CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ONDER INVLOED VAN STRESSFACTOREN

CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ONDER INVLOED VAN STRESSFACTOREN

MARYSE S. KUMMER Afstudeeropdracht wo-master Milieuwetenschappen Faculteit Natuurwetenschappen OPEN UNIVERSITEIT JULI 2011

2 CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ONDER INVLOED VAN STRESSFACTOREN CYST FORMATION BY THE SPIROCHETE BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO UNDER THE INFLUENCE OF STRESS FACTORS

MARYSE S. KUMMER Afstudeeropdracht wo-master Milieuwetenschappen Faculteit Natuurwetenschappen OPEN UNIVERSITEIT JULI 2011

AFSTUDEERCOMMISSIE mevrouw dr. ir. E.W.H.M. Fredrix, intern afstudeerbegeleidster OU Open Universiteit, Faculteit Natuurwetenschappen Postbus 2960, 6401 DL Heerlen de heer dr. F.G.A.J. Van Belleghem, intern afstudeerbegeleider OU Open Universiteit, Faculteit Natuurwetenschappen Postbus 2960, 6401 DL Heerlen de heer dr. R.J.M. Niesink, intern afstudeerbegeleider OU Open Universiteit, Faculteit Natuurwetenschappen Postbus 2960, 6401 DL Heerlen de heer drs. Ph.H.H. Kielman, apotheker, extern studiebegeleider TS. Products Postbus 399, 3840 AJ Harderwijk de heer drs. P.C.W. Geluk, afstudeercoördinator en secretaris Open Universiteit, Faculteit Natuurwetenschappen Postbus 2960, 6401 DL Heerlen

3

VOORWOORD Met dit afstudeerverslag van het literatuuronderzoek naar de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato hoop ik meer duidelijkheid te verschaffen in de mogelijke oorzaken voor het mislukken van een “adequaat” veronderstelde antibioticumbehandeling bij de ziekte van Lyme. Mijn speciale dank gaat uit naar de heer drs. Ph.H.H. Kielman, apotheker bij TS Products te Harderwijk, die mij op het onderzoeksspoor heeft gezet van de cystevorming door de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato. Verder dank ik de hierna genoemde afstudeerbegeleiders van de faculteit Natuurwetenschappen van de Open Universiteit Nederland die mij hebben begeleid met de vormgeving van dit verslag: mevrouw dr. ir. E.W.H.M. Fredrix, de heer dr. R.J.M. Niesink, de heer drs. P. Geluk en de heer dr. F.G.A.J. Van Belleghem. Maryse S. Kummer

4 CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ONDER INVLOED VAN STRESSFACTOREN INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING

7

SUMMARY

10

INLEIDING

13

METHODE VAN LITERATUURONDERZOEK

17

HOOFDSTUK I: ANATOMIE VAN DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO 1.1: Introductie 1.2: Outer Sheat 1.2.1 Major Osp lipoproteïnen 1.2.2 Moleculair mimicry-model van OspA 1.2.3 Complement-resisentie door OspE en OspF 1.2.4 Vorming van immunocomplexen door vrije antigenen 1.2.5 Adhesieproteïnen 1.2.6 Variabele major proteïnen 1.2.7 Andere surface-exposed membraanproteïnen 1.2.8 Inductie van anti-inflammatoire cytokinen 1.2.9 Blebs 1.3 Flagellen en axiaalfibril 1.4 Protoplsmacilinder

18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 21 22 22 24

HOOFDSTUK II: DE ZIEKTE VAN LYME 2.1: Introductie 2.2: Borrelia burgdorferi sensu lato en Ixodes vectoren 2.3: De infectieziekte Lyme-borreliose 2.3.1 Stadium 1: vroege gelokaliseerde Lyme-borreliose 2.3.2 Stadium 2: vroege gedissemineerde Lyme-borreliose 2.3.3 Stadium 3: Late of chronische Lyme-borreliose 2.4 Co-infecties 2.5 Diagnostiek van Lyme-borreliose 2.5.1 ELISA 2.5.2 Western Blot 2.5.3 Q-RiBb-Test 2.5.4 Polymerase Chain Reactie 2.5.5 Cultuur

26 26 26 27 27 27 28 28 28 29 29 30 31 31

HOOFDSTUK III: CYSTEVORMING DOOR BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO

32

3.1: Introductie 3.2 Cystevorming onder invloed van serum-starvation 3.3 Cystevorming onder invloed van oxidatieve -, pH-, temperatuur- en hypotone stress 3.3.1 Inductie van cystevorming als gevolg van oxidatieve stress 3.3.2 Inductie van cystevorming als gevolg van pH-veranderingen 3.3.3 Inductie van cystevorming als gevolg van temperatuurvariaties 3.3.4 Reconversie van mobiele spirocheten uit cysten 3.4 Antibiotica en chemotherapeutica als stressfactoren 3.4.1 penicilline, ceftriaxon en doxycycline 3.4.2 ceftriaxon, penicilline, erythromycine met serum-starvation 3.4.3 Ranitidine bismutcitraat 3.4.4 Hydroxychloroquine 3.4.5 Tinidazol 3.4.6 Telithromycine 3.4.7 Grapefruit seed extract 3.4.8 Tigecyline 3.5 Celwanddeficiënte bacteriën/ sferoplast-, L-vormen 3.5.1 Mycoplasma’s

32 32 36 37 37 38 38 41 41 41 43 45 46 48 48 50 52 52

5 3.5.2 In vitro onderzoek naar sferoplast-, L-vormen met Borrelia burgdorferi s.l 3.5.3 In vivo onderzoek naar sferoplast-, L-vormen van Borrelia burgdorferi s.l. 3.6 Samenvatting

53 54 54

HOOFDSTUK IV: IN VIVO ONDERZOEK MET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO 4.1 Introductie 4.2 In vivo onderzoek met Borrelia burgdorferi s.l. bij muizen, gerbils en honden 4.2.1 C3H-muizen en tigecycline 4.2.2 C3H-muizen, ceftriaxon en doxycycline 4.2.3 CH3-muizen en ceftriaxon 4.2.4 Gerbils, penicilline-G en andere antibiotica 4.2.5 Persistentie van B. burgdorferi s.l. na antibioticumbehandeling bij honden 4.3 In vivo onderzoek bij Lyme-borreliose patiënten 4.3.1 Behandeling van Lyme-borreliose patiënten met erythema chronicum migrans 4.3.2 Persistentie van B. burgdorferi s.l. na antibioticabehandeling 4.3.3 B. burgdorferi s.l. in bloed van Lyme-borreliose patiënten 4.3.4 Klinische gevolgen door trage celdeling van B. burgdorferi s.l. 4.3.5 Borrelia burgdorferi spirocheten in humane huidfibroblasten 4.3.6 B. burgdorferi s.l. in irisbiopsie 4.3.7 De PCR voor het aantonen van B. burgdorferi- DNA na behandeling met antibiotica 4.3.8 Positieve biopsieculturen na behandeling met antibiotica 4.3.9 Positieve culturen van huidbiopsies bij patiënten met Lyme-dermatitis 4.3.10 Atypische spirocheten en cysten in hersenweefsel bij neuroborreliose patiënten met dementie 4.4 Samenvatting

56 56 56 56 58 59 59 60 61 61 61 61 61 62 62 62 63 65 66 67

HOOFDSTUK V: BEHANDELINGSRICHTLIJNEN VOOR LYME-BORRELIOSE 5.1 Introductie 5.2 Behandelingsrichtlijn Lyme-borreliose van het CBO 5.2.1 Antibiotica bij Lyme-borreliose 5.2.2 Antibioticumprofylaxe bij een tekenbeet 5.2.3 Behandeling van de vroege gelokaliseerde Lyme-borreliose: EM en Borrelia-lymfocytoom 5.2.4 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose 5.2.4.1 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose: neuroborreliose 5.2.4.2 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose anders dan neuroborreliose of Lyme-artritis 5.2.4.3 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose: Lyme-artritis 5.2.5 Behandeling van late Lyme-borreliose 5.2.5.1 Behandeling van late Lyme-borreliose: ACA 5.2.5.2 Behandeling van late Lyme-borreliose: chronische neuroborreliose met pleiocytose/zonder pleiocytose 5.2.6 Behandeling van postinfectieuze klachten en symptomen: post-Lymeziekte syndroom 5.3 Behandelingsregimen volgens de Infectious Diseases Society of America (IDSA) 5.3.1 Behandeling na een tekenbeet 5.3.2 Behandeling van de vroege lokale Lyme-borreliose en vroege gedissemineerde Lyme-borreliose met EM zonder neurologische aandoeningen 5.3.3 Behandeling van acute neuroborreliose 5.3.4 Behandeling van Lyme-carditis 5.3.5 Behandeling van de late Lyme-borreliose 5.3.6 Behandeling van acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) 5.3.7 Behandeling van post-Lyme-ziekte syndroom 5.3.8 Behandeling van de co-infectie human granulocytic anaplasmosis (HGA)/ human granulocytic Ehrlichiosis (HGE) 5.3.9 Behandeling van de co-infectie babesiosis 5.3.10 Niet aanbevolen therapieën 5.4 Behandeling van Lyme-borreliose volgens de ILADS benadering 5.4.1 Individuele behandeling 5.4.2 Antibiotica en dosering bij de vroege lokale Lyme-borreliose: EM, Borrelia-lymfocytoom 5.4.3 Behandeling van de vroege gedissemineerde - en chronische Lyme-borreliose 5.4.4 Behandelingsduur 5.4.5 Combinatietherapie 5.4.6 Co-infecties 5.4.6.1 Babesiosis 5.4.6.2 Ehrlichiose en Anaplasmose 5.4.6.3 Bartonella 5.5 Samenvatting

69 69 69 69 70 70 73 73 73 74 75 75 75 76 77 78 78 80 81 81 83 83 84 85 85 88 89 89 89 90 91 93 93 93 93 95

6 Hoofdstuk VI: SYFILIS 6.1 Introductie 6.2 Spirocheten van de orde der Spirochaetales 6.3 Anatomie Treponema pallidum 6.4 Cysteuze vormen van Treponema pallidum 6.5 Stadia syfilis 6.5.1 Primair stadium 6.5.2 Secundair stadium 6.5.3 Vroeg latent stadium

97 97 97 97 98 98 98 99 99

6.5.4 Laat latent stadium en syfilis van onbekende duur 6.5.5 Tertiair stadium 6.5.5.1 Tertiaire orgaansyfilis 6.5.5.2 Cardiovasculaire syfilis 6.5.5.3 Late neurosyfilis 6.5.6 Congenitale syfilis 6.6 Epidemiologie van syfilis 6.7 Diagnose syfilis 6.8 Behandeling en follow-up syfilis

99 99 99 99 99 100 100 102 103

6.8.1 Behandeling vroege syfilis (stadium 1,2 en vroeg latente syfilis) en follow-up 6.8.2 Behandeling laat latente syfilis of syfilis van onbekende duur en follow-up 6.8.3 Behandeling tertiaire syfilis en follow-up 6.8.4 Behandeling neurosyfilis en follow-up 6.8.5 Congenitale syfilis en follow-up 6.9 Samenvatting 6.9.1 Pathogene spirocheten met cystevorming 6.9.2 Gevolgen van cystevorming voor de behandeling 6.9.3 Behandeling syfilis als voorbeeld voor de behandeling van Lyme-borreliose

103 103 103 104 104 104 105 105 105

HOOFDSTUK VII: DISCUSSIE, AANBEVELINGEN VOOR VERDER ONDERZOEK, CONCLUSIE

107

REFERENTIES

114

----------------

7 CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ONDER INVLOED VAN STRESSFACTOREN SAMENVATTING Lyme-borreliose of de ziekte van Lyme wordt momenteel beschouwd als de snelst groeiende infectieziekte van de wereld en het aantal patiënten met deze door Ixodes-teken overgebrachte bacteriële ziekte neemt wereldwijd dan ook steeds verder toe. De veroorzaker is de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato, een spiraalvormige bacterie waatoe drie pathogene soorten behoren: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii en Borrelia afzelii. Wat betreft de tekenbeetconsultaties bij de huisartsen in Nederland, nam de incidentie toe van 191/100.000 in 1994, naar 564 per 100.000 inwoners in 2009; een verdrievoudiging sinds 1994. In 1994 was de incidentie van erythema migrans 39/100.000 en in 2009 was deze incidentie gestegen tot 134/100.000. Indien men het aantal erythema migrans gevallen en tekenbeetconsulten omrekent naar de totale Nederlandse bevolking betekent dit dat in 2009 de huisartsen ongeveer 22.000 patiënten zagen met erythema migrans en 93.000 patiënten met een tekenbeet. Net als de geslachtsziekte syfilis is ook Lyme-borreliose een multisysteem ziekte waarbij verschillende stadia zijn te onderscheiden. Het bekendste stadium bij Lyme-borreliose is de vroege lokale huidinfectie erythema migrans of Bull’s eye op de plaats van de tekenbeet, die slechts in 50% van de gevallen optreedt. Door een speciaal bewegingsmechanisme dat bestaat uit een axiaalfibril en endoflagellen is de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato in staat om actief de infectiehaard te verlaten om zich elders in het lichaam van zijn gastheer te vestigen. Via endotheelcellen van de bloedvaten kan B. burgdorferi s.l. de bloedbaan verlaten, om zich diep in de weefsels te vestigen, met een voorkeur voor zuurstofarme milieu’s zoals de gewrichten en het centrale zenuwstelsel. Het gevolg is de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose die tot uiting kan komen als Lyme-artritis en neuroborreliose. Verder is er het stadium van de late of chronische Lyme-borreliose met chronische Lyme-artritis en chronische neuroborreliose als veelvoorkomende aandoeningen. De patiënten met deze aandoeningen vormen het grote probleem. Ondanks “adequaat” veronderstelde antibioticabehandelingen in de lokale- en vroege gedissemineerde Lyme-borreliose is de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato, regelmatig in staat tot overleving in de weefsels. Korte antibioticumbehandelingen laten een percentage zien van 30-62% aan recidieven binnen 3 jaar na de behandeling van de vroege Lyme-borreliose. Als men dit percentage betrekt op de jaarlijkse 22.000 patiënten die in Nederland behandeld worden voor erythema migrans, dan betekent dit dat 6600 tot 13.640 patiënten te maken kunnen krijgen met een recidiverende Lyme-borreliose binnen 3 jaar na een “adequaat” veronderstelde antibioticumbehandeling. Dat er jaarlijks enkele duizenden chronische Lyme-borreliose patiënten bij komen, komt overeen met de gegevens van de Nederlandse vereniging van Lyme patiënten (NVLP). Volgens de NVLP zouden er in 2009 in Nederland ruim 70.000 personen zijn die min of meer te lijden zouden hebben van de neurologische gevolgen van een besmette tekenbeet. Het totale aantal chronische Lyme patiënten zou volgens de NVLP enige honderdduizenden groot zijn. Het exacte aantal is echter niet bekend. Wat wel bekend is, is dat het chronische Lyme-borreliose legioen met persisterende klachten alleen maar groeiende is, ondanks “adequate” antibioticumbehandelingen. De volgende vraag staat dan ook centraal in dit literatuuronderzoek: “Ontbreken er fundamentele schakels in de antibacteriële behandeling bij Lyme-borreliose?” Het mislukken van “adequaat” veronderstelde antibioticumbehandelingen bij Lyme-borreliose werd voor het eerst gemeld door onderzoeker Preac-Mursic in 1989, al meer dan 20 jaar geleden. Bij patiënten die met antibiotica waren behandeld, werd de persistentie van de spirocheet bevestigd met positieve culturen van B. burgdorferi s.l. van huidbiopsies, synoviaalvocht, liquor en bloed. Falende antibioticumbehandelingen bij Lyme-borreliose vormde de aanzet in Europa om uitgebreid in vitro onderzoek te doen naar het gedrag van de bacterie onder invloed van diverse stressfactoren waaronder “effectief ” veronderstelde antibiotica. Een nadere beschouwing van het in vitro onderzoek toont aan dat de spirocheet B. burgdorferi s.l. onder ongunstige omstandigheden als het ware (tijdelijk) onderduikt en kan.transformeren van een normale mobiele spirocheet in een inerte cyste, een afgegrensd ruststadium waarin de spirocheet zich verbergt en waarbij de buitenste membraan zich als een “cocon” om de spirocheet heeft gelegd. De cyste biedt zodoende bescherming tegen de meeste antibiotica en andere stressfactoren en ook tegen eventuele antilichamen van de gastheer. Men dient zich te realiseren dat de spirocheet razendsnel kan overgaan in de cystevorm zodra de stressfactor aanwezig is. Een in vitro onderzoek laat zien dat na één minuut 95% van de spirocheten van B. burgdorferi s.l. was overgegaan in cysten onder invloed van hypotone stress (aquadest) en na 4 uur werd er geen mobiele intakte spirocheet meer waargenomen.

8 In vitro onderzoeken hebben ook laten zien dat na het verdwijnen van de stressfactor, dus als de omstandigheden weer gunstig worden voor de spirocheet B. burgdorferi s.l., deze reconversie kan vertonen van de cystevorm naar een normale spiraalvormige spirocheet. De reconversie kan afhankelijk zijn van de concentratie van een stressfactor en/of de tijdsduur van de beïnvloeding hiervan. Reconversie kan ook razendsnel gaan zoals een onderzoek heeft aangetoond bij cysten van 48 uur oud, die waren gevormd onder invloed van serum-starvation. Reconversie vond binnen 10 seconden plaats na toevoeging van konijnenserum aan het medium van de cysten. Uit de cysten kwamen onbeweeglijke maar intakte spirocheten. De spirocheten herkregen hun beweeglijkheid na 12 tot 15 uur na het uitkomen van de cysten. De stresstoestand serum-starvation kan zich voordoen in de liquor cerebrospinalis. Indien een patiënt wordt verdacht van een neuroborreliosis, dient men zich te realiseren dat de spirocheet B. burgdorferi s.l. aanwezig kan zijn in de cystevorm en dat deze cysten alleen met de microscoop zijn waar te nemen. De liquor culturen zullen voor de spirocheet B. burgdorferi s.l. in dat geval negatief uitvallen. Met het in vitro onderzoek voor ogen, zou men zich een voorstelling kunnen maken van het gedrag van de spirocheet B. burgdorferi s.l. in vivo. Onder invloed van een antibioticumbehandeling wordt een deel van de spirocheten gedood, maar ook kan een deel overgaan in cysten. Bij Lyme-borreliose patiënten tijdens antibioticabehandelingen met penicilline-G en met ceftriaxon werden cysten aangetoond in liquor, huidbiopsies en bloed. Bij patiënten die geen antibioticumbehandeling hadden gekregen werden intakte spirocheten geïsoleerd. Na het beëindigen van de therapie, dus als de omstandigheden weer gunstig zijn voor de spirocheet, kan reconversie naar een normale virulente spirocheet plaatsvinden, die weer aanleiding kan geven tot recidieven. Dat er inderdaad reconversie van cysten naar normale spirocheten kan plaatsvinden, is aangetoond in muizen waarbij intraperitoneaal cysten werden getransplanteerd en waarbij normale spirocheten werden teruggevonden in de harten van twee van de 15 getransplanteerde muizen. Bij een recidiverende Lyme-borreliose vindt normaliter opnieuw een antibioticumbehandeling plaats. Dit houdt in dat de cyclus opnieuw begint: cystevorming, reconversie na het beëindigen van de therapie en mogelijk weer een recidiverende Lyme-borreliose etc. een “jo-jo-effect”. Cystevorming onder invloed van een antibioticumbehandeling en reconversie naar normale spirocheten na het beëindigen van de kuur kunnen van klinisch belang zijn in verband met het wel of niet slagen van de behandeling. Behalve als normale mobiele spirocheet en in de cystevorm kan B. burgdorferi s.l. ook nog voorkomen als celwanddeficiënte (CWD) bacterie die gevormd kan worden onder invloed van celwandsynthese-remmende antibiotica, zoals de penicillinen en de cefalosporinen (bèta-lactam antibiotica). Celwand-deficiënte bacteriën of sferoplast-, L-vormen hebben geen spiraalvorm meer omdat zij een deel of hun hele celwand hebben verloren. In deze vorm veroorzaken ze ook geen antilichamenrespons en de ELISA en Western Blot zijn dus negatief. L-vormen kunnen verder leven zonder celwand en kolonies vormen die vaak diep verborgen zijn in de weefsels van de gastheer. Antibiotica die hun invloed uitoefenen op de celwand hebben dus geen effect op celwand-deficiënte bacteriën. Deze bacteriën zouden ook weer kunnen veranderen in intakte spirocheten en zouden zodoende een recidiverende Lyme-borreliose kunnen veroorzaken. De spirocheet B. burgdorferi s.l. beschikt net als de spirocheet Treponema pallidum, de verwekker van geslachtsziekte syfilis, over verscheidene overlevingsstrategieën om zich te handhaven in het lichaam van zijn gastheer. Behalve bovengenoemd pleiomorfisme vormt het intra-cellulaire verblijf van de spirocheet een andere overlevingsstrategie. B. burgdorferi s.l. is waargenomen in vele celtypen, zoals gliacellen, neuronen, endotheelcellen, Kupffercellen, synoviaalcellen, fibroblasten en macrofagen. De spirocheet is zodoende beschermd tegen het immuunsysteem van zijn gastheer en tegen de werking van de antibiotica waarvan het merendeel niet intracellulair werkzaam is. De spirocheet kan vrijkomen met de apoptosis van de cel en kan zodoende tot een relapsus van de infectie leiden. De spirocheet Treponema pallidum, vertoont zowel anatomisch als pathologisch veel overeenkomsten met de spirocheet Borrelia burgdorferi s.l.. Het ziektebeeld van de chronische Lyme-neuroborreliose vertoont veel overeenkomsten met het ziektebeeld van de late neurosyfilis. Er is een toenemend bewijs dat de spirocheten van B. burgdorferi s.l. zich weten te handhaven in geïnfecteerd weefsel, met inbegrip van de hersenen, ook na antibioticumtherapiën waaronder penicilline-G. De spirocheten zouden zich intracellulair ophouden in neuronen en gliacellen van het centrale zenuwstelsel met als gevolg dysfunctioneren hiervan en progressieve celdood. Het klinische beeld is progressieve dementie. Bovengenoemde bevindingen van in vitro - en in vivo onderzoek maken het duidelijk dat een antibioticumbehandeling die alléén gericht is tegen de normale mobiele spirocheet, onvoldoende is. Het feit dat de bacterie pleiomorfisme kan vertonen afhankelijk van het type - en de aan- of afwezigheid van de anti-bacteriële stressfactor, betekent in feite dat men de behandelingsstrategie zo breed mogelijk zou moeten toepassen Aangezien er momenteel geen therapeuticum is tegen alle verschijningsvormen van de spirocheet, zou het beste een combinatietherapie zijn, die bestaat uit het simultaan of intermitterend toedienen van diverse antibiotica die ieder afzonderlijk gericht zijn tegen één of meerdere verschijningsvormen van B. burgdorferi s.l..

9 Een voorbeeld van een combinatietherapie zou kunnen bestaan uit doxycycline dat actief is tegen normale spirocheten en celwand-deficiënte bacteriën, een erythromycine derivaat dat intracellulair werkzaam is en metronidazol of tinidazol die effectief zijn tegen de cysten van B. burgdorferi s.l.. Uiteraard is verder onderzoek nodig naar dergelijke brede behandelingsstrategieën tegen Lyme-borreliose. Tot op heden zijn alle officiële behandelingsrichtlijnen van het Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg (CBO), de Infectious Diseases Society of America (IDSA) en de International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) alleen gericht op de bestrijding van de normale spirocheet. Van de andere verschijningsvormen is men niet op de hoogte of deze worden ten onrechte genegeerd. Alleen bij de werkgroep van de ILADS wordt er momenteel onderzoek verricht naar brede behandelingsstrategieën tegen de diverse verschijningsvormen van de spirocheet bij Lyme-borreliose. Het wachten is op de resultaten. Het merendeel van de huidige wetenschappers waaronder microbiologen en artsen staren zich blind op de normale spiraalvormige bacterie B. burgdorferi s.l.. Ten onrechte gaat men ervan uit dat een enkelvoudig “adequaat” bevonden antibioticumbehandeling voldoende zou zijn om de spirocheet te bestrijden. Concluderend kan men stellen dat indien men een adequate behandeling van Lyme-borreliose wil toepassen deze gericht dient te zijn tegen alle mogelijke verschijningsvormen van de bacterie: de normale spirocheet, de intra-cellulaire spirocheet, de celwanddeficiënte bacterie, en de intra- en extracellulaire cysten van Borrelia burgdorferi s.l.. Er dient dus een brede behandelingsstrategie toegepast te worden bestaande uit een combinatietherapie van antibiotica en chemotherapeutica, opdat men deze bacterie op alle fronten kan aanvallen. Trefwoorden: Lyme-borreliosis, ziekte van Lyme, Borrelia burgdorferi sensu lato, spirocheet, celwand-deficiënte bacteriën, sferoplast-, L-vormen, cyste, stressfactor, combinatietherapie.

Maryse S. Kummer. [email protected]

10 CYST FORMATION BY THE SPIROCHETE BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO UNDER THE INFLUENCE OF STRESS FACTORS

SUMMARY Lyme-borreliosis or Lyme-disease is transmitted by the bites of ticks of the Ixodes genus that are infected with the spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato, a spiral shaped bacterium that consists of three pathogenic genospecies: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii and Borrelia afzelii. The infection has a wide distribution in the northern temperate regions of the world and during the last decades the number of patients with the Lyme-disease is growing steadily. In the Netherlands the consultations of tick bites were increased from 191/100.000 in 1994 to 564/100.000 in 2009; a three fold augmentation since 1994. In 1994 was the incidence of erythema migrans 39/100.000 and in 2009 the incidence has amounted to 134/100.000.When calculating the number of cases with erythema migrans and the number of tick-bite consultations to the total of the Dutch population, this means that in 2009 physians diagnosed about 22.000 patients with erythema migrans and 93.000 cases with a tick-bite. Like the veneral disease syphilis, Lyme borreliosis is a multisystem disease with several stages. The early local infection at the site of the tick-bite, erythema migrans or bull’s eye, is the most common which happens in only 50% of the cases. From the site of the tick-bite the spirochete may spread in the body of the host and may affect other organs like the nervous system, joints and heart: the early disseminated Lyme-borreliosis. The spirochete can leave the site of the tick-bite very quickly by means of a special movement mechanism, that encludes an axial fibril and endoflagels and may move deep into tissues. When not adequately treated the early stages of Lyme-borreliosis will develop in the late chronic Lyme borreliosis like chronic neuroborreliosis and chronic arthritis. Patients with these chronic affections form the major problems to the physicians. For with the increasing number of patients, physicians are also more and more confrontated with the failure of “adequate” supposed antibiotic treatments in the early stages of Lyme disease. Short antibacterial treatments result in 30- to 62% of recidives within three years after initial treatment. When calculating these percentages on the yearly 22.000 patients with erythema migrans in the Netherlands, this means that 6600 to 13.640 patients may have a recidive within three years after an “adequate” supposed antibiotic treatment. These numbers of some thousands of patients do correspond with the cases of the Dutch Society of Lyme Patients. Following this organisation there might be in the Netherlands in 2009 about 70. 000 patients who are suffering from the neurologic affections due to a contaminated tick-bite. However, the exact number of patients is not known. Only the fact that the army of chronic Lyme disease patients is still growing. The mean question of this literature study is: Are there fundamental links missing in the antibiotic treatments in Lyme borreliosis? The failing of “adequate”supposed antibiotic treatments was for the first time mentioned in 1989 by Preac-Mursic more than 20 years ago. After antibiotic therapies the persistence of the spirochete was confirmed by means of positive cultures of B. burgdorferi s.l. in skin biopsies, synovial fluid, liquor cerebrospinalis and blood. The failing antibiotic treatments formed the beginning in Europe to start in vitro studies after the behaviour of the spirochete B. burgdorferi s. l. under different stress conditions including the antibiotics. Cultures were examinated by dark field microscopy, interference microscopy and transmission electron microscopy. In vitro studies have revealed that the normal, mobil spirochete under stress conditions can convert to a cystic form by folding the outer membrane like a “cocon” around the spirochetal body. The cyst has a low metabolic activity that allows the spirochete to survive until conditions are becoming favourable again, as is the case when the (antibiotic) stress factor has disappeared. The cyst protects the spirochete against most of the antibiotics and other stress factors and also against antibodies of the host. The spirochete may convert to a cystic form very fast as has shown a study with aquadest as a stress condition. After one minute 95% of the spirochetes has converted to cysts and after four hours there was no mobile spirochete left. In vitro studies with the transmission electron microscope showed that after the disappearance of the (antibiotic)stress conditions the reconversion from a cystic form to a normal, mobile spirochete took place. The reconversion is dependant of the concentration of the stressor and/or the time of influence. Reconversion may happen very fast as shown in an in vitro study with cysts of 48 hours which were formed by the stress condition of serum-starvation. Within 10 seconds the cysts converted back to normal, intact spirochetes after the suppletion of rabbit serum to the medium of the cysts. After 12 to 15 hours the spirochetes regained their mobility again. A situation of serum-starvation may happen in the spinal fluid. When a neuroborreliosis is suspected, it is necessary to realise that the spirochetes may be present in cystic forms. These cysts can only be recognized by microscopy and cultivations of spinal fluid will be negative for the spirochete B. burgdorferi s.l..

11 With the in vitro studies in mind, one can imagine what may happen in vivo. The antibiotic treatment may kill a part of the spirochetes but also a part may convert to cystic forms. From patients with Lyme disease who were treated with penicillineG and with ceftriaxon, cysts were isolated in spinal fluid, skin biopsies and blood during the antibiotic treatments. From patients without an antibiotic treatment normal spirochetes were isolated. In vivo this means also that after an antibiotic treatment the cysts might be converted back into virulent spirochetes with a possible relapse of the disease. Indeed there may be reconversion from cysts to normal spirochetes as was shown in mice with transplanteted cysts. Two of the fifteen mice had normal spirochetes in their hearts. Relapses of Lyme borreliosis should be treated again with antibiotics. This means a new beginning of the cycle: cystic forming, reconversion after the antibiotic treatment and a possible recidive again followed by a new treatment etc. etc. a “yo-yo-effect”. It might be clear that cystic forming under the influence of an antibiotic treatment and reconversion to normal spirochetes after the treatment, will be of clinical importance in relation of the failing or the success of the therapy. Next to normal spirochetes and cysts, B. burgdorferi s.l. may also exist as cell wall deficient bacteria or spheroplast-, Lforms. These forms without a cell wall may be formed by beta lactam antibiotics as penicillines and cephalosporines. These antibiotics will not affect cell wall deficient bacteria. Cell wall deficient forms have no spiral form anymore because of the loss of their cell wall. In these forms there are no antibody responses and the Elisa and Western Blot tests are negatives. Spheroplast-, L-forms can live without a cell wall and form colonies deep in the tissues of the host. Cell wall deficient forms may revert back to normal spirochetes. Next to these pleomorphisms there is another reason for a possible relapse of Lyme-disease after an antibiotic therapy. Borrelia burgdorferi s.l. can penetrate in cells and can remain viable intracellular. In the cell the spirochete is protected against the host immune system and the action of most antibiotics. The spirochete has been found in glial cells, neurons, endothelial cells, Kupffer cells, fibroblasts and macrophages. The spirochete may be liberated after the apoptosis of the cell and may be the reason of a recidive of the Lyme borreliosis infection. Another spirochete, Treponema pallidum, the causative agent of syphilis, shows anatomic and pathologic similarities with the Lyme disease spirochete B. burgdorferi s.l.. The chronic neuroborreliosis resembles the late neurosyphilis. There is an increasing proof that B. burgdorferi s.l. can survive in infected tissues including the brains, also after treatment of penicilline-G, like Treponema pallidum. The Borrelia spirochete can hide intracellular in neurons and glial cells of the central nervous system, which is resulting in dysfunction of the cells and progressive cell death. The clinical manifestations are increasing dementia like the late neurosyphilis. So there are three different morphologic forms of the bacteria B. burgdorferi s.l and Treponema pallidum: the normal spirochete, the cystic form and the cell wall deficient - or spheroplast-, L-form. The bacterium can shift among these forms and the spirochete may be also intracellular situated. So this means that an antibiotic therapy that attacks only the normal, mobile spirochetes is not sufficient. The fact that the bacterium shows pleomorphism which depends of the type and presence or absence of the antibacterial stressor, means that the treatment strategy has to be as large as possible. This requires a combination therapy that consists of simultane or intermittent applications of different antibiotics which are each active against one or more pleomorphic forms of the spirochete. A combination might be doxycycline which is effective against the normal spirochetes and cell wall deficient bacteria, a derivate of erythromycine against the intracellular spirochetes and metronidazole or tinidazole against the cysts. The concentrations should be high enough to penetrate in all tissues and should be bactericidal to all different morphologic forms of the spirochete. All the official Lyme borreliosis guidelines of the Dutch Quality Institute for Health Care (CBO), The Infectious Diseases Society of America (IDSA) and The International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) are orientated at the treatment of the normal Lyme spirochete. However, the ILADS working group will come with new guidelines which enclude studies of combination therapies that are active against the different morphologic forms of B. burgdorferi s.l.. Further research is needed to determine which combinations of antibiotics work best, if it should be given orally, intravenous or intramuscular and in which doses and durations of treatment. This literature study has made it clear that an “adequate” supposed antibiotic treatment against the normal, mobile spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato is not sufficient to eliminate the bacterium. An adequate treatment of Lyme borreliosis should consist of the application of a combination of antibiotics against all possible morphologic forms: the normal, mobile spirochete, cysts, cell wall deficient forms (spheroplast-, L-forms) and intracellular spirochetes of B. burgdorferi s. l.: a wide range treatment strategy.

12 Keywords: Lyme-borreliosis, Lyme-disease, Borrelia burgdorferi sensu lato, spirochete, cell wall deficient bacteria, spheroplast -, L-forms, cyst, stress factor, combination therapy. Maryse S. Kummer [email protected]

13 CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ONDER INVLOED VAN STRESSFACTOREN INLEIDING Lyme-borreliose of de ziekte van Lyme wordt momenteel beschouwd als de snelst groeiende infectieziekte van de wereld en het aantal patiënten met deze ziekte neemt wereldwijd dan ook steeds verder toe. De ziekte van Lyme kan worden overgebracht op de mens of huisdier via een beet van een teek van het geslacht Ixodes die besmet is met de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato, een spiraal vormige bacterie die de verwekker is van deze infectieziekte. De teken raken besmet doordat zij zich normaliter voeden met bloed van vertebraten in hun leefomgeving. Deze vertebraten, zoals herten, kleine zoogdieren en vogels, vormen natuurlijke reservoirs voor de Borrelia bacterie. De mens en huisdieren zijn voor de (besmette) teek toevallige gastheren (Stanek et al., 2002). Ondanks “adequate” behandelingen met antibiotica is de verwekker van Lyme-borreliose, de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato, regelmatig in staat tot overleving in de weefsels. Dit heeft tot gevolg dat veel patiënten toch te maken krijgen met recidieven en een late of chronische Lyme-borreliose. Het mislukken van “adequate” antibioticumbehandelingen bij Lyme-borreliose werd voor het eerst gemeld door onderzoeker Preac-Mursic (1989) meer dan 20 jaar geleden. Bij patiënten die met antibiotica waren behandeld, werd de persistentie van de spirocheet bevestigd met positieve culturen van B. burgdorferi s.l. van huidbiopsies, synoviaalvocht, liquor en bloed. Volgens de onderzoekers Asch et al. (1994) laten korte antibioticumbehandelingen een percentage van 30 tot 62% aan recidieven zien binnen 3 jaar na de behandeling (Hoofdstuk V). Falende antibioticumtherapieën bij Lyme-borreliose vormde de aanzet in Europa om uitgebreid in vitro onderzoek te doen naar het gedrag van de bacterie onder invloed van diverse “adequate” antibiotica en andere stressfactoren. De onderzoekers Kersten et al. (1995) vroegen zich af of de antibiotica misschien zelf de oorzaak vormden tot het mislukken van een “adequate” antibioticumbehandeling bij Lyme-borreliose. In verband hiermee luidt de centrale vraagstelling bij dit literatuuronderzoek: “Ontbreken er fundamentele schakels in de antibacteriële behandeling bij Lyme-borreliose?” Alvorens een blik te werpen op de wereldwijde epidemiologie van Lyme-borreliose zal kort worden gekeken naar enkele historische mijlpalen van deze infectieziekte. Al meer dan 100 jaar geleden worstelde men al met wat nu bekend is als de infectieziekte Lyme-borreliose of de ziekte van Lyme. Hiervan getuigen de eerste beschrijvingen die plaats vonden in Europa en niet in de Verenigde Staten zoals de verwijzing van de ziekte naar het stadje “Lyme” zou doen vermoeden. De eerste melding werd gedaan door de arts Buchwald in 1883 en betrof een chronische huidaandoening die later bekend werd als acrodermatitis chronica atrophicans (ACA). In 1909 presenteerde de Zweedse arts Afzelius aan het Zweeds Dermatologisch Genootschap te Stockholm een patiënt met een zich langzaam uitbreidende huidaandoening die hij “erythema migrans” (EM) noemde. In 1913 beschreef de Weense dermatoloog Lipschütz een soort gelijk geval van erythema migrans (zie hoofdstuk II) (Stanek et al., 2002). Deze vroeg Europese beschrijvingen van Lyme-borreliose kwamen opnieuw in de schijnwerpers te staan toen in 1975 de reumatoloog Allen C. Steere melding maakte van een artritis-epidemie bij kinderen in de Noord-Amerikaanse plaatsen Old Lyme, Lyme en East Haddam in de staat Connecticut (Steere et al., 1984) . De symptomen traden vooral op in het zomerseizoen en de vroege herfst in bosrijke streken. Een kenmerkend verschijnsel bij de symptomen van artritis in de omgeving van Lyme was het voorkomen van een huiduitslag ongeveer vier weken voordat de symptomen van artritis zich openbaarden; dit wekte de veronderstelling dat dit verschijnsel te maken kon hebben met een insektenbeet (Steere et al., 1984). De huidaandoening kwam overeen met de eerste Europese beschrijvingen van Afzelius in 1909 en Lipschütz in 1913 van het erythema migrans (EM). Echter, in de Verenigde Staten was men in 1975 van mening dat men te maken had met een geheel nieuwe ziekte die men “Lyme-artritis” noemde (Steere et al., 1984) In de jaren hierna volgde men de patiënten met huidaandoeningen intensief en ontdekte dat de meeste na het EM artritis ontwikkelden, maar er waren ook patiënten met neurologische - en/of hartaandoeningen. In feite dus een complex multisysteem aandoening. Dit leidde ertoe dat de naam “Lyme-artritis” werd veranderd in “Lyme disease” of ziekte van Lyme (Steere et al., 1984). In 1982 ontdekte de Zwitserse entomoloog Willy Burgdorfer, die werkzaam was voor de Rocky Mountain Laboratories in de Verenigde Staten, spiraalvormige bacteriën, spirocheten, in de ingewanden van de hertenteek Ixodes dammini, ook Ixodes scapularis genoemd. Deze teken komen veel voor in het landelijk gebied rond het stadje Lyme. Met deze ontdekking werd duidelijk dat de de “Lyme-artritis” van dokter Steere in feite een infectieziekte was. In 1983 toonde microbioloog en onderzoeker Johnson aan dat de ontdekte spirocheet een nieuw soort van het genus Borrelia betrof en als eerbetoon aan zijn ontdekker gaf hij deze bacterie de naam “Borrelia burgdorferi” (Johnson et al., 1984)

14 Lyme-borreliose één van de snelst groeiende infectieziekten op het hele noordelijk halfrond. De voornaamste gebieden in de Verenigde Staten, Europa en Azië die nu getroffen worden door de ziekte van Lyme zijn gelegen bij de eind-morenen van de gletschers van 15.000 jaar geleden (Figuur 1).

