. Am. vet. med. Ass., 57, 653,(1920). WILLIAMS, W,: A research project into biology of the duck leech Theromyzon tessulatum (O.F. Muller) 1774. Annual report and year book Wagbi (Wildfowlers ass. Great Britain and Ireland), Chester, Grosvenor House, 1970. WILSON, G.S. and MILES, A.A.: Topley and Wilson's principles of bacteriology and immunity. 4th. ed. Edward Arnold Ltd., London (1957). WINSLOW, C.-E.A., BROADHURST, J., BUCHANAN, R.E., KRUMWIEDE.C, ROGERS, L.A. and SMITH, G.H.: The families and genera of the bacteria. Preliminary report of the committee of the society of American bacteriologists on characterization and classification of bacterial types. J. Bact., 2, 505, (1917). YNDESTAD, M. and LOFTSGARD, G.: Susceptibility of mink to Clostridium botulinum typeC toxin. Acta vet. Scand., 11,594, (1970).

202

REGISTER METVOGELNAMEN

Determ watervogels isbij ornithologen niet exact omschreven. In dit onderzoek zijn met watervogels aangeduid die vogels die op of bij het water leven,zoals: Podicipidae (futen) Ardeidae (reigersen roerdompen) Anatidae (eenden,ganzen en zwanen) Rallidae (bleshoenders en rallen) Scolopacidae (snippen, ruiters,wulpen,grutto's en strandlopers) Recurvirostridae (kluten) Laridae (meeuwen en sterns) Onderstaand volgt een overzicht van de vogelsoorten die bij dit onderzoek in de tekst zijn genoemd. Hierbij is de volgorde aangehouden van de "Field guide to the birds of Britain and Europe" van R.T.Peterson, G.Mountfort en P.A.D. Hollom ("Vogelgids", Nederlandse vertalingvan Mr.J. Kist). Nederlandse naam

Wetenschappelijke naam

Fuut Dodaars Blauwe reiger Lepelaar Wilde eend Wintertaling Zomertaling Smient Pijlstaarteend Slobeend Mandarijneend Krooneend Kuifeend Fidereend Bergeend Grauwe gans Kolgans

Podiceps cristatus Podiceps ruficollis Ardea cinerea Platalea leucorodia Anas platyrhynchos Anas crecca Anas querquedula Anas penelope Anas acuta Spatula clypeata Aix galericulata Netta rufina Aythya fuligula Somateria molissima Tadorna tadorna Anser anser Anser albifrons

203

Nederlandse naam

Wetenschappelijke naam

Rietgans Rotgans Knobbelzwaan Torenvalk Fazant Waterral Porseleinhoen Waterhoen Meerkoet Scholekster Bontbekplevier Goudplevier Watersnip Tureluur Zwarte ruiter Poelruiter Kluut

Anser fabalis Branta bernicla Cygnus olor Falco tinnunculus Phasianus colchicus Rallus aquaticus Porzana porzana Gallinula chloropus Fulica atra Haematopus ostralegus Charadrius hiaticula Charadrius apricarius Capella gallinago Tringa totanus Tringa erythropus Tringa stagnatilis Recurvirostra avosetta Larcus canus Larus ridibundus Chlidonias niger Sterna hirundo Sterna albifrons Columba palumbus Alauda arvensis Corvus corone Corvus monedula Turdus ericetorum Turdus meruia Anthus pratensis Sturnus vulgaris Fringilla coelebs Emberiza schoeniclus Passer domesticus Passer montanus Aix sponsa Anas paecilorhyncha paecilorhyncha Anas formosa Cairina moschata Alopochen aegyptiacus

Stormmeeuw Kokmeeuw (= kapmeeuw) Zwarte stern Visdiefje Dwergstern Houtduif Veldleeuwerik Zwarte kraai Kauw Zanglijster Merel Graspieper SpreeuwVink Rietgors Huismus Ringmus Carolina eend* Indische vlekbekeend* Baikaleend* Muskuseend* Nijlgans*

* Sierwatervogels, niet in de "Vogelgids" vermeld. Opmerking: tamme en halfwilde "stadseenden" zijn in dit onderzoek bij de "wilde eenden" gevoegd, omdat het niet mogelijk bleek deze soorten steeds voldoende van elkaar te onderscheiden.

204

CURRICULUM VITAE De schrijver van dit proefschrift werd op 3 februari 1933 te Wymbritseradeel geboren. Hij behaalde in 1951 te Sneek het einddiploma HBS-B en voltooide op 6 februari 1958 de studie in de diergeneeskunde. Onmiddellijk hierna werd hij opgeroepen voor de vervulling van zijn militaire dienstplicht. Hieruit volgde in 1959 voortijdig ontslag door in dienst te treden van het Gouvernement van het voormalige Nederlands Nieuw-Guinea. Van 1959 tot 1962 was hij gouvernementsveearts voor de residenties West-Nieuw-Guinea en Fak -Fak met als standplaats Manokwari. Vanaf februari 1963 ishij verbonden aan het Centraal Diergeneeskundig Instituut, afdeling Rotterdam, waar hij aanvankelijk was betrokken bij het rabies-onderzoek. Daarna heeft hij zich bezig gehouden met diverse microbiologische en pathologisch-diagnostische onderzoekingen, in het bijzonder in verband met infectieziekten bij pelsdieren en gezelschapsdieren.

205