Fig. 1. Wereldwijde verspreiding van de ziekte van Lyme in Noord-Amerika, Europa en Azië. Gebieden langs de terminale morenen van de gletjers 15000 jaar geleden (Steere, 1994). In die tijd was het gebied van het noordoosten en het noordelijk deel van het middenwesten, wat nu de Verenigde Staten is, bedekt met toendra’s. Toen de gletsjers zich terugtrokken kwam er een ecologische conditie voor in de plaats, die gunstig was voor herten en teken (Steere, 1994). Zowel in de Verenigde Staten, als in Europa en Azië neemt het aantal Lyme-borreliose gevallen de laatste jaren gestadig toe, zowel in absolute - als in relatieve zin. Meer dan 20.000 nieuwe gevallen worden jaarlijks in de Verenigde Staten gerapporteerd. Men schat dat het werkelijke aantal tussen de 60.000 en 100.000 patiënten bedraagt. In het jaar 2000 was de incidentie 111 per 100.000 inwoners in de staat Connecticut. Een belangrijke factor welke in de Verenigde Staten een rol speelt bij de stijging van het aantal Lyme gevallen, is de toename van het aantal herten in de buitenwijken. De in de Verenigde Staten voorkomende volwassen teken Ixodes dammini, Ixodes pacificus en Ixodes scapularis hebben namelijk bij voorkeur het hert als gastheer. Herten kunnen grote afstanden afleggen en zijn zodoende goede verspreiders van teken, die belangrijke vectoren zijn voor de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.). Vermeld dient nog te worden dat in de Verenigde Staten hoofdzakelijk Borrelia burgdorferi sensu stricto voorkomt. Terwijl in Europa alle drie de species die pathogeen zijn voor de mens voorkomen, namelijk: Borrelia burgdorferi sensu stircto, Borrelia garinii en Borrelia afzelii, alle drie de species onder de verzamelnaam Borrelia burgdorferi sensu lato (dit is: in brede zin) (Steere, 1994; Steere et al., 2004; Steere, 2006; Gray et al., 2002). In Europa is men het er nog steeds niet overeens aan welke gastheer door de teek Ixodes ricinus, ook wel schapenteek genoemd, de voorkeur wordt gegeven. Deze teken voeden zich op meer dan 300 diersoorten, zoals grote en kleine zoogdieren, waaronder paarden, koeien, herten, wilde zwijnen, vossen, schapen, honden, katten, eekhoorns, wezels, ratten, muizen etc. De mens kan een toevallig passerende gastheer zijn voor de Ixodes teek. Verder voedt de teek zich op vogels en reptielen. Borrelia garinii wordt meer in verband gebracht met vogels als gastheer, terwijl Borrelia afzelii beter aangepast lijkt met knaagdieren als gastheer. Volgens een rapport van de Wereld Gezondheidsorganisatie komen de hoogste frequenties van de ziekte van Lyme voor in midden-Europa, vooral in Duitsland, Oostenrijk, Slovenië en Zweden. In 1995 werd de jaarlijkse incidentie van de Borreliose-infectie in Slovenië en Oostenrijk geschat op 120 tot 130 gevallen per 100.000 inwoners; dit is iets hoger dan de incidentie in Connecticut, de staat in de Verenigde Staten met het hoogste aantal Lyme patiënten (111) per 100.000 inwoners (Steere et al., 2004; Steere, 2006; Gray et al., 2002). Vanaf 1994 tot 2005 constateerde men al in Nederland een sterke toename van tekenbeten en ziekenhuisopnamen die verband hielden met Lyme-borreliose. In 1994 was de incidentie van erythema migrans 39/100.000; in 2001 was dit verdubbeld tot 74/100.000 (Den Boon et al., 2004; Hofhuis et al., 2006). In 2005 was de incidentie van erythema migrans ten opzichte van 1994 verdrievoudigd tot 103/100.000 (Figuur 2) (Hofhuis et al., 2006). En in 2009 was de incidentie van erythema migrans gestegen naar 134 per 100.000 inwoners (Hofhuis et al., 2011) De grootste toename van tekenbeten en erythema migrans werd waargenomen in zuid- en noordoost Nederland en verschillende locaties langs de westkust, overeenkomend met bos-en duingebied waar met Borrelia burgdorferi sensu lato besmette veldmuizen, herten en vogels als vaste gastheer fungeren voor de teek Ixodes ricinus (Hofhuis et al., 2006).

15

Fig.2. De geografische verdeling van patiënten met erythema migrans per 100 000 inwoners in Nederland in 1994, 2001 en 2005.(Euro surveillance, 2006). Wat betreft de tekenbeetconsultaties bij de huisartsen, nam de incidentie toe van 191/100.000 in 1994, naar 446/100.000 in 2005, een verdubbeling (Den Boon et al., 2004; Hofhuis et al., 2006). En in 2009 was de incidentie voor tekenbeetconsulten gestegen naar 564 per 100.000 inwoners in Nederland, een verdrievoudiging sinds 1994 (Hofhuis et al., 2011). Indien men het aantal erythema migrans gevallen en tekenbeetconsulten omrekent naar de totale Nederlandse bevolking betekent dit dat in 2009 de huisartsen ongeveer 22.000 patiënten zagen met erythema migrans en 93.000 patiënten met een tekenbeet (Hofhuis et al., 2011). Volgens de Nederlandse vereniging van Lyme patiënten (NVLP) zouden er in 2009 in Nederland ruim 70.000 personen zijn die min of meer te lijden zouden hebben van de neurologische gevolgen van een besmette tekenbeet. Het totale aantal chronische Lyme patiënten zou volgens de NVLP enige honderdduizenden groot zijn. Het exacte aantal is echter niet bekend. Wat wel bekend is, is dat het Lyme-borreliose legioen alleen maar groeiende is; dit ondanks “adequate” behandelingen met antibiotica. Dit leidt weer naar het doel van dit literatuuronderzoek dat erop gericht is om mogelijke fundamentele oorzaken van regelmatig falende antibioticumtherapieën bij Lyme-borreliose patiënten te achterhalen. Bij dit literatuuronderzoek komen verder de volgende onderzoeksvragen aan de orde: 1) Welke anatomische eigenschappen bezit de intakte mobiele spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato om te kunnen overleven in zijn gastheren? 2) Welke invloed hebben de aan- of afwezigheid van diverse stressfactoren op de verschijningsvormen van de spirocheet Borrelia burgdorferisensu lato? 3) Welke mogelijke implicaties heeft de cystevorming door Borrelia burgdorferi sensu lato voor de behandeling van Lyme-borreliose? 4) Hoe zijn de huidige nationale - en internationale richtlijnen bij de behandeling van Lyme-borreliose? 5) Zijn er nog andere pathogene spirocheten met cystevorming onder invloed van stressfactoren; wat zijn de mogelijke gevolgen hiervan voor de antibacteriële behandeling en wat zou men hieruit kunnen leren voor de behandeling van de ziekte van Lyme? In verband met onderzoeksvraag 1 zal in hoofdstuk I de anatomie van Borrelia burgdorferi sensu lato worden behandeld. In verband met de onderzoeksvragen 2 en 3 zal in de hoofdstukken III en IV respectievelijk in vitro- en in vivo onderzoek van Borrelia burgdorferi sensu lato worden behandeld. Het onderzoek is een evaluatie van studies die met name gericht zijn op de blootstelling van in vitro culturen van de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato aan diverse stressfactoren zoals: antibiotica (Barbour en Hayes, 1986; Kersten et al., 1995; Preac Mursic et al; 1996; Murgia et al., 2002; Brorson en Brorson, 1999; Brorson en Brorson, 2001; Brorson en Brorson, 2002; Brorson en Brorson, 2004; Brorson en Brorson, 2005; Brorson en Brorson, 2007; Brorson et al., 2009: Yang et al., 2009). Serum-starvation (Brorson en Brorson, 1997; Alban et al., 2000; Murgia et al., 2002), hypotone stress (Brorson en Brorson, 1997; Murgia en Cinco, 2004), extreme pH’s, oxidatieve stress en temperatuurverhogingen (Murgia en Cinco, 2004). Tevens zal aan de hand van diverse studies nader worden ingegaan op het gedrag van de bacterie na opheffing van de genoemde stressfactoren (Brorson en Brorson, 1997; Alban et al., 2000; Murgia en Cinco, 2004).

16 In het kader van falende antibioticumtherapieën bij Lyme-borreliose zal verder het gedrag van Borrelia burgdorferi sensu lato in vivo worden behandeld (Gruntar et al., 2001; Preac Mursic et al., 1987; Preac Mursic et al., 1989; Preac Mursic et al., 1993; Preac Mursic et al., 1996; Preac Mursic et al., 1996; Aberer et al., 1996; Barthold et al., 2010; Hodzic et al., 2008; Bockenstedt et al., 2002). In verband met onderzoeksvraag 4 zullen in hoofdstuk V de behandelingsrichtlijnen van het Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg (CBO), de Infectious Diseases Society of America (IDSA) en de International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) besproken worden. In verband met onderzoeksvraag 5 zal in hoofdstuk VI met name de pathogene spirocheet Treponema pallidum, de verwekker van de geslachtsziekte syfilis, centraal staan.

------------------------------

17 METHODE VAN LITERATUURONDERZOEK MET BETREKKING TOT “CYSTEVORMING DOOR DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO” In de eerste plaats werd er in 2006 t/m 2009 literatuur over Lyme-borreliose en cystevorming door de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato verkregen via dhr. drs. Ph.H.H. Kielman, apotheker bij TS Products. In de tweede plaats werd het volgende standaardboek over Lyme-borreliose geraadpleegd: “Lyme Borreliosis, Biology, Epidemiology and Control” Edited in 2002 by JS Gray, O Kahl, RS Lane and G. Stanek. In de derde plaats werd er aanvullende literatuur met betrekking tot Lyme-borreliose en cystevorming verkregen via de database van PubMed tot april 2011. Aangezien de cystevorming door Borrelia burgdorferi sensu lato centraal staat in dit verslag, was de zoekterm: Borrelia AND cysts: 23 referenties. Andere zoektermen: anatomy AND chemistry AND spirochetes: 8 reviews, waaronder standaardwerk van Holt (1978) Steere AC AND Lyme review: 24 referenties. In 2007 heeft dhr. Dr. R. Niesink van de OU op verzoek van de auteur van dit verslag diverse niet vrij te downloaden studies over cystevorming door Borrelia burgdorferi sensu lato aangeleverd. In 2008 heeft mevrouw Dr. Ir. L. Fredrix van de OU op verzoek van de auteur van dit verslag de niet vrij te downloaden en nog ontbrekende studies over cystevorming door Borrelia burgdorferi sensu lato toegestuurd. In 2007/2008 abstracten gelezen en uitgeprint van de literatuur van de Lyme-borreliose richtlijnen van het CBO (2004), de IDSA (2000) en de ILADS (2004).Waar dit mogelijk was, werden de volledige publicaties via PubMed gedownload of er werden verscheidene studies aangeschaft. In september 2010 werd de mogelijkheid geboden om literatuur te verkrijgen via de digitale bibliotheek van de OU, waar via Google scholar/PubMed meer volledige studies te verkrijgen zijn. Van de digitale bibliotheek is gebruik gemaakt voor het verkrijgen van een aantal literatuurstudies over Lyme-borreliose en ontbrekende literatuur van de richtlijnen van het CBO (2004), de IDSA (2006) en de ILADS (2004). In verband met de analogie van de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato en de spirocheet Treponema pallidum, de verwekker van de geslachtsziekte syfilis, zijn tevens een aantal publikaties over syfilis verkregen via de websites van het RIVM en het CBO. Verder werden nog een aantal boeken met betrekking tot Lyme-borreliose geraadpleegd: Lyme Disease, the Cause, the Cure, the Controversy. AG Barbour. Everything you need to know about Lyme Disease and other tick-borne disorders. Karen Vanderhoof-Forschner. Medical Microbiology & Infection. T. Elliott, T Worthington, H Osman & M Gill. Zie voor details onder referenties. Andere informatiebronnen waren de websites van Borreliose.nl, CBO, Eurosurveillance, Farmacotherapeutisch Kompas, IDSA, ILADS, RIVM. Het literatuuronderzoek vond plaats vanaf juni 2006 tot en met april 2011. Het was de bedoeling om op 15 augustus 2007 af te studeren. Door uiteenlopende oorzaken waaronder ongeval/ziekte van de auteur en bijzondere familie-omstandigheden thuis, heeft het afstuderen helaas aanzienlijke vertraging opgelopen.

----------------

18 HOOFDSTUK I ANATOMIE VAN DE SPIROCHEET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO 

INTRODUCTIE

De infectieziekte Lyme-borreliose wordt veroorzaakt door drie nauw verwante spiraalvormige bacteriën (spirocheten) van het genus Borrelia, welke gezamenlijk worden vermeld onder de naam Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l). Het betreft de species Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s), Borrelia garinii en Borrelia afzelii. Deze spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.), is dankzij enkele bijzondere kinetische eigenschappen zoals het bezit van een axiaalfibril en periplasmatische flagellen, in staat om zich als een slang voort te bewegen. De spirocheet is zo in staat om snel op actieve wijze de geïnfecteerde plaats van de tekenbeet te verlaten en te migreren naar de weefsels van zijn gastheer. Dit kan later langdurige infecties veroorzaken, vaak leidend tot een chronische Lyme-borreliose (Brorson en Brorson, 2004). De onderzoeksvraag die in dit hoofdstuk aan de orde komt luidt: “Welke anatomische eigenschappen bezit de intacte mobiele spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato om te kunnen overleven in zijn gastheren?”. In paragraaf 1.2 zal er aandacht worden geschonken aan de outer membrane, de buitenste membraan of outer sheath van de bacterie met de outer membrane-proteïnen. Meer naar binnengaande treft men het periplasma aan met de flagellen en de axiaalfibril, die zorgen voor de morfologie en de mobiliteit van de spirocheet; dit zal behandeld worden in paragraaf 1.3. In het centrum van de bacterie is de protoplasmacilinder gelegen, die bestaat van buiten naar binnen uit een celwand, een cytoplasmamembraan en twee polaire membranen. In het cytoplasma bevinden zich één chromosoom en circulaire - en lineaire plasmiden. De protoplasmacilinder wordt beschreven in paragraaf 1.4. Met een nadere beschouwing van bovengenoemde structuren zal men meer inzicht krijgen in enkele strategieën die de bacterie in staat stellen te overleven in zijn gastheren (Holt, 1978; Barbour en Hayes, 1986; Bergström et al., 2002; Kurtenbach et al., 2002; Steere et al., 2004; Bradford en Allen, 2006; Steere, 2006). 

1.2 OUTER SHEAT

Het geslacht Borrelia bestaat uit spirocheten met een lengte van 8-16 µm en met spitse uiteinden. De spiraalvormige bacterie heeft 5-10 windingen met een grote spoed (dit is de afstand tussen twee windingen). Door de buigzame celwand en flagellen en axiaalfibril kunnen de spirocheten zich als een slang voortbewegen. Van buiten naar binnen onderscheidt men bij de spiraalvormige normale mobiele Borrelia-bacterie achtereenvolgens: de outer sheath, outer envelope, outer membrane of buitenste wand. het periplasma met de axiaalfibril en de flagellen. de protoplasmacilinder met van buiten naar binnen: de celwand, het cytoplasmamembraan, de twee polaire membranen, het cytoplasma met één chromosoom en circulaire- en lineaire plasmiden (Figuren 1.1, 1.2 en 1.4).

Fig.1.1. Illustratie van de morfologie van een spirocheet. AF: axiaal fibril, PC: protoplasmacilinder, OS: outer sheath, IP: insertie pore (Holt, 1978). De outer sheath wordt beschouwd als de meest extern gelegen buitenste laag van de bacteriecel. Deze scherp omlijnde laag kan variëren bij de spirocheten van een fijne structuur welke glad is en geen textuur heeft, tot een morfologisch complexe laag van polygonale subeenheden, dat een mozaïkachtig uiterlijk geeft. Alle Borrelia species, waaronder dus B. burgdorferi s.l., worden gekenmerkt door het ontbreken van bepaalde structurele details en hebben een glad uiterlijk (Holt, 1978, Barbour en Hayes, 1986). De buitenste wand is vloeibaar, beweeglijk en niet stabiel. De outer sheath is opgebouwd uit drie lamellen en bestaat uit 4562% proteïnen, 23-50% lipiden en 3-4% koolhydraten (Barbour en Hayes, 1986). Verder kan het oppervlak van de outer sheath van de Borrelia spirocheet een amorfe slijmlaag (mucoïd layer) hebben, bestaande uit glycoproteïnen (Figuur 1.2). Met deze laag kunnen de antigenen van de spirocheet, de Outer surface proteïnen (Osp’s), op de outer sheath worden afgedekt en zijn zodoende niet te traceren door het immuunsysteem van de gastheer (Barbour and Hayes, 1986; Bradford en Allen, 2006).

19

Fig. 1.2 Dwarsdoorsnede van de spirocheet Borrelia burgdorferi s.l.(Vanderhoof-Forschner, 2003). In paragraaf 1.2.1 zullen eerst de outer surface proteïnen worden besproken met in paragraaf 1.2.2 het moleculaire mimicry-model van OspA en in paragraaf 1.2.3. de complementresistentie door OspE en OSPF. Vervolgens in paragraaf 1.2.4 de vorming van immunocomplexen door vrije antigenen, in paragraaf 1.2.5 de adhesieproteïnen, in paragraaf 1.2.6 de variabele major proteïnen, in paragraaf 1.2.7 andere surface-exposed membraanproteïnen, in paragraaf 1.2.8 de inductie van anti-inflammatoire cytokinen en in paragraaf 1.2.9 de blebs. 

1.2.1 Major Osp lipoproteïnen

Het hele oppervlak van de outer sheath bevat de voor de spirocheet belangrijke lipoproteïnen, de outer surface proteïnen (Osp’s), de antigenen OspA tot en met OspG die afwisselend geactiveerd kunnen worden. Het afwisselend “aan-en-uit” zetten van de Osp’s is een vorm van antigenenvariatie die fasevariatie wordt genoemd en waarbij de genen die coderen voor de Osp’s afwisselend tot expressie komen. Fasevariatie van de antigenen stelt B. burgdorferi s.l. in staat om aan de immunoglobulinen van het immuunsysteem van zijn gastheer te ontsnappen door van antigeen-expressie te wisselen zodra er nieuwe antilichamen in de bloedbaan verschijnen ( Bergström et al., 2002; Steere et al., 2004; Steere 2006). OspA en OspB spelen een belangrijke rol in de pathogenesis van B. burgdorferi s.l. en zijn betrokken bij de adhesie aan zoogdiergastheercellen en de penetratie ervan. OspA speelt tevens een rol bij de adhesie van de spirocheet aan de epitheelcellen van de ingewanden van de Ixodes teek. Verder bestaat er een omgekeerde evenredigheid tussen de mate van activering van het OspA - en het OspC antigeen. Indien B. burgdorferi s.l. verblijft in de ingewanden van een nuchtere teek van het geslacht Ixodes, zijn OspA- en OspB antigenen geactiveerd en OspC niet. Zodra de teek begint aan een bloedmaaltijd van een vertebrate gastheer en B. burgdorferi s.l. komt in contact met dit bloed, daalt de productie van OspA en Osp B en wordt het antigeen OspC geactiveerd. Het betreft hier antigene fasevariatie van Osp’s A en B met Osp C. Indien een teek een bloedmaaltijd neemt bij een zoogdierengastheer en B. burgdorferi s.l. in de ingewanden van de teek komt in contact met dit bloed dan hecht de spirocheet zich aan zoogdierenplasminogeen, een serumproteïne dat door activering van de enzymen desmo- en strepto-urokinase overgaat in plasmine. Zowel het plasminogeen en de activatoren hiervan zijn ook aanwezig in de bloedmaaltijd van de teek. Het plasmine vergemakkelijkt door de fibrino- en thrombolytische werking de verspreiding van B. burgdorferi s.l. vanuit de ingewanden, via de haemolymfe naar de speekselklieren van de teek. In de speekselklieren van de teek overheerst de expressie van OspC dat noodzakelijk is voor de infectie van de zoogdierengastheer tijdens het bloedzuigen van de teek (Bergström et al., 2006, Steere, 2006). 

1.2.2 Moleculair mimicry-model van OspA

Bij patiënten met antibiotica-resistente Lyme-artritis is een bijzonder major histocompatibility complex (MHC) klasse II allelen aangetoond. De meeste van deze patiënten hebben de human leucocyte antigens (HLA)-DRBI‫ ٭‬0401, 0101 en andere verwante allelen en de ernst en duur van hun artritis correleert met de cellulaire en humorale immuunrespons tegen het OspA proteïne van B. burgdorferi s.s.. Het OspA epitoop wordt gepresenteerd door het DRBI‫٭‬0401 of 0101 molecuul aan het oppervlak van de synoviaalcellen. Andere synoviaalcellen presenteren een zelfpeptide met homologe sequenties als die van het OspA epitoop, het human lymphocyte function-associated antigen-I (hLFA-I) dat bindt aan het DRB1 ‫٭‬0401molecule. Het B. burgdorferi OspA-DRB1‫٭‬0401 peptidecomplex veroorzaakt een humorale - en cellulaire immuunrespons die ingang worden gezet door de helper-T (Th)-lymfocyten met het CD4 proteïne. De Th-cellen stimuleren de Blymfocyten tot de productie van antilichamen en stimuleren de productie van cytotoxische T-cellen met het CD8 proteïne. De T-celrespons is gericht tegen synoviaalcellen met het B. burgdorferi OspA-DRB1‫٭‬0401 peptidecomplex en ook tegen de synoviaalcellen met het hLFA-I-DRB1‫٭‬0401 peptidecomplex. Alleen patiënten met antibiotica-resistente Lyme-artritis genereren een immuunrespons tegen OspA, hLFA-I en de nauw verwante peptide epitopen. Uit deze resultaten werd een

20 hypothese voor een moleculair mimicry-model afgeleid voor de auto-immuunziekte bij genetisch-bepaalde patiënten met antibiotica-resistente Lyme-artritis (Steere et al., 2001; Bergström et al., 2002; Singh en Girschick, 2004; Steere et al., 2004). Het hLFA-I peptide bindt echter niet aan het DRBI‫ ٭‬0101 molecuul; dit veronderstelt dat het hLFA-I peptide waarschijnlijk niet een relevant auto-antigeen is (Steere et al., 2004). 

1.2.3 Complement-resisentie door OspE en OspF

De outer surface proteïnen OspE en OspF behoren tot de OspEF-related proteïnen (Erp’s) en spelen een rol bij de interacties met vertebrate weefsels. Diverse Erp’s kunnen complementfactor H binden dat leidt tot inactivering van het complement (Bergström et al., 2002). Gastheercellen bezitten ter bescherming tegen lysis door het eigen complement, complement-controlerende proteïnen of kunnen complement-inhiberende factoren binden. De spirocheet B. burgdorferi s.l. vertoont soort-specifieke resistentie tegen de complementproteïnen van diverse vertebrate gastheren. Borrelia spp zijn heterogeen met betrekking tot de complement-mediated cellysis (Kurtenbach et al., 2002). Door het bezit van verscheidene lipoproteïnen op het celoppervlak zoals OspE, p21, ErpA en ErpP, is B. burgdorferi s.l. in staat om twee complement-control-proteïnen van de gastheer te binden aan het celoppervlak: factor H-like (FHL)-I proteïne/ reconectine en factor H. Vijf proteïnen van B. burgdorferi s.l. die samen complement regulatory acquiring surface proteins (CRASP’s) worden genoemd, vertonen interacties met de complement-control-proteïnen. OspE is een specifiek legand om te binden aan factor H. BbCRASP-1, -2 en -3 zijn andere factor H bindingsproteïnen. Het mechanisme van complementresistentie berust waarschijnlijk op de inactivatie van C3b, een centrale component van de complementcascade, behorende tot het natuurlijke afweermechanisme (Kurtenbach et al., 2002). Het binden van de complement control proteïnen van de gastheer door B. burgdorferi s.l. is een voorbeeld van het exploiteren van de gastheermoleculen en is een efficiënt mechanisme om lysis en stimulatie van de verworven immuniteit te vermijden (Kurtenbach et al., 2002). Verder wordt verondersteld dat B. burgdorferi s.l. een proteïne synthetiseert dat lijkt op het complement-regulator proteïne CD59 of protectine van de gastheer. Het CD59 inhibeert de synthese van het membraan attack complex (MAC) dat betrokken is bij de laatste stap in de complementcascade, de cellysis. Een molecule met antigene eigenschappen overeenkomstig het CD59 van de gastheer en met de mogelijkheid om bij voorkeur aan de poriënvormende C9 MAC moleculen te binden, werd gevonden in complement-resistente Borreliae (Embers et al., 2004). 

1.2.4 Vorming van immunocomplexen door vrije antigenen

De spirocheet B. burgdorferi s.l. kan vrije antigenen in zijn omringende milieu afgeven en zodoende de immunoglobulinen van de gastheer binden waarbij immunocomplexen ontstaan. De bacteriecel is op deze wijze beschermd tegen de specifieke antilichamen van de gastheer die normaliter met één receptor aan de antigenen op het celoppervlak binden en met een andere receptor kunnen binden aan fagocyten. De antilichamen funtioneren als opsoninen, moleculen die de fagocytose bevorderen. Het hele proces wordt opsonisatie genoemd waarbij het opsonine eerst aan het object bindt dat gefagositeerd moet worden en vervolgens aan een specifieke receptor op de fagocyt. Indien de antilichamen van de gastheer vrije antigenen binden kan dit gevolgen hebben voor de antilichamentesten zoals de ELISA. Indien er geen vrije antilichamen beschikbaar zijn dan kan dit resulteren in een negative uitslag terwijl de patiënt een Lyme-borreliose infectie heeft (Embers et al., 2004). 

1.2.5 Adhesieproteïnen

Op de outer sheath van B. burgdorferi s.l. bevinden zich niet alleen de Osp’s, maar er zijn tevens verscheidene adhesieproteïnen aanwezig. De spirocheet heeft twee decorin-bindings proteïnen (Dbp’s), DbpA en DbpB, die beide zijn gebonden aan de outer sheath en die de adhesie aan zoogdierenweefsel vergemakkelijken. Indien spirocheten in de huid terecht komen via de beet van een Ixodes teek binden zij zich eerst aan decorine, een klein leucine-rijk proteoglycaan (SLRP) dat gebonden is aan collageenvezels in de extra cellulaire matrix (ECM) van de huid. SLRP treft men ook aan in vele andere weefsels van de zoogdierengastheer (Bergström et al., 2002). Een ander adhesieproteïne van B. burgdorferi s.l. is het fibronectine-bindingsproteïne BBK32 dat bindt aan het universele cellulaire fibronectine. De punt van de spirocheet kan zich met behulp van het BBK32 aan de cellen binden van de gastheer. Ook kan de spirocheet zich met behulp van zijn flagellen en axiaalfibril de cel in wurmen waarbij de bacterie de gastheercel tot afgifte van de eigen enzymen stimuleert zodat een deel van het celmembraan oplost. Hierdoor kan de spirocheet de cel binnen gaan en intracellulair verblijven. Op deze wijze kan de spirocheet B. burgdorferi s.l. zich diep in de weefsels verankeren en zich verborgen houden. De spirocheet is zodoende beschermd tegen het immuunsysteem van zijn gastheer en tegen de werking van de meeste antibiotica (Bergström et al., 2002; Bradford en Allen, 2006). (Zie ook paragraaf 1.3).

21 

1.2.6 Variabele major proteïnen

Borrelia bacteriën kunnen het lang volhouden in een gastheer dankzij de mogelijkheid tot antigenenvariatie die ook wel “successieve fasevariatie” wordt genoemd. Bij antigenenvariatie is er sprake van mutaties in het DNA, waarbij nieuwe genen ontstaan die coderen voor nieuwe antigenen. Deze nieuwe surface proteïnen worden variabele major proteïnen (Vmp’s) genoemd. Iedere keer wordt er slechts één gen dat codeert voor een bepaalde Vmp tot expressie gebracht, terwijl andere nietgeactiveerde genen in vooraad worden gehouden. Antigenenvariatie vindt plaats als een niet-actief gen het huidige coderende gen vervangt door homologe recombinatie (Bergström et al., 2002). Een lipoproteïne, genaamd Variable majorproteïne Like Sequent Epitope (VlsE)-antigeen, kan uitgebreide antigenenvariatie vertonen indien B.burgdorferi s.l. zich bevindt in dieren die fungeren als gastheer voor de spirocheet. Het VlsE-gen dat gelokaliseerd is op het lineair plasmide (lp) 28-1, heeft 15 cassette-sequenties die na combinatie met invariante VlsE- sequenties tot expressie kunnen komen, hetgeen resulteert in verandering van het VlsE antigeen, waartegen de gastheer niet direct nieuwe immunoglobulinen beschikbaarbaar heeft, waardoor de overlevingskans van de spirocheet gedurende de infectie vergroot wordt ( Bergström et al., 2002; Steere et al., 2004; Steere, 2006). 

1.2.7 Andere surface-exposed membraanproteïnen

Vele aan het oppervlak van de outer surface gebonden membraanproteïnen zijn waarschijnlijk belangrijke virulente determinanten en zijn mogelijke antigenen die gebruikt kunnen worden voor profilactische en diagnostische doeleinden. Profilactisch, door met de hierna genoemde antigenen mogelijk een vaccin te bereiden; diagnostisch, door deze antigenen te gebruiken in de diverse testkits voor het traceren van de immunoglobulinen tegen B. burgdorferi s.l. in patiëntensera. Tot enkele belangrijke outer surface gebonden membraanproteïnen behoren de antigenen met de reguliere afkortingen P22, P35, Bmp, Mlp,EppA en RevA (Bergström et al., 2002). Het proteïne-(P)22 wordt gecodeerd vanaf het lineaire chromosoom en is een surface-exposed lipoproteïne. Het P35 is een ander lipoproteïne van B. burgdorferi s.l. dat wordt herkend door de immunoglobulinen van zoogdieren die geïnfecteerd zijn door deze spirocheet. Het Borrelia membraanproteïne (Bmp) bestaat uit een familie van homologe lipoproteïnen die immunogeen zijn gedurende de infectie van B. burgdorferi s.l. in de vertebrate gastheer. De Bmp-familie bestaat uit BmpA (P39), BmpB, BmpC en BmpD. Het multicopy lipoproteïne (Mlp) wordt in mintens zeven verschillende versies gecodeerd op de circulaire chromosomen van de circulaire plasmiden cp32 en cp18. Het exported plasmide proteïne A (EppA) wordt alleen geactiveerd gedurende de infectie van B. burgdorferi s.l. in de zoogdierengastheer. De genen van EppA bevinden zich op de circulaire plasmiden cp9-1 en cp9-2. De wijdverspreide eppA genen en de 9 kb circulaire plasmiden doen veronderstellen dat deze bijdragen aan het overleven van B. burgdorferi s.l. in de natuur en mogelijk aan de pathogenese van Lyme-borreliose (Bergström et al., 2002). Het reversibele proteïne RevA is een ander surface-exposed proteïne dat wordt geactiveerd bij een temperatuur vanaf 34 graden Celsius in de zoogdierengastheer en inactief is bij 23 graden Celsius. In culturen is RevA afhankelijk van de pH. Bij pH 8 is het antigeen inactief en wordt geactiveerd bij pH 7 (Carroll et al., 2001; Bergström et al., 2002). Bovengenoemde variatie aan antigenen die al naar gelang de omstandigheden geactiveerd kunnen worden, spelen een belangrijke rol in de virulentie van B. burgdorferi s.l. en vergroten de overlevingskans voor de spirocheet in de zoogdierengastheer doordat de immuunrespons iedere keer als de gastheer nieuwe antilichamen heeft geproduceerd, ontlopen kan worden. 

1.2.8 Inductie van anti-inflammatoire cytokinen

De spirocheet kan de productie initiëren van het anti-inflammatoire cytokine interleukine 10 (IL-10) dat een negatieve regulator is van inflammatoire cytokine-afgifte en /of funktie. De lipoproteïnen van de spirocheet veroorzaken de afgifte van IL-10 door macrofagen, monocyten en lymfocyten. Deze perifere-bloed-mononucleaire cellen (PBMC’s) vertonen onder invloed van B. burgdorferi s.l. hyporesponses van de tumor-necrotic-factor-alpha (TNF-α) en interferon gamma (INF-γ) cytokine-afgifte. Cytokinen spelen een belangrijke rol bij de bestrijding van infecties door de stimulatie van de ontwikkeling van B- en T-lymfocyten, cytotoxiciteit en de stimulering van de proliferatie van granulocyten en monocyten. Voor de overleving van de spirocheet is het belangrijk dat deze infectiebestrijdende factoren afwezig zijn. Dit is het geval indien door de macrofagen het anti-inflammatoire IL-10 wordt afgegeven. Het is gebleken in onderzoek met niet-resistente en resistente muizen voor Lyme-borreliose, dat resistente muizen een grotere IL-10 productie door de macrofagen vertoonden en hierdoor minder artritisverschijnselen kregen dan de muizen die gevoelig waren voor Lyme-borreliose (Embers et al., 2004). Ander onderzoek toonde aan dat de spirocheet B. burgdorferi s.l. in staat is tot het veroorzaken van sterke ontstekingsreacties die aanleiding geven tot ziekteverschijnselen. Er wordt hier geen melding gemaakt van de aan- of afwezigheid van IL-10. De aanwezigheid van de spirocheet kan macrofagen stimuleren tot de afgifte van zuurstofradicalen en stikstofoxide, als ook van diverse pro-inflammatoire cytokinen zoals IL-Iβ, IL-6 en TNF-α. Het IL-8 speelt ook een belangrijke rol in de pathogenese door de activatie van diverse witte bloedcellen. Men veronderstelt dat de lipoproteïnen en

22 glycoproteïnen van de outer-surface van B. burgdorferi s.l. de pathologische processen veroorzaken door interacties met infiltrerende - en weefselspecifieke cellen (Kurtenbach et al., 2002). 

1.2.9 Blebs

Een behandeling van spirocheten met oppervlak- actieve agentia en/of enzymen resulteert meestal in een dramatische verandering of herschikking van de outer sheath. De losse verbinding van de buitenste wand of outer envelope met de onderliggende protoplasmacilinder leidt tot de scheiding van deze celbestanddelen indien de spirocheten verblijven in hypotonische oplossingen. Dergelijke oplossingen zijn stressfactoren voor de spirocheet en vormen een bedreiging voor de bacterie. Als bescherming hiertegen kan de spirocheet cysteuze vormen aannemen zoals de “outer envelope blebs”, uitstulpingen van de buitenste wand (Figuur 1.3). Outer envelope - blebs worden onder andere ook gezien als er specifieke antilichamen worden toegevoegd aan Borrelia spp., indien cellen worden bevroren en ontdooid, of als cellen worden blootgesteld aan penicilline. Verder komen blebs ook voor bij ouder wordende culturen (Barbour en Hayes, 1986) .

Fig.1.3. Electronen-microscopische foto van spirocheten van Borrelia burgdorferi sensu lato met grote en kleine blebs in de outer sheat. In de grote bleb, rechtsonder zijn losgelaten flagellen uit het periplasma te zien. Bar 0.5 μm (Barbour en Hayes, 1986). Indien de spirocheet B. burgdorferi s.l. wordt blootgesteld aan een stressvolle omgeving in de zoogdieren-gastheer veroorzaakt dit de vorming van membraangebonden blebs of zelfs de secretie hiervan. Alle blebs van de borrelia-bacteriën hebben een buitenste wand, terwijl sommige blebs ook een cytoplasmamembraan kunnen bevatten. Echter, alle kunstmatig veroorzaakte blebpreparaties hebben niet het periplasmatische 41 kiloDalton (kDa) flagellinantigeen. De blebs bevatten wel plasmide-DNA met Osp-DNA. In de buitenste membranen van de blebs treft men de antigenen OspA en OspB aan en een ander lipoproteïne (Lp) met een laag moleculairgewicht, het Lp6.6. Men veronderstelt dat de blebmembranen ook het fibronectine bindingsproteïne BBK32 bevatten, daar de spirocheten zich aan het fibronectine van humane endotheelcellen kunnen binden (Bergström et al., 2002). In de eerste helft van de twintigste eeuw was men van mening dat de grote blebs of “gemmae” zoals ze ook wel worden genoemd, een ander stadium van de levenscyclus van de spirocheet vormde. Dit gaf weer steun aan de vroegere classificatie van Borrelia spirocheten als protozoa (Barbour en Hayes, 1986; Bergström et al., 2002). In hoofdstuk III zal nader worden ingegaan op de verschillende stressfactoren die niet alleen kunnen leiden tot blebvorming, maar ook tot sferoplast -, L-vormen en cysten. Hierbij treden structuurveranderingen op in de membranen en de spiraalvorm van de spirocheet B. brugdorferi s.l.. 

1.3 FLAGELLEN EN AXIAALFIBRIL

Onder de outer sheath in het periplasma liggen de flagellen, waarmee de bacterie zich als een slang kan voortbewegen en waarmee hij zich actief kan verspreiden in het lichaam van zijn gastheer. Door deze kronkelende voortbeweging werden de Borreliae eerst geclassificeerd als protozoae of ééncellige dieren. De aanduiding “cyste” in plaats van “spore” vormt nog een overblijfsel van de oorspronkelijke classificatie. De flagellen van de Borrelia spirocheten lijken op elkaar en bestaan uit vier componenten, namelijk een filament, een haak, een nek en een basaalschijf waarmee ze bevestigd zijn aan de de protoplasmacilinder (Holt, 1978; Barbour en Hayes, 1986).

23

Fig.1.4. Illustratie van de polaire regio van de protoplasmacilinder met de weergave van de flagellen (f) door de celwand (a), door het cytoplasma-membraan (b) en de verankering van de flagellen in het polaire membraan (c). Deze laatste is verbonden door middel van “linkers” (l) met het cytoplasmamembraan (b). De insertieporie (g) ter bevestiging van de axiaalfibril (Figuur 1.5) (Holt, 1978). . Zoals bij andere spirocheten zitten ook de flagellen van B. burgdorferi s.l. subterminaal en bipolair vast in de protoplasmacilinder (Figuur 1.4 met de afbeelding van één polaire regio). De oriëntatie van de bevestigingspunten van de flagellen met betrekking tot de lengte-as van de cel kan tussen de soorten verschillen. In B. burgdorferi s.l., zijn de bevestigingspunten van de flagellen parallel aan de lengte-as. Spirocheten van B. burgdorferi s.l hebben 7 à 11 flagellen; één enkele stam van B. burgdorferi s.l. kan variëren in het aantal flagellen per cel. Alle Borrelia species hebben een antigeen flagellin dat is gebonden aan de periplasmaflagellen in het periplasma. Het flagellinepitoop werd ontdekt met een monoclonaal antilichaam en is onderdeel van de proteïnen die het hoofdbestanddeel vormen van de flagellen (Barbour en Hayes, 1986). Flagellin is geen specifiek antigeen en kan ook andere antilichamen binden die zijn aangemaakt met betrekking tot andere infecties: een zogenaamde kruisreactie (Steere et al., 1994; Steere, 2006). Naast flagellen heeft de spirocheet B. burgdorferi s.l één axiaalfibril welke spiraalvormig gewonden is om de protoplasmacilinder (Figuur 1.1) en hierin verankerd is met de insertie-schijf (ID) (Figuur 1.5) in de insertie-porie (g ) (Figuur 1.4). Indien een cultuur van B. burgdorferi s.l. lang bewaard wordt, worden de spirocheten langwerpiger en de windingen minder stevig. Dit is waarschijnlijk het gevolg van een verandering van het aantal en de functie van de flagellen in de cultuur (Holt, 1978).

Fig. 1.5. Tekening van de structuur van een axiaalfibril waarvan B. burgdorferi s.l er maar één heeft. Van boven naar beneden: insertie-schijf (ID), nek (C), proximale haak (PH), axiaal-fibrilkern (AFC) en axiaal-fibrilschede (AFS) (Holt, 1978). Door het bezit van flagellen en een axiaalfibril heeft de spirocheet de beschikking over een krachtig bewegingsmechanisme dat hem in staat stelt om zich snel en actief te verspreiden in de diverse weefsels van zijn gastheer. Dit kan ertoe leiden dat vele systemen worden aangetast. Zoals eerder vermeld is de ziekte van Lyme dan ook bekend als een multisysteemziekte (Steere et al., 2004). Zoals reeds is vermeld onder paragraaf 1.2.1 kan B. burgdorferi s.l. zich binden aan het plasminogeensysteem van de gastheer. Dit systeem speelt een belangrijke rol in de fibrinolysis. In de aanwezigheid van specifieke activatoren wordt het plasminogeen dat gebonden is aan het oppervlak van de bacteriecel omgezet in plasmine. Het plasmine is een agressief

24 proteolytisch enzym met een brede substraatspecificiteit. Zo kan het plasmine fibrine en fibronectine afbreken, dus de extracellulaire matrix. In vitro bevordert het gebonden plasmine de migratie van B. burgdorferi s.s. door de endotheliale monolagen. In vivo helpt het plasmine de spirocheet B. burgdorferi s.l. met de verspreiding door de huid en organen en vermijdt zodoende dat de bacterie ge-inmobiliseerd wordt door het fibrine (Kurtenbach et al., 2002). Er zijn microscopische waarnemingen gedaan van B. burgdorferi s.l. in diverse cellen van het afweermechanisme, waaronder macrofagen, B-lymfocyten, eosinofielen en basofielen. De spirocheet is zodoende beschermd tegen het immuunsysteem van zijn gastheer en tegen de werking van de meeste antibiotica. Intracellulair zijn de antigenen van B. burgdorferi s.l. niet te traceren door het immuunsysteem en veel antibiotica werken niet intracellulair. (Bradford en Allen, 2006). Door zich te draaien en te kronkelen met behulp van zijn flagellen en axiaalfibril stimuleert de bacterie de cellen tot afgifte van de eigen enzymen waarmee een deel van het membraan oplost, zodat de spirocheet de cel in kan gaan. Dit kan leiden tot de dood van de geïnfecteerde cel of de spirocheet kan er verblijven tot de natuurlijke celdood (apoptosis) en en cellysis volgt. Indien men de levensduur van intracellulaire spirocheten of cysten van B. burgdorferi beschouwt als gelijk aan die van de levensduur van de lichaamscellen, dan komen de spirocheten of cysten regelmatig vrij als gevolg van de natuurlijke celdood en lysis van de bezette cellen. De levensduur van de diverse cellen is afhankelijk van het type cel en variëert van 23 weken tot 6-8 maanden. Als het immuunsysteem de vrijgekomen spirocheten of cysten niet kan uitschakelen en/of er is geen antibioticum aanwezig, dan vormt het intracellulaire verblijf van de spirocheet/cyste een voortdurende bedreiging in de vorm van een recidiverende Lyme-borreliose (Cowden et al., 2004; Bradford en Allen, 2006) (Zie voor cysten hoofdstuk III). 

1.4 PROTOPLASMACILINDER

De protoplasmacilinder wordt van buiten naar binnen omgeven door een spiraalvormige celwand. Deze uit lipoproteïnen bestaande celwand is de peptidoglycanlaag. De volgende wand wordt gevormd door een protoplasmamembraan welke de binnenste wand vormt. Aan de polen echter wordt de binnenste wand gevormd door een derde membraan, het polaire membraan, waaraan de flagellen verankerd zijn (Figuur 1.4), (Holt, 1978). In het protoplasma van B. burgdorferi s.l. bevinden zich achteréénvolgens: een klein lineair chromosoom, 9 circulaire - en 12 lineaire plasmiden. De plasmiden voorzien de bacteriecel van extrachromosomaal DNA. Voor Borrelia bacteriën is het uniek dat zij lineair extrachromosomaal DNA van plasmiden bezitten (Figuur 1.6) (Bergström et al., 2002).

Fig. 1.6. Schematische weergave van het totale genoom van Borrelia burgdorferi sensu stricto (Bergström et al., 2002).

25 De genen van B. burgdorferi s.s. coderen voor meer dan 100 bekende lipoproteïnen; dit is meer dan enig ander organisme. Dankzij het DNA van de plasmiden kunnen genen die coderen voor de antigeen-lipoproteïnen zoals de outer surface proteïnen, al dan niet tot expressie worden gebracht. Met deze variabele expressie kan B. burgdorferi s.l. de immuunstelsels van verschillende gastheren ontwijken (Steere et al, 2004; Steere, 2006). Als antwoord op de onderzoeksvraag: “Welke anatomische eigenschappen bezit de intakte mobiele spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato om te kunnen overleven in zijn gastheren?”, zijn er diverse mogelijkheden naar voren gekomen. In de eerste plaats kunnen de antigenen van de outer sheath worden afgedekt met een glycoproteïnenlaag of mucoïd layer waardoor de antigenen niet te traceren zijn door het afweermechanisme van de gastheer. In de tweede plaats kunnen de outer surface proteïnen, de Osp’s, afwisselend geactiveerd worden door het afwisselend tot expressie laten komen van de Osp-genen. Dit “aan-en-uit” zetten van de antigenen heet antigene fasevariatie. In de derde plaats is er de antigene variatie waarbij er mutaties optreden in het DNA, waardoor er nieuwe genen ontstaan die leiden tot structureel nieuwe antigenen waartegen de gastheer niet direct nieuwe immunoglobulinen paraat heeft. En in de vierde plaats biedt het extra-chromosomaal DNA door de aanwezigheid van plasmiden in het cytoplasma een grote voorraad en verscheidenheid aan genen die coderen voor de antigeen-lipoproteïnen en die al of niet tot expressie kunnen worden gebracht. Bovendien bieden de OspEF-related proteins (Erp’s) B. burgdorferi s.l bescherming tegen het complement van de gastheer en indien de macrofagen het interleukine-10 afgeven veroorzaakt dit een immunosuppressieve werking. Verder kan de spirocheet zich dankzij flagellen en een axiaalfibril actief verspreiden en zich met behulp van decorinbindingsproteïnen (Dbp’s) verschuilen in de weefsels, waaronder de cellen van het immuunsysteem van zijn gastheer. De spirocheet B. burgdorferi s.l. is door bovengenoemde mogelijkheden in staat de immuunstelsels van diverse gastheren te ontwijken en te overleven in de diverse gastheermilieu’s van teken, zoogdieren, vogels en reptielen. Een andere belangrijke overlevingsstrategie voor de spirocheet B. burgdorferi s.l. is de cystevorming die in hoofdstuk III aan de orde komt.

--------------------

26 HOOFDSTUK II DE ZIEKTE VAN LYME 

2.1 INTRODUCTIE

De chronische huidaandoening acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) vormde de eerste klinische beschrijving van de door teken overgebrachte multisysteem infectieziekte die nu bekend staat als “Lyme- Borreliose of “de ziekte van Lyme”. Deze huidaandoening vormt één van de vele aandoeningen die bij Lyme-borreliose kunnen voorkomen en werd al meer dan 100 jaar geleden beschreven in Europa en niet in de Verenigde Staten, zoals de verwijzing naar het stadje Lyme zou doen vermoeden. De eerste melding werd gedaan door de arts Buchwald in 1883 en betrof een chronische huidaandoening die later bekend werd als acrodermatitis chronica atrophicans (ACA). In 1909 presenteerde de Zweedse arts Afzelius aan het Zweeds Dermatologisch Genootschap te Stockholm een patiënt met een zich langzaam uitbreidende huidaandoening die hij “erythema migrans” (EM) noemde. In 1913 beschreef de Weense dermatoloog Lipschütz een soort gelijk geval bij een 29 jarige vrouw bij wie al 7 maanden een enorme huidaandoening aanwezig was die zich uitstrekte vanaf de knieholte, via de rug naar de nek. Dermatoloog Lipschütz was zich er al van bewust dat één of andere ziektekiem via de beet van een teek werd overgebracht op de mens. Hij opperde het idee om microscopisch - en bacteriologisch onderzoek te doen van de darm en de secreta van de speekselklieren van teken. Echter, niemand in Europa gaf hier gehoor aan . Het verband met een tekenbeet werd ook gelegd in 1922 door de Franse neurologen Garin en Bujadoux in de eerste borreliose beschrijving van meningo-polyradiculoneuritis, een zenuwaandoening die betrekking heeft op de hersenvliezen en ruggemergswortels (Stanek et al., 2002). Na het beschikbaar komen van het antibioticum penicilline na de Tweede Wereldoorlog, werd er veel onderzoek gedaan in Europa naar de inmiddels bekend geworden huidaandoeningen erythema migrans en acrodermatitis chronica atrophicans. Spectaculair was het onderzoek van de Duitse arts Götz die in 1954 bij zichzelf en bij drie collega’s een huidbiopsie, afkomstig van een patiënt met ACA, transplanteerde. Rondom de inentingsplaats ontwikkelde zich een erythema-achtige uitslag op de huid van de vrijwilligers. De erythema’s verdwenen na een antibioticumtherapie, wat een bewijs was voor de artsen dat men hier te maken had met een organisme dat gevoelig was voor antibiotica (Stanek et al., 2002). De vroeg Europese beschrijvingen van diverse symptomen van de ziekte van Lyme kwamen opnieuw in de schijnwerpers te staan toen in 1975 de reumatoloog Allen C. Steere melding maakte van een artritis-epidemie bij kinderen in de NoordAmerikaanse stad Lyme in de staat Connecticut. De symptomen traden vooral op in het zomerseizoen en de vroege herfst in bosrijke streken. Een kenmerkend verschijnsel bij de symptomen van artritis in het stadje Lyme was het voorkomen van een huiduitslag ongeveer 4 weken voordat de symptomen van artritis zich openbaarden; dit wekte de veronderstelling dat dit verschijnsel te maken kon hebben met een insektenbeet. De huidaandoening kwam overeen met de Europese beschrijvingen van Afzelius in 1910 en Lipschütz in 1913 van het erythema migrans (EM). Echter, in de Verenigde Staten was men in 1975 van mening dat men te maken had met een geheel nieuwe ziekte die men “Lyme-artritis” noemde. In de jaren hierna volgde men de patiënten met huidaandoeningen intensief en ontdekte dat de meeste na het EM artritis ontwikkelden, maar er waren ook patiënten met neurologische – en/of hartaandoeningen. In feite dus een complex multisysteem aandoening. Dit leidde ertoe dat de naam Lyme-artritis werd veranderd in “Lyme disease” of ziekte van Lyme (Stanek et al., 2002). In 1982 ontdekte de Zwitserse entomoloog Willy Burgdorfer, die werkzaam was voor de Rocky Mountain Laboratories in de Verenigde Staten, spiraalvormige bacteriën, spirocheten, in de ingewanden van de hertenteek Ixodes dammini, ook Ixodes scapularis genoemd. Deze teken komen veel voor in het landelijk gebied rond het stadje Lyme. Met deze ontdekking werd duidelijk dat de de “Lyme-artritis” van dokter Steere in feite een infectieziekte was (Stanek et al., 2002) In 1983 toonde microbioloog en onderzoeker Johnson aan dat de ontdekte spirocheet een nieuw soort van het genus Borrelia betrof en als eerbetoon aan zijn ontdekker gaf hij deze bacterie de naam “Borrelia burgdorferi” (Johnson et al., 1984) 

2.2 BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO EN IXODES VECTOREN

Zoals reeds in hoofdstuk I beschreven wordt de infectieziekte Lyme-borreliose veroorzaakt door drie nauw verwante spiraalvormige bacteriën van het genus Borrelia, welke gezamenlijk worden vermeld onder de naam Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l) (dit is: in brede zin). Het betreft de species Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s), Borrelia garinii en Borrelia afzelii, alle veroorzakers van de ziekte van Lyme. B. burgdorferi s.s. treft men hoofdzakelijk aan in de Verenigde Staten met als vector de teek Ixodes (I) scapularis in het noordoosten en het noorden van het centrale deel van de Verenigde Staten. In het westen van de Verenigde Staten fungeert de teek I. pacificus hoofdzakelijk als vector (Tabel 2.1)( Steere et al., 2004; Steere, 2006).

27 In Europa komen zowel B. burgdorferi s.s., B. garinii en B. afzelii voor, met de teek I. ricinus als vector (Steere, 1994; Steere et al., 2004; Steere 2006). Ieder soort van B. burgdorferi s.l. is vaak specifiek geassocieerd met een bepaald type pathologie. B. burgdorferi s. s. vindt men vaak bij Lyme-artritis van de grote gewrichten, B. afzelii bij huidaandoeningen zoals acrodermatitis chronica atrophicans en B. garinii is vaak geassocieerd met neurologische aandoeningen (Steere 2006). Verder zijn er nog andere soorten behorend tot B. burgdorferi sensu lato gevonden. Dit is bijvoorbeeld B. valaisiana die gevonden wordt in Europa en Azië met als vector I. ricinus. Verder B. japonica die gevonden wordt in Japan met als vector I. persulcatus; B. sinica die gevonden wordt in China met als vector eveneens I. persulcatus. Van de negen recent ontdekte soorten van B. burgdorferi s. l. wordt verondersteld dat ze gering - of niet pathogeen zijn (Tabel 2.1). Er is nog weinig bekend over de kenmerken van Lyme-borreliose in Azië (Steere et al., 2004; Steere, 2006).

Nine minimally pathogenic or nonpathogenic species

Tabel 2.1. De genospecies van Borrelia burgdorferi sensu lato en de tekenvectoren en locaties (Steere et al., 2004; Steere, 2006). 

2.3 DE INFECTIEZIEKTE LYME-BORRELIOSE

Heeft de mens een met B. burgdorferi s.l. besmette tekenbeet opgelopen, dan kan de ziekte van Lyme zich in drie stadia ontwikkelen, maar dit hoeft echter niet altijd het geval te zijn. 

2.3.1 Stadium 1: vroege gelokaliseerde Lyme-borreliose

Het eerste stadium betreft de lokale huidinfecties erythema migrans (EM) en lymphocytoma. Deze laatste is een blauwrode verkleuring die slechts in 2-3% van de Lyme-borreliose gevallen voorkomt. Het erythema migrans, ook wel Bull’s eye genoemd, verschijnt op de plaats van de tekenbeet en is het meest voorkomende ziekteverschijnsel bij Lyme-borreliose. en gaat vaak gepaard met griepachtige verschijnselen. Het EM is een rode zich centrifugaal uitbreidende verkleuring van de huid met een diameter die kan variëren van 5 - tot 60 centimeter. Het EM gaat vaak gepaard met griepachtige verschijnselen. Echter, in 50% van de gevallen is het EM afwezig en heeft de spirocheet B. bugdorferi sensu lato kans gezien om zich direct te verspreiden in het lichaam van zijn humane gastheer. De spirocheet kan zich namelijk doormiddel van een speciaal bewegingsmechanisme, bestaande uit een axiaal fibril en endoflagellen (hoofdstuk I), actief voortbewegen en kan zich zodoende snel verwijderen van de plaats van de tekenbeet om zich diep in de weefsels vestigen. De ziekte van Lyme kan zich dan later openbaren nadat de spirocheet zich heeft verspreid in het lichaam van de gastheer. Dit betreft het tweede stadium van de ziekte (Steere, 1994; Stanek et al., 2002). 

2.3.2 Stadium 2: vroege gedissemineerde Lyme-borreliose

Heeft verspreiding in het lichaam van de gastheer plaatsgevonden dan spreekt men van het tweede stadium of de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose. Hierbij kunnen verschillende organen worden aangetast. De aandoeningen die zich hierbij kunnen manifesteren zijn secundaire dermatosen (huidaandoeningen) zoals multiple erythema migrans. Neuropathieën (zenuwaandoeningen) zoals meningo-polyradiculoneuritis een zenuwaandoening waarbij de meningen (hersenvliezen) en de ruggemergswortels zijn betrokken. Radiculoneuritis is een aandoening van het perifere zenuwstelsel

28 uitgaande van de ruggemergswortels (radix is wortel). Meningo-polyradiculoneuritis wordt ook wel Bannwarth-syndroom genoemd. Vooral bij kinderen treft men vaak facialis paresis (aangezichtsverlamming) aan tengevolge van een onsteking van de 7de hersenzenuw. Verder kunnen in dit tweede stadium de gewrichten worden aangetast, Lyme-artritis, waarbij het in ongeveer de helft van de gevallen artritis (gewrichtsontsteking) van de knie betreft, gevolgd door de gewrichten van enkel, pols en elleboog. In meer zeldzame gevallen betreft het de kleine gewrichten. Ook aandoeningen van andere organen zoals lever, ogen, lucht- en urinewegen kunnen voorkomen. Bekend zijn verder de cardiopathieën (hartaandoeningen) zoals Lyme-carditis, ritmestoornissen en heartblock (het te laat optreden of wegblijven van een kamersamentrekking). Acute hartstoornissen kunnen zich voordoen tegelijkertijd met het EM of enkele weken later. Lyme-carditis gaat vaak vanzelf over Aangezien vele organen kunnen worden aangetast, is de ziekte van Lyme in feite een multisysteem ziekte (Steere, 1994; Steere, 2001; Stanek et al., 2002). 

2.3.3 Stadium 3: Late of chronische Lyme-borreliose

Tot de late of chronische Lyme-borreliose behoren acrodermatitis chronica atrophicans (ACA), de chronische Lymeartritis, de chronische Lyme-myocarditis en de Lyme-encefalopathie of chronische Lyme-neuroborreliose. ACA is een chronische persisterende huidinfectie die ook wel de ziekte van Pick-Herxheimer wordt genoemd. Deze chronische huidaandoening wordt gekenmerkt door een bruinrood verkleurde sterk atrofische - en droge huid met fribreuze noduli (bindweefselachtige knobbeltjes) die zich voornamelijk bevinden op de strekzijden van armen en benen en de handruggen. De temperatuur is daar 34ºC, de ideale groeitemperatuur voor de spirocheet B. burgdorferi s.l., zoals in vitro culturen laten zien (hoofdstuk III). Het komt voor dat na een latente infectie van tientalle jaren ACA als eerste verschijnsel van Lyme-borreliose manifest wordt (Steere, 1994; Gray, 2002, Steere et al., 2004; Steere 2006). De chronische Lyme artritis is een recidiverende of persisterende infectie van één of meerdere gewrichten, meestal van de knie (Steere, 1994; Stanek et al., 2002). De chronische Lyme-myocarditis is een blijvende ontsteking van de hartspier ten gevolge van een Lyme-borreliose infectie. Er wordt weinig melding gemaakt van deze aandoening (Steere, 2001; Stanek et al., 2002). Lyme-encefalopathie is een vorm van de late of chronische Lyme-neuroborreliose. Deze hersenaandoening kan maanden, jaren, of zelfs decades na de tekenbeet manifest worden. Enkele verschijnselen kunnen bijvoorbeeld zijn: ataxie (coördinatiestoornissen voornamelijk bij het lopen), blaasfunctiestoornissen, geheugen- en concentratiestoornissen, slaapstoornissen, evenwichts-, gehoor- en gezichtsstoornissen.Verder kunnen verlammingen van de ledematen voorkomen. Bij de chronische Lyme-neuroborreliose is de laatste tijd veel onderzoek verricht waarbij analogie is gevonden met de geslachtsziekte neurosyfilis (hoofdstuk VI) (Miklossy, 2008). Evenals bij neurosyfilis onderscheidt men een meningo-vasculaire vorm en een parenchymateuse vorm van neuroborreliose (hoofdstuk VI). De meningo-vasculaire Lyme-borreliosis wordt net als bij de neurosyfilis gekenmerkt door een progressief herseninfarct met uiterlijke kenmerken van een beroerte. Cerebrale vasculitis met multiple stenoses van de grote hersenarteriën en onregelmatigheden van de wanden van de kleine bloedvaten veroorzaken multiple herseninfarcten (Miklossy, 2008). De parenchymateuse neuroborreliose, het derde stadium van Lyme-neuroborreliose, gaat net als bij parenchymateuse neurosyfilis gepaard met chronische meningo-encefalitis. Deze vorm van neuroborreliose wordt veroorzaakt door een directe invasie van het hersenweefsel door de spirocheet B. burgdorferi s.l.. evenals T. pallidum bij parenchymateuse neurosyfilis. Gevallen van dementie, waarbij Borrelia spirocheten zijn gevonden in de hersenen of gekweekt uit hersenweefsel, zijn inmiddels gemeld geworden (Miklossy, 2008). 

2.4 CO-INFECTIES

Tegelijkertijd met de spirocheet B. burgdorferi s.l. kunnen ook andere ziekteverwekkers door de Ixodes teek worden overgebracht, waardoor naast de infectie Lyme-borreliose tevens co-infecties kunnen voorkomen. I. scapularis in de Verenigde Staten en I. ricinus in Europa kunnen vectoren zijn van Babesia microtti, een erythrocyten-parasiet en veroorzaker van Babesiose of van Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum, een granulocyten-bacterie en veroorzaker van de humane granulocyten ehrlichiose. Ook virussen kunnen worden overgebracht samen met B. burgdorferi s.l. (Steere et al., 2004). De co-infecties worden verder behandeld in hoofdstuk V bij de richtlijnen van de IDSA en ILADS. 

2.5 DIAGNOSTIEK VAN LYME-BORRELIOSE

De basis voor de diagnose van de humane Lyme-borreliose wordt gevormd door de klinische symptomen. Een gedegen kennis van de klinische kenmerken is hierbij essentiëel. De typische huidaandoening erythema migrans in het eerste stadium van de infectie is zo kenmerkend dat op basis daarvan de diagnose Lyme-borreliose gesteld kan worden. Bij andere

29 aandoeningen van Lyme-borreliose kunnen laboratoriumtesten behulpzaam zijn bij de diagnosestelling (Stanek et al., 2002). De volgende diagnostische testen kunnen uitgevoerd worden: Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assay (ELISA), Western Blot, Quantitative- Rapid- Identification of Borrelia burgdorferi (Q-RiBb) test, Polymerase Chain Reactie (PCR) en Cultuur. De antigenen van B. burgdorferi s.l., waartegen de patiënt immunoglobulinen IgM en/of IgG heeft gevormd, bevinden zich op het hele oppervlak van de outer-sheath. . Dit zijn in de eerste plaats de outer-surface proteïnen (Osp’s): OspA, OspB, ……. tot en met OspG. Andere bekende antigenen zijn flagellin, variabele major proteïnen (Vmp’s) en het (vmp)-like sequence E (VlsE) (Bergström et al., 2002). De daarbij behorende antilichamen duidt men aan met de letter "p" van proteïne en een cijfer dat de molecuulmassa (MM) aangeeft in kiloDalton (kD). Het antilichaam van OspA is p31, het antilichaam van OspB is p34, het antilichaam van OspC is p23 en het antilichaam van flagellin is p41 (Figuur 2.2). Flagellin is geen specifiek antigeen en kan ook andere antilichamen binden die zijn aangemaakt met betrekking tot andere infecties: een zogenaamde kruisreactie (Steere et al., 1994; Steere, 2006; Borreliose.nl). De eerste antilichamen die in het bloed verschijnen zijn de immunoglobulinen (Ig)M, gevolgd door IgG. Gedurende de eerste twee weken van de infectie zijn er nog geen antilichamen IgM in het bloed te traceren. Een positieve IgM response treft men gewoonlijk aan na 2 tot 4 weken vanaf het begin van de infectie en na ongeveer zes weken verschijnen de immunoglobulinen IgG in het bloed en kunnen met de ELISA of Western blot worden aangetoond. IgG en ook IgM kunnen jaren aanwezig blijven in het bloed, zoals ook de IgG respons op het VlsE antigeen (Steere et al., 2004). 

2.5.1 ELISA

De ELISA is de eerste test die uitgevoerd kan worden bij Lyme-borreliose klachten en gaat als volgt: Op een microtiterplaat fixeert men een suspensie van antigenen van B. burgdorferi s.l. en vervolgens voegt men aan deze suspensie het patiënteserum toe. Indien er immunoglobulinen IgM en/of IgG in het serum tegen de antigenen van B. burgdorferi s.l. aanwezig zijn, dan zullen zich immunocomplexen vormen doordat de immunoglobulinen zich hechten aan de antigenen van Borrelia burgdorferi s.l.. Vervolgens wordt het antigeen dat zonder antilichaam is gebleven van de plaat gespoeld. Aan de overgebleven antilichaamantigeen complexen wordt een tweede antilichaam, waaraan een enzym als marker-molecuul is gekoppeld, toegevoegd. Dit tweede antilichaam of anti-antilichaam is gericht tegen het eerste antilichaam of immunoglobuline en zal hiermee reageren. De enzymen die aan één kant gekoppeld zijn aan het tweede antilichaam, zetten vervolgens met het actieve deel een substraat om, waarvan men de ontstane kleurintensiteit kan meten. De kleurintensiteit is een maat voor de aanwezige antilichamen gericht tegen de antigenen van B. burgdorfer s.l. in het patiëntenserum (Alberts et al., 1994; Stryer, 1995; Borreliose.nl). Bij de ELISA kunnen zich analyse-problemen voordoen die betrekking hebben op de sensitiviteit en de specificiteit. De sensitiviteit is het percentage juist geteste Lyme-patiënten en de specificiteit is het percentage juiste geteste gezonde personen. De Europian Union Concerted Action on Lyme Borreliosis (EUCALB), verlangt momenteel een sensitiviteit van 90% en een specificiteit van 95% . Voor de commerciële kits werd gemiddeld een IgG sensitiviteit van ongeveer 60% gevonden en een IgG specificiteit voor niet-Lymepatiënten van 91% (Borreliose.nl). 

2.5.2 WESTERN BLOT

Indien de ELISA-test positief is, kan er een Western Blot test uitgevoerd worden. Men voert eerst een sodium dodecyl sulfaat (SDS) - poly-acrylamide gel electroforese (PAGE) uit met een suspensie van B. burgdorferi s.l. De antigeen-proteïnen van B. burgdorferi s.l. vormen hierbij een complex met de negatief geladen SDS moleculen en migreren als een negatief SDS-proteïnencomplex door een poreuze gel van poly-acrylamide in de richting van de positieve pool. De migratiesnelheid is afhankelijk van het moleculairgewicht van de verschillende antigenen. Na de electroforese liggen de verschillende antigenen van B. burgdorferi s.l. keurig op een rij. Vervolgens worden de antigenen overgebracht op een blad van nitrocellulose en gefixeerd. Dit overbrengen van de antigeen-proteïnen op het nitrocellulosepapier wordt “blotting” genoemd. Hierna wordt het nitrocelluloseblad in contact gebracht met het verdunde patiëntenserum, waarin zich de antilichamen IgM en/of IgG tegen de antigenen van B. burgdorferi s.l. kunnen bevinden. Deze antilichamen hechten zich aan de antigenen op het nitrocelluloseblad en de niet gebonden antigenen wast men weg. Hierna wordt een secondair antilichaam waaraan een enzym is gebonden, toegevoegd, zoals bij de ELISA-test. Het vrije deel van het aanwezige enzym zet vervolgens een toegevoegd substraat om, waardoor de antigeen-antilichamen complexen als gekleurde banden zichtbaar worden (Figuur 2.1). Door gelijkertijd een monster met bekende monoklonale antilichamen mee te laten lopen kunnen de banden geïdentificeerd worden. De bovenbeschreven proteïnen-detectiemethode wordt Western blotting of immunoblotting genoemd ( Alberts et al., 1994; Stryer, 1995; Borreliose.nl).

30

Fig. 2.1. Voorbeeld van een Western Blot (Borreliose.nl). Om een Western Blot test als positief te beoordelen, moeten volgens de criteria van Centres for Disease Control (CDC) bij IgM minimaal twee banden van de drie en bij IgG minimaal vijf specifieke banden van de tien positief zijn (Steere, 2006). Er zijn veel oorzaken die een negatief testresultaat van de ELISA en Western Blot te zien geven, ook al heeft de patiënt de ziekte van Lyme. In de discussie zal hier nader aandacht aangegeven worden. 

2.5.3 Q-RiBb-Test

De Quantitative-Rapid-Indentification of Borrelia burgdorferi (Q-RiBb)-Test is een test die gericht is tegen de antigenen van B. burgdoreferi s.l. en dient om de spirocheet op te sporen in plaats van de antilichamen van de patiënt. De test is geheel onafhankelijk van de antilichamenproductie; dit in tegenstelling tot ELISA en Western blot, waarbij het gaat om de detectie van de immunoglobulinen IgM en IgG tegen B. burgdorefri s.l. De oorspronkelijke microscopische immunofluorescententie assay (IFA) werd door de arts Whitaker van het Bowen Research Instituut verbeterd en kan binnen één uur worden uitgevoerd. Met fluorescerende gemaakte specifieke antilichamen die gericht zijn tegen de antigenen op het oppervlak van de outer sheath van de spirocheet, de outer surface proteïnen (Osp’s), kan men met fluorescentiemicroscopie de specifieke helix morfologie van de spirocheet zichtbaar maken. Door de fluorescerende antilichaam-antigeen complexen aan het oppervlak van de bacterie licht de hele spirocheet op in het donkere veld van de microscoop (Figuur 2.2).

Fig. 2.2. Fluorescentiemicroscopie van spirocheten B. burgdorferi s.l. (Bigaignon et al., 1996).

31 Het tweede deel van de Q-RiBb-test bestaat uit de titratie van een verdunningsreeks, die gaat van 1:2 tot de hoogste verdunning van 1:128. Hiermee kan men het aantal bacteriën van B. burgdorferi s.l. in het bloed berekenen; het kwantitatieve aspect van de test (Whitaker, 2004). Bacteriologe en onderzoekster Lida Mattman, genomineerd voor een Nobelprijs in 1997, onderzocht in het kader van de goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) de Q-RiBb-test. Hiervoor werden 316 bloedmonsters afgenomen van patiënten met de ziekte van Lyme. Hieruit kweekte men 316 culturen van B. burgdorferi s.l. en tevens werden er met dezelfde bloedmonsters 316 positieve Q-RiBb-testen gevonden; een 100% correlatie (Whitaker, 2004). 

2.5.4 POLYMERASE CHAIN REACTIE

De Polymerase Chain Reactie (PCR) is een in vitro techniek die dient ter amplificatie van specifieke nucleotidensequenties van het deoxy-ribonucleïc acid (DNA). In het geval van Lyme-borreliose kan men met deze techniek het soort spirocheet B. burgdorferi sensu lato identificeren. In het kader van dit verslag voert het te ver om in detail op de PCR in te gaan. Kort samengevat: Het te repliceren DNA van de bacterie wordt samengebracht met voldoende oligonucleotiden, de bouwstenen van het DNA, voldoende primer om de replicatie te starten en voldoende polymerase-enzym om de reactie te katalyseren. Voordat de DNA synthese kan beginnen, wordt eerst het DNA van B. burgdorferi s.l. verhit om de twee complementaire DNA strengen van de dubbele helix van elkaar te scheiden. Deze gescheiden strengen worden vervolgens gerepliceerd, zodat er na de eerste replicatieronde vier strengen aanwezig zijn, die in de tweede replicatiecyclus ook weer worden vermenigvuldigd. Bij iedere replicatiecyclus vindt er dus een verdubbeling plaats van de hoeveelheid DNA. Met de PCR kan al een zeer klein aantal bacteriën worden opgespoord. De PCR is een soortspecifieke test en geeft daarmee een identificatie van de veroorzaker van Lyme-borreliose: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii of B. garinii (Steere, 2006; Stryer, 1995; Borreliose.nl). 

2.5.5 CULTUUR

Het maken van een cultuur van B. burgdorferi s.l. is te kostbaar om routinematig uit te voeren, maar het levert wel een groot aantal cellen op dat de indentificatie van de bacterie door de PCR kan vergemakkelijken (Kahl et al., 2002). Spirocheten zijn moeilijk te kweken en vereisen speciale verrijkte cultuurmedia vanwege de geringe metabole activiteit van B. burgdorferi s.l.. (In hoofdstuk III zal dit verder ter sprake komen). Verder heeft de spirocheet een lange generatietijd van 12 tot 24 uur, waardoor de kweekresultaten pas na weken beschikbaar zijn na het afnemen van het patiëntenmateriaal. De lange kweektijd is niet in het voordeel van de patiënt (Stanek et al., 2002; Kahl et al., 2002).

-------------------

32 HOOFDSTUK III CYSTEVORMING DOOR BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO 

3.1 INTRODUCTIE

Het vermogen van de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato om te overleven en te groeien in diverse gastheren, zoals in de teek van het geslacht Ixodes en in verscheidene zoogdieren waaronder de mens, laat duidelijk het aanpassingsvermogen zien van deze bacterie. De bacterie komt voor in drie verschijningsvormen: de intakte mobiele spirocheet, de cyste (spreek uit “kieste”) en de cellwand deficiënte bacterie. De cyste ontstaat doordat de buitenste membraan zich onder ongunstige omstandigheden om de spirocheet heen legt. De spirocheet is zo veilig opgeborgen in zijn “cocon” de cyste en zodoende beschermd tegen stressfactoren. Oorspronkelijk werden alle afwijkende verschijningsvormen van de normale spirocheet “cysten” genoemd en tegenwoordig ook “round bodies” (RBs). Hiertoe behoren blebs, afgestoten blebs of gemmae, granulen, sferoplast-, Lvormen en cysten; allemaal cysteuze vormen (Holt, 1978; Barbour en Hayes 1986). Ook worden de sferoplast-, L-vormen apart tot de celwanddeficiënte (CDW) bacteriën gerekend (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971; Preac-Mursic et al., 1996; Onwuamaegbu et al., 2005; Elliot et al., 2007). Het feit dat er ondanks een “adequate” antibioticumtherapie veel recidieven na de behandeling van Lyme-borreliose ontstaan, was de aanzet voor verscheidene onderzoekers om het gedrag van Borrelia burgdorferi s.l. onder invloed van diverse stressfactoren nader te onderzoeken. Hierbij bouwde men voort op de bevindingen die destijds door Holt (1978) en Barbour en Hayes (1986) al gesignaleerd waren naar aanleiding van het uitéénrafelen van de anatomische structuren van spirocheten. Onder invloed van hypotonische oplossingen, bevriezen en weer ontdooien, en penicilline veranderde de spirocheet van vorm, er trad blebvorming op en er ontstonden sferische structuren (Holt, 1978; Barbour en Hayes 1986). In de vervolgonderzoeken werd in vitro gekeken naar de invloed van de stressfactoren ‘serum-starvation’ (Brorson en Brorson, 1997; Alban et al., 2000; Murgia et al., 2002), veranderingen in zuurgraad, zuurstof, temperatuur en osmose (Murgia en Cinco, 2004) en antibioticatoediening (Kersten et al., 1995; Preac Mursic et al; 1996; Murgia et al., 2002; Brorson en Brorson, 1999; Brorson en Brorson, 2001; Brorson en Brorson, 2002; Brorson en Brorson, 2004; Brorson en Brorson, 2005; Brorson en Brorson, 2007; Brorson et al., 2009: Yang et al., 2009). In dit hoofdstuk komt de volgende onderzoeksvraag aan de orde: Welke invloed hebben de aan- of afwezigheid van diverse stressfactoren op de verschijningsvormen van de spirocheet Borrelia burgdorferi sens lato? In de samenvatting van dit hoofdstuk zal verder aandacht worden geschonken aan de beantwoording van deze onderzoeksvraag. Dit hoofdstuk biedt een literatuuroverzicht van het onderzoek in vitro met betrekking tot cysteuze vormen van de spirocheet B. burgdorferi s.l., dat tot op heden is verricht. 

3.2 CYSTEVORMING ONDER INVLOED VAN SERUM-STARVATION

De bacterie B. burgdorferi s.l. heeft een genoom van 1000 kilobasenparen ( kbp) dat slechts weinig biosynthetische mogelijkheden biedt. Door het gebrek aan vele biosynthetische pathways vereist de groei van de spirocheet in vitro een complex medium dat onder andere verrijkt is met dierenserum. Een veel gebruikt cultuurmedium voor B. burgdorferi s.l is het Barbour-Stoener-Kelly (BSK II) medium dat 6% konijnenserum bevat en andere toegevoegde metabolieten zoals bovine serumalbumine, Na-citraat, glucose, Na-pyruvate, Na-bicarbonaat, gistextract (B-complex) en N-acetylglucosamine dat een bouwsteen is voor het peptidoglycanlaag van de celwand van de Borrelia spirocheet ( Barbour, 1984) . Het konijnenserum voorziet de bacteriën van een benodigde vetzuurbron. Dit is noodzakelijk aangezien de bacteriën niet zelf vetzuren kunnen maken (Canale - Parola, 1977; Brorson en Brorson, 1997; Alban et al., 2000). Het BSK II medium bevat verder het cultuurmedium CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) 1066 dat groeifactoren bevat zoals aminozuren en vitaminen (Barbour, 1984; Kurtti et al., 1987). Serum-starvation is een toestand waarbij gebrek is aan essentiële voedingsstoffen voor de spirocheet B. burgdorferi s.l.. Deze toestand kan gecreëerd worden door een cultuurmedium te gebruiken zonder konijnenserum. In vivo komt deze toestand van serum-starvation voor in de liquor cerebrospinalis.(Alban et al., 2000). In een onderzoek door Brorson en Brorson (1997) naar het verschijnsel cystevorming door B. burgdorferi s.l. onder invloed van serum-starvation werd een cultuurmedium gebruikt dat verrijkt was met 6% konijnenserum. Dit medium wordt in dit onderzoek “BSK-H(a)” genoemd en het cultuurmedium zonder konijnenserum “BSK-H(u)”. Na een incubatie van 1 maand met het verrijkte cultuurmedium BSK-H(a) waren er enkele cysten zichtbaar . Donkerveldmicroscopie toonde de cysten als ronde structuren (s) en sommige van hen vertoonden onregelmatige bewegingen alsof iets binnen in de cyste bewoog. Interferentiemicroscopie liet opgerolde bacteriën zien en granula binnen in de cysten. Indien de cultuur op het verrijkte medium jonger was dan 1 maand waren er alleen mobiele spirocheten te zien (Brorson en Brorson, 1997). Cysten ontstonden al na 1 week incubatie met het BSK-H(u) medium (Figuur 3.1).

33 De cysten vertoonden dikwijls onregelmatige vormen, waarschijnlijk door kernen en spirocheten in de cysten (Figuur 3.2).

Fig.3.2. Interferentie-contrastmicroscopie toont een BSK-H(u) cultuur na 3 weken. De cyste(s) heeft een onregelmatige vorm, waarschijnlijk door een interne kern en een interne spirocheet. Oorspronkelijke vergroting 1200 x, bar = 2 μm (Brorson en Brorson, 1997).

Fig. 3.1. Donkerveldmicroscopie toont een BSK-H(u) cultuur na 1-2 weken met cysten (s), blebvorming (b) (rechtsboven) en mobiele spirocheten. Oorspronkelijke vergroting 400 x, bar = 2 μm (Brorson en Brorson, 1997). Met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd het cultuurmedium BSK-H(u) na 3 weken onderzocht. Er waren zowel mobiele spirocheten als cysten aanwezig. Ultrastructurele beelden lieten opgerolde spirocheten zien binnenin de cysten en de cysten waren omgeven door een uit twee lagen bestaande membraan (Figuur 3.3). Behalve spirocheten waren er in de cysten ook flagellen en macromoleculaire substanties aanwezig. De spirocheten in de cysten waren niet omgeven door een uit drie lamellen bestaande membraan, zoals het geval is bij normale mobiele spirocheten buiten de cysten. Het leek erop dat zij een membraanlaag hadden verloren. In sommige cysten waren dwarsdelingen van de bacteriën waar te nemen (Figuur 3.4). Verscheidene cysten bevatten ook meer dan één spirocheet. In sommige cysten waren door een membraan omgeven kernen te zien in de nabijheid van min of meer goed geconserveerde spirocheten (Figuren 3.3 en 3.4). Ook werden delingen van cysten aangetoond (Figuur 3.5).

34

Fig. 3.3 (l).en 3.4 (r). Transmissie-elektronenmicroscopie toont links een cyste met binnenin een spirocheet met een dunne buitenste membraan (i); dit in vergelijking met de buitenste membraan van de spirocheet (e). In de cyste is een structuur te zien omgeven door een membraam (v); waarschijnlijk is dit een zich ontwikkelende kern. Oorspronkelikjke vergroting 15.000 x, bar = 200 nm. Rechts een cyste met een dwarsdeling (f). Verder is een kern met electronendicht materiaal te zien, omgeven door een membraan (v). Oorspronkelijke vergroting 15.000 x, bar = 200 nm (Brorson en Brorson, 1997). Behalve cysten waren er ook normale mobiele spirocheten te zien, waarvan sommige zich aan het delen waren en er waren ook beginnende cysten bestaande uit 4 mini-cysten met een spirocheet in iedere mini-cyste (Figuur 3.6).

Fig. 3.5 (l) en 3.6 (r). Transmissie-elektronenmicroscopie toont links een zich delende cyste (d).Oorspronkelijke vergroting 12.000 x, bar = 200 nm. Rechts een normale dwarsdeling (n) buiten de cyste. Een beginnende cyste met vier spirocheten (q) is zichtbaar, waarschijnlijk als gevolg van herhaalde delingen van spirocheten, waarbij de twee lagen van de outer-sheath zijn blijven zitten. Ook is een parelsnoer zichtbaar (s). Oorspronkelijke vergroting 20.000 x, bar = 200 nm (Brorson en Brorson, 1997). Verder leek het erop dat verscheidene spirocheten in dezelfde cyste hun inhoud samenbrengen tot een kern die kan groeien en de hele cyste kan opvullen (Figuren 3.1, 3.4, 3.5, 3.6). Ook was te zien dat opgevulde cysten zich kunnen delen (Figuur 3.5). De afwezigheid van pH-veranderingen in het cultuurmedium BSK-H(u) duidde op een lage biologische activiteit, wat erop wees dat de cysten in een soort sluimer -, verdovingstoestand verkeerden (Brorson en Brorson, 1997). Na 6 weken waren alle normale mobiele spirocheten verdwenen en waren er alleen cysten over. Om na te gaan in hoeverre de in het BSK-H(u) medium gevormde cysten levensvatbaar waren, werden deze cysten na 3 maanden overgebracht naar het verrijkte cultuurmedium BSK-H(a). Na ongeveer 6 weken kwamen uit de cysten normale mobiele spirocheten (Figuur 3.7) (Brorson en Brorson, 1997).

35

Fig. 3.7. Interferentie-contrastmicroscopie toont normale spirocheten uit cysten na 6 weken incubatie in een BSK-H(a) medium. De cysten zijn gevormd in een BSK-H(u) medium (Brorson en Brorson, 1997). Alban et al. (2000) onderzochten eveneens de veranderingen van B. burgdorferi s.l. als reactie op de stressfactor serumstarvation. Daarbij werd tevens na gegaan in hoeverre de gevormde cysten nog zouden leven en mogelijkerwijs tot een andere eiwitsynthese waren overgegaan (Alban et al., 2000). Om de cystevorming goed te kunnen definiëren werd een Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium gebruikt, dat geen konijnenserum (dus geen vetzuren) en geen bovine-serum albumine (BSA) bevat maar wel glucose, vitaminen en 20 aminozuren. Binnen 24 uur waren de cellen van B. burgdorferi s.l. geheel onbeweeglijk geworden en 30 tot 40 % van de bacteriën was begonnen aan cystevorming. Na een incubatie van 48 uur in een RPMI medium hadden ongeveer 90 % van de vegetatieve cellen cysten gevormd. Een cyste bevatte een intacte, opgerolde onbeweeglijke spirocheet binnen in een membraan (Figuur 3.8). Het is onduidelijk of dit membraan deel uitmaakt van de oorspronkelijke celwand van de vegetatieve cel of dat het membraan gemaakt is tijdens de cystevorming (Alban et al., 2000). Cysten van B. burgdorferi s.l. werden met de elektronenmicroscoop bekeken en vergeleken met de vegetatieve cellen. De vorm van de cysten was ruwweg sferisch, dikwijls met het einde van de spiraalvormige spirocheet er nog uitstekend. Verder werden soms delen van de celwand gezien die vanaf een pool van de cel wegdreven (Figuur 3.8 C).

Fig. 3.8. Transmissie-elektronen microscopische beelden van de cystevorming door B. burgdorferi onder invloed van serum-starvation als stressfactor. Fig.3.8A. Typische vegetatieve spirocheten in BSKII of RPMI+S. Fig. 3.8B en 3.8C. Cystevorming na 48 uur incubatie in RPMI. De pijlen wijzen op parelvorming van het membraan (‘beading’) Bars, 2μm (A, B); 1 μm (C) ( Alban et al., 2000). Uit bovenstaande waarnemingen van Alban et al. (2000) is gebleken dat cystevorming een actieve cellulaire respons is op de stressfactor serum-starvation. In dit onderzoek van Alban et al. (2000) werd ook het antibioticum tetracycline (150 microgram/ml) toegevoegd aan normale mobiele spirocheten. Tetracycline heeft een remmende werking op de eiwit-synthese van bacteriën. In dit onderzoek werd tevens vastgesteld dat tetracycline de cystevorming verhinderde. Volgens Alban et al. (2000) duidt dit erop dat cystevorming niet zonder eiwitsynthese kan en dat cystes niet alleen maar degeneratieve vormen zijn zoals eerst verondersteld was (Alban et al., 2000). Levensvatbaarheid van de cysten Onderzoek naar de levensvatbaarheid van de cysten die na 48 uur incubatie in RPMI medium aanwezig waren, toonde aan dat de cysten zich binnen 10 seconden openden na toevoeging van konijnenserum of BSK. Uit de cysten kwamen onbeweeglijke maar intakte spirocheten (Figuur. 3.9). De spirocheten herkregen hun beweeglijkheid na 12 tot 15 uur na het uitkomen van de cysten (Alban et al., 2000).

36

Fig.3.9. Morfologie van B. burgdorferi in een 48 uur’s serum-starvation cultuur. Fig.3.9A.vóór toevoeging van konijnenserum en fig. 3.9B en fig. 3.9C na toevoeging van koijnenserum. Foto B is genomen < één minuut na toevoeging van konijnenserum. Foto’s A en B zijn genomen met de fase-contrastmicroscoop. Foto C is genomen met de transmissieelectronen microscoop en toont een pas te voorschijn gekomen spirocheet uit een cyste. Pijl (c) toont een lege cyste en pijl (om) een buitenste membraan. Bars, 5 μM (A,B): 2 μM (C) (Alban et al., 2000).

Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed stressfactor op cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Serum-starvation

BSK-H(u)

cystenvorming na 1week tot 6 weken

reconversie na 6 weken voor cysten van 3 mnd, na transfer in BSK-H

Brorson en Brorson (1997)

Serum-starvation

RPMI

Cystenvorming; na 48 uur 90% cysten

reconversie < 10 sec Alban et al. (2000) voor RPMI-cysten van 48 uur, na transfer in BSK-H medium

Serum-starvation

BSK zonder serum

sterfte en cystenvorming na 3-4 dagen

n.v.t

Murgia et al. (2002)

Tabel 3.1. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de stressfactor serum-starvation bij B. burgdorferi s.l.

Verandering van de eiwitsynthese Behalve het verlies aan motiliteit en cystevorming werd als reactie op serum-starvation door de spirocheet een aantal andere eiwitten gevormd. Dit zijn specifieke serum-starvation proteïnen (SSP’s) die niet worden aangemaakt bij de intakte mobiele spirocheten. Tweedimensionale fluorogrammen van de serum-starvationcellen toonden de synthese aan van meer dan twintig andere eiwitten, waaronder het outer-surface proteïne (Osp)A antigeen. Andere antigenen van de serum-starvation cellen zijn Flagellin(Fla), OspC en GroEL, een heat shock proteïne (HSP). Van genoemde antigenen bleek gedurende de serumstarvation alleen OspA geactiveerd te zijn. Zonder serum nam de synthese van OspA tweevoudig toe indien men de synthese vergeleek met cellen in RPMI+S medium. Een vermeerdering van de OspA-synthese bij serum-starvation stemde overeen met de bevinding dat OspA het belangrijkste eiwit vormt van de outer-sheath van de bacterie indien deze zich bevindt in de ingewanden van nuchtere teken (Alban et al., 2000; Steere, 2006). Een ander belangrijk antigeen-proteïne op het oppervlak van de outer-sheath van B. burgdorferi s.l., is OspC dat gevonden wordt als de bacterie zich bevindt in een teek tijdens de bloedmaaltijd en waarbij er dus geen sprake is van serum-starvation (Zie ook hoofdstuk II) (Alban et al., 2000; Steere et al., 2004). Een onderzoek van Murgia en Cinco (2004) naar de eiwitsynthese van beweeglijke spirocheten B. garinii en cystevormen die waren verkregen onder hypo-osmotische omstandigheden met gedestilleerd water en toevoeging van waterstofperoxide (paragraaf 3.3), toonde voor zowel de vegetatieve- als de cystevormen het inbouwen aan van radio-actieve aminozuurprecursors. Uit het inbouwen van radio-actieve aminozuren blijkt dat ook cysten nog steeds in staat zijn tot een geringe metabole activiteit, wat een teken van leven is (Murgia en Cinco, 2004).  3.3 CYSTEVORMING ONDER INVLOED VAN OXIDATIEVE-, PH- TEMPERATUUR- EN HYPOTONE STRESS In een studie van Murgia en Cinco (2004) werd de snelheid onderzocht waarmee cysten worden gevormd onder invloed van de stressfactoren oxidatieve stress, pH-variaties en temperatuurverhoging. Tevens werden de overgang van de

37 cystevorm in de vegatieve vorm en enige aspecten van het metabolisme onderzocht. De bacteriestam die in dit onderzoek werd gebruikt was Borrelia garinii die geïsosleerd was uit de teek Ixodes ricinus.De spirocheten werden gekweekt bij 34 ºC in een BSK-H medium met toevoeging van 6% konijnenserum (Murgia en Cinco, 2004). 

3.3.1 Inductie van cystevorming als gevolg van oxidatieve stress.

De oxidatieve stress die werd veroorzaakt als gevolg van een oplossing van waterstofperoxide (18 mM) in gedestilleerd water, resulteerde in een snelle en complete conversie van de hele spirochetenpopulatie in cysten waarbij de hierna volgende fenomenen zich voordeden. Direct na het starten van de behandeling werd al bij enkele spirocheten het uitpuilen van het membraan van de buitenste wand waargenomen (Figuur 3.10A). Dit leidde tot een uitgesproken uitrekken en uitpuilen van de celwand na een incubatie van 2 minuten (Figuur 3.10B).Na 5 minuten incubatie lieten dwarsdoorsneden van de spirocheten blaasjes zien die enkele protoplasmacilinders van Borreliae bevatten (Figuur 3.10C). De protoplasmacilinders hadden zich opgevouwen in de dubbele structuur van de outer-sheath. Na 10 minuten werd de typiche cystevorm waargenomen met elektronendichte kernstructuren binnenin (Figuur. 3.10D). De weinige spirocheten die nog na 30 minuten aanwezig waren ondergingen binnen een maand lysis en de suspensie bestond uiteindelijk voor 99 % uit zuivere cystevormen (Murgia en Cinco, 2004).

Fig. 3.10. A t/m D. Transmissie-electronenmicroscopie van de cystevorming door B. garinii.(zie tekst). Bars, 0.1 μM (A,B,C); 0.2 μM (D) (Murgia en Cinco., 2004). 

3.3.2 Inductie van cystevorming als gevolg van pH-veranderingen

Onder invloed van pH 6 tot en met pH 9 bleven de spirocheten na 24 uur nog in leven gedurende de blootstelling aan deze pH-waarden (Figuur 3.11). Bij pH-waarden < 6 en > 9 stierven de bacteriën en alleen onder extreme pH-waarden, zowel bij lage (zure) pH van 2, als bij hoge (alkalische) pH van 11, werden er een paar cysten waargenomen na 30 minuten blootstelling. Bij pH 12 losten de bacteriën onmiddellijk op en werden er noch spirocheten, noch cysten gezien (Figuur 3.11) (Murgia en Cinco, 2004).

Fig.3.11. Cystevorming van B. garinii onder invloed van verschillende pH-waarden. (Murgia en Cinco, 2004). Uit bovenstaande resultaten volgt dat de spirocheet goed kan overleven in het bloed van de mens waar de pH ongeveer 7.4 is en in de dunne darm waar een pH van ongeveer 6 tot 7 heerst. Van hieruit kan er actieve disseminatie naar de weefsels plaatsvinden (Murgia en Cinco, 2004).

38 Ook kan de spirocheet als cyste overleven in het speeksel van volwassen nuchtere teken, waar de pH zeer hoge waarden bereikt (Murgia en Cinco, 2004). 

3.3.3 Inductie van cystevorming als gevolg van temperatuurvariaties

Onder invloed van temperatuur-shock behandelingen gingen de Borreliae die waren gesuspendeerd in een minimalessential medium (MEM)- of in gedesilleerd water, meestal bij hoge temperatuur over in de cystevormen. Spirocheten die gesuspendeerd waren in een MEM-oplossing gingen bij het stijgen van de temperatuur al na 30 minuten observatie over in de cystevormen. Een temperatuurstijging van 4 graden- tot 80 graden Celsius correleert met een geleidelijke afname van beweeglijke spirocheten en een geleidelijke toename van de cysten. Hetzelfde verschijnsel werd waargenomen na 24 uur. Verhitten had een gematigde invloed op de cystevorming; tot 80 graden Celsius vond cystevorming plaats in een MEMoplossing en vanaf 80 graden Celsius overheerste de cystevorm (Figuur 3.12) (Murgia en Cinco, 2004).

Fig. 3.12. Cystevorming door B. garinii bij 4 graden -, 37 graden - en 80 graden Celsius, in gedestilleerd water en MEM (Murgia en Cinco, 2004). 

3.3.4 Reconversie van mobiele spirocheten uit cysten

Om na te gaan in hoeverre cysten die waren ontstaan onder temperatuur-, oxidatieve- en hypo-osmotische stress weer over konden gaan naar intakte beweeglijke spirocheten werden de cysten overgebracht naar een BSK-H medium. De cysten die waren verkregen in gedestilleerd water hadden slechts 10 dagen nodig om te veranderen in spirocheten. Een langere tijd, 30 dagen was nodig voor de overgang van cysten die waren gevormd door verhitting bij 80 graden Celsius.

Tabel 3.2. Reconversietijd van cysten van B. garinii verkregen onder verschillende stresscondities en tijdsduren (Murgia en Cinco, 2004). Cysten die waren geïnduceerd via een behandeling met waterstofperoxide leken minder geneigd tot overgang naar spirocheten en hadden meer dan twee maanden nodig (Tabel 3.1) (Murgia en Cinco, 2004). In een studie van Gruntar et al. (2001) werd eerst in vitro de conversie onderzocht naar de cystevorm van Borrelia garinii en vervolgens in hoeverre uit de gevormde cysten weer normale beweeglijke spirocheten te voorschijn zouden komen. De stam B. garinii was afkomstig van een muizenhart; de muis in kwestie was geïnfecteerd geraakt door een besmette teek (Gruntar et al., 2001). De cysten van B. garinii werden gemaakt in steriel gedestilleerd water. De spirocheten gingen binnen één minuut al over in de cystevorm. Na twee uur was meer dan 95% van de beweeglijke spirocheten van B. garinii overgegaan in de cystevorm. De cysten hadden een globulair uiterlijk en waren meestal afzonderlijk te zien aan het begin van het experiment (Figuur 3.16A). Naarmate de tijd vorderde, waren er meer aggregaten van cysten (Figuur 3.16B). Een week na de cystevorming waren de meeste cysten tot een aggregaat geworden en waren afzonderlijke cysten zeldzaam geworden.

39 Een dergelijk onderzoek was ook reeds uitgevoerd door Brorson en Brorson (1998). Hierbij was na één minuut 95% van de spirocheten van B. burgdorferi s.l. overgegaan in cysten en na 4 uur werd er geen mobiele intakte spirocheet meer waargenomen (Brorson en Brorson, 1998).

Fig. 3.16 A. Cysten van B. garinii in gedestilleerd water, 24 uur na de cystenvorming: De cysten zijn afzonderlijk te zien en globulair gevormd. Fig. 3.16 B. Cysten van B. garinii in gedestilleerd water, 7 dagen na de cystenvorming: een typisch aggregaat van cysten is te zien.In A en B zijn structuren van spirocheten zichtbaar. Donkerveldmicroscopie, oorspronkelijke vergroting 400 x; bar = 1 μm (Gruntar et al., 2001). Vervolgens werden de gevormde cysten van 2-, 7-, en 28 dagen oud, overgebracht naar een BSK-II cultuurmedium; dit om na te gaan hoe lang de ontwikkeling tot normale spirocheten duurde voor de diverse cysten. Naarmate de cysten langer in gedestilleerd water hadden verbleven, duurde het langer om weer in normale spirocheten te veranderen (Tabel 3.3). Na overbrenging van de cysten naar het BSK-II kweekmedium waren de cysten zelfs na een verblijf van vier weken in gedestilleerd water in staat tot transformatie naar normale mobiele spirocheten. Transformatie vond plaats na 33 dagen. Naarmate de cysten langer in gedestilleerd water hebben gelegen, duurt het langer om weer in normale spirocheten te veranderen. Dit wijst op een sterk vermogen tot overleving onder ongunstige levensomstandigheden voor de spirocheet. Jongere cysten hadden minder tijd nodig dan oudere om weer tot beweeglijke spirocheten te worden (Tabel 3.3).

Tabel 3.3 Levensvatbaarhied van B. garinii cysten van verschillende leeftijden in BSK II cultuur, met de benodigde dagen voor reconversie naar normale beweeglijke spirocheten (Gruntar et al., 2001).

40

Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed stressfactor op cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Hypotone oplossing

Aquadest 4ºC

cystenvorming

reconversie na 10 dagen in aquadest van 4º C voor cysten van 24 uur, na transfer in BSK-H medium

Murgia en Cinco (2002)

Hypotone oplossing

Aquadest 4ºC

cystenvorming start na reconversie na 9 1 minuut; na 2 uur dagen voor cysten van 95% cysten 2 dagen; - na 20 dagen voor cysten van 7 dagen; - na 33 dagen voor cysten van 28 dagen, na transfer in BSK-H medium

Gruntar et al. (2001)

Hypotone oplossing

Aquadest 4ºC

cystenvorming; na 1 minuut 95% cysten; na 4 uur geen mobiele spirocheten meer waargenomen

reconversie na 1 dag na transfer in BSK-H medium

Brorson en Brorson (1998)

Oxidatieve stress

H2O2 (18mM) in aquadest

cystenvorming na 10 30 minuten

reconversie na 70 dagen voor H2O2 cysten van 1 dag, na transfer in BSK-H medium

Murgia en Cinco (2004)

pH 6 t/m pH9

MEM + 1M HCL/ 1M NAOH

mobiele spirocheten; geen cystenvorming

n.v.t.

Murgia en Cinco (2004)

pH 2 en pH 11

MEM + 1M HCL/ 1M NAOH

cystenvorming na 30 minuten

n.v.t.

Murgia en Cinco (2004)

pH 12

MEM + 1M HCL/ 1M NAOH

onmiddelijk oplossen spirocheten

n.v.t.

Murgia en Cinco (2004)

pH’s: 1, 3, 4, 5 en 10

MEM + 1M HCL/ 1M NAOH

sterfte spirocheten.

n.v.t.

Murgia en Cinco (2004)

Temperatuur-stijging

MEM of Aquadest 4º C 80º C

geleidelijke overgang naar cysten bij stijging temp. tot 80º C; vanaf 80º C alleen cysten over

reconversie na 10 dagen voor in aquadest van 4º C geïncubeerde cysten van 1 dag, na transfer in BSK-H medium

Murgia en Cinco (2004)

Instant-shock 80ºC

Aquadest 80º C

cystenvorming na 30 minuten

reconversie na 30 dagen voor instantshock cysten van 80ºC na transfer in BSK-H medium

Murgia en Cinco (2004)

Tabel.3.4. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de oxidatieve-, pH- en temperatuurstressfactoren bij B. burgdorferi s.l..

41 

3.4 ANTIBIOTICA EN CHEMOTHERAPEUTICA ALS STRESSFACTOREN

In de tweede helft van de jaren 90 werden de eerste experimenten met culturen van Borrelia burgdorferi s.l. gedaan om de invloeden van diverse antibiotica te onderzoeken op de beweging, de morfologie en de overleving van B. burgdorferi s.., Deze onderzoeken werden gedaan in verband met het vaak mislukken van “adequate”antibioticumbehandelingen (Kersten et al., 1995). Achteréénvolgens wordt verslag gedaan van de volgende onderzoeken: paragraaf 3.4.1 penicilline, ceftriaxon en doxycycline (Kersten et al., 1995); paragraaf 3.4.2 ceftriaxon, penicilline, erythromycine en serum-starvation (Murgia et al., 2002); paragraaf 3.4.3 ranitidine bismuth citraat (Brorson en Brorson, 2001); paragraaf 3.4.4 hydroxychloroquine (Brorson en Brorson, 2002); paragraaf 3.4.5 tinidazole (Brorson en Brorson, 2004); paragraaf 3.4.6 telithromycine (Brorson en Brorson, 2005); paragraaf 3.4.7 grapefruit seed extract (Brorson en Brorson, 2007). paragraaf 3.4.8 tigecycline (Brorson et al., 2009; Yang et al., 2009). De Bèta-lactam antibiotica penicilline-G en ceftriaxon werken op de peptidoglycaan-celwand van de protoplasmacilinder tijdens de celdeling van bacteriën. De antibiotica doxycycline en tigecycline, beide tetracycline derivaten, werken op de ribosomen en verhinderen zo de eiwitsynthese van de bacteriën. 

3.4.1 penicilline, ceftriaxon en doxycycline

Bij het eerste onderzoek door Kersten et al. (1995) werden drie stammen van B. burgdorferi s.l. onderzocht: een stam van B. burgdorferi s. s. genaamd B31 en twee geïsoleerde stammen van patienten met de huidaandoening erythema migrans: Borrelia afzelii en Borrelia garinii. De stammen werden gedurende vier dagen bij 34 graden Celsius in een BarbourStoenner-Kelly (BSK)-medium gekweekt en vervolgens blootgesteld aan antibacteriële verdunningen van penicilline, ceftriaxon en doxycycline. De minimale inhiberende concentraties (MIC”s) waarbij 90% van de bacteriën worden geremd, de MIC-90, waren voor penicilline-G 4.0 microgram/ml, voor ceftriaxon 0.06 microgram/ml en voor doxycycline 2.0 microgram/ml. Hierbij valt op dat de concentratie van de MIC-90 van ceftriaxon veel geringer is dan van penicilline en doxycycline (Kersten et al., 1995). De eerste veranderingen van de culturen van B. burgdorferi s.l. die werden blootgesteld aan penicilline en ceftriaxon, begonnen na een incubatie van 24 uur met een overproductie van het oppervlak-membraan. Dit resulteerde in een verhoogd aantal membraanblebs, van 0.05 tot 0.2 micrometer grootte. Ook werden losse blebs gevonden met dezelfde outer-sheath als de mobiele normale spirocheet (Kersten et al., 1995). Deze veranderingen aan het oppervlakmembraan waren al eerder aangetoond na blootstelling aan stressfactoren zoals bevriezen en ontdooien, hypotonische oplossingen en het toevoegen van penicilline. (Holt, 1978; Barbour en Hayes, 1986). Incubatie met doxycycline veroorzaakt allereerst onbeweeglijkheid van de spirocheten. Er kon hier niet worden achterhaald of onbeweeglijke B. burgdorferi s.l. spirocheten alleen verlamd waren of dat ze gedood waren. Aangezien beweeglijkheid een belangrijke factor is voor de invasie van weefsels, zoals het endothelium, voorkomt doxycycline mogelijk in vivo de intracellulaire invasie of de actieve disseminatie van de spirocheten in het lichaam (Kersten et al., 1995). Verder bleek dat in de culturen van B. burgdorferi s.l. met een penicilline- of doxycycline concentratie van 0.1 maal de MIC-90, er na 96 uur nog steeds grote aantallen intacte spirocheten aanwezig waren. Deze situatie moet in ogenschouw genomen worden, indien lage doses antibiotica worden voorgeschreven of wanneer de antibiotica door de patiënt onregelmatig worden ingenomen (Kersten et al., 1995). Ondanks MIC-90- antibiotica-concentraties waren er na 72 uur nog altijd mobiele organismen aanwezig na incubaties met penicilline en doxycycline, maar niet na incubatie met ceftriaxon. Na 96 uur, dus na vier dagen incubatie, werden door middel van transmissie-electronenmicroscopie bij alle drie de antibiotica-cultuursuspensies intacte delen van spirocheten waargenomen, waarbij het merendeel gelegen was in cysten (Kersten et al., 1995). De onderzoekers Preac Mursic et al. (1996) deden in vitro onderzoek met B. burgdorferi s.l. geïncubeerd in MKP medium met 3 mg/L penicilline-G. Na 48 uur ontstonden er naast uitgerekte spirocheten en blebs ook sferoplasten of celwanddeficiënte bacteriën (zie ook paragraaf 3.6). Na overbrenging van de sferoplasten in MKP medium met bovine albumine of overbrenging op PMR-agar kwamen er normale spirocheten met te voorschijn (Preac Mursic et al., 1996). 

3.4.2 ceftriaxon, penicilline, erythromycine met serum-starvation

Later werd eveneens onderzoek gedaan door Murgia et al. (2002) naar de morfologische veranderingen van de spirocheet B. burgdorferi s.l. onder invloed van serum-starvation met de antibiotica ceftriaxon, penicilline-G en erythromycine. Hier werden dus twee stressfactoren tegelijk toegepast. Als cultuurmedia werden gebruikt BSK-compleet, hier BSK genoemd en BSK zonder konijnenserum; hier weergegeven als BSK-serum.

42 Onder invloed van de stressfactor serum-starvation gingen na 3-4 dagen de normale spirocheten over in de cystevorm en bij het BSK- complete medium werd geen cystevorming waargenomen (Figuren 3.13a en 3.13b). In het onderzoek werd gebruik gemaakt van twee maal de MIC-90 concentraties antibiotica; kortweg 2 MIC genoemd. De 2MIC-concentraties van de Bèta-lactaam antibiotica ceftriaxon en penilline-G waren in dit onderzoek 0.06 microgram/ml voor ceftriaxon en 0.12 microgram/ml voor penicilline-G. Vanaf de eerste incubatiedag werd cystevorming waargenomen, zowel met - als zonder de stressfactor serum-starvation (Figuren 3.13c -f) (Murgia et al., 2002). Het aantal cysten dat microscopisch werd geteld was voor beide antibiotica met de stressfactor serum-starvation twee tot drie maal hoger dan met de serum-starvation factor zonder de antibiotica ceftriaxon en penicilline-G (Figuren 3.13b, 3.13d en 3.13f). Naast serum-starvation veroorzaakten de Bèta-lactaam antibiotica dus een extra toename van het aantal cysten (Murgia et al., 2002).

Figuur 3.13 a-h: concentraties spirocheten en cysten na behandeling met ceftriaxon, penicilline-G en erythromycine. BSK = BSK-compleet, BSK-serum = BSK zonder konijnenserum. Zie tekst (Murgia et al., 2002).

43 Bij het macrolide antibioticum erythromycine echter, werden in beide BSK media een gering aantal cysten waargenomen (Figuren 3.13g en 3.13h). Erythromycine inhibeert net als doxycycline en minocycline de eiwitsynthese van B. burgdorferi s.l. ter hoogte van de ribosomen, zoals ook in het onderzoek van Kersten et al. (1995) al is gebleken (Murgia et al., 2002).

Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed van de stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Penicilline-G

BSK + 4.0 μg/ml penicillline-G

lysis en start cystenvorming na 24 uur; intakte delen van spirocheten in cysten na 96 uur

n.v.t.

Kersten et al. (1995)

Penicilline-G

MKP + 3 mg/L penicilline-G

uitgerekte spirocheten, blebs en sferoplastenvorming na 48 uur

Preac Mursic et al. (1996)

Penicilline-G +/serum-starvation

BSK met/zonder serum + 0.12 μg/ml penicilline-G

sterfte en cystenvorming vanaf incubatiedag 1 in BSK met/zonder serum; met penicilline-G 3 x meer cystenvorming dan met serumstarvation alleen

reconversie sferoplasten na transfer in MKP + albumine bovine of op PMR-agar. n.v.t.

Ceftriaxon

BSK + 0.06 μg/ml ceftriaxon

cystenvorming start na n.v.t. 24 uur; intakte delen van spirocheten in cysten na 96 uur

Kersten et al. (1995)

Ceftriaxon +/- serumstarvation

BSK met/zonder serum + 0.06 μg/ml ceftriaxon

sterfte en n.v.t. cystenvorming vanaf incubatiedag 1 in BSK met en zonder serum

Murgia et al. (2002)

Doxycycline

BSK + 2.0 μg/ml doxycycline

na 18 uur start geleidelijke onbeweeglijkheid spirocheten; na 96 uur 90% immobiele spirocheten en intakte delen van spirocheten in cysten

n.v.t.

Kersten et al. (1995)

Erythromycine +/serum-starvation

BSK met/zonder serum + 0.06 μg/ml erythromycine

onbeweeglijkheid spirocheten gevolgd door weinig of geen cystenvorming

n.v.t.

Murgia et al. (2002)

Onderzoekers

Murgia et al. (2002)

Tabel 3.5. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van antibacteriële stressfactoren penicilline-G, doxycycline, ceftriaxon en erythromycine bij B. burgdorferi s.l.. 

3.4.3 Ranitidine Bismutcitraat

Al meer dan 300 jaar wordt het metaal bismut in de vorm van bismutzouten gebruikt bij de behandeling van gastrointestinale (GI) aandoeningen zoals stomatitis, flatulentie, diarree, abdominale pijn, constipatie, dyspepsie en ulcus pepticum. Sommige entero- pathogene bacteriën zoals Clostridium difficile en Heliobacter pylori en ook virussen blijken gevoelig te zijn voor bismutzouten. Verder kan de Heliobacter pylori coccoïde vormen aannemen, net zoals de cysten bij B.

44 burgdorferi s.l. en uit deze coccoïde vormen kunnen weer normale bacteriën komen. Om na te gaan of het mogelijk zou zijn Lyme-borreliose van het maagdarmstelsel effectief te behandelen, werd in vitro onderzoek gedaan naar de gevoeligheid van B. burgdorferi s.l. ten aanzien van ranitidine bismutcitraat (RBC). Hierbij werden de minimale bactericide concentraties (MBC’s) bepaald voor normale spirocheten en cysten (Brorson en Brorson, 2001). Zowel de MIC als de MBC hebben beide een antibacteriële werking, waarbij de MIC een bacteriostatische werking heeft waarbij de bacteriën zich niet kunnen vermenigvuldigen door remming van de eiwitsynthese of door remming van de deling. De MBC heeft een bactericide werking waarbij de bacteriën gedood worden. Het onderzoek van Brorson en Brorson (2001) naar de bactericide werking van RBC liet de hierna genoemde MBC’s zien. Als normale mobiele spirocheten van B. burgdorferi s.l. gedurende 1 week bij 37 ºC werden geïncubeerd met RBC, was de MBC > 64 μg/ ml. Bij 30 ºC was de MBC > 256 μg/ml. Als de incubatietijd 2 weken was bij 37 ºC, daalde de MBC voor de spirocheten naar > 2 μg/ml. (Zie verder overzichtstabel aan het einde van dit hoofdstuk). Elektronen-transmissiemicroscopie (TEM) liet zien dat bismut-aggregaten aanwezig waren op het oppervlak van de spirocheten indien de concentratie RBC > MBC, waarbij de bacteriën gedood werden (Brorson en Brorson, 2001). Verder werden cysten van B. burgdorferi s.l. onderzocht door deze gedurende 2 weken bij 37 ºC bloot te stellen aan RBC. Bij jonge cysten van 1 dag oud was de MBC voor RBC > 0.125 μg /ml en voor oude cysten van 8 maanden was de MBC > 2 μg/ml. Bismut-aggregaten zaten vast gehecht aan de cysten en puntige aggregaten doorboorden de celwand van de cysten. Ook hechtten bismut-aggregaten zich sterk aan blebs en granulen indien de RBC concentratie > MBC (2 μg/ml). RBC is bij deze concentratie effectief tegen zowel de cysten als tegen de blebs en granulen van B. burgdorferi s.l. (Brorson en Brorson, 2001). Acridine-oranje (AO) kleuring bij pH 7.4 van 8 maanden oude cysten van B. burgdorferi s.l. die gedurende 14 dagen bij 37 ºC waren geïncubeerd bij verschillende RBC concentraties gaven de volgende resultaten: bij een RBC concentratie van 1 μg/ml bevatten de cysten groene kernen (cores), dat duidt op leven; bij een RBC concentratrie van 2 μg/ml bevatten de cysten zowel groene als oranje kernen; bij een concentratie van 256 μg /ml zijn er in de cysten alleen rode granulen van kernen te zien en geen cysten of kernen zijn zichtbaar. De oranje en rode kleuren duiden op biologisch inactieve organismen waarbij het DNA is gedenatureerd en de AO kleurstof zich kan plaatsen tussen de nucleotiden van het DNA (Alban et al., 2000; Brorson en Brorson, 2001). Cysten die waren geïncubeerd met RBC concentraties van 0 μ/ml (controle) tot 2 μg/ml werden naar een BSK-H medium overgebracht om te onderzoeken of deze cysten nog levensvatbaar waren. Uit 50 % van de cysten kwamen mobiele spirocheten te voorschijn waarvan de meeste erg kort waren en vast zaten aan de cysten. 5 % van de spirocheten waren los van de cysten en hadden een normale verschijning behalve dat ze zeer dun waren. Deze spirocheten ontwikkelden zich niet verder gedurende de incubatie van 1 maand in BSK-H medium. Bij een concentratie van RBC > 2 μg/ml kwamen er geen spirocheten uit de cysten (Brorson en Brorson, 2001). Uit het bovenstaande onderzoek komt naar voren dat ook cysten ouder dan 2 maanden levensvatbaar zijn en ook dat oudere cysten meer resistent zijn tegen stressfactoren dan jonge cysten. Aangezien B. burgdorferi s.l. het maagdarmstelsel kan infecteren en zowel de normale mobiele spirocheet als de cyste van B. burgdorferi s.l. gevoelig zijn voor RBC in vitro, kan RBC volgens de onderzoekers Brorson en Brorson (2001) mogelijk gebruikt worden in vivo bij Lyme-borreliose van de gastro-intestitinale tractus (Brorson en Brorson, 2001).

45 Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Ranitidine bismuth citraat (RBC)

MBC”s: 1 week 37º C RBC> 64 μg/ml; 2 weken 37º C RBC> 2 μg/ml; 1 week 30º C RBC> 256 μg/ml

Sterfte spirocheten; bij n.v.t. deze RBC concentraties geen cystenvorming

Brorson en Brorson (2001)

Ranitidine bismuth citraat (RBC)

2 weken 37º C RBC=MBC > 0.125 μg/ml + cysten van 1 dag

n.v.t.

Sterfte cysten en mobiele spirocheten uit 50% van de in 0-2 μg/ml RBC geïncubeerde cysten na transfer in BSK-H medium

Brorson en Brorson (2001)

Ranitidine bismuth citraat (RBC)

2 weken 37º C RBC = MBC > 2 μg/ml + cysten van 8 mnd

n.v.t.

Sterfte cysten en geen spirocheten uit geïncubeerde cysten in RBC > 2 μg/ml na transfer in BSK-H medium

Brorson en Brorson (2001)

Invloed van de stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Tabel. 3.6 Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de stressfactor Ranitidine bismuth citraat (RBC) bij B. burgdorferi s.l.. 

3.4.4 Hydroxychloroquine

Het onderzoek met het anti-malaria medicijn hydroxychloroquine (HCQ), plaquenil®, werd uitgevoerd om na te gaan of HCQ ook effectief zou zijn tegen de mobiele spirocheten en cysten van B. burgdorferi s.l.. HCQ wordt gebruikt tegen veroorzaker van malaria, een ééncellige parasiet van het genus Plasmodium. HCQ kan de cel in diffunderen als er geen protonenlading (H+) op het molecuul aanwezig is. Binnen in de zure omgeving van de cel wordt er een proton aan HCQ toevoegd, zodat er een positieve lading ontstaat, waardoor polaire HCQ-moleculen niet meer de cel uit kunnen diffunderen. Zo ontstaat er in de cel een hoge concentratie HCQ die een remmend effect heeft op de RNA - en DNA synthese van de cel. (Brorson en Brorson, 2002). De minimale bactericide concentratie (MBC) van HCQ tegen de normale mobiele spirocheten is in vitro temperatuurafhankelijk. Bij 37 ºC is de MBC > 32 μg/ml en bij 30 ºC > 128 μg/ml. Incubatie van de mobiele spirocheten met HCQ resulteerde in een verminderde overgang naar cysten. De MBC van HCQ is ook tegen de cysten van B. burgdorferi s.l temperatuur- afhankelijk. Een situatie die van belang is als de cysten zich in de huid bevinden. Bij 30 ºC. is een hogere concentratie HCQ (>128 μg/ml) nodig om de cysten te vernietigen dan bij 37 ºC (> 32 μg/ml) (Brorson en Brorson, 2002). AO kleuring bij 1 dag oude cysten die waren geïncubeerd bij 37 ºC. gedurende 14 dagen bij een HCQ concentratie > 16 μg/ml vertoonden rode draadstructuren en het cystemembraan was erg dun of gescheurd, dit leidde tot vernietiging van de cysten. Bij een incubatie van 30 ºC. gedurende 14 dagen was een HCQ concentratie > 32 μg/ml nodig om 1 dag oude cysten te vernietigen. De MBC van HCQ is afhankelijk van de leeftijd van de cysten. Bij 37 ºC. gedurende 14 dagen incubatie was de MBC voor cysten van 1 dag > 8 μg/ml en voor cysten van 1 week oud was de MBC > 32 μg/ml. Bij hoge concentraties > 256 μg/ml was ongeveer 95 % van de cysten uitéén gevallen. Bij een HCQ concentratie die gelijk aan de MBC ontwikkelden zich geen draadstructuren meer in de cysten en de hoeveelheid RNA nam hierbij significant af. De resultaten van het in vitro onderzoek van HCQ wijzen erop dat HCQ mogelijk werkzaam zou zijn in vivo tegen intracellulaire cysten van B. burgdorferi s.l.. Het onderzoek met HCQ heeft namelijk aangetoond dat de cysten van B. Burgdorferi s.l. gevoelig zijn voor dit agens in concentraties die ook in vivo intracellulair bereikt worden bij een normale lichaamstemperatuur van 37 ºC. Als de infectie gelokaliseerd is in de huid waar een lagere temperatuur heerst of er is

46 sprake van de aanwezigheid van vrije spirocheten in de bloedbaan, dan is de MBC van HCQ ontoereikend. Volgens de onderzoekers Brorson en Brorson (2002) kan HCQ mogelijk gebruikt worden in combinatie met een macrolide antibioticum om zowel de mobiele spirocheten als de cysten te vernietigen bij de behandeling van resistente Lymeborreliosen (Brorson en Brorson, 2002). Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed van de stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Hydroxy-chloroquine (HCQ)

MBCbij 37ºC HCQ > 32 μg/ml;

sterfte spirocheten

n.v.t.

Brorson en Brorson (2002)

Hydroxy-chloroquine (HCQ)

MBC bij 30ºC HCQ > 128 μg/ml

sterfte spirocheten

n.v.t.

Brorson en Brorson (2002)

Hydroxy-chloroquine (HCQ)

2 weken 37º C in HCQ ≥ 16 μg/ml; (MBC= HCQ> 8 μg/ml) + cysten van 1 dag

n.v.t.

vernietiging cysten; geen spirocheten uit cysten

Brorson en Brorson (2002)

Hydroxy-chloroquine (HCQ)

2 weken 37º in HCQ > n.v.t. 32 μg/ml ( =MBC) + cysten van 1 week

vernietiging cysten; geen spirocheten uit cysten

Brorson en Brorson (2002)

Hydroxy-chloroquine (HCQ)

2 weken 30º C in HCQ ≥ 32 μg/ml + cysten van 1 dag

vernietiging cysten; geen spirocheten uit cysten

Brorson en Brorson (2002)

n.v.t.

Tabel 3.7. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de stressfactor Hydroxy-cloroquine (HCQ) bij B. burgdorferi s.l.. 

3.4.5 Tinidazol

In 1999 werd er een studie gepubliceerd door Brorson en Brorson over de behandeling van de cysten van B. burgdorferi s.l. met het chemotherapeuticum metronidazol (MZ). Dit medicijn werd echter niet door alle patiënten even goed verdragen. Daarom werd de tweede generatie 5-nitroimidazole tinidazole (TZ) ontwikkeld, welke hopelijk beter zou worden verdragen en misschien ook efficiënter zou zijn dan MZ. Hiertoe werd de gevoeligheid van mobiele spirocheten en cysten van een stam genaamd Borrelia burgdorferi acrodermatitis chronica atroficans, ACA-I voor tinidazole(TZ) onderzocht (Brorson en Brorson, 2004). Gevoeligheidsbepalingen ten aanzien van TZ van normale beweeglijke Borreliae lieten een minimale bactericide concentratie (MBC) zien van TZ die groter was dan 128 μg/ml voor culturen die gedurende 14 dagen geïncubeerd waren bij 37 ºC in een micro-aerobe atmosfeer. Volgens de onderzoekers Brorson en Brorson (2004) is TZ effectief tegen mobiele spirocheten, maar de normale doses van éénmalig 1.5 gram TZ en kortdurende behandelingen zullen waarschijnlijk de bacteriën niet doden. De toevoeging aan mobiele spirocheten van gedestilleerd water met een TZ concentratie die ook in vivo wordt bereikt (300 μg/ml) beperkte de vorming van cysten. Normaliter stimuleert gedestilleerd water als hypotone oplossing de cystevorming. Dergelijk onderzoek met hypotone oplossingen is niet uitvoerbaar in vivo, aangezien er voor de lichaamscellen een isotone oplossing is vereist. Het breken van cysten werd waargenomen bij 10 tot 90 % van de cysten die 14 dagen bij 37 ºC geïncubeerd waren in TZ-verdunningen van respectievelijk 0.5 tot 512 μg/ml in een micro-aeroob milieu. Andere antibiotica doen het tegenovergestelde door juist het stimuleren van vorming en handhaving van cysten (Brorson en Brorson, 2004). Transmissie-electronenmicroscopie (TEM) liet het oplossen van de inhoud van één dag oude cysten zien bij een concentratie van TZ van 32 μg/ml, bij een incubatie van 37 ºC gedurende veertien dagen in een micro-aerobe omgeving (Figuur 3.14 (Brorson en Brorson , 2004). De onderzoekers Brorson en Brorson (2004) veronderstellen dat de aan- of afwezigheid van zuurstof gedurende de incubatie er de oorzaak van kan zijn dat er verschil werd geconstateerd in ontwikkeling en verschijning van de cysten. Er werd een verminderde diffussie van TZ door het celmembraan geconstateerd in aanwezigheid van zuurstof. Gedurende de incubatie in een micro-aerobe omgeving echter kan er een anaerobe toestand ontstaan binnenin de cysten. Volgens de onderzoekers kan dit resulteren in een hogere influx van TZ. Onder anaerobe omstandigheden in de cysten ontstaan er gereduceerde metabolieten van TZ die hun volledige vernietigende werkzaamheid kunnen uitoefenen op het DNA van B. burgdorferi s.l. (Brorson en Brorson, 2004) .

47

Fig. 3.14 Links: één dag oude cysten geïncubeerd in tinidazole concentratie van 32μ /ml gedurende 14 dagen, onder microaerobe omstandigheden bij 37 ºC. De inhoud van de cysten zijn bijna geheel opgelost en de cystewanden zijn gebroken (witte cirkel). Bar: 500 nm. Rechts: één dag oude cysten geïncubeerd onder dezelfde condities zonder tinidazole. Kernen zijn te zien in de cysten. In de grote cyste hebben spirocheten zich gedeeld en de cyste zelf is ook in een delingsproces. Bar: 1 μm (Brorson en Brorson, 2004). Bij TZ concentraties boven de MBC van 128 μg/ml werden geen spirocheten gezien die uit de cysten kwamen en was de cystestructuur uiteen gevallen. Tinidazole is in vitro effectief gebleken tegen de cysten van B. burgdorferi s.l. Volgens de onderzoekers is TZ alléén echter niet voldoende om in vivo Borrelia infecties te behandelen aangezien mobiele spirocheten zeer resistent zijn tegen TZ. TZ kan wel de cystenvorming remmen en spirocheten en RNA structuren binnenin de cysten vernietigen bij een concentratie die in vivo zou kunnen worden bereikt met een enkelvoudige dosis van 1.5 gram. (Brorson en Brorson, 2004).

Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed van de stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Tinidazole (TZ)

2 weken 37º C, microaeroob, MBC = TZ> 128μg/ml

Sterfte spirocheten; geen cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2004)

Tinidazole (TZ)

2 weken 37º C, microaeroob, MBC = TZ> 0.125 μg/ml, + cysten van 1 dag

n.v.t.

oplossen inhoud cysten; geen spirocheten uit cysten

Brorson en Brorson (2004)

Tinidazole (TZ)

2 weken 37º C, microaeroob, MBC = TZ> 0.5 μg/ml, + cysten van 10 mnd

n.v.t.

oplossen inhoud cysten; geen spirocheten uit cysten

Brorson en Brorson (2004)

Tinidazole (TZ)

2 weken 37º C, microaeroob, TZ = 32 μg/ml, + cysten van 1 dag

n.v.t.

oplossen inhoud cysten en gescheurde cystewanden

Brorson en Brorson (2004)

Tinidazole (TZ)

2 weken 30º C, microaeroob, MBC= TZ> 8μg/ml; en aeroob, MBC= TZ> 16μg/ml, + cysten van 1 dag

n.v.t.

openscheuren cysten; geen spirocheten uit cysten na tranfer in BSK-H medium

Brorson en Brorson (2004)

Tabel 3.8. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de stressfactor Tinidazole (TZ) bij B. burgdorferi s.l..

48 

3.4.6 Telithromycine

Brorson en Brorson deden ook in vitro onderzoek met met een nieuw antibioticum telithromycine (TM) waarbij de activiteit tegen mobiele spirocheten van B. afzelii en tegen cysten werd onderzocht (Brorson en Brorson, 2006). TM is een ketolide dat afgeleid is van het macrolide antibioticum clarythromycine. Deze antibiotica binden aan de ribosomen waardoor de eiwitsynthese wordt verhinderd. De activiteit van TM in vitro tegen de mobiele spirocheten na 7 dagen incubatie bij 34 ºC was hoog, 0.0003 μg/ml < MBC < 0.0006 μg/ml en de MIC < 0.00015 μg/ml. Na 7 dagen incubatie met een TM concentratie van 0.01 μg/ml werden alleen nog gedegenereerde bacteriën waargenomen. Ongeveer 50% van de bacteriën was opgelost en er vond geen vermenigvuldiging plaats. Bij een TM concentratie van 0.0006 μg/ml werden geen intakte spirocheten waargenomen en de meerderheid van de gevormde cysten waren leeg of hadden een degeneratieve inhoud. Er werden tevens enkele cysten met ophopingen van draad-structuren waargenomen met TM, maar deze cysten gingen niet meer over in normale spirocheten na enting op een BSK-H medium dat verrijkt was met konijnenserum, zelfs niet na een incubatie van 2 maanden. Eerder onderzoek van Brorson en Brorson (1998) heeft aangetoond dat incubatie van spirocheten in gedestilleerd water na 1 minuut resulteerde in 95% cystenvorming en dat er na 4 uur geen normale mobiele spirocheten meer werden waargenomen. Om na te gaan of TM cystenvorming kon voorkomen, werden spirocheten geïncubeerd in gedestilleeerd water met TM concentraties variërend van 0.003 μg/ml tot 400 μg/ml. Bij deze concentraties was er geen stagnatie in de cystenvorming waar te nemen. Volgens de onderzoekers Brorson en Brorson (2006) werkt TM waarschijnlijk bacteriostatisch en het elimineren van de spirocheten vindt plaats als functie van de tijd en is onafhankelijk van de concentratie. Verder is TM in gedestilleerd water niet in staat gebleken om cystevorming te verhinderen en de cysten werden ook niet aangetast bij concentraties die in vivo worden bereikt (Brorson en Brorson, 2006). Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed van stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Telithromycine (TM)

7 dagen 34º C, MIC = TM < 0.00015μg/ml

vertraagde beweging spirocheten; geen vermenigvuldiging

n.v.t.

Brorson en Brorson (2005)

Telithromycine (TM)

14 dagen 34º C, 0.0003 μg/ml <MBC= TM≤ 0.0006 μg/ml

geen intakte spirocheten; sporadische cystenvorming met lege of degeneratieve inhoud

lege of degeneratieve cysten; geen spirocheten uit cysten na transfer in BSK-H medium

Brorson en Brorson (2005)

Tabel 3.9. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de stressfactor Telithromycine bij B. burgdorferi s.l.. 

3.4.7 Grapefruit seed extract

Grapefruit-seed extract (GSE) is een natuurlijk antibioticum tegen bacteriën en fungi. Voor het onderzoek naar de antibacteriële werking van GSE tegen mobiele spirocheten en cysten werd de stam B. afzelii ACA-1 gebruikt (Brorson en Brorson, 2007). Mobiele spirocheten Mobiele spirocheten werden geïncubeerd met GSE en daarna overgeënt op een BSK-H medium om na te gaan of er nog levende spirocheten waren na de incubatie. De MBC van de mobiele spirocheten werd bepaald door na te gaan bij welke concentratie GSE geïncubeerde spirocheten geen groei meer vertoonden op het BSK-H medium. De MBC voor mobiele spirocheten werd gesteld op 0.041 % GSE bij 34 ºC gedurende 1 uur incubatie; gedurende 1 week incubatie bij 34 ºC was de MBC 0.0052 % GSE. De MBC lijkt dus afhankelijk van de incubatieduur. De MIC voor de mobiele spirocheten werd bepaald door na te gaan bij welke incubatie-concentratie van GSE de reproductie van de spirocheten werd geremd; de MIC was 0.00032 % GSE bij een incubatie van 1 week bij 34 ºC (Brorson en Brorson, 2007). Conversie naar cysten De conversiesnelheid naar 34 Ccysten door mobiele spirocheten in gedestilleerd water met verschillende GSE verdunningen was sterk afhankelijk van de GSE concentratie. Incubatie van 1 uur bij C liet geen cysten zien bij GSE

49 concentraties van 0.165 % tot 0.052 %. Bij 0.0028 % GSE waren er 10 % cysten gevormd. Bij 0.0013 % GSE was dit 20 % en bij 0.00064 % GSE waren er 95 % cysten gevormd uit mobiele spirocheten (Brorson en Brorson, 2007). Aantasting van cysten 100 % scheuring van 1 uur oude cysten vond plaats bij 34 ºC bij een GSE concentratie van 0.165 % tot 0.021 %. Bij GSE concentraties van 0.01 % tot 0.00064 % trad scheuring op bij 90 % tot 5 % van de 1 uur oude cysten bij 34 ºC Met de meeste scheuringen bij de hoogste concentraties GSE (Brorson en Brorson, 2007). Reconversie naar spirocheten Na overbrenging van de 1 uur oude cysten naar een BSK-H kwamen er na 14 dagen mobiele spirocheten uit de cysten te voorschijn, die geïncubeerd waren geweest bij een GSE concentratie van 0.00032 %. Na 5 weken was dit het geval voor een GSE concentratie van 0.00064 % en er kwamen geen spirocheten meer uit de cysten bij GSE concentraties > 0.00064%. De MBC voor cysten werd gesteld op 0.0013 % GSE concentratie (Brorson en Brorson, 2007). Bovengenoemde resultaten laten zien dat GSE in vitro een actief natuurlijk antibioticum is tegen de mobiele spirocheten en de cysten van B. burgdorferi s.l.. Verder zal de effectiviteit van GSE in vivo nader onderzocht moeten worden. (Brorson en Brorson, 2007). Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed van stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Grapefruit-seedextract (GSE)

1 uur 34 ºC, BSK-H met 0.041% GSE = MBC

Sterfte spirocheten; geen cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

1 week 34º C, BSK-H met 0.0052% GSE= MBC

Sterfte spirocheten; geen cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

1 uur 34º C, aquadest met 0.165% - 0.52% GSE

geen cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

1uur 34º C, aquadest met 0.0028% GSE

10% cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

1 uur 34º C, aquadest met 0.0013% GSE

20% cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

1 uur 34º C, aquadest met 0.00064% GSE

95% cystenvorming

n.v.t.

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

cysten van 1 uur bij 34º C in 0.165% 0.021% GSE

n.v.t.

100% scheuring cysten

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

cysten van 1 uur bij 34º C in 0.01% GSE

n.v.t.

90% scheuring cysten

Brorson en Brorson (2007)

Grapefruit-seedextract (GSE)

cysten van 1 uur bij 34º C in 0.00032% GSE

n.v.t.

na 14 dagen mobiele spirocheten uit intakte cysten na transfer in BSK-H medium

Brorson en Brorson (2007)

Tabel 3.10. Beknopt overzicht van in vitro onderzoek van de stressfactor Grapefruit-seed-extract (GSE) bij B. burgdorferi s.l..

50 

3.4.8 Tigecyline

De onderzoekers Brorson et al. (2009) hebben in vitro onderzoek verricht naar de werking van het antibioticum tigecycline (TG) op de mobiele spirocheten en round-bodies (RBs) van Borrelia afzelii. Andere benamingen voor de round-bodies zijn: coccoïd bodies, globulair bodies, sferische bodies, granulen, cysten, L-vormen, sferoplasten en blaasjes. Aangezien er de laatste jaren meer en meer resistente microbiële organismen waren die wisten te ontsnappen aan de activiteit van de tetracyclinen tegen de bacteriële ribosomen, is er onderzoek gedaan naar analogen van de antibiotica tetracyclinen. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van de glycylcyclinen waartoe het nieuwe antibioticum tigecycline behoort. In feite is tigecycline een derivaat van minocycline, ook een glycylcycline (Zhanel et al., 2004). Tigecycline bindt zich aan de bacteriële ribosomen en verhindert de synthese van het proteïne glycylcycline op de 30S en 70S ribosomale subeenheden. De S staat voor Svedberg en is een centrifugeereenheid (Brorson et al., 2009) . Mobiele spirocheten Indien normale spirocheten van Borrelia afzelii geïncubeerd werden in BSK-H medium met TG-concentraties < 50 μg/ml gedurende 3 uur bij 34º, toonde donkerveldmicroscopie aan dat er geen verandering optrad in de beweeglijkheid van de spirocheten. Bij een TG-concentratie tussen 50 μg/ml en 100 μg/ml was de mobiliteit gereduceerd. Bij een incubatie van 8 weken in een TG-concentratie van 0.4 μg/ml werd er één mobiele spirocheet waargenomen na overbrenging in een vers BSK-H medium. De minimale bactericide concentratie (MBC) werd daarom gesteld op 0.8 μg/ml bij een incubatietijd van 3 uur en 34º. Na een incubatie van 24 uur met TG-concentraties oplopend van 6.25 tot 100 μg/ml waren de bacteriën geheel uitééngevallen. Bij TG-concentraties van 3.12 tot 0.4 μg/ml hadden de bacteriën de spiraalvorm verloren en waren onbeweeglijk geworden. Bij TG-concentraties van 0.012 tot 0.2 μg/ml bewogen sommige bacteriën normaal terwijl andere nauwelijks meer mobiel waren. Na overbrenging naar een vers BSK-H medium waren deze spirocheten niet meer instaat te overleven of zich te reproduceren gedurende een incubatietijd van 2 maanden bij 34º. Spirocheten die geïncubeerd waren in een TG-concentratie van 0.003 μg/ml reproduceerden zich in dezelfde mate als de antibioticumvrije contrôlekolonie. De minimale inhibitieconcentratie (MIC) van TG werd daarom gesteld op 0.006 μg/ml en de MBC op 0.05 μg/ml voor een incubatietijd van 24 uur bij 34º. Voor een incubatietijd van 7 dagen bij 34º was de MBC van TG 0.012 μg/ml en bij een incubatie van TG-concentraties ≤ 0.006 μg/ml gedurende 7 dagen bij 34º overleefden de spirocheten en waren in staat zich te reproduceren na overbrenging naar een vers BSK-H medium. Bij een TG-concentratie van 0.0006 μg/ml gedurende 7 dagen bij 34ºC werden er spirocheten zonder S-layer waargenomen. De S-layer is de “sheat” of kenmerkende wand om de protoplasmacilinder van de spirocheet. De binnenste laag van de S-layer wordt gevormd door een peptidoglycanlaag. De MIC voor spirocheten bij een incubatie van 34º gedurende 7 dagen werd gesteld op TG <0.0006 μg/ml (Brorson et al., 2009). Conversie naar RB’s Bij een concentratie van 0.006 μg/ml TG gedurende 7 dagen bij 34ºwaren enkele RBs of cysten gevormd en bij een TG concentratie ≥0.05 μg/ml vertoonden de gevormde RBs het uitpuilen van membranen en het lekken van cytoplasma door breuken in het membraan (Brorson et al., 2009). Aantasting van RBs/ reconversie naar spirocheten Onderzoek van RBs die waren geïncubeerd in TG concentraties <0.1 μg/ml gedurende 1 week bij 34º en vervolgens werden overgeplaatst naar een vers BSK-H medium gedurende 2 maanden, ontwikkelden zich tot normale spirocheten. Indien de TG concentratie ≤ 0.2 μg/ml gedurende 5 weken toonde acridine-oranje kleuring bij pH 6.4 aan dat de meeste RBs gedeeltelijk uitééngevallen waren en een groene kleuring vertoonden. Dit laatste duidde erop dat de RBs niet levensvatbaar waren. Bij gezonde RBs zou het RNA met acridine-oranje een oranje kleur vertonen, dat duidt op levende cellen. RBs die geïncubeerd waren in TG concentraties <0.1 μg/ml gedurende 5 weken en gekleurd werden met BacLight vitaalkleuring, vertoonden groene RNA draden en structuren van spirocheten binnenin de cysten. Groen bij deze kleuring wil zeggen dat er levende organismen zijn. Indien de TG concentratie 0.1 μg/ml was, werden er alleen rode RBs waargenomen die niet levensvatbaar waren. De MBC voor RBs werd daarom geschat op 0.1 μg/ml (Brorson et al., 2009). Aangezien bovenstaand in vitro onderzoek heeft aangetoond dat tigecycline effectief is tegen zowel de normale spirocheten als tegen de cysten of round-bodies van B. afzelii, dringen de onderzoekers Brorson et al. (2009) aan op verder uitgebreid onderzoek in vitro en in vivo met dit antibioticum tigecycline op round-bodies vormende pathogene spirocheten. Hiertoe behoren ook de verwekker van de geslachtsziekte syfilis, namelijk Treponema pallidum en de verwekker van leptospirosis icterohaemorrhagiae (ziekte van Weil), Leptospira icterhaemorrhagiae (Brorson et al., 2009). In een in vitro onderzoek van Yang et al. (2009) werd de effectiviteit van tigecycline en doxycycline bepaald tegen 20 stammen B. burgdorferi s.l. namelijk: B. burgdorferi s.s.(14), B. garinii (3) en B. afzelii (3). De stammen werden geïncubeerd in BSK-H medium met de antibiotica bij 34ºC. Een effectieve inhiberende activiteit van tigecycline werd na 24 uur bereikt (MIC 0.048 mg/L) en na 48 uur was tigecycline met een zeer lage concentratie (MIC 0.012 mg/L) in staat om de groei van de spirocheten tegen te houden. Ook doxycycline vertoonde een bacteriostatische werking, maar die was trager en tijdsafhankelijk. Na 24 uur was de MIC voor doxycycline 1.5 mg/L en 48 uur 0.78 mg/L. Een optimale activiteit werd bereikt na 72 uur met een doxycycline concentratie van 0.39 mg/L (Yang et al., 2009). Verder werd aangetoond dat ongeveer 0.1 mg/L tigecycline na 24 uur effectief de spirocheten wisten te immobiliseren, terwijl doxycycline ineffectief was na 24 uur (> 25 mg/L). Na 48 uur was dit voor tigecycline 0.0048 mg/L en voor

51 doxycycline 3.1 mg/L. Na 72 uur werden de spirocheten van B. burgdorferi s.l. immobiel bij een concentratie van 1.5 mg/L doxycycline (Yang et al., 2009). De minimale bactericide concentraties (MBC”s) voor tigecycline waren 0.095 en 0.195 mg/L, afhankelijk van de Borrelia stam; voor doxyxycline waren de MBC”s 12.5 en 25.0 mg/L na een incubatie van 72 uur bij 34ºC in BSK-H medium. De MBC voor tigecycline was 64 tot 132 maal lager dan die van doxycycline (Yang et al., 2009). Dit in vitro onderzoek heeft aangetoond dat het nieuwe antibioticum tigecycline een snelle werking heeft met bovendien gemakkelijk te bereiken concentraties waarmee B. burgdorferi s.l. immobiel - en gedood kan worden binnen 24 uur.Vergelijk hierbij doxycycline dat pas na 72 uur een optimale activiteit bereikt (Yang et al., 2009). Zie tevens in vivo onderzoek (paragraaf 4.6) met tigecycline bij muizen door Barthold et al. (2010). Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Invloed van stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l.

Onderzoekers

Tigecycline (TG)

3 uur 34ºC BSK-H met TG < 50μg/ml 3 uur 34ºC BSK-H met 100 μg/ml > TG > 50μg/ml 8 weken 34ºC BSK-H met 0.4 μg/ml 3 uur 34ºC BSK-H met TG 0.8 μg/ml =MBC 24 uur 34ºC BSK-H met 100 μg/ml >TG>6.25 μg/ml 24 uur 34ºC BSK-H met 0.4 μg/ml> TG>3.12 μg/ml 24 uur 34ºC BSK-H met 0.2 μg/ml >TG>0.012 μg/ml

geen verandering mobiliteit spirocheten reductie in mobiliteit spirocheten

n.t.v.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009).

1 overlevende spirocheet sterfte spirocheten

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

uitéénvallen spirocheten

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

degeneratie en immobiliteit spirocheten mobiele en immobiele spirocheten; geen reproductie en overleving na transfer in vers BSK-H 2mnd. normale groei/ reproductie spirocheten geen reproductie en geen groei spirocheten sterfte spirocheten

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

spirocheten zonder Slayer + vorming van enkele RBs vorming RBs met breuken in membraan en lekken cytoplasma n.v.t.

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

n.v.t.

Brorson et al. (2009)

na 2 mnd immobiele spirocheten uit RBs; na transfer in BSK-H merendeel Rb’s gedeeltelijk uitééngevallen; niet levensvatbaar uitéén gevallen RBs

Brorson et al. (2009)

Tigecycline (TG) Tigecycline (TG) Tigecycline (TG) Tigecycline (TG) Tigecycline (TG) Tigecycline (TG)

Tigecycline (TG)

24 uur 34ºC BSK-H met 0.003 μg/ml TG

Tigecycline (TG)

24 uur 34ºC BSK-H met 0.006 μg/ml TG = MIC 24 uur 34ºC BSK-H met 0.05 μg/ml TG = MBC 7 dagen 34ºC BSK-H met 0.006 μg/ml TG

Tigecycline (TG) Tigecycline (TG) Tigecycline (TG)

7 dagen 34ºC BSK-H met TG≥ 0.05 μg/ml

Tigecycline (TG)

7 dagen 34ºC BSK-H met TG < 0.1μg/ml +RBs 5 weken 34ºC BSK-H met TG ≤ 0.2 μg/ml + RBs

Tigecycline (TG)

Tigecycline (TG) Tigecycline (TG)

5 weken 34ºC BSK-H TG > 0.2 μg/ml +RBs 5 weken 34ºC BSK-H TG < 0.1 μg/ml + RBs

n.v.t.

n.v.t. n.v.t.

enkele RBs met levende spirocheten binnenin

Brorson et al. (2009)

Brorson et al. (2009) Brorson et al. (2009)

52 Stressfactor

Onderzoeksmedium

Reactie van B. burgdorferi s.l. op de stressfactor

Tigecycline (TG)

5 weken 34ºC BSK-H met TG = 0.1 μg/ml = MBC voor RBs

n.v.t.

Tigecycline (TG)

24 uur 34ºC BSK-H met TG = 0.048 mg/L = MIC 48 uur 34ºC BSK-H met TG = 0.012 mg/L = MIC 24 uur 34ºC BSK-H met DOX = 1.5 mg/L =MIC 48 uur 34ºC BSK-H met DOX = 0.78 mg/L = MIC 72 uur 34ºC BSK-H met DOX = 0.39 mg/L = MIC 24 uur 34ºC BSK-H met TG ~ 0.1 mg/L 24 uur 34ºC BSK-H met DOX > 25 mg/L 48 uur 34ºC BSK-H met TG = 0.0048 mg/L 48 uur 34ºC BSK-H met DOX = 3.1 mg/L 72 uur 34ºC BSK-H met DOX = 1.5 mg/L 72 uur 34ºC BSK-H met TGs= 0.095 en 0.195 mg/L= MBC’s, afh. borrelia stam 72 uur 34ºC BSK-H met TGs = 12.5 en 25.0 mg/L = MBC”s, afh. borrelia stam

Tigecycline (TG) Doxycycline (DOX) Doxycycline (DOX) Doxycycline (DOX) Tigecycline (TG) Doxycycline (DOX) Tigecycline (TG) Doxycycline (DOX) Doxycycline (DOX) Tigecycline (TG)

Doxycycline (DOX)

Invloed van stressfactor op de cysten van B. burgdorferi s.l. Geen levensvatbare RBs

Onderzoekers

geen groei spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

geen groei spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

geen groei spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

geen groei spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

geen groei spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

immobiliteit spirocheten mobiele spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

n.v.t.

Yang et al. (2009)

immobiliteit spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

immobiliteit spirocheten immobiliteit spirocheten sterven spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

n.v.t.

Yang et al. (2009)

n.v.t.

Yang et al. (2009)

sterven spirocheten

n.v.t.

Yang et al. (2009)

Brorson et al. (2009)

Tabel 3.11. Overzicht van in vitro onderzoek met Tigecycline (TG) bij B.burgdorferi s.l.. MIC = minimale inhiberende concentratie; MBC = minimale bacteriocide concentratie; n.v.t. = niet van toepassing. 

3.5 CELWANDDEFICIËNTE BACTERIËN / SFEROPLAST-, L-VORMEN

Onder invloed van stressfactoren zoals veranderingen in zuurgraad, zuurstof, temperatuur en osmose en antibioticatoediening kunnen veel bacteriën een celwanddeficiënte (CWD)- of sferoplast-, L-vorm aannemen. De celwanddeficiënte vorm wordt gerangschikt onder de cysteuze vormen en komt behalve bij spirocheten zoals Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi s.l. en Leptospira species, ook voor bij veel andere bacteriën zoals Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Streptococcus species., Staphilococcus species, Escherichia coli, Klebsiella species, Salmonella typhimurium, Clostridium tetani. Dit is slechts een geringe opsomming van klinisch belangrijke bacteriën die een celwanddeficiënte vorm kunnen aannemen indien zij onder invloed komen van de juiste stressfactor zoals het antibioticum penicilline (Onwuamaegbu et al., 2005).  3.5.1 Mycoplasma’s De onderzoekers Dienes en Bullivant (1968) hebben morfologisch onderzoek verricht naar mycoplasma’s en de L-vormen van Proteus, Staphilococcus en Streptococcus. De eerst ontdekte L-vormen waren de mycoplasma’s. Dit zijn de kleinste (0.1-0.2 μ) zelfstandige micro-organismen zonder celwand. Zij werden L-vormen genoemd naar het Lister Instituut waar ze voor het eerst werden ontdekt en bestudeerd. De L-vorm kan ook betrekking hebben op de verschijningsvorm in de vorm van een “L”. Door het gedeeltelijk of geheel

53 ontbreken van een celwand hebben dergelijke micro-organismen geen spiraalvorm meer en kunnen allerlei vormen aannemen. Dit geldt ook voor de verschijningsvormen van de vaak mycoplasma-achtige kolonies die vaak lijken op een gebakken ei. L-vormen kunnen gehouden worden op een osmotisch stabiel medium om zodoende lysis te voorkomen. De L-vormen kunnen zich ook vermenigvuldigen. Verder kunnen sommige L-vormen weer transformeren in de oorspronkelijke vegetatieve cellen waarbij de celwand is teruggevormd. Deze L-vormen worden instabiel genoemd. Lvormen die geen reconversie vertonen zijn stabiele vormen en kunnen geen celwanden maken. Men veronderstelt dat mycoplasma’s stabiele L-vormen zijn. L-vormen zijn aangetoond bij infecties van de nieren maar de klinische betekenis is nog niet duidelijk (Elliot et al., 2007). Mycoplasma-achtige kolonies zijn te zien in figuur 3.15 van de onderzoekers PreacMursic et al. (1996b).

Fig. 3.15.Donkerveldmicroscopie.L-vormen van B. burgdorferi s.l. Links, L-vormige kolonie met centrale kern en perifere granulen en ronde lichaampjes die zich naar binnen in het medium uitstrekken. Rechts, granulen die groeien vanaf de periferi van een L-vormige kolonie met centraal een donker areaal en een duidelijk te onderscheiden periferie (PreacMursic et al., 1996b). 

3.5.2 In vitro onderzoek naar sferoplast-, L-vormen met Borrelia burgdorferi s.l.

De onderzoekers Barbour en Hayes (1986) en Kersten et al. (1995) hebben in vitro experimenten met penicilline gedaan waarbij sferoplast-, L-vormen zijn waargenomen bij Borreliae. Preac-Mursic et al. (1996b) hebben het gedrag van B. burgdorferi s.l. in vitro onderzocht bij incubatie met penicilline G. De morfologische veranderingen van de cultuur ontwikkelden zich geleidelijk en namen toe met de lengte van de incubatietijd. Pleiomorfisme zoals uitgerekte spirocheten en sferische structuren werden waargenomen, zoals te zien is in figuur 3.19, na een incubatie van 48 uur met penicilline-G bij 33 ºC (Preac Mursic et al., 1996b).

Fig. 3.16 Scanning- elektronenmicroscopie toont cysten gebonden aan een spirocheet B. burgdorferi s.l.na 48 uur incubatie met penicilline-G in modified Kelly-Pettenkofer (MKP) medium bij 33 graden Celsius (Preac-Mursic et al., 1996b). Andere aspecten die tot uiting kwamen onder invloed van de stressfactor penicilline-G waren het onvermogen van de (celwanddeficiënte) bacteriën om zich te vermenigvuldigen, de lange adaptatietijd om te groeien in een modified-KellyPettenkofer (MKP)- medium en de mycoplasma-achtige koloniën die ontstonden na kweek op een vaste PMR-agar voedingsbodem (Figuur 3.15).Volgens de onderzoekers Preac-Mursic et al. (1996) doen deze verschijnselen veronderstellen dat B. burgdorferi s.l. in vivo onder invloed van antibiotica cysteuze vormen kan aannemen en dat deze vormen de spirocheet in staat zouden stellen om gedurende lange tijd in een organisme te kunnen overleven (Preac-Mursic et al., 1996; Onwuamaegbu et al., 2005). Vooral de celwandsynthese-remmende antibiotica, de bèta-lactaam antibiotica zoals de penicillinen en cefalosporinen, zouden sferoplast-, L-vormen veroorzaken. Deze antibiotica verhinderen de synthese van de peptidoglycanlaag van de celwand van bacteriën. In vitro onderzoek heeft aangetoond dat celwanddeficiënte bacteriën resistent zijn tegen bèta-

54 lactaam antibiotica die hun werking uitoefenen op de celwandsynthese. Bij deze bacteriën ontbreekt immers de celwand. Bacteriostatische antibiotica zullen daarom meer effect hebben op celwanddeficiënte bacteriën door het verhinderen van de eiwitsynthese ter hoogte van de ribosomen. (Onwuamaegbu et al., 2005). In vitro onderzoek heeft aangetoond dat sferoplast-, L-vormen reconversie kunnen vertonen naar de oorspronkelijke bacteriën mèt een celwand ( Mattman, 2001; Onwuamaegbu et al., 2005). In vitro onderzoek toonde verder aan dat cdw-bacteriën van B. burgdorferi s.l. nog steeds actief zijn wat betreft het metabolisme en de eiwitsynthese, aangezien zij in staat waren om het radio-actieve gelabelde aminozuur S-methionine na twee uur in te bouwen. Verder toonde in vitro onderzoek aan dat spirocheten die blootgesteld werden aan een temperatuur van 38ºC, blebvorming vertoonden. Een dergelijke temperatuur zullen de spirocheten tegenkomen in warmbloedige gastheren. Het verlies van de integriteit van de buitenmembraan met daarbij het vrijkomen van flagellen zou een stimulans vormen voor het immuuunsysteem om de productie van antilichamen te starten (Bruck et al., 1995).  3.5.3 In vivo onderzoek naar sferoplast-, L-vormen van Borrelia burgdorferi s.l. In vivo onderzoek bij Lyme-borreliose patiënten die behandeld werden met penicilline en ceftriaxon, toonde sferoplasten aan in de culturen afkomstig van huidbiopsies. De sferoplasten waren van verschillende grootte en dichtheid en er waren spirocheten met een uitgerekte vorm. Verder werden er endoflagellen waargenomen die afkomstig waren van uitééngevallen spirocheten (Preac-Mursic et al., 1996). Deze losse flagellen zouden het immuunsysteem van de gastheer stimuleren tot het maken van antilichamen tegen het flagellin antigeen van de flagellen. Zoals eerder beschreven heeft men gedurende de ziekte van Lyme eerst een piek van de IgM respons in de derde tot de zesde week na het begin van de ziekte. Vervolgens verschijnt de IgG respons ongeveer drie weken na het verschijnen van de IgM respons. De antilichamenresponsen zijn hoofdzakelijk gericht tegen flagellin en de IgG antilichamen kunnen maanden tot jaren aanwezig blijven. (Bruck et al., 1995). In vivo onderzoek heeft verder aangetoond dat spirocheten in de cdw-vorm geen antilichamen-respons veroorzaken van de celwand antigenen OspA en OspB, die gelegen zijn op het oppervlak van de spirocheten. De Elisa en Western Blot zijn dus negatief (Preac-Mursic et al., 1996). Onder invloed van een antibacteriële stressfactor zoals de bèta-lactaam antibiotica, kunnen intakte spirocheten dus overgaan in de celwanddeficiënte vormen. Deze sferoplast-, L-vormen zouden diep in de weefsels kunnen overleven in het lichaam van de gastheer. Er zijn sferoplast-, L-vormen na behandeling met penicilline aangetoond in hartweefsel, synoviaalvocht, bloed en andere lichaamsvloeistoffen (Preac-Mursic et al., 1996). Deze sferoplast-, L-vormen kunnen ook weer overgaan in normale spirocheten (Mattman, 1993). Na het opheffen van de antibacteriële stressfactor of een afname van de immuunrespons van de gastheer, kunnen celwanddeficiënte bacteriën ook weer overgaan in bacteriën met een celwand, waarbij ook de antilichamentiters van OspA en OspB weer aantoonbaar worden. Beide vormen van bacteriën zijn gevonden bij patiënten met infecties zoals meningitis, osteomyelitis, endocarditis en urineweginfecties. In hoeverre celwanddeficiënte bacteriën zèlf een virulente rol kunnen spelen bij genoemde infecties, is nog niet aangetoond (Preac-Mursic et al., 1996; Onwuamaegbu et al., 2005). Er wordt verondersteld dat de celwanddeficiënte spirocheten net als de cysten recidiverende Lyme-borreliosen zouden kunnen veroorzaken na reconversie tot intakte spirocheten mèt een celwand (Mattman , 1993; Preac-Mursic et al., 1996; Onwuamaegbu et al., 2005). De celwanddeficiënte vormen van B. burgdorferi s.l. zijn ook bekend als cysteuze vormen en worden tegenwoordig ook round-bodies genoemd samen met blebs, granulen en cysten (Brorson en Brorson, 2009). 

3.6 SAMENVATTING

Samenvattend zijn diverse voorbeelden van in vitro onderzoek beschreven over de cystevorming door de spirocheet B. burgdorferi s. l.. onder invloed van stressfactoren. De stressfactoren die hier ter sprake zijn gekomen waren achteréénvolgens: serum-starvation, extreme pH’s, oxidatieve stress, temperatuurverhoging, hypotone stress en antimicrobiële stressfactoren. Tevens is aandacht besteed aan een bijzondere cystevorm van B. burgdorferi s.l., namelijk de celwanddeficiënte vorm of de sferoplast-, L-vorm. De onderzoeksvraag van dit hoofdstuk luidt: “Welke invloed hebben de aan- of afwezigheid van diverse stressfactoren op de verschijningsvormen van de spirocheet Borrelia burgdorferi s.l.?” In vitro onderzoek het hierna volgende aangetoond: 1. Onder invloed van de aanwezigheid bovengenoemde stressfactoren is de conversie aangetoond van een intakte mobiele spirocheet naar een onbeweeglijke inerte cyste die bescherming biedt tegen de besproken (antibacteriële) stressfactoren. Een uitzondering hierop vormen de stressfactoren ranitidine bismuth citraat, hydroxychloroquine, tinidazol, grapefruit-seed extract en tigecycline. Deze stoffen kunnen in vitro

55

2.

cysten vernietigen, maar zijn niet actief tegen de mobiele spirocheten van B. burgdorferi s.l., met uitzondering van grapefruit-seed extract en tigecycline die tevens actief zijn tegen mobiele spirocheten in vitro. Onder invloed van de aanwezigheid van de antibacteriële stressfactoren penicillinen en cefalosporinen (de β-lactaam antibiotica) is de conversie aangetoond van een intakte mobiele spirocheet naar een celwanddeficiënte bacterie: de sferoplast-, L-vorm. De bacterie kan verder leven zonder celwand en is zodoende beschermd tegen genoemde antibiotica die hun invloed uitoefenen op de celwandsynthese.

Terugkomend op bovengenoemde onderzoeksvraag met betrekking tot de afwezigheid van de stressfactor, heeft in vitro onderzoek eveneens aangetoond dat na het opheffen van de stressfactor uit zowel de overlevende cysten (1) als uit de sferoplast-, L-vormen (2) weer intakte mobiele spirocheten te voorschijn kunnen komen. Deze reconversie naar een intakte mobiele spirocheet is in vitro aangetoond nà toepassing van de antibiotica penicilline-G, tetracycline, erythromycine en ceftriaxon. Deze antibiotica kunnen in de praktijk worden gebruikt bij de behandeling van de ziekte van Lyme, zoals tot uiting zal komen in hoofdstuk V. In vivo kunnen dezelfde verschijnselen optreden als in vitro onderzoek heeft laten zien. In het volgende hoofdstuk IV zal nader worden ingegaan op het in vivo onderzoek met B. burgdorferi s.l..

----------------

56 HOOFDSTUK IV IN VIVO ONDERZOEK MET BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO 

4.1 INTRODUCTIE

Aansluitend op het in vitro onderzoek van hoofdstuk III, wordt in dit hoofdstuk in vivo onderzoek besproken dat verricht is naar het gedrag van de spirocheet B. burgdorferi s.l., zowel met - als zonder antibioticabehandelingen. Ook zal de persistentie van de Borrelia-spirocheet na een antibioticumtherapie ter sprake komen (Preac Mursic et al., 1987; Berger, 1988, MacDonald 1988; Preac Mursic et al., 1989; Nadelman et al., 1990; MacDonald, 1991; Preac Mursic et al., 1993; Klemper et al., 1993; Fallon en Nields,1994; Kuiper et al., 1994; Bayer et al., 1996; Oksi et al., 1996; Preac Mursic et al., 1996; Preac Mursic et al., 1996; Aberer et al., 1996; Straubinger et al., 1997; Priem et al., 1998; Gruntar et al., 2001; Bockenstedt et al., 2002; Miklossy et al., 2004; MacDonald, 2006a; MacDonald 2006b; MacDonald, 2006c; Miklossy, 2008; Miklossy et al., 2008; Hodzic et al., 2008; Barthold et al., 2010). In dit hoofdstuk komt met betrekking tot het in vivo onderzoek met de spirocheet B. burgdorferi s.l. de volgende onderzoeksvraag aan de orde: “Welke mogelijke implicaties heeft de cystevorming door Borrelia burgdorferi sensu lato voor de behandeling van Lymeborreliose?” 

4.2 IN VIVO ONDERZOEK MET BORRELIA BURGDORFERI S.L. BIJ MUIZEN, GERBILS EN HONDEN

In een studie van Gruntar et al. (2001) werd in vivo onderzoek verricht met een muizenstam BALB/c die intraperitoneaal geënt was met cysten van Borrelia garinii. Het doel van dit onderzoek was te onderzoeken in hoeverre zich intakte beweeglijke spirocheten uit de geënte cysten in de muizen zouden ontwikkelen. Voor het onderzoek werd een spirochetenstam van B. garinii gebruikt die afkomstig was van een muizenhart; de muis in kwestie was geïnfecteerd geraakt door een besmette teek (Gruntar et al., 2001). De cysten van B. garinii werden in vitro gemaakt in steriel gedestilleerd water. De spirocheten gingen binnen één minuut al over in de cystevorm. Na twee uur was meer dan 95% van de beweeglijke spirocheten van B. garinii overgegaan in de cysten. De cysten werden vervolgens intraperitoneaal geënt op 15 muizen. Er werden beweeglijke spirocheten geïsoleerd uit de harten van twee van de vijftien muizen. Voor de onderzoekers Gruntar et al. (2001) was dit een bewijs dat de in dit onderzoek gevormde cysten van B. garinii het vermogen behouden om weer te veranderen in normale mobiele spirocheten, niet alleen in vitro, maar ook in vivo en kunnen daarom beschouwd worden als virulent, tenminste in de onderzochte muizenstam BALB/c (Gruntar et al., 2001).  4.2.1 C3H-muizen en tigecycline Het nieuwe antibioticum tigecycline dat door Brorson et al. (2009) en door Yang et al. (2009) in vitro werd onderzocht, is in vivo bij muizen onderzocht door Barthold et al. (2010). Hierbij werd het antibioticum gegeven aan immunocompetente C3H/HeN (C3H) muizen. Dit zijn specifieke pathogeen-vrije muizen. De C3H-muizen werden subcutaan geënt met een kloon van B. burgdorferi N40 (cN40). Toediening van het antibioticum tigecycline vond plaats 1 week na de besmetting bij één groep muizen verder na 3 weken en na 4 maanden bij twee andere groepen. Dit kwam achtereenvolgens overeen met de vroege disseminatie (1 week), de vroege immuunfase ( 3 weken) en het late stadium (4 maanden) van de infectieziekte Lyme-borreliose (Barthold et al., 2010). De muizen werden gedurende 10 dagen subcutaan ingespoten met met een lage dosis (12.5 mg/kg) of een hoge dosis (50 mg/kg) tigecycline. 12.5 mg/kg zou overeenkomen met de serumconcentraties die bereikt zouden worden bij de mens. Andere groepen besmette C3H-muizen werden behandeld met een 0.9% NaCl-oplossing die diende als controle van een negatief-effect, of de muizen werden behandeld met 16 mg/kg ceftriaxon-oplossing in een 500 μl totaal volume van een 0.9 % NaCl- oplossing, als controle van een positief-effect (Barthold et al., 2010). Weefselculturen Weefsels van de urineblaas en van de entingsplaats werden in cultuurmedia BSK II geplaatst. Alle weefselculturen van alle groepen muizen die behandeld waren met antibiotica in de verschillende infectiestadia waren negatief en de weefselculturen van de muizen die behandeld zijn met een fysiologische zoutoplossing waren positief. PCR Bij iedere C3H-muis werd de polymerase chain reactie (PCR) bepaald van weefsel dat afkomstig was van de entingsplaats, de boezem en ventrikelspier van het hart, de tibiotarsus (deel van scheenbeen bij voetwortel) en de quadriceps (vierhoofdige dijbeenspier). Bij de helft van de muizen die na 1 week besmetting waren behandeld met antibiotica, was de PCR voor OspA positief. Bij alle met antibiotica behandelde muizen van de vroege immuunfase (3 weken) en van de late persisterende fase (4 maanden), waren de PCR”s voor OspA positief. Dit duidde erop dat er DNA van B. burgdorferi -N40 aanwezig was in de onderzochte weefsels, ondanks de behandeling met antibiotica (zie PCR-tabel 4.1 van de late persisterende fase) (Barthold et al., 2010).

57

Tabel 4.1. PCR OspA resultaten van weefsels afkomstig van C3H- muizen die behandeld waren met hoge doses tigecycline, lage doses tigecycline, ceftriaxon of fysiologisch zout 4 maanden na infectie met B. burgdorferi s.l. en waarvan de weefsels werden onderzocht 3 maanden na beëindiging van de antibioticumbehandelingen (Bartold et al., 2010). Transplantaten Verder werd er weefsel van hart en ledematen afgenomen van alle C3H-muizen van de late fase van de infectie (4 maanden) die behandeld waren met hoge doses tigecycline, ceftriaxon of een fysiologisch zout oplossing. Deze weefsels werden vervolgens subcutaan getransplanteerd op immunodeficiënte muizen met de code: C3H. C-PrkdcSCID // crSmnHsd (SCID)-muizen. 4 weken na de transplantaties werden de getransplanteerde SCID-muizen gedood. BSK II-culturen van bloed, urineblaas en weefsel van de transplantatieplaatsen waren negatief voor de SCID- muizen die transplantaten hadden ontvangen van de met hoge doses tigecycline of ceftriaxon behandelde C3H-donormuizen. De PCR voor OspA van weefsels van hart en ledematen was positief bij 4 van de 9 SCID-muizen met hoge doses tigecycline transplantaten en bij 4 van de 10 SCID-muizen met ceftriaxon transplantaten (Barthold et al., 2010). Histologisch onderzoek Er werd verder histologisch onderzoek verricht van gewrichts- en hartweefsel van de getransplanteerde SCID-muizen met transplantaten die afkomstig waren van de met een fysiologisch zoutoplossing behandelde C3H-donormuizen. In alle knie-

58 en tibiotarsal (deel van scheenbeen bij voetwortel) -gewrichten werden ontstekingen aangetoond (artritis), evenals ontstekingen in het weefsel van alle harten (carditis). Er werden echter geen ontstekingen waargenomen bij SCID-muizen met tranplantaten afkomstig van C3H-donormuizen die behandeld waren met hoge doses tigecycline of ceftriaxon (Barthold et al., 2010) (zie tabel 4.2).

Tabel.4.2. Cultuur en OspA PCR resultaten afkomstig van weefsels van SCID muizen 4 weken na transplantaties met weefsels van donormuizen die behandeld waren met hoge doses tigecycline, ceftriaxon of fysiologisch zout 4 maanden na infectie met B. burgdorferi s.l. en waarvan weefsels zijn afgenomen 3 maanden na het beëindigen van de antibioticumbehandelingen (Barthold et al., 2010). Deze resultaten tonen aan dat weefsels van de met antibiotica behandelde muizen spirocheten bevatten die in staat zijn om na transplantatie SCID-muizen te infecteren en die in staat zijn om zich door het hele lichaam te verspreiden, echter zonder artritis of carditis te veroorzaken. Aangezien de SCID-muizen na 4 weken werden gedood, is er verder niet onderzocht of virulentie van de spirocheten misschien later op zou treden. Ook is er geen microscopisch onderzoek gedaan naar mogelijke cysteuze vormen (Barthold et al., 2010). Tekenonderzoek Verder mochten larveteken zich vol bloed zuigen op met B. burgdorferi-N40 besmette C3H- muizen die behandeld waren met hoge doses tigecycline en daarna mochten deze larven overgaan naar het nymfestadium. De nymfen mochten zich vervolgens voeden op immunodeficiënte SCID-muizen waarmee nog niet was geëxperimenteerd. PCR-onderzoek op deze SCID-muizen toonde aan dat weefsels afkomstig van de ventrikelspier en van de quadriceps OspA positief waren. Dus, muizen die behandeld waren met een hoge dosis tygecycline gedurende de late fase van de borrelia-infectie bleven geïnfecteerd met spirocheten die opgenomen konden worden door bloedzuigende teken en vervolgens door teken konden worden overgebracht op SCID-muizen. Het aantal aanwezige spirocheten was echter laag en veroorzaakte geen ontstekingen zoals weefselonderzoek verder aantoonde. Men kan echter niet zeggen of ontstekingen misschien later op zouden treden, aangezien de muizen geen lang leven was gegeven om dit later te onderzoeken (Barthold et al., 2010).  4.2.2 C3H-muizen, ceftriaxon en doxycycline Een eerder onderzoek met muizen werd gedaan door Bockenstedt et al. (2002). In dit onderzoek werden de C3H-muizen geïnfecteerd op natuurlijke wijze via de beet van B. burgdorferi s.l. besmette teken die verzameld waren in het veld. Vervolgens werden één maand na de infectie via tekenbeten de antibiotica ceftriaxon (16mg/kg) of doxycycline (50 mg/kg) of als contrôle een oplossing van fysiologisch zout gedurende 30 dagen toegediend aan de met B. burgdorferi s.l. geïnfecteerde C3H-muizen (Bockenstedt et al., 2002). Tekenlarven mochten een bloedmaaltijd nemen op de geïnfecteerde - en met antibiotica behandelde C3H-muizen en mochten zich verder ontwikkelen tot tekennimfen. Tot 3 maanden na de toediening van antibiotica werden er met xenodiagnose spirocheten in de teken aangetoond; na 6 maanden echter was dit negatief voor zowel teken afkomstig van met antibiotica - als met een fysiologisch zoutoplossing behandelde muizen. De nimfen waren niet langer PCR positief en gaven de infectie niet door aan niet-geïnfecteerde C3H-muizen (Bockenstedt et al., (2002). Verder waren de weefselculturen van bloed, oor, milt en blaas van de met antibiotica behandelde CH3-muizen negatief en toonde histologisch onderzoek geen artritis of carditis aan. Echter, de PCR’s van hart, blaas en gewrichten waren positief; dit betekende dat er nog steeds DNA van B. burgdorferi s.l. in de weefsels aanwezig was bij 4 van de 5 muizen; dit 9 maanden na behandeling met doxycycline. Bij muizen die behandeld waren met ceftriaxon was alleen de PCR van de blaas positief en dit was het geval voor 2 van de 4 met ceftriaxon behandelde muizen. Bij niet geïnfecteerde controlemuizen was de PCR negatief (Bockenstedt et al., 2002).

59  4.2.3 CH3-muizen en ceftriaxon In een ander onderzoek van Hodzic et al. (2008) werden C3H-muizen subdermaal geënt met B. burgdorferi s.l. en 3 weken of 4 maanden na infectie behandeld met 16 mg/kg ceftriaxon intraperitoneaal of fysiologisch zout gedurende 30 dagen. Evaluatie vond plaats 1 en 4 maanden na het beëindigen van de antibioticumtherapieën. Hierbij waren de weefselculturen negatief maar bij sommige met ceftriaxon behandelde muizen was de PCR positief voor het weefsel van hart en tibiotarsus. Hier was dus DNA van B. burgdorferi s.l. aanwezig. De PCR was hoger bij weefsel dat afkomstig was van muizen die 4 maanden na infectie behandeld waren met ceftriaxon, dan van de muizen die al na 3 weken behandeld waren. In het weefsel van hart en tibiotarsus werden met immunohistochemie spirocheten aangetoond; er was geen histologisch bewijs voor ontstekingen van de weefsels (Hodzic et al., 2008). Tekenonderzoek Bij 11 van de 23 met ceftriaxon behandelde C3H-muizen werd een positieve xenodiagnosis geconstateerd; dat wil zeggen dat bij teken die zich gevoed hadden op deze muizen de PCR voor B. burgdorferi s.l. positief was. Teken die zich gevoed hadden op de met ceftriaxon behandelde C3H-muizen mochten zich vervolgens voeden op immunodeficiënte SCID-muizen. De weefselculturen van blaas, oor en inentingsplaats van deze SCID-muizen waren negatief, maar DNA van B. burgdorferi s.l. kon wel worden aangetoond met de PCR, behalve op de plaats van de tekenbeet. Histologisch onderzoek van deze weefsels toonde echter geen ontstekingen aan (Hodzic et al., 2008).  4.2.4 Gerbils, penicilline-G en andere antibiotica Een in vivo onderzoek van Preac-Mursic et al. (1987) naar de effectiviteit van penicilline-G in vergelijking met andere antibiotica werd gedaan met B. burgdorferi s.l. geïnfecteerde gerbils (woestijnratten, renmuizen). Voorafgaande aan dit onderzoek werden eerst in vitro bij diverse antibiotica de MIC’s 50 en - 90 bepaald; dit zijn minimale inhiberende concentraties waarbij respectievelijk 50% en 90% groei-inhibitie van de bacteriën optreedt (zie tabel 4.3). De bacterieculturen waren afkomstig van liquor en huidbiopsies van Lyme-borreliose patiënten.

Tabel 4.3. In vitro activiteit van 12 antibiotica tegen B. burgdorferi s.l. (Preac-Mursic et al., 1987). De antibiotica met de grootste activiteit tegen B. burgdorferi s.l. waren erythromycine, ceftriaxon en cefotaxime met MIC’s 90 van respectievelijk 0.06 mcg/ml, 0.06 mcg/ml en 0.12 mcg/ml. Tetracycline, amoxycilline en lincomycine hadden MIC’s 90 van 0.50 mcg/ml. Bij augmentin en imipenem met MIC’s 90 van 0.25, was de effectiviteit tegen B. burgdorferi s.l. eveneens hoog (zie tabel 4.3) (Preac-Mursic et al., 1987). Vervolgens werden penicilline-G en de antibiotica tetracycline, erythromycine, cefotaxim, ceftriaxon, amoxycilline, augmentin en imipenem toegepast voor het in vivo vergelijkend onderzoek met geïnfecteerde gerbils (gewicht 80-90 gram), die intraperitoneaal geïnfecteerd werden met B. burgdorferi s.l.. In het onderzoek werd aangetoond dat de activiteit van penicilline-G in vivo gering was tegen B. burgdorferi s.l.. Slechts met de hoogste dosering van 320 mg/kg/dag waren de weefselculturen bij 1 van de 5 gerbils negatief (zie tabel 4.4). Voor erythromycine met 400 mcg/kg/dag waren bij 2 van de 4 gerbils de weefselculturen negatief. Tetracycline toonde een grotere activiteit met 50 mg/kg/dag, waarbij 2 van de 3 gerbils negatieve weefselculturen hadden. Voor ceftriaxon en cefotaxim waren met 50 mg/kg/dag bij 2 van de 4 gerbils de weefselculturen negatief. Voor 50 mg/kg/dag amoxicilline en 25 mg/kg/dag augmentin waren bij 2 van de 3 gerbils de weefselculturen negatief. Verder werd een goede activiteit aangetoond met het antibioticum imipenem waarbij met 36 mg/kg/dag alle 3 gerbils negatieve weefselculturen hadden.

60

Tabel 4.4. Therapeutische activiteit van acht antibiotica tegen experimentele infectie met B. burgdorferi s.l. bij gerbils (Preac-Mursic et al., 1987). Deze in vivo resultaten laten zien dat penicilline-G tegen B. burgdorferi s.l. bij gerbils minder effectief is dan oorspronkelijk werd verondersteld (Preac-Mursic et al., 1987).  4.2.5 Persistentie van B. burgdorferi s.l. na antibioticumbehandeling bij honden In een onderzoek van Straubinger et al. (1997) werden werden specifiek- pathogeen- vrije beagles blootgesteld aan Ixodes scapularis teken die verzameld waren in een bosrijke omgeving in de maanden april en november. Op iedere hond werden gedurende 7 dagen 15 volwassen vrouwelijke teken en 7 mannelijke teken geplaatst.Om na te gaan of de teken Borrelia burgdorferi s.l. spirocheten bevatten, werden van iedere collectie teken er 20 overgebracht naar een BSK II medium en gedurende 6 weken in cultuur gehouden. Van de 20 voorjaars-teken waren er 10 culturen positief en van de 20 najaarsteken waren 12 culturen positief voor B. burgdorferi s.l.. Verder werden er twee beagels als niet-geïnfecteerde controle honden gehouden. Gedurende twee maanden na de blootstelling aan de teken werden de honden gecontroleerd op een Lyme-borreliose infectie. Hierbij kon B. burgdorferi s.l. geïsoleerd worden en huidbiopsies, afgenomen naast de plaatsen van de tekenbeten, lieten een positieve polymerase chain reactie (PCR) zien voor het DNA van de spirocheet. Vervolgens werd een 30-dagen antibioticumbehandeling gestart. Hierbij kregen zes honden twee maal daags 50 mg doxycycline (10 mg/kg), vier honden drie maal daags 100 mg amoxicilline (20 mg/kg) en twee honden twee maal daags 100 mg amoxicilline. Verder bleven zes geïnfecteerde honden onbehandeld als controles (Straubinger et al., 1997). Binnen twee weken na de aanvang van de antibioticumbehandelingen waren de culturen van de huidbiopsies van de behandelde honden negatief geworden voor Borrelia spirocheten. De honden werden ongeveer zes maanden na de behandeling ge-euthanaseerd en verder onderzocht. In dit onderzoek werd met de antibioticumbehandelingen gewrichtsontstekingen voorkomen of genezen in vijf van de zes doxycycline-honden en in vijf van de vijf amoxicilline-honden. Maar huidbiopsies en weefsels van hart, buikvlies, hersenen, lymfeklieren, spieren en pezen van de poten en synoviaalmembranen, die tijdens autopsie waren verzameld, bleven positief voor de PCR. Er was dus nog steeds Borrelia- DNA aanwezig in de afgenomen weefsels zes maanden na het beëindigen van de antibioticumtherapieën (Straubinger et al., 1997). Zes maanden na de antibioticumbehandeling kon de persistentie van B. burgdorferi s.l. worden aangetoond in culturen van twee met doxycycline behandelde honden en van één met amoxicilline behandelde hond. Van zes onbehandelde geïnfecteerde controle honden waren de culturen voor B. burgdorferi s.l. positief en bij vier van deze honden werden gewrichtsontstekingen gevonden (Straubinger et al., 1997). Bij alle honden daalden de antilichamentiters tegen B. burgdorferi s.l. na de antibioticumbehandelingen en werden negatief bij vier van de zes doxycycline-honden en bij vier van de zes amoxicilline-honden. Echter zes maanden na het beëindigen van de antibioticumbehandelingen begonnen de antilichamentiters weer te stijgen. Volgens de onderzoekers werd dit

61 veroorzaakt door de proliferatie van overlevende spirocheten, die zou kunnen leiden tot een relapsus van de infectieziekte Lyme-borreliose (Straubinger et al., 1997). 

4.3 IN VIVO ONDERZOEK BIJ LYME-BORRELIOSE PATIËNTEN

Na een antibioticumbehandeling krijgen Lyme-borreliose patiënten vaak te maken met een recidief of een persisterende infectie waarvan hier enkele studies zullen worden aangehaald. 

4.3.1 Behandeling van Lyme-borreliose patiënten met erythema chronicum migrans

Tussen juni 1981 en juli 1987 werden door Berger (1988) 215 patiënten behandeld voor erythema chronicum migrans (ECM) van Lyme-borreliose. Er werden verschillende antibiotica gebruikt waaronder penicilline V, benzathine penicilline G, tetracycline, erythromycine en minocycline. Van de 80 patiënten met een geringe vorm van de ziekte van Lyme, dat wil zeggen alleen een ECM en wat griepachtige verschijnselen, moesten 2 patiënten (2.5%) herbehandeld worden. Van 81 patiënten met een ernstige vorm van de ziekte van Lyme, zoals multiple ECM of een ECM met koorts, hevige spierpijnen, hoofdpijn en moeheid, moesten 17 patiënten (21%) een nieuwe antibioticumbehandeling ondergaan. De onderzoeker vond het destijds te vroeg om conclusies te trekken over een effectieve antibioticumbehandeling bij het ECM van Lyme borreliose (Berger, 1988). 

4.3.2 Persistentie van B. burgdorferi s.l. na antibioticabehandeling

Preac-Mursic et al. (1989) toonden in vivo de persistentie aan van B. burgdorferi s.l. in cerebrospinaal vloeistof en biopsies van de huid na therapie met penicilline-G, penicilline-V, tetracycline en ceftriaxon. B. burgdorferi s.l. kon worden aangetoond in cerebrospinaal vloeistof in een tijdsbestek van 3-8 maanden na een antibioticumbehandeling en in huidbiopsies 3 maanden na het beëindigen van een antibioticumkuur en het verdwijnen van erythema migrans (PreacMursic et al., 1989). Er werden 6 patiënten met Lyme-borreliose onderzocht, waarvan er 3 patienten met neuroborreliose en 3 patiënten met erythema migrans. De onderzoekers vonden bij 3 neuroborreliose patiënten positieve culturen van de liquor na behandeling met antibiotica: - casus 1: 14 dagen penicilline V en 10 dagen doxycycline, positief na 7 maanden; - casus 2: 10 dagen penicilline G, positief na 3 maanden; - casus 3: 10 dagen ceftriaxon, positief na 7.5 maanden. Verder werden bij 3 patiënten met erythema migrans positieve huidbiopsies gevonden na behandeling met antibiotica: - casus 4: 12 dagen Penicilline V, positief na 3 maanden; - casus 5: 10 dagen Penicilline G, positief na 2 maanden; - casus 6: 10 dagen doxycycline, positief na 1 maand (Preac-Mursic et al., 1989). 

4.3.3 B. burgdorferi s.l. in bloed van Lyme-borreliose patiënten

In een onderzoek van Nadelman et al. (1990) werden van 104 Lyme-borreliose patiënten 132 bloedmonsters afgenomen voor culturen met het Barbour-Stoenner-Kelly medium. Van de 132 bloedculturen waren er zeven positief bevonden voor B. burgdorferi s.l, waarbij de eerste tekenen van een positieve cultuur zichtbaar werden na een incubatietijd van vier weken. Bij de bloedafname waren de zeven patiënten met bacteriëmie (bacterie in het bloed) gemiddeld vijf dagen ziek geweest en drie patiënten van de zeven herinnerden zich een recente tekenbeet. Vier patiënten hadden erythema migrans, twee hadden facialis paresis (aangezichtsverlamming) en één patiënt had griepachtige verschijnselen zonder erythema migrans.Van de 19 patiënten met het kenmerkende erythema migrans waren er vier (21%) met een positieve bloedcultuur voor B. burgdorferi s.l. Van de vijf patiënten met facialis paresis waren er twee (40%) met een positieve bloedcultuur. Vijf (71%) van de zeven patiënten hadden last van persisterende symptomen gemiddeld vier maanden na de behandeling met het oraal toegepaste antibioticum tetracycline. Van de 97 negatieve bloedculturen waren er slechts 30 patiënten bij wie de diagnose Lyme-borreliose gesteld kon worden op basis van seropositieve antilichamentesten of op basis van de aanwezigheid van het erythema migrans (Nadelman et al., 1990). 

4.3.4 Klinische gevolgen door trage celdeling van B. burgdorferi s.l.

In een onderzoek van MacDonald et al. (1991) werden van 63 patiënten met erythema migrans huidbiopsies afgenomen op de plaats van het erythema. De biopsies werden overgebracht naar een Barbour-Stoenner-Kelly medium en na een incubatietijd variërend van 2.5 - tot wel 10.5 maand waren 16 culturen van de huidbiopsies positief voor de spirocheet B. burgdorferi s.l.. De onderzoekers veronderstellen dat de spirocheet B. burgdorferi s.l. onder bepaalde omstandigheden in vitro en in vivo een langere delingstijd heeft dan de in vitro gebruikte stam B31met een delingstijd van 6 tot 12 uur (MacDonald et al., 1991). Als men er van uit gaat dat een antibioticum alleen de zich actief delende spirocheten doodt en dat deze Borrelia spirocheten zich niet delen tijdens een antibioticumkuur, dan kunnen deze overleven in de gastheer met als mogelijk gevolg een recidiverende Lyme-borreliose. De onderzoekers zijn van mening dat sommige Lyme-borreliose patiënten een langere

62 antibioticumkuur nodig hebben dan de aanbevolen behandeling van twee tot drie weken om langzaam delende Borrelia soorten te elimineren (MacDonald et al., 1991). 

4.3.5 Borrelia burgdorferi spirocheten in humane huidfibroblasten

De onderzoekers Klempner et al. (1993) toonden in een in vitro onderzoek aan dat spirocheten van B. burgdorferi s.l. binnen 24-48 uur in staat waren zich vast te hechten aan een cellaag van humane fibroblasten. Na toevoeging van 1 μg/ml ceftriaxon gedurende 5 dagen, werden de spirocheten van het celoppervlak van de fibroblasten verdreven. Nader onderzoek van de fibroblasten toonde aan dat bewegende spirocheten zich bevonden in de peri-nucleaire regio van de cellen. Ondanks antibioticumconcentraties die > of = 10 maal de minimale bactericide concentratie waren, boden de fibroblasten gedurende < of = 14 dagen bescherming aan de spirocheten. De onderzoekers veronderstellen dat B. burgdorferi s.l. behoort tot één van de weinige bacteriën die chronische infecties kunnen veroorzaken door zich te huisvesten in gastheercellen, waar ze beschermd zijn tegen sommige antibiotica en tegen de immuunrespons van de gastheer (Klempner et al., 1993). 

4.3.6 B. burgdorferi s.l. in irisbiopsie

De onderzoekers Preac-Mursic et al. (1993) toonden voor het eerst B. burgdorferi s.l. aan in een irisbiopsie nadat een patiënt met chronische recurrerende uveïtis (ontsteking van het oog) verschillende malen was behandeld met het antibioticum doxycycline. De patiënt werd sedert 1985 behandeld met corticosteroïden. Er werd toen niet getest op Lymeborreliose. Dit werd wel gedaan in 1988 waarbij de IgG antilichamentiter tegen B. burgdorferi s.l. positief was en de IgM was negatief. De patiënt werd behandeld met doxycycline 200 mg/dag gedurende 4 weken. Hierna daalde de IgG antilichamentiter. In 1989 werd de patiënt opnieuw behandeld met doxcycycline 200 mg/dag gedurende 4 weken nadat de IgG’s voor Lyme herhaaldelijk positief waren. In 1991 werd de patiënt gehospitaliseerd wegens een acute panuveïtis. De Lyme Elisa (IgG) was 593 U (normaal < 200 U). Uit de irisbiopsie werd B. burgdorferi s.l. gekweekt (Figuur 4.1) (PreacMursic et al., 1993).

Fig. 4.1. Borrelia burgdorferi s.l. afkomstig van een irisbiopsie (donkerveldmicroscopie x 600) (Preac-Mursic et al., 1993). 

4.3.7 De PCR voor het aantonen van Borrelia burgdorferi- DNA na behandeling met antibiotica

In een onderzoek van Bayer et al. (1996) werd de urine van 97 patiënten met de ziekte van Lyme onderzocht op Borrelia DNA met behulp van de polymerase chain reactie (PCR). De patiënten hadden allemaal erythema chronica migrans vertoond na de beet van een Ixodes damminii teek. De patiënten werden behandeld met antibiotica die gewoonlijk toegepast werden bij Lyme-borreliose namelijk de bèta-lactam antibiotica zoals de penicillinen en de cefalosporinen; de tetracyclinen zoals tetracycline en doxycycline; de macroliden zoals erythromycine, azithromycine en clarithromycine. Alle patiënten werden continu met antibiotica behandeld variërend van 3 weken tot 2 maanden. De meeste patiënten werden na een pauze van een paar weken opnieuw met antibiotica behandeld gedurende 1 tot 4 maanden. Bij langere behandelingen werden antibioticakuren afgewisseld met een therapie-vrije periode van enkele weken (Bayer et al., 1996). Bij 72 (74.2%) van de 97 patiënten was de PCR van de urine voor B. burgdorferi s.l. positief na behandelingen met antibiotica. De aanwezigheid van Borrelia- specifiek DNA dat is aangetoond met de PCR, is een indicator voor de persistentie van de spirocheet B. burgdorferi s.l. in het lichaam van de patiënt (Bayer et al., 1996). Verder was bij 25 patiënten (25.7%) de PCR negatief; vijf patiënten werden pas behandeld na 10-16 maanden na het uitbreken van erythema chronicum migrans en kregen een antibioticabehandeling van 2 tot 4 maanden. Zeven patiënten met een negatieve PCR werden pas behandeld na een periode van 8 maanden tot enkele jaren, na het begin van de chronische Lyme-borreliose symptomen en kregen antibioticatherapieën gedurende 6 tot 2 jaar. De negatieve PCR’s van deze patiënten ondersteunden de veronderstelling dat lange intensieve antibioticabehandelingen er uiteindelijk toe bijdragen om de spirocheten te doden, ondanks de late aanvang van de behandeling (Bayer et al., 1996).

63 De meeste patiënten in de studie kregen na een antibioticum-vrije periode van enkele maanden weer te maken met neurologische aandoeningen en gewrichtsontstekingen, ondanks intensieve antibioticabehandelingen. zodat nieuwe antibioticumtherapieën werden overwogen (Bayer et al., 1996). In een studie van Oksi et al. (1996) werd de polymerse chain reactie (PCR) toegepast bij het onderzoek van hersenweefsel bij drie Lyme-neuroborreliose patiënten. Histologisch onderzoek van het hersenweefsel toonde bij alle drie de patiënten perivasculaire (rondom de vaten) of vasculaire ontstekingshaarden aan met lymfocyten. Bij de eerste patiënt (I) werden met histologisch onderzoek en magnetic resonance imaging (MRI) grote demyelinisatie-gebieden aangetoond in de periventriculaire (rondom de hersenkamers) gebieden van de witte stof in de hersenen. De infectieziekte werd deze patiënt fataal (Oksi et al., 1996). De tweede neuroborreliose patiënt (II) was een kind met als belangrijkste symptoom hemiparese, een onvolkomen verlamming aan één zijde van het lichaam. De derde neuroborreliose patiënt (III) had epileptische aanvallen. De MRI toonde bij deze patiënt multifocale (meerdere plaatsen) infectiehaarden aan in de hersenen Oksi et al., 1996). Het DNA van B. burgdorferi s.l. kon direct worden aangetoond met de PCR in ontstoken hersenweefsel van patiënten I en III en in de liquor cerebrospinalis, in plasma of in beenmerg bij alle drie de patiënten. Verder waren de antilichamen IgM en IgG tegen B. burgdorferi s.l. die bepaald werden met de ELISA, in de liquor cerebrospinalis negatief. Na herhaalde antibioticumbehandelingen verbeterde de toestand van de patiënten II en III aanzienlijk. De PCR’s van de patiënten I, II en III bleven respectievelijk 8 -, 16 - en 0 maanden na de aanvang van de antibioticabehandelingen positief. De aanwezigheid van DNA van B. burgdorferi s.l. in de infectiehaarden deed de onderzoekers veronderstellen dat focale encephalitis bij Lyme-neuroborreliose zou kunnen ontstaan door een directe invasie van het hersenweefsel door de spirocheet B. burgdorferi s.l.(Oksi et al., 1996). In een studie van Priem et al. (1998) werden vier patiënten (1,2,3,4) met een persisterende Lyme-artritis onderzocht. Ondanks antibioticabehandelingen met ceftriaxon en doxycycline hielden de gewrichtsontstekingsklachten aan. Voor dit onderzoek werd de polymerase chain reactie (PCR) toegepast om DNA van de bacterie B. burgdorferi s.l. aan te tonen in het synoviaalmembraan, de synoviaalvloeistof en de urine. Bij alle vier de patiënten was de PCR negatief voor de synoviaalvloeistof en de urine, maar positief voor het synoviaalmembraan (Priem et al., 1998). De onderzoekers veronderstellen dat negatieve PCR resultaten van de synoviaalvloeistof na een antibioticumbehandeling nog geen indicatie is dat Borrelia- DNA intra-articulair verdwenen is. Men dient met de PCR zowel de synoviaalvloeistof als het synoviaalmembraan te onderzoeken op DNA van B. burgdorferi s.l., daar er volgens de onderzoekers sterke aanwijzingen zijn voor een aanhoudende infectie bij een positieve PCR van het synoviaalmembraan. De patiënten kregen aanvullende antibioticabehandelingen die bestonden voor patiënten 1,2 en 4 uit drie weken cefotaxim, gevolgd door zes weken doxycycline of minocycline. Patient 3 kreeg twee weken imipenem, gevolgd door zes weken doxycycline. Binnen zes maanden verdween de Lyme-artritis geheel bij alle vier patiënten en er was geen terugval na een gemiddelde observatieperiode van 18 maanden (Priem et al., 1998). 

4.3.8 Positieve biopsieculturen na behandeling met antibiotica

In een in vivo onderzoek van Preac-Mursic et al.(1996) werden Lyme-borreliose patiënten behandeld met de antibiotica cefotaxim, doxycycline of ceftriaxon; met of zonder ibuprofen of corticosteroïden (zie verder tabel 4.5). Er werden na de behandeling met antibiotica biopsies afgenomen van kniegewrichten, huid, synovia van de hand en van de mitralisklep van het hart. De biopsieculturen werden gedurende 5-15 weken bij 33ºC in MKP medium gehouden. Analyses met donkerveldmicroscopie toonde de persistentie aan van B. burgdorferi s.l. in de culturen van genoemde biopsies, dus na behandeling met antibiotica. Tevens werden de antilichamen IgM en IgG bepaald in bloed en lumbaalvocht met de indirecte immunofluorescentie test (IFT) en met de ELISA. Hierbij werd aangetoond dat er bij een Lyme-borreliose infectie geen antilichamen aanwezig behoeven te zijn (zie tabel 4.5 ter illustratie )(Preac-Mursic et al., 1996a).

64

Tabel 4.5. Patiënten met persistentie van Borrelia burgdorferi s.l. na antibiotica therapie. Klinische en microbiologische resultaten (Preac- Mursic et al., 1996a). In een ander in vivo onderzoek van Preac-Mursic et al. (1996b) werden bij 60- tot 80% van de patiënten nà behandeling met de antibiotica penicilline-G en ceftriaxon, overlevende spirocheten gevonden in de afgenomen patiëntenspecimen liquor, huidbiopsies en bloed. De spirocheten hadden vaak een atypische vorm met oppervlakkige spiralen en de spiraalvorm was dikwijls uitgerekt. De cellen vertoonden soms granulen. Sferische structuren (sferoplast-, L-vormen), en membraanblebs werden ook waargenomen.(Zie ook paragraaf 3.5 celwanddeficiënte bacteriën) (Preac-Mursic et al., 1996b).

65

Fig. 4.2. Sferoplasten cultuur van Borrelia burgdorferi s.l. afkomstig van Lyme-borreliose patiënt die behandeld werd met penicilline en ceftriaxon. Fig.4.2a. Donkerveldmicroscopie van 4 dagen oude cultuur in MKP-medium bij 33ºC; sferoplasten van verschillende afmetingen en dichtheden. Fig. 4.2b. en 4.2c. Scanning electronen microscopie van uitgerekte spirocheten met 3.18b tubili en 3.18c hangende sferoplasten en vrijgekomen endoflagellen van opengebarste borreliae. Bars: 1 μm (Preac-Mursic et al., 1996b). Bij patiënten die geen antibioticumbehandeling hadden gekregen werden intakte spirocheten geïsoleerd. Verder waren de culturen van liquor en huidbiopsies bij de onbehandelde patiënten eerder positief (2-4 subculturen) dan bij de behandelde patiënten (5-15 subculturen) (Preac-Mursic et al., 1996b). 

4.3.9 Positieve culturen van huidbiopsies bij patiënten met Lyme-dermatitis

In een onderzoek van Aberer et al. (1996) werden huidbiopsies onderzocht van onbehandelde patiënten met erythema chronicum migrans (ECM) en acrodermatitis chronicum atroficans (ACA). Bij 9 patiënten met ECM en bij 3 patiënten met ACA waren de culturen van de huidbiopsies positief. In de positieve culturen van de ECM patiënten werden vrije normale spirocheten en aggregaten hiervan aangetoond. Ook waren er spirocheten met een afwijkende morfologie, zoals een uitgerekte spiraalvorm of samengeklonterd met granulen langs de assen. Grotere granulen (0.2-0.4 μm) werden gevonden in ontstekingshaarden van de huid, overeenkomstig in vitro culturen onder stresscondities. Ook werden spirocheten waargenomen in macrofagen en in de epidermis. Grote granulen of sferoplastvormen (“gemmae”) met een grootte van 1-3 μm werden aangetoond in collageenvezels van de huid, vergelijkbaar met cysten zoals die aangetoond zijn in vitro experimenten. Seropositieve patiënten vertoonden samengeklontering en agglutinatie van borreliae in huidweefsel, terwijl bij de seronegatieve patiënten kolonievorming van spirocheten optrad. Door kolonievorming en het zich verbergen in collageenweefsel hebben de spirocheten de mogelijkheid om te ontsnappen aan het immuunstelsel; dit kan resulteren in seronegativiteit (Aberer et al., 1996). Ondanks een antibioticumtherapie vertoonde een seronegatieve patiënt 6 maanden na het ECM neuralgiën. Hierbij werden in biopsies peri-neurale staafvormige borrelia structuren aangetoond. In biopsies van ACA patiënten werden geagglutineerde in elkaar gedraaide spirocheten waargenomen; dit kwam overeen met de geklonterde stervende borreliae van de cultuurexperimenten. In biopsies afkomstig van ontstekingshaarden in de huid werden verspreid fijne -, slangachtige organismen waargenomen evenals kleine granulen tussen de degenererende collageenvezels.

66 De sterke affiniteit van B. burgdorferi s.l voor collageenweefsel is eerder aangetoond in het steunweefsel van synoviaalmembranen, in trabeculae (bindweefsel) van de milt en de sinusoïden van de lever. Borreliae zouden worden aangetrokken door de extra-collagene matrix die bestaat uit zure glucosaminoglycanen met N-acetylglucosamine en glucose als belangrijkste bestanddelen die beide essentieel zijn voor de in vitro culturen van Borreliae (Aberer et al., 1996). Onderzoek van Kuiper et al. (1994) bij 7 patiënten van wie er 6 erythema migrans (EM) hadden gehad en bij wie het EM zonder antibioticumbehandeling was verdwenen, toonde aan dat B. burgdorferi s.l. nog steeds aanwezig was op de plaats van het oorspronkelijke EM. Voor dit onderzoek werden na 1 tot 6 maanden na het verdwijnen van het EM huidbiopsies van de patiënten afgenomen en deze biopsies werden gedurende 8 weken incubeerd in Kelly”s medium bij 33ºC. Alle culturen waren positief; dit betekende dat er beweeglijke spirocheten te zien waren met donkerveldmicroscopie. Er was ook een zevende patiënt bij wie zich geen EM had ontwikkeld en bij wie op de plaats van de tekenbeet 2 maanden later een huidbiopsie was afgenomen. Ook deze cultuur was positief. PCR-onderzoek toonde aan dat B. garinii aanwezig was bij 6 patiënten en B. afzelii bij 1 patiënt (Kuiper et al., 1994). 

4.3.10 Atypische spirocheten en cysten in hersenweefsel bij neuroborreliose patiënten met dementie

Bij spirocheten van B. burgdorferi s.l. komt invasie van het centrale zenuwstelsel voor en de persisentie van de bacteriën na antibioticumtherapieën waaronder penicilline-G (Preac-Mursic et al.,1989; Miklossy et al., 2008; Miklossy, 2008). Cysten van B. burgdorferi s.l. zijn gevonden in de liquor cerebrospinalis (MacDonald, 2006a). Er is een toenemend bewijs dat de spirocheten van B. burgdorferi s.l. zich weten te handhaven in geïnfecteerd weefsel, met inbegrip van de hersenen, en dat de belangrijkste pathologische symptomen worden veroorzaakt door de spirocheten op de aangetaste plaatsen, (Miklossy et al., 2004). Ook bij de late Lyme-neuroborreliose zijn meningovasculaire en parenchymateuze vormen aangetoond evenals bij de late neurosyfilis (zie hoofdstuk VI) (Miklossy et al., 1990; Miklossy et al., 2004). Analoog aan de tertiaire neurosyfilis zouden deze beschadigingen de morfologische basis kunnen vormen voor progressieve dementie (Miklossy, 2008). Hierbij zouden wegens het intracellulaire verblijf van de spirocheten in neuronen en gliacellen, de hersencellen ontregeld kunnen raken met mogelijke apoptosis tot gevolg en vele neurologische klachten waaronder progressieve dementie (Miklossy et al., 2008, Miklossy, 2008). Een mogelijk senario voor de apoptosis van de hersencellen is volgens MacDonald (2006c) een destructie van de cellen die van binnen uit gaat en veroorzaakt wordt door kleine cysten van B. burgdorferi s.l. die het cytoplasma van de gastheercelllen in bezit hebben genomen. Een ander senario voor de destructie van gastheercellen zou kunnen bestaan uit het geheel opnemen van de cellen door grotere cysten van de spirocheet: een destructie van buiten af (MacDonald, 2006c). De eerste waarnemingen van het voorkomen van dementie bij chronische Lyme-neuroborreliose werden ongeveer 20 jaar geleden gemeld (MacDonald, 1988). Het aantal neuroborreliose patiënten met cognitieve stoornissen neemt steeds verder toe. Veel psychiatrische stoornissen worden in verband gebracht met de chronische neuroborreliose zoals: paranoïa, dementie, schizofrenia, manische depressiviteit, anorexia nervosa. 26-66% van de chronische neuroborreliose patiënten hebben te lijden van depressies. Artsen die werken in een endemisch gebied voor Lyme-borreliose dienen deze infectieziekte in hun differentiaaldiagnose te betrekken (Fallon en Nields, 1994). Gevallen van dementie en subacute preseniele dementie bij Lyme-borreliose patiënten werden waargenomen door de onderzoekers Fallon en Nields (1994) en Miklossy et al. (2004). Bij gevallen van dementie zijn Borrelia spirocheten in de hersenen gevonden of deze konden worden gekweekt uit hersenweefsel, zoals bij drie patiënten met een langzame progressieve dementie, waarbij de culturen uit hersenweefsel voor B. burgdorferi s.s positief waren (MacDonald, 1988; Miklossy et al., 2004). Culturen van de cerebrale cortex en hippocampus van een overleden Alzheimer patiënt waren positief voor de Borrelia spirocheet. Verder werden er met donkerveldmicroscopie cysten waargenomen in culturen en coupes van de hippocampus (MacDonald, 1988; MacDonald 2006a). Volgens MacDonald (2006a) zouden uit de cysten van B. burgdorferi s.l. in de hersenen de ronde plaques bij de ziekte van Alzheimer kunnen ontstaan. Miklossy et al. (2008) onderzochten hersenweefsel van drie patiënten met pathologische en serologische bevestiging van Lyme-neuroborreliose en met de ziekte van Alzheimer. De patiënten waren 74, 78 en 86 jaar oud. Histologisch onderzoek toonde zowel extra- als intracellulair atypische vormen aan van de spirocheet B. burgdorferi s.l., zoals cysten, opgerolde vormen en granula. Deze atypische spirocheten en cysten zagen er net zo uit zoals aangetoond bij in vitro onderzoek onder ongunstige omstandigheden van culturen uit geïnfecteerd celweefsel. Na overplaatsing van de culturen met atypische spirocheten en cysten naar een BSK-II medium, kon men met succes uit de cysteuze vormen weer normale spiraalvormige spirocheten kweken. De culturen van twee patiënten bleken de spirocheten B. burgdorferi sensu stricto (s.s.) te bevatten (Miklossy et al., 2008).

67 Verder weefselonderzoek met bevroren coupes van de hippocampus en de cerebrale cortex, afkomstig van de drie chronische neuroborreliose patiënten, toonde zowel intracellulair als extracellulair atypische spirocheten en cystenvormen aan. Volgens de onderzoekers Miklossy et al. (2008) zouden deze meer resistente spirochetenvormen en hun intracellulaire locatie in neuronen en gliacellen de oorzaak kunnen zijn van de lange latente fase en het aanhouden van de borrelioseinfectie. Het intracellulaire verblijf van B. burgdorferi s.l. doet veronderstellen dat dit kan leiden tot dysfunctioneren en apoptosis van zenuwcellen. Het opsporen en herkennen van atypische spirocheten, cysten en granula in geïnfecteerd weefsel is essentieel voor de diagnose en behandeling van Lyme-borreliose, aangezien de typische spiraalvorm van de spirocheet B. burgdorferi s.l. niet aanwezig behoeft te zijn volgens de onderzoekers MacDonald (2006b) en Miklossy et al. (2008).  4.4 SAMENVATTING Onderzoek in vivo met geënte cysten van B. garinii in muizen toonde aan dat uit de cysten intakte spirocheten te voorschijn kwamen (Gruntar et al., 2001). Onderzoek in vivo met B. burgdorferi s.l. geïnfecteerde muizen die behandeld waren met antibiotica, toonde negatieve weefselculturen aan, maar de PCR”s van de weefsels waren positief en in collageen rijke weefsels werden spirocheten waargenomen. Verder mochten larven van Ixodes teken zich voeden op de met B. burgdorferi s.l. geïnfecteerde muizen nà de behandeling met antibiotica. Hierbij werden spirocheten opgenomen door de larventeken en deze spirocheten werden vervolgens door de zich inmiddels tot nimfen ontwikkelde teken overgebracht op immunodeficiënte SCID-muizen. De weefselculturen van de SCID-muizen waren negatief, maar de PCR’s waren positief. Ondanks behandelingen met antibiotica bleven de muizen geïnfecteerd met spirocheten. Onderzoek met B. burgdorferi s.l geïnfecteerde gerbils heeft aangetoond dat weefselculturen na antibioticabehandelingen positief kunnen blijven voor de spirocheet. Onderzoek met B. burgdorferi s.l. geïnfecteerde honden heeft aangetoond dat ondanks een antibioticumtherapie met doxycycline of amoxicilline, er zes maanden na het beëindigen hiervan nog altijd DNA van B. burgdorferi s.l. in de weefsels aanwezig was. Ook waren er positieve culturen waarin de spirocheten aangetoond konden worden. Verder werden bij Lyme-borreliose patiënten tijdens antibioticumbehandelingen met penicilline-G en ceftriaxon, cysteuze vormen aangetoond in liquor, huidbiopsies en bloed. Bij patiënten die geen antibioticumbehandeling hadden gekregen werden intakte spirocheten geïsoleerd. Verder waren de culturen van liquor en huidbiopsies bij de onbehandelde patiënten eerder positief (2-4 subculturen) dan bij de behandelde patiënten (5-15 subculturen). In vivo is de persistentie van B. burgdorferi s.l. aangetoond nà een antibioticumtherapie in cerebrospinaal vloeistof, in biopsies van de huid, het hart, de gewrichten en de iris. In hersenweefsel van chronische neuroborreliose patiënten zijn zowel spirocheten als cysten gevonden.” Het onderzoek in vivo leidt tot het antwoord van de volgende onderzoeksvraag: “Welke mogelijke implicaties hebben de cyste- en celwanddeficiëntevorming door Borrelia burgdorferi sensu lato voor de behandeling van Lyme-borreliose?” Het in vitro onderzoek (hoofdstuk III) heeft laten zien dat de spirocheet Borrelia burgdoeferi sensu lato uiterst gevoelig is voor de omstandigheden waarin hij zich bevindt. In vitro onderzoek heeft de morfologische veranderingen laten zien van normale beweeglijke spirocheten naar inerte cystevormen onder invloed van antibacteriële stressfactoren. Deze morfologische overgangen werden waargenomen met donkerveldmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie. Onderzoek in vivo heeft aangetoond dat er bij Lyme-borreliose patiënten eveneens cystevorming kan plaatsvinden tijdens de behandeling met antibiotica. De cystevorming tijdens de antibioticumbehandeling verandert het klinische beeld. De inerte cyste geeft geen antilichamenstimulans meer af via antigenen. Tijdens de antibioticumtherapie worden virulente spirocheten of gedood of gaan voor onbepaalde tijd over in de cystevorm, met als gevolg dat de Lyme-borreliose patiënt van zijn klachten afkomt. Men denkt genezen te zijn van Lyme-borreliose. Onderzoek in vitro heeft eveneens aangetoond dat na het opheffen van de antibacteriële stressfactoren de gevormde cysten of celwanddeficiënte bacteriën weer over kunnen gaan in normale mobiele spirocheten. Dergelijke transformaties kunnen zich ook in vivo voordoen, getuige de in vivo studies van de persistentie van spirocheten en/of Borrelia- DNA na het behandelen met antibiotica. Het beëindigen van de antibioticumkuur bij Lyme-borreliose patiënten houdt in dat de antibacteriële stressfactor langzaam maar zeker verdwijnt en dat de omstandigheden weer gunstig worden voor de spirocheten om uit hun intra-, of extracellulaire schuilplaatsen te komen. Het gevolg is dat er in vivo uit de gevormde cysten of celwanddeficiënte bacteriën na onbepaalde tijd, weer virulente spirocheten te voorschijn kunnen komen. Deze normale mobiele spirocheten kunnen opnieuw klachten veroorzaken die

68 zich ook elders in het lichaam kunnen manifesteren dan op de plaatsen van de voorgaande infecties en waarbij verscheidene (andere) organen aangetast kunnen worden. De patiënt kan dus te maken krijgen met een relapsus. Recidieven vereisen opnieuw een antibioticumbehandeling. Tot op heden zijn de meeste behandelingen alleen gericht tegen de normale mobiele spirocheten en niet tegen de cysten of andere cysteuze vormen van B. burgdorferi s.l.. Volgens de onderzoekers Brorson en Brorson ( 2001), Brorson en Brorson (2002), Brorson en Brorson (2004), Brorson en Brorson (2007) en Brorson en Brorson (2009) zou men niet alleen de antibacteriële behandeling moeten richten op de mobiele intakte spirocheten, maar tevens op de cysten, zowel intra- als extracellulair, om zodoende een effectieve behandeling van Lyme-borreliose te bereiken.

----------------

69 HOOFDSTUK V BEHANDELINGSRICHTLIJNEN VOOR LYME-BORRELIOSE 

5.1 INTRODUCTIE

In dit hoofdstuk staat de behandeling van de ziekte van Lyme centraal. In verband hiermee is de volgende onderzoeksvraag aan de orde: “Hoe zijn de huidige nationale - en internationale richtlijnen bij de behandeling van Lyme-borreliose?” Hiertoe zal eerst de aandacht worden gericht op de richtlijnen van het Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg, het CBO, in Nederland. Het CBO heeft tot doel individuele beroepsbeoefenaren, hun beroepsverenigingen en zorginstellingen te ondersteunen bij het verbeteren van de patiëntenzorg. Vervolgens zullen de internationale richtlijnen van de Infectious Diseases Society of America (IDSA) en van de International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) de revue passeren. De IDSA is een Amerikaanse organisatie die op bewijs gebaseerde richtlijnen opstelt voor infectieziekten. De ILADS is een non-profit -, internationale -, multidisciplinaire medische organisatie, die zich toelegt op de diagnose en geschikte behandeling van Lyme-borreliose en daaraan verwante ziekten. De behandelingsrichtlijnen opgesteld door de ILADS werkgroep zijn gebaseerd op klinische bewijzen. 

5.2 BEHANDELINGSRICHTLIJN LYME-BORRELIOSE VAN HET CBO

De door het Kwaliteitsinstituut van de Gezondheidszorg, het CBO, voorgestelde richtlijn “Lyme-borreliose” is ondermeer een op feiten gebaseerde richtlijn waaraan systematisch literatuur onderzoek ten grondslag ligt. Verder is de richtlijn gebaseerd op de klinische ervaringen van de artsen en wordt er in de richtlijn ook rekening gehouden met het restrictieve antibioticabeleid in Nederland in verband met resistentieontwikkeling van bacteriën. De aanbevolen behandelingen voor Lyme-borreliose zijn gebaseerd op wetenschappelijk bewijs die door de CBOwerkgroep is samengevat in een “conclusie”. De geselecteerde literatuur ter onderbouwing van de conclusies zijn beoordeeld op kwaliteit van onderzoek en mate van bewijs. Voor literauur betreffende de therapie van Lyme-borreliose gold in 2004 de volgende bewijskracht: A1 systematische reviews die ten minste enkele onderzoeken van A2 niveau betreffen, waarbij de resultaten van de afzonderlijke onderzoeken met elkaar overeenkomen; A2 gerandomiseerd vergelijkend klinisch onderzoek van goede kwaliteit (gerandomiseerde, dubbelblind gecontroleerde trials) van voldoende omvang en consistentie; B gerandomiseerde klinische trials van matige kwaliteit of onvoldoende omvang of ander vergelijkend onderzoek (nietgerandomiseerd, vergelijkend cohortonderzoek, patiëntcontroleonderzoek; C niet-vergelijkend onderzoek;. D mening van deskundigen, zoals de leden van de CBO-werkgroep. Niveau van bewijs van de conclusies: 1 één systematische review (A1) of tenminste twee onafhankelijk van elkaar uitgevoerde onderzoeken van niveau A2; 2 ten minste twee onafhankelijke van elkaar uitgevoerde onderzoeken van niveau B; 3 één onderzoek van niveau A2 of B of onderzoek van niveau C; 4 mening van deskundigen, bijvoorbeeld de leden van de werkgroep. . De richtlijn “Lyme-borreliose” van het CBO is tot stand is gekomen op initiatief van de Nederlandse Vereniging voor Lymepatiënten (Speelman et al., 2004).  5.2.1 Antibiotica bij Lyme-borreliose Doxycycline en ceftriaxon zijn de meest toegepaste antibiotica in de verschillende stadia bij Lyme-borreliose. Doxycycline behoort evenals minocycline en tetracycline tot de tetracyclinen. Deze antibiotica hebben een remmende werking op de eiwitsynthese van de bacterie ter hoogte van de ribosomen en werken daardoor bacteriostatisch. Door de bacteriostase die tetracyclinen veroorzaken belemmeren zij de bactericide werking van onder andere penicillinen en cefalosporinen (Farmacotherapeutisch Kompas, 2007). De actieve voortbeweging van de spirocheet vindt plaats met behulp van flagellen en een axiaal fibril (hoofdstuk I, anatomie) welke zijn opgebouwd uit eiwitten. Door het toepassen van doxycycline zou in de eerste plaats de actieve verspreiding van de bacterie door het lichaam van de gastheer worden voorkomen (Kersten et al., 1995; Alban et al., 2000). Tot de cefalosporinen behoort cefuroxim-axetil, ceftriaxon. Dit is een bètalactam-antibioticum evenals de penicillinen. Deze antibiotica worden chemisch gekenmerkt door een bèta-lactamring die essentieel is voor de antibacteriële werking, welke bestaat uit het voorkomen van de celwandsynthese tijdens de replicatie van de bacterie. Deze antibiotica kunnen

70 echter hiermee celwand-deficiënte bacteriën (L-vormen) veroorzaken, die ook zonder celwand verder kunnen leven en waaruit weer normale mobiele spirocheten kunnen komen (Preac-Mursic et al., 1996b). Macroliden zoals erythromycine, azithromycine en clarithromycine zijn antibotica die de eiwitsynthese remmen en hierdoor, evenals de tetracyclinen, een bacteriostatische werking hebben (Farmacotherapeutisch Kompas, 2007).  5.2.2 Antibioticumprofylaxe bij een tekenbeet Bij de huidige prevalentie (2007) van 23.6% besmette teken in Nederland, met uitschieters tot 50%, is er volgens de werkgroep van het CBO géén reden om na iedere tekenbeet antibioticumprofylaxe te geven. Alleen volgens bepaalde voorwaarden gesteld door de Infectious Diseases Society of America (IDSA) kan een éénmalige behandeling met doxycycline worden overwogen. De IDSA ontraadt een routinematige profilactische behandeling na een tekenbeet. Als het gaat om een beet van een nimf of volwassen teek die meer dan 36 uur op de huid heeft vastgezeten kan echter wel met de profilaxe worden begonnen binnen 72 uur na verwijdering van de teek. Verder moet in het betreffende gebied meer dan 20% van de teken geïnfecteerd zijn en er mag uiteraard geen contra-indicatie zijn voor doxycycline, aldus de richtlijn van de IDSA (Wormser, 2006; Speelman, 2007)(zie tabel 5.1 en 5.3). In tegenstelling tot het CBO en de IDSA om geen antibioticumprofilaxe routinematig toe te passen, laat een onderzoek van Nadelmann et al. (2001) zien dat dit juist wel aan te bevelen is. Een enkele dosis van 200-mg doxycycline, indien toegepast binnen 72 uur na een I. scapularis tekenbeet, kan een infectie van Lyme-borreliose voorkomen. De interventie verminderde de kans op ziekte met 87% (Nadelman et al., 2001). In Nederland zijn verscheidene onderzoeken uitgevoerd op het waddeneiland Ameland in verband met de besmettingsgraad van Ixodes ricinus teken met B. burgdorferi s.l.. Tussen 1988 en 1993, met uitzondering van 1990, werden in bos en duin op Ameland in totaal 7173 Ixodes ricinus teken verzameld, waarvan 547 teken met immunofluorescentie werden onderzocht op Borrelia burgdorferi senu lato. De besmettingsgraad van de nimfen (n=341) variëerde van 13 tot 46% en bij volwassen teken (n=122) was dit 20 tot 43%. Van de larven (n=84) was 21% besmet, wat duidde op de mogelijkheid van transovariële besmetting (Rijpkema et al., 1994). Transovariële transmissie van spirocheten was al eerder aangetoond door Canale-Parola (1977). In mei 1995 werd er een vervolgstudie gedaan op Ameland waarbij alleen Ixodes ricinus larven onderzocht werden op Borrelia burgdorferi sensu lato met de polymerase chain reactie (PCR). Hierbij waren drie (5%) van de 57 larven positief bevonden voor Borrelia DNA. De transovariële besmette larven kunnen gastheren tijdens een bloedmaaltijd besmetten met Borrelia spirocheten of deze spirocheten meenemen naar het nimfestadium. Besmette volwassen moederteken kunnen de besmetting doorgeven aan de volgende generatie. Er kunnen besmette eieren worden gelegd waaruit besmette tekenlarven kunnen komen. De besmetting kan zich zo uitbreiden en in stand blijven in de tekenpopulatie zelf, onafhankelijk van een bloedmaaltijd uit een natuurlijk reservoir voor Borrelia spirocheten zoals knaadieren, vogels, schapen, herten etc. (Rijpkema en Bruinink, 1996). Van 2004 tot 2006 werd op het waddeneiland Ameland een tekenbeetonderzoek uitgevoerd. Hierbij was het van belang om de teek binnen 24 uur te laten verwijderen om zodoende een mogelijke infectie met de spirocheet B. burgdorferi s.l. te voorkomen. Bij een huisartsenpraktijk hadden zich 167 personen gemeld met in totaal 216 vastzittende teken. De verwijderde teken werden met de polymerase-chain reactie (PCR) onderzocht op DNA van de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato.; hierbij werden 44 (20.4%) van de teken positief bevonden (Jacobs et al., 2008). Bij 146 personen vond er na 6 maanden een evaluatie plaats. Van de 41 (28.1%) personen die waren gebeten door een positieve teek, ontwikkelde geen enkele persoon het karakterestieke huidaandoening erythema migrans met de rode ring (Bull’s eye). Er waren 13 (9%) personen die een rode vlek rapporteerden op de plaats van de tekenbeet. 5 personen van deze 13 waren gebeten door een positieve teek en van deze 5 personen was er slechts één persoon die systemische symptomen had ontwikkeld behorende bij een Lyme-borreliose. Deze persoon had last van moeheid, zweten en gewrichtspijn, echter zonder lokale roodheid. Bij dit onderzoek werd aangetoond dat het zaaks is om een vastzittende teek zo snel mogelijk te (laten) verwijderen. Indien dit binnen 24 uur gebeurd, is de kans op besmetting met de Borrelia bacterie gering aangezien de bacterie zich dan nog in de darm van de teek zou bevinden en de speekselklieren van de teek nog niet bereikt zou hebben (Jacobs et al., 2008). In een andere studie op Ameland werden tussen januari 2004 en december 2008, 297 teken onderzocht die afkomstig waren van 246 personen. Hierbij werd 16% van de verzamelde teken positief bevonden voor de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato (Tysse-Klasen et al., 2011). Volgens het Rijks Instituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne (RIVM) ligt het percentage besmette teken met de bacterie Borrelia burgdorferi sensu lato tussen de 10- en 30%. In augustus 2010 was dit percentage volgens het laboratorium Pro Health Medical gestegen tot 44.7%. 

5.2.3 Behandeling van de vroege gelokaliseerde Lyme-borreliose: EM en Borrelia-lymfocytoom Voor de vroege gelokaliseerde Lyme-borreliose, het erythema migrans (EM), heeft de arts de volgende mogelijkheden: afwachten, orale antibiotica of intraveneuze antibiotica. Het doel van een behandeling met antibiotica is het genezen van

71 het EM en het voorkomen van eventuele late complicaties. Deze voordelen dient men in overweging te nemen met betrekking tot de potentiële bijwerkingen van de antibiotica zoals hoofdpijn, misselijkheid, braken, verstoring van de darmflora, huidreacties etc. Voor de behandeling van het EM met antibiotica zijn geen placebo-gecontroleerde studies verricht. Het additionele bewijs voor de werking van antibiotica bij het EM wordt gegeven door de gerandomiseerde studies waarbij verschillende antibiotica met elkaar worden vergeleken. Een antibioticumtherapie waarbij patiënten met een persistente EM of late complicaties in de minderheid zijn, wijst op een nuttig effect van de antibioticumbehandeling (Speelman et al.,2004) De werkgroep van het CBO heeft voor de aanbevelingen voor de behandeling van de vroege Lyme-borreliose (tabel 5.1) zich ondermeer gebaseerd op (vergelijkende) onderzoeken met diverse antibiotica, waarvan hierna een aantal studies zullen worden aangehaald. In een onderzoek van Steere et al. (1983) werden de drie antibiotica penicilline, tetracycline en erythromycine met elkaar vergeleken bij 108 patiënten met een vroege Lyme borreliose. Geen van de 39 patiënten (0%) die behandeld waren met tetracycline ontwikkelde late complicaties zoals meningo-encephalitis, myocarditis of terugkerende aanvallen van artritis. Bij 3 van de 40 met penicilline behandelde patiënten (7.5%) en bij 4 van de 29 erythromycine patiënten (14%) traden complicaties op (Steere et al., 1983). De onderzoekers kwamen tot de conclusie dat tetracycline à vier maal daags 250 mg als eerste keus beschouwd kan worden, gevolgd door fenoxymethylpenicilline à vier maal daags 500 mg en tenslotte erythromycine à vier maal daags 250 mg (Steere et al. 1983). In een gerandomiseerde dubbel-blind gecontroleerde studie werd azithromycine vergeleken met amoxycilline. Van de 217 patiënten met EM die de studie van 20 dagen volbrachten, was 88% geheel vrij van symptomen met amoxycilline versus 76% met azithromycine en liet amoxycilline 4% terugval zien ten aanzien van azithromycine 16% (Luft et al., 1996). In een kleine gerandomiseerde prospectieve studie van Dattwyler et al. (1990) werden de antibiotica doxycycline en amoxicilline plus probenecid met elkaar vergeleken. Van de 72 patiënten met erythema migrans kregen 35 patiënten 2 x daags 100 mg doxycycline en 37 patiënten kregen 3 x daags 500 mg amoxicilline plus 500 mg probenecid. 33 patiënten van de 35 in de doxycyclinegroep (94%) en 32 patiënten van de 37 in de ammoxycilline/probenecid groep (86.5%) ontwikkelden geen symptomen van een late Lyme-borreliose. Geen van de patiënten ontwikkelde meningitis, meningoencephalitis, myocarditis of terugkerende artritisaanvallen. De patiënten kregen geen recidiverende erythema migrans en hadden verder geen herhalingen van antibioticabehandelingen nodig. Volgens de onderzoekers waren deze resultaten te danken aan hogere weefselspiegels van de toegepaste behandelingsregimes en ook gedeeltelijk aan een langere halfwaardetijd van de antibiotica. Verder waren beide behandelingsregimen gelijkwaardig in het voorkomen van late complicaties van Lyme-borreliosis (Dattwyler et al., 1990). Met betrekking tot de vroege Lyme-borreliose is een gerandomiseerde dubbel-blind multicentra-onderzoek verricht met de antibiotica cefuroxime axetil (de eerste orale cefalosporine) en doxycycline. 119 patiënten kregen oraal twee maal 500 mg cefuroxime axetil per dag en 113 patiënten kregen oraal doxycycline drie maal 100 mg per dag. 1 maand na de behandeling van de vroege Lyme-borreliose was er succes of verbetering opgetreden in 90% van de met cefuroxime axetil behandelde patiënten versus 95% in de doxycycline behandelde patiënten die de 20 dagen behandeling hadden afgemaakt. De evaluatie na 1 jaar met betrekking tot de preventie van het late stadium van de ziekte van Lyme liet 95% bevredigende resultaten zien voor de met cefuroxime axetil behandelde patiëten en 100% voor de met doxycycline behandelde patiënten (Luger et al., 1995). Een eerdere studie van Nadelman et al. (1992) met 63 cefuroxime axetil - en 60 doxycycline patiënten met EM liet respectievelijk 93% en 88% bevredigende resultaten zien 1 maand na de beëindiging van de behandeling en na 1 jaar was dit respectiecelijk 90- en 92%. Volgens de onderzoekers zijn orale cefalosporines hiermee even effectief gebleken als doxycycline in de behandeling van erythema migrans ter voorkoming van een late Lyme-borreliose en kunnen orale cefalosporinen toegepast worden indien de patiënt de antibiotica penicillinen en tetracyclinen slecht verdraagt (Nadelman et al., 1992). In het kader van een restrictief antibioticabeleid in Nederland acht het CBO het toepassen van orale cefalosporines zoals cefuroxim axetil echter ongewenst wegens de kans op het ontstaan van resistente Gram-negatieve bacteriën (Speelman et al., 2004). In een niet gerandomiseerde Europese studie van Weber et al. (1988) met 121 patiënten met erythema migrans (EM), kregen 65 patiënten oraal penicillinen, waarvan 23 patiënten 1.2 tot 3.6 miljoen éénheden fenoxymethylpenicilline, 22 patiënten 4.5 miljoen éénheden fenoxymethylpenicilline en 20 patiënten 3.0 miljoen éénheden propicilline (een oraal penicilline) per dag gedurende 10 tot 14 dagen. 36 patiënten kregen oraal tetracyclinen, waarvan 28 patiënten 2 x 100 mg per dag minocycline gedurende 14 dagen, 5 patiënten kregen 2 tot 3 maal per dag 500 mg tetracycline gedurende 8 tot 21 dagen en 4 patiënten 100 mg 2 maal per dag doxycycline gedurende 10 tot 14 dagen.

72 20 patiënten kregen amoxicilline-clavulaanzuur, waarvan 1000 mg amoxycilline en 250 mg clavulaanzuur 3 x per dag gedurende de eerste 3 dagen en daarna gedurende 7 dagen respectievelijk 500 mg en 125 mg. De penicillinen patiënten werden gemiddeld 29 maanden na de behandeling gevolgd; de tetracyclinen patiënten gedurende 17 maanden en de amoxycycline-clavulaanzuur patiënten gedurende 7 maanden.. Bij 27% van de EM patiënten ontwikkelde zich late symptomen van Lyme-borreliose. De onderzoekers kwamen tot de conclusie dat orale penicillinen (phenoxymethylpenicilline, propicilline), orale tetracyclinen (tetracycline, minocycline,doxycycline) en oraal amoxicillineclavulaanzuur gelijkwaardig zijn in de behandeling van EM (Weber et al., 1988). In een Europese prospectieve gerandomiseerde multicentra studie van Weber et al. (1990), werden orale penicilline en ceftriaxon met elkaar vergeleken bij de behandeling van de vroege Lyme-borreliose. 40 patiënten kregen gedurende 5 dagen 1 gram ceftriaxon intramusculair en 33 patiënten kregen oraal 3 maal daags 1 miljoen eenheden phenoxypenicilline gedurende 12 dagen. Zes patiënten van de ceftriaxongroep (15%) en acht patiënten van de penicillinegroep (24%) ontwikkelden symptomen van late Lyme-borreliose zoals gewrichtspijnen, gevoelsstoornissen, moeheid, slapeloosheid etc.. Indien de patiënten behalve erythema migrans nog andere symptomen van Lyme-borreliose vertoonden vóórdat de antibioticumbehandeling was gestart, bleek dat intramusculair ceftriaxon een betere reductie van deze symptomen gaf dan oraal penicilline. De onderzoekers van deze studie zijn van mening dat een kortdurende intramusculaire behandeling met ceftriaxon de voorkeur heeft boven een orale behandeling met penicilline in die gevallen met een meer ernstige vorm van een vroege Lyme-borreliose. Hierbij is niet alleen sprake van erythema migrans, maar tevens van gewrichtsontstekingen, meningitis of facialispalsy. Dit betekent dat patiënten met erythema migrans zorgvuldig onderzocht dienen te worden, alvorens de juiste antibioticumtherapie te starten (Weber et al., 1990). In een andere Europese gerandomiseerde multicentra studie van Weber et al. (1993), werden 32 patiënten met erythema migrans behandeld met 1 x daags 500 mg azithromycine en 33 patiënten werden behandeld met 3 x daags 1 miljoen eenheden phenoxypenicilline (penicilline-V) gedurende 10 dagen. Drie maanden na het begin van de therapieën waren 25 patiënten (78%) van de azothromycine groep en 28 patiënten van de penicilline-V groep geheel vrij van alle symptomen en ontwikkelden verder geen nieuwe klachten. De onderzoekers kwamen volgens deze studie tot de conclusie, dat azithromycine even effectief was als penicilline-V in de behandeling van de vroege Lyme-borreliose. Verder leken de symptomen van erythema migrans sneller verdwenen te zijn met azithromycine dan met penicilline-V (Weber et al., 1993). In een Europese prospectieve studie van Strle et al. (1996) werden patiënten met EM en met positieve culturen van de huidbiopsies voor B. burgdorferi s.l behandeld met azithromycine (n=58) of doxycycline (n=42). Na 12 maanden was er 1 patiënt in iedere groep met ernstige symptomen van een late Lyme-borreliose (meningoradiculitis, artritis) en waren er 9 patiënten (15.5%) in de azithromycine groep en 10 patiënten (23.8%) in de doxycycline groep met minder ernstige klachten van een late Lyme-borreliose (artralgieën, myalgieën, moeheid, hoofdpijn, geheugenstoornissen)(Strle et al., 1996). In een eerdere studie van Strle et al. (1993) met azithromycine (n=55) en doxycycline (n=52) was er na een evaluatie van 12 maanden geen enkele patiënt van de azithromycine groep en waren er 3 patiënten van de doxycycline groep met ernstige symptomen van een late Lyme borreliose. Er waren respectievelijk 10 (18%) - en 15 (29%) patiënten met minder ernstige klachten van een late Lyme-borreliose (Strle et al., 1993). Een vergelijkende gerandomiseerde multicentra studie van Barsic et al. (2000) met de antibiotica azithromycine (n=48) en doxycycline (n=40) bij Lyme-borreliose patiënten met EM, liet een succes of verbetering zien bij 46 (95.8%) azithromycine - en bij 33 (82.5%) doxycycline patiënten (Barsic et al., 2000). Wormser et al. (2003) deden onderzoek in een gerandomiseerde -, dubbelblinde -, placebo gecontroleerde studie bij 180 patiënten met EM. De behandelingen bestonden uit 10 dagen oraal doxycycline, met of zonder één enkele intraveneuze dosis ceftriaxon, of 20 dagen oraal doxycycline. Na 30 maanden trad volledige genezing op in 90.3% van de 10-dagen doxycycline groep, 86.5% in de doxycycline-ceftriaxon groep en 83.9% in de 20-dagen doxyxycline groep (Wormser et al., 2003). Naar aanleiding van bovengenoemde studies is de CBO-werkgroep tot de hierna volgende conclusies gekomen met bijbehorende maten van bewijskracht: Het is aannemelijk dat de behandeling met antibiotica een gunstig effect heeft op de genezing van EM en het voorkomen van late complicaties van vroege Lyme-borreliose. Niveau 3, A2: Steere et al. (1983); Luft et al. (1996); Strle et al. (1993); Weber et al. (1990); Weber et al. (1993). Het is aannemelijk dat fenoxymethylpenicilline, tetracycline en minocycline even effectief zijn. Niveau 2, A2: Steere et al. (1983) Niveau 2, B: Weber et al. (1988). Amoxicilline in combinatie met het niet meer verkrijgbare probenecide leidt tot even goede resultaten als doxycycline. Niveau 3, A2: Dattwyler et al. (1996). De CBO-werkgroep acht het aannemelijk dat amoxicilline zonder probenecid even effectief is als fenoxymethylpenicilline. Niveau 4.

73 Het is aangetoond dat orale cefalosporinen even effectief zijn als fenoxymethylpenicilline of doxycycline. Niveau 1, A2: Nadelman et al. (1992); Luger et al. (1995). Uit Europese onderzoeken is gebleken dat azithromycine even effectief is als doxycycline of fenoxymethylpenicilline in de behandeling van het EM. Het CBO beschouwt het macrolide azithromycine in Europa gelijkwaardig aan doxycycline. Niveau 2, A2: Strle et al.(1993). Niveau 2, B: Strle et al. (1992); Strle et al. (1996); Barsic et al. (2000); Weber et al. (1993). Echter, wegens de toenemende resistentie van streptokokken en pneumokokken voor macroliden zoals erythromycine of azithromycine, is het CBO van mening dat deze antibiotica alleen gebruikt dienen te worden voor de vroege ongecompliceerde Lyme-borreliose zoals het EM indien er geen gelijkwaardig middel tegenoverstaat (Speelman et al., 2004). Ten aanzien van de risico’s en belasting van de intraveneuze behandeling voor de patiënt is er volgens de werkgroep van het CBO verder geen reden om een vroege Lyme-borreliose, zoals het EM, intraveneus te behandelen met ceftriaxon, daar orale antibiotica hier ook succesvol zijn (Speelman et al., 2004). Niveau 1, A2: Steere et al. (1983); Dattwyler (1990). Niveau 1, B: Weber (1990). Aan de hand van de studie van Wormser et al. (2003) acht de CBO-werkgroep een behandelingsduur van 10 dagen orale doxycycline voldoende voor de behandeling van het EM. Niveau 3, A2: Wormser et al. (2003). Op grond van het bovenstaande wordt door de CBO-werkgroep voor de behandeling van de vroege Lyme-borreliose het volgende aanbevolen: Volgens de Lyme-borreliose richtlijn van het CBO dienen patiënten met een EM of Borrelia-lymfocytoom behandeld te worden met een oraal antibioticum met als eerste keuze doxycycline in een dosering van 2 dd 100 mg, gedurende 10 dagen. Indien er contra-indicaties mochten zijn voor het gebruik van doxycycline, zoals zwangerschap, allergie, fotosensibiliteit of leeftijd < 9 jaar etc., is het tweede keuze antibioticum amoxicilline 3 dd 500 mg gedurende 14 dagen. Zijn er tevens contraindicaties voor amoxicilline dan is het derde keuze antibioticum azithromycine 1 dd 500 mg gedurende 5 dagen (Speelman et al., 2004). Voor kinderen < 9 jaar met EM of lymfocytoom is de eerste keuze amoxicilline 50 mg/kg/dg in 3 doses, met max. 3 dd 500 mg, gedurende 14 dagen. De tweede keuze is azithromycine 10 mg/kg/dg in 1 dosis, max. 1 dd 500 mg, gedurende 5 dagen (Speelman et al., 2004)(tabel 5.1).  5.2.4 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose De vroege gedissemineerde Lyme-borreliose kan zich manifesteren als een multiple EM, Lyme-carditis, Lyme-artritis en vroege neuroborreliose. Deze laatste aandoening kan zich uiten als meningitis, (meningo)-radiculitis (uitstralende zenuwpijnen uitgaande van de ruggemergswortel), perifere facialisparese (gezichtverlamming door uitval van de zevende hersenzenuw) of uitval van andere hersenzenuwen.  5.2.4.1 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose: neuroborreliose Na de eerste resultaten met penicilline-G voor de behandeling van Lyme-meningitis heeft men de aandacht gevestigd op ceftriaxon, wegens de goede penetratie in de liquor en het éénmaal daags toedienen van 1 dosis. Er zijn onvoldoende goede klinische studies verricht om te kunnen concluderen dat penicilline-G even effectief is als ceftriaxon bij de behandeling van de vroege Lyme-borreliose. Ook zijn er geen studies verricht naar een behandelingsduur langer dan 14 dagen met ceftriaxon bij de vroege Lyme-meningitis. Verder laat de behandeling van Lyme-meningitis met doxycycline 2 dd 200 mg matige resultaten zien met een aanzienlijk percentage recidieven. De werkgroep van het CBO beroept zich door het ontbreken van goede klinische studies vooral op de klinische ervaringen (Speelman et al., 2004). Aanbeveling Voor de behandeling van de vroege neuro-borreliose wordt als eerste keuze aanbevolen: ceftriaxon 1 dd 2 gram intraveneus gedurende 14 dagen. Bij contra-indicaties voor ceftriaxon als tweede keuze: penicillineG 6 dd 2-3 mega eenheden (ME) gedurende 14 dagen. Bij allergie voor bètalactam-antibiotica als derde keuze: doxycycline 2 dd 200 mg per os gedurende 21 dagen (Speelman et al., 2004). Kinderen < 9 jaar met vroege Lyme-borreliose als eerste keuze ceftriaxon 100 mg/kg/dg in 1 dosis (max. 1 dd 2 gram) intraveneus gedurende 14 dagen. Bij contra-indicaties voor ceftriaxon als tweede keuze penicilline 200.000-400.000 E/kg/dg in 6 doses (max. 6 dd 2-3 ME gedurende 14 dagen (Speelman et al., 2004)(tabel 5.1). 

5.2.4.2 Behandeling van de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose anders dan neuroborreliose of Lyme-artritis In een prosfectief - , gerandomiseerde -, open multicentra studie van Dattwyler et al. (1997) met 140 patiënten met acute gedissemineerde Lyme-borreliose zonder neuroborreliose, werd ceftriaxon vergeleken met doxyxycline. Patiënten kregen

74 parenteraal 2g/dag ceftriaxon gedurende 14 dagen of oraal 2x 100mg/dag doxycycline gedurende 21 dagen. Volledige genezing trad op in 85% van de ceftriaxon groep en in 88% van de doxycycline groep (Dattwyler et al., 1997). Conclusie (niveau 4) van de CBO-werkgroep: er zijn geen gegevens om een keuze te maken tussen doxycycline en ceftriaxon bij de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose anders dan een neuroborreliose. In het geval van een Lymecarditis kan zowel doxycycline als intraveneus ceftriaxon worden overwogen. Aanbeveling Voor de behandeling van een vroege gedissemineerde Lyme-borreliose anders dan een neuroborreliose, Lyme-artritis of Lyme-carditis beveelt de werkgroep van het CBO 2 x 100 mg/dag doxycycline aan gedurende 21 dagen (Speelman et al., 2004). Bij Lyme-carditis komt ook een behandeling met intraveneus ceftriaxon gedurende 14 dagen in aanmerking (Speelman et al., 2004)(tabel 5.1). 

5.2.4.3 Behandeling van de vroege gedessimineerde Lyme-borreliose: Lyme-artritis Voor de behandeling van Lyme-artritis zijn er volgens het CBO geen kwantitatief - en kwalitatief voldoende vergelijkende studies verricht. Enkele studies zullen hier toch aangehaald worden. In een dubbelblind- placebo gecontroleerde studie met patiënten met Lyme-artritis kregen 20 patiënten intramusculair 2.4 ME benzathine penicilline per week gedurende 3 weken en 20 patiënten kregen als placebo een fysiologische zoutoplossing. Zeven van de 20 met penicilline geïnjecteerde patiënten (35%) waren compleet genezen van artritis en bleven zonder klachten gedurende een evaluatieperiode van 33 maanden. Alle 20 placebo-patiënten bleven artritisaanvallen houden (Steere et al. 1985). In een vervolgstudie werden 20 patiënten behandeld met 20 ME penicilline-G per dag gedurende 10 dagen en bij 11 patiënten (55%) trad volledige genezing op (Steere et al., 1985). In een prospectief gerandomiseerd onderzoek van Hassler et al. (1990) met 135 patiënten die ten minste 6 maanden Lymeborreliose hadden, werd cefotaxim (een cefalosporine derivaat) vergeleken met penicilline-G en als infuus toegediend. Cefotaxim werd intraveneus toegepast met een dosering van 2 x 3 g/dag en penicilline-G in een intraveneuze dosering van 2 x 10 ME/dag gedurende 8-10 dagen. Met cefotaxim werden betere resultaten bereikt dan met penicilline-G, 87.9% versus 61.3% van de patiënten waarbij complete genezing of verbetering optrad (Hassler et al., 1990). Een vergelijkende studie met doxycycline, amoxycilline plus probenecid voor de orale behandeling van Lyme-artritis suggereren dat deze antibiotica effectief zijn bij deze aandoening. In deze studie was het succespercentage van doxycycline 90%, 18 van de 20 patiënten, bij een behandelingsduur van 30 dagen à 200 mg doxycycline per dag. Het succespercentage van amoxycilline plus probenecid was 89% (16 van de 18 patiënten) binnen 1-3 maanden na de start van de therapieën. Bij 5 patiënten ontwikkelde zich later neuroborreliose, waarvan 4 patiënten uit de amoxycilline groep (Steere et al., 1994). Tevens werden 16 patiënten met een persisterende Lyme-artritis intravenous behandeld met ceftriaxon, waarbij geen genezing van de artritis optrad (Steere et al., 1994). Voor de optimale behandelingsduur van Lyme-artritis zijn geen vergelijkende studies verricht. Een behandelingsduur van 30 dagen van Steere et al. (1994) laat hogere succespercentages zien dan een behandelingsduur van 10-14 dagen van Hassler et al. (1990). De CBO-werkgroep komt voor de behandeling van Lyme-artritis tot de volgende conclusies: Het is aangetoond dat een behandeling met antibiotica effectief is bij de behandeling met Lyme-artritis. Niveau 1, A2: Steere et al. (1985). Het is aangetoond dat penicilline-G, cefotaxim en ceftriaxon effectief zijn bij de behandeling van Lyme-artritis. Niveau 1, A2: Steere et al. (1985); Hassler et al. (1990). Verder zijn er aanwijzingen dat doxycycline effectief is bij de behandeling van Lyme-artritis. Niveau 3, B: Steere et al. (1994). Hoewel er geen vergelijkende onderzoeken zijn gedaan naar de optimale behandelingsduur bij Lyme-artritis, zijn de succespercentages in studies met een behandelingsduur van 30 dagen hoger dan die met een behandelingsduur van 10-14 dagen. Niveau 3, C: Hassler et al. (1990); Steere et al. (1994); Steere et al. (1985). De CBO-werkgroep is van mening (niveau 4) dat doxycycline een verantwoorde keuze is bij Lyme-artritis, ondanks het ontbreken van voldoende vergelijkende studies. Een behandelingsduur van 30 dagen met 2 maal daags 100 mg doxycycline wordt aanbevolen, mede door het veelvuldig optreden van recidieven bij Lyme-artritis. Aanbeveling

75 Op basis van het bovenstaande wordt als eerste keuze door de werkgroep van het CBO bij Lyme-artritis doxycycline aanbevolen, 2 dd 100 mg gedurende 30 dagen. Indien de behandeling niet succesvol is, dan alsnog een behandeling met ceftriaxon 1 dd 2 gram gedurende 14 dagen. Bij contra-indicaties voor doxycycline kan een behandeling met amoxicilline 3 dd 500 mg gedurende 30 dagen worden toegepast (Speelman et al., 2004). Voor kinderen < 9 jaar met Lyme-artritis zonder tekenen van neuroborreliose, wordt aanbevolen als eerste keuze amoxicilline 50 mg/kg/dg in 3 doses (max. 3 dd 500 mg) gedurende 30 dagen. De tweede keuze is ceftriaxon 100 mg/kg/dg in 1 dosis intraveneus (max. 1 dd 2 gram) gedurende 14 dagen (Speelman et al., 2004). Bij patiënten met Lyme-artritis èn neuroborreliose wordt intraveneus ceftriaxon 1 dd 2 gram gedurende ten minste 14 dagen als eerst keuze aanbevolen. Voor kinderen < 9 jaar met Lyme-artritis en neuroborreliose is de aanbeveling intraveneus ceftriaxon 100 mg/kg/dg in 1 dosis (max. 1 dd 2 gram) gedurende 14 dagen (Speelman et al; 2004)(tabel 5.1).  5.2.5 Behandeling van late Lyme-borreliose Acrodermatitisch chronica atroficans (ACA), artritis en vele neurologische aandoeningen, zoals neuropathie, encefalopathie behoren tot de late uitingen van gedessimineerde Lyme-borreliose, die na meer dan één jaar na het ontstaan van een Lymeborreliose infectie optreden als persisterende infecties.  5.2.5.1 Behandeling van late Lyme-borreliose: ACA In een niet-gerandomiseerde studie met 34 ACA-patiënten van Weber et al. (1988) kregen 14 patiënten orale penicillinen, 9 patiënten parentale penicillinen en 6 patiënten orale tetracyclinen. Van deze tetracyclinen-groep, waarvan de doseringen genoemd worden in verband met een latere studie van Aberer et al. (1996)(zie hierna), kreeg 1 patiënt 2 x 500 mg/dag tetracycline gedurende 3 weken; 3 patiënten kregen 2 x 100 mg/dag doxycycline gedurende 10 tot 21 dagen; 2 patiënten kregen 2 x 100 mg/dag minocycline gedurende 7 - of 14 dagen. Verder kreeg 1 patiënt amoxycilline gedurende 4 weken; 2 patiënten kregen intraveneus ceftriaxon gedurende 2 weken en 2 patiënten amoxycilline-clavulaanzuur gedurende 7 dagen. 47% van de ACA-patiënten ontwikkelde ondanks een antibioticumtherapie extra-cutane aandoeningen. Geen van de toegepaste antibiotica in deze studie bleek superieur in de behandeling van ACA (Weber et al., 1988). In een latere studie van Aberer et al. (1996) met 46 ACA patiënten werden 14 patiënten intraveneus behandeld met 2g/dag ceftriaxon gedurende 15 dagen; 5 patiënten kregen oraal 3 x 1.5 ME/dag penicilline-V gedurende 20 dagen en 14 patiënten kregen deze dosering gedurende 30 dagen. Verder kregen 7 patiënten oraal 2 x 100 mg/dag doxycycline gedurende 20 dagen en 6 patiënten gedurende 30 dagen. In de ceftriaxon-groep hadden 4 van de 14 patiënten (28.6%) persisterende ACA. In de 20-dagen penicilline-groep was dit 1 van de 5 patiënten (20%) en in de 30-dagen penicilline-groep kreeg 1 patiënt van de 14 artralgia (7.1%). In de 20-dagen doxycycline-groep hadden 5 van de 7 patiënten (71.4%) voortdurende klachten van Lyme-borreliose (1 fibroïd nodule, 1 neuropathie, 1 persisterende ACA, 2 artralgieën). De beste resultaten (100% genezing) in deze studie werden behaald met de 30-dagen doxycycline-groep; alle 6 patiënten waren binnen 3 tot 6 maanden na de behandeling vrij van symptomen. De onderzoekers kwamen tot de conclusie dat een 30-dagen behandeling met orale antibiotica van cruciaal belang is om ACA te genezen en niet de keuze van het antibioticum (Aberer et al., 1996). In verband met bovengenoemde studies komt de CBO-werkgroep tot de conclusie dat er aanwijzingen zijn dat een behandeling van 30 dagen met penicilline-G, ceftriaxon, fenoxymethylpenicilline of doxycycline effectief is bij ACA. Niveau 2, B: Weber et al. (1988); Aberer et al. (1996). Aanbeveling Volgens de werkgroep van het CBO heeft klinische ervaring uitgewezen dat een behandelingsduur van mintens 4 weken het belangrijkste is om ACA effectief te behandelen. Voor de behandeling van ACA wordt doxycycline 2 x 100 mg/dag gedurende 30 dagen aanbevolen (Speelman et al., 2004)(tabel 5.1). Voor de behandeling van oculaire Lyme-borreliose heeft het CBO geen richtlijn.  5.2.5.2 Behandeling van late Lyme-borreliose: chronische neuroborreliose met pleiocytose en zonder pleiocytose De late gedissemineerde of chronische neuroborreliose kan zich onder andere uiten door radiculitis, paresthesieën (onjuiste gevoelsgewaarwordingen), radiculaire pijn, encephalopathie, geheugenverlies, concentratieproblemen, slapeloosheid, duizeligheid, gehoorverlies, geïrriteerdheid, moeheid, depressie en andere neuro-psychologische symptomen. In een prospectieve gerandomiseerde studie van Hassler et al. (1990) werd cefotaxim vergeleken met penicilline bij 135 patiënten met chronische Lyme-borreliose. 66 patiënten kregen intraveneus 2 x 10 ME/dag penicilline gedurende 8-10 dagen en 69 patiënten kregen intraveneus 2 x 3 g/dag cefotaxim gedurende 8-10 dagen. Het antibioticum cefotaxim gaf betere resultaten dan penicilline: 87.9% van de cefotaxim-patiënten waren na 24 maanden na de behandeling compleet genezen of er was verbetering opgetreden versus 61.3% in de penicilline-groep (Hassler et al., 1990). In een studie van Logigian et al. (1990) werden 27 patiënten met een chronische neuroborreliose behandeld met ceftriaxon. De chronische neurologische afwijkingen bij de patiënten waren begonnen 1 maand tot 14 jaar na het uitbreken van de

76 infectieziekte Lyme-borreliose met EM. De neurologische symptomen waren op het moment van het onderzoek al geruime tijd aanwezig, variërend van 3 maanden tot 14 jaar. De patiënten kregen intraveneus 1 x 2 g/dag ceftriaxon toegediend gedurende 14 dagen. Bij de evaluatie 6 maanden na de therapie was er bij 17 patiënten (63%) een verbetering opgetreden. Herstel trad pas op enkele maanden na het beëindigen van de therapie en was zelden compleet. 6 patiënten (22%) verbeterden eerst maar vielen later terug en bij 4 patiënten (15%) trad geen verbetering op (Logigian et al., 1990). In een latere studie van Logigian et al. (1999) waaraan 18 patiënten met Lyme encephalopathie deelnamen, werd een intraveneuze therapie toegepast van 2 g/dag ceftriaxon gedurende 30 dagen in plaats van een 14 dagen-therapie, die volgens de onderzoekers aanleiding kan geven tot terugval (Logigian et al., 1999). Dit laatste is gebleken uit een eerdere studie van dezelfde onderzoekers Logigian et al. (1990) (zie hierboven). 15 van de 18 patiënten deden mee aan het evaluatieonderzoek 6 maanden na het beëindigen van de therapie. Bij 3 patiënten (17%) waren de klachten verdwenen, 8 patiënten (44%) waren sterk verbeterd, 3 patiënten (17%) vertoonden enige verbetering en bij 1 patiënt (6%) trad geen verbetering op. Bij het evaluatie-onderzoek van 12-24 maanden met alle 18 patiënten waren er 7 patiënten (39%) zonder klachten, 9 patiënten (50%) waren sterk verbeterd, en bij 2 patiënten (11%) was enige verbetering opgetreden (Logigian et al., 1999). Naar aanleiding van bovengenoemde studies komt de CBO-werkgroep tot de conclusie dat er aanwijzingen zijn dat een behandeling met ceftriaxon gedurende 30 dagen de prognose verbetert indien een chronische neuroborreliose is aangetoond. Niveau 3, C: Logigian et al. (1999); Logigian et al. (1990); Hassler et al. (1990). Verder (niveau 4) heeft de CBO-werkgroep geen consensus bereikt over het nut van een 30 dagen behandeling met doxycycline, indien er sprake is van een chronische neuroborreliose zonder pleiocytose (vermeerdering van cellen) in de liquor cerebrospinalis. Aanbeveling Voor de behandeling van chronische neuroborreliose met pleiocytose in de liquor cerebrospinalis wordt door het CBO intraveneus ceftriaxon à 2 gram/dag gedurende 30 dagen aanbevolen (Speelman et al., 2004). In het geval van een chronische neuroborreliose zonder pleiocytose in de liquor cerebrospinalis kan volgens de CBOwerkgroep doxycycline 2 dd 100 mg gedurende 30 dagen worden overwogen (Speelman et al., 2004)(tabel 5.1).  5.2.6 Behandeling van postinfectieuze klachten en symptomen post-Lymeziekte-syndroom Van een post-Lymeziekte-syndroom is sprake indien er bij patiënten met een eerder vastgestelde Lyme-borreliose na een antibacteriële behandeling volgens de CBO richtlijn, zich persisterende klachten voordoen. De klachten kunnen bestaan uit persisterende vermoeidheid, myalgie, artralgie (gewrichtspijn) zonder artritis, dysesthesieën (ziekelijke overgevoeligheid, ook vermindering van de gevoeligheid), paresthesieën (onjuiste gevoelsgewaarwordingen), stemmings- of concentratiestoornissen. Twee paralel lopende gerandomiseerde -, dubbelblinde placebo gecontroleerde studies door Klempner et al. (2001) werd uitgevoerd met 129 patiënten met persisterende algemene klachten die begonnen waren binnen 6 maanden na het uitbreken van de ziekte van Lyme en die ten minste 6 maanden tot hoogstens 12 jaar aanwezig waren. IgG antilichamen werden bepaald met de Western blot en DNA van B. burgdorferi s.l. werd bepaald met de PCR in bloed en liquor. Verder werd van de liquor cerebrospinalis gedurende 6 weken een kweek gemaakt in het Barbour-Stoenner-Kelly II medium en met donkerveldmicroscopie bekeken. Alle culturen waren negatief, evenals de PCR’s, van bloed en liquor waardoor een persisterende infectie werd uitgesloten. Alleen de serum-antilichamen tegen B. burgdorferi s.l. waren positief of negatief en dit vormde het onderscheid tussen de twee groepen in de twee studies (Klempner et al., 2001). De ene studie werd uitgevoerd met 64 seropositieve patiënten die werden verdeeld in een antibioticagroep en een placebogroep. De andere studie werd uitgevoerd met 65 seronegatieve patiënten en ook die werden verdeeld in een antibioticagroep en een placebogroep. De antibiotica-groepen van de seropositieve- en seronegatieve patiënten kregen een behandeling met 2 gram/dag intraveus ceftriaxon gedurende 30 dagen, gevolgd door een behandeling van 60 dagen oraal doxycycline à 2 x 100 mg/dag. De placebogroepen kregen een placebobehandeling van een intraveneuze dextrose oplossing gedurende 30 dagen, gevolgd door orale placebo capsules (Klempner et al., 2001). Bij een evaluatie van 180 dagen na de behandelingen was er bij 28 van de resterende 51 patiënten (55%) van de beide antibiotica-groepen samen een verbetering opgetreden volgens de Fibromialgia Impact Questionnaire (FIQ) wat betreft lichamelijk- en geestelijk welbevinden. In de beide placebo-groepen was dit het geval voor 22 van de resterende 53 patiënten (42%). Verder was de toestand, gemeten volgend de FIQ-score, verslechterd bij 7 van de 51 patiënten (14%) in de antibiotica-groepen en bij 10 van de 53 patiënten (19%) in de placebogroepen. Afzonderlijke vergelijkingen volgens de FIQ score tussen de antibioticagroep en de placebogroep van de seropositieve studie toonden geen significante verschillen aan tussen deze behandelingsgroepen. Hetzelfde was het geval met de vergelijking tussen de antibioticagroep en de placebogroep van de seronegatieve studie.

77 Er werd geen verschil geconstateerd wat betreft pijn, lichamelijk - en geestelijk welbevinden en dagelijks functioneren tussen de behandeling met placebo en de antibacteriële behandeling die bestond uit 30 dagen intraveneus ceftriaxon, gevolgd door 60 dagen doxycycline per os (Klempner, 2001). Op basis van bovengenoemde studie van Klempner et al. (2001) komt de CBO-werkgroep tot de conclusie dat een langdurige (90 dagen) antibioticabehandeling bij patiënten met een post-Lymeziekte-syndroom zonder dat een persisterende infectie aangetoond kan worden, geen positief effect heeft op de klachten en het funtioneren. Niveau 2, A2: Klempner et al. (2001). De CBO-werkgroep is verder van mening (niveau 4) dat de arts in geval van persisterende of recidiverende symptomen van ACA, Lyme-artritis of meningitis, dient te denken aan de mogelijkheid van een recidiverende Lyme-borreliose infectie. Aanbeveling Indien er geen actieve Lyme-borreliose aangetoond kan worden met een kweek of PCR bij persisterende algemene klachten na een eerdere behandelde Lyme-borreliose, beveelt het CBO aan om geen antibiotica toe te passen (Speelman et al., 2004). TABEL 5.1 Overzicht van de CBO behandelingsrichtlijn voor Lyme-borreliose (Speelman et al., 2004). Antibioticumprofylaxe bij tekenbeet: volgens supplement CBO behandelingsrichtlijn naar IDSA richtlijn uit 2006 (Speelman et al., 2007) - éénmalige dosis van 200 mg doxycycline binnen 72 uur na verwijderen teek die ≥36 uur heeft vastgezeten en aantal besmette teken > 20% in desbetreffend gebied. - kinderen ≥ 8 jaar 4 mg/kg doxycycline in éénmalige dosis binnen 72 uur na verwijderen teek die ≥ 36 uur heeft vastgezeten en aantal besmette teken in desbetreffend gebied > 20%. Vroege Lyme-borreliose: EM en Borrelia-lymfocytoom - Eerste keuze: doxycycline 2 dd 100 mg gedurende 10 dagen - Tweede keuze: amoxicilline 3 dd 500 mg gedurende 14 dagen - Derde keuze: azithromycine 1 dd 500 mg gedurende 5 dagen Kinderen jonger dan 9 jaar - Eerste keuze: amoxicilline 50 mg/kg/dg in 3 doses (max. 3 dd 500 mg) gedurende 14 dagen - Tweede keuze: azithromycine 10 mg/kg/dg in 1 dosis (max. 1 dd 500 mg) gedurende 5 dagen Vroege gedissemineerde Lyme-borreliose: neuroborreliose - Eerste keuze: ceftriaxon 1dd 2 gram intraveneus gedurende 14 dagen - Tweede keuze: penicilline-G 6 dd 2-3 ME gedurende 14 dagen - Derde keuze: doxycycline 2 dd 200 mg per os gedurende 21 dagen Kinderen jonger dan 9 jaar - Eerste keuze: ceftriaxon 100 mg/kg/dg in 1 dosis (max. 1 dd 2 gr) intraveneus gedurende 14 dagen - Tweede keuze: penicilline-G 200.000-400.000 E/kg/dg in 6 doses (max. 6 dd 2-3 ME) gedurende 14 dagen. Vroege gedissemineerde Lyme-borreliose anders dan neuroborreliose, Lyme-artritis of Lyme-carditis: - Doxycycline 2 dd 100 mg gedurende 21 dagen Vroege gedissemineerde Lyme-borreliose: Lyme-carditis - Ceftriaxon 1 dd 2 gr intraveneus gedurende 14 dagen Vroege gedissemineerde Lyme-borreliose: Lyme-artritis - Eerste keuze: doxycycline 2 dd 100 mg gedurende 30 dagen, indien geen succes: - Vervolgbehandeling: ceftriaxon 1 dd 2 gr intraveneus 14 dagen - Tweede keuze: amoxicilline 3 dd 500 mg gedurende 30 dagen Kinderen jonger dan 9 jaar - Eerste keuze: amoxicilline 50 mg/kg/dg in 3 doses (max. 3 dd 500 mg) gedurende 30 dagen (zonder tekenen van neuroborreliose) - Tweede keuze: ceftriaxon 100 mg/kg/dg in 1 dosis intraveneus (max. 1dd 2 gr) gedurende 14 dagen Late Lyme-borreliose: ACA - Doxycycline 2 dd 100 mg gedurende 30 dagen Chronische neuroborreliose met pleiocytose - Ceftriaxon 1 dd 2 gr intraveneus gedurende 30 dagen Chronische neuroborreliose zonder pleiocytose - Doxycycline 2 dd 100 mg gedurende 30 dagen Postinfectieuze klachten en symptomen: post-Lyme-ziekte syndroom zonder actieve Lyme-borreliose infectie - Geen antibiotica 

5.3 BEHANDELINGSREGIMEN VOLGENS DE INFECTIOUS DISEASES SOCIETY OF AMERICA (IDSA)

In het jaar 2006 publiceerde de Infectious Diseases Society of America een herziening van de op bewijs gebaseerde richtlijnen uit 2000 voor de behandeling van Lyme-borreliose, waarvan hierna een overzicht volgt (tabel 5.3). Enkele belangrijke studies zullen bij de verschillende behandelingsrichtlijnen eerst de revue passeren als achtergrondinformatie voor de aanbevelingen van de IDSA werkgroep voor de behandeling van Lyme-borreliose.

78 De richtlijnen voor Lyme-borreliose van de IDSA uit het jaar 2006 (tabel 5.2) zijn opgesteld door de IDSA-werkgroep en gebaseerd op de sterkte van het bewijs en de kwaliteit van de gegevens. Een dergelijke waardering geldt eveneens voor de richtlijnen van de ILADS uit het jaar 2004 (zie hierna paragraaf 5.4). De sterkte van het bewijs wordt aangeduid met categorie A-E en de kwaliteit van de gegevens met de Romeinse cijfers IIII. De aanbevelingen met een waardering “A” worden beschouwd als een goed bewijs ter ondersteuning van de aanbevelingen; een waardering “B” is een matig bewijs; waardering “C” is een neutraal bewijs waarbij een keuze gemaakt kan worden, bij waardering “D” is het bewijs niet overtuigend ter ondersteuning van de aanbevelingen en bij waardering “E” wordt het bewijs beschouwd als een contra-indicatie ter ondersteuning van de aanbevelingen (Wormser et al., 2006). Verder geeft een kwaliteit van de gegevens met een Romeinse “I” aan dat tenminste één gerandomiseerd gecontroleerd onderzoek de aanbevelingen ondersteunt; een “II” betekent een ondersteuning van tenminste één goede opgezette nietgerandomiseerde klinische studie en “III” betekent dat het bewijs voor de aanbevelingen steunt op de opinie van deskundigen (Wormser et al., 2006). 

5.3.1 Behandeling na een tekenbeet

In een studie van Nadelman et al., (2001) werden personen na een tekenbeet behandeld met een éénmalige dosis doxycycline of met een placebo. EM ontwikkelde zich bij 1 (0.4%) van de 235 personen die één enkele dosis van 200 mg doxycycline kregen binnen 72 uur na het verwijderen van een vastzittende I. scapularis teek; dit in vergelijking met 8 (3.2%) van 247 personen die placebo kregen. Het behandelingssucces ter voorkoming van een Lyme-borreliose infectie was 87%. Bij geen van de personen was een gedessimineerde of asymptomatische Lyme-borreliose aan te tonen (Nadelman et al., 2001). Aanbeveling: De werkgroep van de IDSA beveelt een antibioticumprofylaxe aan na een tekenbeet van nymfen of volwassen teken van Ixodes scapularis of Ixodes pacificus, de soorten die in Noord Amerika voorkomen. De antibioticumprofylaxe bestaat uit een éénmalige orale dosis van 200 mg doxycycline indien de teek 36 uur of langer heeft vastgezeten en het percentage besmette teken in het desbetreffende gebied 20% of meer is. De therapie kan worden toegepast binnen 72 uur na het verwijderen van de teek indien er geen contra-indicaties zijn voor doxycycline. Voor kinderen vanaf 8 jaar bestaat de orale éénmalige dosering uit 4 mg/kg doxycycline. Indien niet aan bovenstaande criteria kan worden voldaan, wordt observatie aanbevolen (B-I) (Wormser et al., 2006)(tabel 5.3). 

5.3.2 Behandeling van de vroege lokale Lyme-borreliose en vroege gedissemineerde Lyme-borreliose met EM zonder neurologische aandoeningen

In een vergelijkende gerandomiseerde studie met 112 volwassen patiënten voor de behandeling van EM werden erythromycine, tetracycline en penicilline in doseringen van 250 mg 4 x daags gedurende 10 dagen met elkaar vergeleken. EM genas sneller bij patiënten die behandeld waren met penicilline of tetracycline dan bij patiënten die behandeld waren met erythromycine (Steere et al., 1983). Geen van de 39 patiënten (0%) die behandeld waren met tetracycline ontwikkelde late complicaties zoals meningoencephalitis, myocarditis of terugkerende aanvallen van artritis. Bij 3 van de 40 met penicilline behandelde patiënten (7.5%) en bij 4 van de 29 erythromycine patiënten (14%) traden complicaties op (Steere et al., 1983). In een kleine gerandomiseerde prospectieve studie van Dattwyler et al. (1990) werden de antibiotica doxycycline en amoxicillin plus probenecid met elkaar vergeleken. Van de 72 patiënten met erythema migrans kregen 35 patiënten 2 x daags 100 mg doxycycline en 37 patiënten kregen 3 x daags 500 mg amoxicilline plus 500 mg probenecid. 33 patiënten van de 35 in de doxycyclinegroep (94%) en 32 patiënten van de 37 in de ammoxycilline/probenecid groep (86.5%) ontwikkelden geen symptomen van een late Lyme-borreliose. Geen van de patiënten ontwikkelde meningitis, meningoencephalitis, myocarditis of terugkerende artritisaanvallen. De patiënten kregen geen recidiverende erythema migrans en hadden verder geen herhalingen van antibioticabehandelingen nodig. Volgens de onderzoekers waren deze resultaten te danken aan hogere weefselspiegels van de toegepaste behandelingsregimen en ook gedeeltelijk aan een langere halfwaardetijd van de antibiotica. Beide behandelingsregimen waren gelijkwaardig in het voorkomen van late complicaties van Lyme-borreliosis (Dattwyler et al., 1990). In een gerandomiseerde multicentra studie van Nadelman et al. (1992) met cefuroxime axetil in een dosering van 2x 200 mg/dag gedurende 20 dagen en doxycycline in een dosering van 3 x 100 mg/dag gedurende 20 dagen, was de behandeling voor EM na één jaar voor 90% van de 123 patiënten nog steeds bevredigend. 71% van de patiënten in de cefuroxime groep en 76% van de doxycycline groep waren geheel genezen, respectievelijk 19% en 16% van de patiënten hadden subjectieve klachten, maar hun toestand verbeterde. Bij 10% van de patiënten was de behandeling mislukt, maar bij de meeste van deze patiënten kon geen voortgaande actieve infectie worden aangetoond (Nadelman et al., 1992). Een andere gerandomiseerde multicentra studie van Luger et al. (1995) met 232 patiënten met EM die als behandeling 20 dagen cefuroxime of doxycycline kregen, toonde een vergelijkbare effectiviteit aan tussen de twee antibiotica als het bovengenoemde onderzoek van Nadelman et al. (1992). Hierbij kregen 119 patiënten oraal twee maal 500 mg/dag cefuroxime axetil en 113 patiënten kregen oraal drie maal 100 mg/dag doxycycline. 1 maand na de behandeling van de

79 vroege Lyme-borreliose was er succes of verbetering opgetreden in 90% van de met cefuroxime axetil behandelde patiënten versus 95% in de doxycycline behandelde patiënten die de 20 dagen behandeling hadden afgemaakt. De evaluatie na 1 jaar met betrekking tot de preventie van het late stadium van de ziekte van Lyme liet 95% bevredigende resultaten zien voor de met cefuroxime axetil behandelde patiënten en 100% voor de met doxycycline behandelde patiënten (Luger et al., 1995). In een prospectieve, longitudinale cohort studie van Gerber et al. (1996) werden 201 kinderen uit het zuidoosten van de staat Connecticut behandeld voor de ziekte van Lyme. 66% van de kinderen had eryrhema migrans, 23 % multiple erythema migrans, 6% artritis, 3% facialis parese, 2% aseptische meningitis en 0.5% Lyme-carditis. 192 kinderen werden twee tot vier weken oraal behandeld met amoxicilline (71%), doxycycline (27%), erythromycine (1.5%) en penicilline (0.5%). Zeven patiënten met meningitis, facialis parese of carditis kregen intraveneus ceftriaxon toegediend. De ouders van twee patiënten weigerden antibioticabehandelingen voor hun kinderen (Gerber et al., 1996). Bij een folluw-up van gemiddeld 23.3 maanden had geen van de patiënten een chronische of recidiverende Lyme-borreliose. De onderzoekers kwamen tot de conclusie dat een snelle behandeling met de bovengenoemde antibiotica succesvol kan zijn (Gerber et al., 1996). In een multicentra-, dubbelblinde-, gerandomiseerde-, prospectieve studie met 217 patiënten met EM, werden azithromycine in een dosering van 1x 500 mg/dag gedurende 7 dagen en amoxycilline in een dosering van 3 x 500 mg/dag gedurende 20 dagen met elkaar vergeleken. Hierbij werd aangetoond dat amoxycilline een effectiever antibioticum was dan azithromycine wat betreft het volledig genezen van het EM en in het voorkomen van recidieven gedurende 6 maanden na de behandeling. Van de 217 patiënten met EM die de studie van 20 dagen volbrachten, was 88% geheel vrij van symptomen met amoxycilline versus 76% met azithromycine en slechts 4% van de patiënten die behandeld waren met amoxicilline vielen terug, tegenover 16% van de azithromycine groep (Luft et al., 1996). Een prospectieve-, gerandomiseerde-, multicentra studie van Dattwyler et al. (1997) met 140 patiënten met een acute nietneurologische gedissemineerde Lyme-borreliose werden orale doxycycline en intraveneus ceftriaxon met elkaar vergeleken. De patiënten kregen oraal 2 x 100 mg/dag gedurende 3 weken doxycycline of 1 x 2 gram/dag intraveneus ceftriaxon gedurende 2 weken. De antibiotica waren even effectief en er traden geen belangrijke late complicaties van de ziekte van Lyme op (Dattwyler et al.,1997). In de meeste gecontroleerde studies werd voor doxycycline of amoxycilline een therapie van 3 weken toegepast. In een studie van Smith et al. (2002) kregen 118 patiënten met erythema migrans een behandeling van 14 tot 30 dagen met doxycycline of amoxicilline, waarbij de symptomen bij de meeste patiënten prompt verdwenen. 13 patiënten (11%) hielden last van blijvende moeheid of gewrichtspijnen gedurende enkele weken na de behandeling (Smith et al., 2002). Er zijn echter ook studies waarbij een kortere behandeling effectief was zoals aangetoond in een prospectieve -, gerandomiseerde -, dubbelblinde -, placebo-gecontroleerde studie met 180 patiënten met EM uitgevoerd door Wormser et al. (2003). De patiënten kregen oraal doxycycline in een dosering van 2 x 100 mg/dag gedurende 10 dagen. Andere groepen kreeg één enkele intraveneuze dosis van 2 gram ceftriaxon gevolgd door oraal doxycycline in een dosering van 2 x 100 mg/dag gedurende 10 dagen of 1 x 2 gram intraveneus ceftriaxon gevolgd door oraal 2 x 100 mg/dag doxycycline gedurende 20 dagen. Het volledige herstel wat betreft tekenen en symptomen van het EM was na 30 maanden 90.3% in de 10-dagen doxycycline groep, 86.5% in de doxycycline-ceftriaxon groep en 83.9% in de 20-dagen doxyxycline groep (Wormser et al., 2003). In een studie van Strle et al. (1996) werden 52 patiënten met Borrelia-lymfocytoom behandeld volgens het regime van EM. Binnen 1-12 weken met een gemiddelde van 2 weken waren alle patiënten genezen. Twee (4%) van de 52 patiënten ontwikkelden later een gedissemineerde Lyme-borreliose. Deze patiënten waren ingedeeld in een groep van 19 die behandeld waren met fenoxymethylpenicilline (Strle et al., 1996). Het Borrelia-lymfocytoom is een blauw-rood gekleurd knobbeltje of ronde vlek, die scherp afgebakend is met een doorsnee van 1-5 cm en dikwijls een licht atrofisch oppervlak heeft. Het Borrelia-lymfocytoom komt voornamelijk voor in Europa en is van de dermatoborreliosen de minst voorkomende huidaandoening (5%). Hier staat tegenover het EM dat 6090% van de dermatoborreliosen uitmaakt (Müllegger, 2006). Volgens Müllegger (2004) is de optimale behandeling voor Borrelia-lymfocytoom nog niet bepaald en kunnen de patiënten behandeld worden als voor het EM, dus met doxycycline, amoxicilline, cefuroxime axetil, azithromycine, phenoxymethyl penicilline of ceftriaxon. De gemiddelde tijd voor het genezen van het Borrelia-lymfocytoom bedraagt 4-7 weken en is afhankelijk van de duur van de huidaandoening voorafgaande aan de therapie. De behandeling kan wel 40 weken in beslag nemen (Müllegger, 2004). Aanbeveling Volgens de behandelingsrichtlijnen van de IDSA werkgroep wordt er bij een vroege gelokaliseerde Lyme-borreliose (EM, Borrelia-lymfocytoom) of een vroege gedessimineerde Lyme-borreliose met EM en zonder neurologische symptomen of heart block, voor volwassenen een orale behandeling van 14 dagen aanbevolen met de hierna genoemde eerstelijns antibiotica (A-I): amoxycilline 3x daags 500 mg (gemiddeld 14-21 dagen); doxycycline 2x daags 100 mg gemiddeld 10-21 dagen) of cefuroxime axetil 2x daags 500 mg (gemiddeld 14-21 dagen).

80 Een behandeling van 10 dagen is voldoende indien oraal doxycycline gegeven wordt. Aangezien de β-lactam antibiotica zoals amoxycilline en cefuroxime axetil een kortere halfwaardetijd hebben is het onduidelijk of een behandeling van 10 dagen met deze antibiotica even effectief is. Daarom wordt hier een behandeling van 14 dagen aanbevolen voor alle eerstelijns orale antibiotica (Wormser et al., 2006)(tabel 5.3). Doxycycline heeft bovendien het voordeel dat het effectief is in de behandeling van de co-infectie Human Granulocyten Ehrlichiose die tegelijkertijd met de vroege Lyme-borreliose kan optreden (zie verder onder paragraaf 5.3.8 coinfecties)(Wormser et al., 2006). Ondanks de uitstekende activiteit van de macroliden tegen B. burgdorferi s.l. in vitro, waarvan erythromycine door Steere et al.(1983) en azithromycine door Luft et al. (1996) zijn onderzocht, zijn deze macroliden in vivo minder effectief dan andere antibiotica zoals doxycycline en amoxicilline. De macroliden worden daarom niet aanbevolen als eerste keuze therapie (E-I) (Wormser et al., 2006). Ceftriaxon is volgens de IDSA niet beter dan genoemde orale antibiotica doxycycline, amoxycilline, cefotaxim en kan ernstige nevenverschijnselen (diarree) veroorzaken. Ceftriaxon wordt daarom niet aanbevolen bij patiënten met een vroege Lyme-borreliose zonder neurologische symptomen of heartblock (EII) (Wormser et al., 2006).  5.3.3 Behandeling van acute neuroborreliose Beschikbaar bewijs voor de behandeling van acute neuroborreliose bestaat slechts uit enkele casestudies zoals de studie van Steere et al. (1983). In deze studie werd aangetoond dat patiënten met Lyme-meningitis of acute radiculopathie (ruggemergswortel- of uitstralingspijn) goed reageerden op intraveneuze penicilline, hoewel wereldwijd ceftriaxon hiervoor meer wordt gebruikt wegens de makkelijke éénmalige toediening per dag (Steere et al., 1983). Een prospectieve gerandomiseerde Europese studie van Pfister et al. (1991) werd uitgevoerd met 33 Lyme-neuroborreliose patiënten. Om ethische redenen werd er geen controlegroep samengesteld. De patiënten werden gedurende 10 dagen intraveneus behandeld met 2 gram ceftriaxon (n=17) iedere 24 uur of met 2 gram cefotaxime (n=16) iedere 8 uur. Bij 30 van de 33 patiënten kon de effectiviteit van de antibiotica worden vastgesteld. Gedurende de behandeling verbeterde of verdwenen de neurologische symptomen bij 12 patiënten van de ceftriaxongroep en bij 14 patiënten van de cefotaximegroep. 27 patiënten, waarvan 12 uit de ceftriaxongroep en 15 uit de cefotaximegroep, werden gemiddeld na 8.1 maanden opnieuw onderzocht. Hierbij waren 17 patiënten geheel zonder symptomen; bij 4 patiënten uit de ceftriaxongroep en bij 6 patiënten uit de cefotaximegroep bleven neurologische symptomen bestaan. Bij 1 patiënt uit de ceftriaxongroep werd de spirocheet B. burgdorferi s.l. na 7.5 maanden na de antibioticumbehandeling geïsoleerd uit het lumbaalvocht . De onderzoekers zijn van mening dat een bovengenoemde antibioticumbehandeling met ceftriaxon of met cefotaxime gedurende 10 dagen een gunstig resultaat kan geven bij patiënten met een Lyme-neuroborreliose. Zij veronderstellen verder dat langere antibioticabehandelingen waarschijnlijk nodig zullen zijn bij patiënten bij wie de behandeling niet effectief was (Pfister et al., 1991). In de Verenigde Staten is weing onderzoek gedaan naar de behandeling van Lyme- meningitis met orale of intraveneuze doxycycline; dit in tegenstelling tot Europa waar onderzoek succesvolle behandelingen van 10 tot 14 dagen liet zien. In een Europees onderzoek van Kohlhepp et al. (1989) met 75 neuroborreliose patiënten, kregen 39 patiënten intraveneus doxycycline (200 mg de eerste 2 dagen en 100 mg de volgende 8 dagen) en 36 patiënten kregen intraveneus penicilline-G (20 mega-eenheden gedurende 10 dagen). Een jaar na bovenstaande behandelingsregimen waren de resultaten voor beide groepen gelijk. Bij tweederde van de patiënten waren de symptomen geheel verdwenen. Bij de overige patiënten was duidelijk een verbetering opgetreden. 10 patiënten werden opnieuw behandeld wegens terugval na een aanvankelijke verbetering. Een evaluatie na 3 jaar liet een herstel zien van 94% in de doxycyclinegroep en van 91% in de penicilline-Ggroep; hierbij was de groep met recidieven buiten beschouwing gelaten (Kohlhepp et al., 1989). Een Europese studie van Dotevall et al. (1999) toonde aan dat doxycycline effectief was in de behandeling van neuroborreliose met verlamming van de zevende hersenzenuw bij patiënten met pleiocytose in de liquor. Dergelijke patiënten, indien niet behandeld, hebben het risico om Lyme artritis te ontwikkelen zoals in een studie van Kalish et al. (2001) is aangetoond bij 14 (87.5%) van de 16 patiënten. Dergelijke patiënten bij wie de gezichtverlamming meestal vanzelf over gaat, dienen volgens de onderzoekers toch met antibiotica behandeld te worden om een late Lyme borreliose te voorkomen (Kalish et al., 2001). In een Europese retrospectieve studie door Karkkonen et al. (2001) zijn 69 Lyme-neuroborreliose patiënten behandeld met orale doxycycline. Hierbij kregen 61 patiënten oraal doxycycline à 200 mg/dag gedurende 10 tot 14 dagen; 7 patiënten kregen de eerste 2 dagen 400 mg doxycycline per dag en vervolgens gedurende 19 dagen 200 mg; 1 patiënt kreeg doxycycline à 100 mg/dag gedurende 28 dagen. Bij alle patiënten trad gedurende - en na de behandeling verbetering op. In een tijdsbestek van 14 dagen tot 9 maanden (gemiddeld 6 weken) na de therapie waren 56 patiënten (81%) geheel genezen. 13 patiënten (19%) van de 69 bleven persisterende neurologische klachten houden, ook bij ondervraging enkele jaren na de antibioticumbehandeling. Van de 13 patiënten waren er 7 met een gedeeltelijke éénzijdige verlamming van de zevende hersenzenuw, met als gevolg een gedeeltelijke éénzijdige gezichtsverlamming. Andere klachten waren: gedeeltelijk gehoorverlies, geheugenstoornissen, coördinatiestoornissen en blindheid door ontsteking van de oogzenuw, éénzijdige gedeeltelijke verlamming van de oogspierzenuw, lokaal gevoelsverlies en gedeeltelijke kuitspierverlamming. Aangezien de

81 incidentie van Lyme-neuroborreliose in Zweden wordt geschat op 400 tot 500 gevallen per jaar, is het van belang dat het merendeel van de patiënten thuis behandeld kan worden met een oraal antibioticum.. Volgens de onderzoekers vormt orale doxycycline een goed alternatief voor de intraveneuze antibioticabehandelingen (Karkkonen et al., 2001). In een prospectieve -, niet gerandomiseerde open Europese studie was de genezing of de afname van het aantal cellen in de liquor voor patiënten die behandeld werden met 1 x 2 g/dag intraveneus ceftriaxon (n=29) of met 2 x 200 mg/dag oraal doxycycline (n=36) gedurende 10-14 dagen, voor beide groepen gelijkwaardig (Borg et al., 2005). Aanbeveling Voor patiënten met acute neurologische verschijnselen zoals meningitis of radiculopathie en voor het kleine percentage patiënten met Lyme-artritis die niet reageren op de orale therapie, wordt door de werkgroep van de IDSA een intraveneuze (IV) behandeling aanbevolen met 2 gram/dag ceftriaxon gedurende 14 dagen, met een variatie van 10-28 dagen (B-I). Als alternatief kunnen dienen een intraveneuze therapie met cefotaxime in een dosering van 2 gram/8 uur, of intraveneus penicilline-G, 18-24 miljoen eenheden/dag gedurende 14 dagen, met variatie van 10-28 dagen (B-I). Bij patiënten die geen β-lactam antibiotica verdragen kan oraal 200-400 mg/dag doxycycline worden toegepast gedurende 10-28 dagen (B-I). Verlamming van de zevende hersenzenuw (Bell’s palsy) met normale liquor uitslagen kunnen behandeld worden met de antibiotica voor EM zoals amoxoxycilline, doxycycline of cefotaxime gedurende 14 dagen met een variatie van 14-21 dagen (B-III) (zie 5.3.2). Indien de uitslagen van het liquoronderzoek niet normaal zijn dan wordt behandeld als bij meningitis (B-III) (Wormser et al., 2006)(tabel 5.3).  5.3.4 Behandeling van Lyme-carditis Er zijn geen speciale studies met betrekking tot de optimale behandeling van Lyme-carditis. Aanbeveling Patiënten met een heartblock (het te laat optreden of wegblijven van een kamersamentrekking) worden direct behandeld met intraveneuze antibiotica zoals 1 x 2 gram/dag ceftriaxon gedurende 14 dagen met een variatie van 14-21 dagen (B-III) (Wormser et al., 2006)(tabel 5.3).  5.3.5 Behandeling van de late Lyme-borreliose De IDSA werkgroep heeft verschillende orale en parenterale antimicrobiële behandelingen voor de late Lyme-borreliose bestudeerd. Tot de late Lyme-borreliose worden ACA, (oligo)-artritis, encefalopathie en neuropathie gerekend. De encefalopathie van de late Lyme-borreliose kan bestaan uit geheugenstoornissen, geïrriteerdheid en slapeloosheid. De kenmerken van neuropathie zijn vooral distale paresthesieën (onjuiste gevoelswaarnemingen) en radiculaire pijn (uitstralende zenuwpijnen vanuit de ruggemerswortel). Voor ACA heeft de IDSA geen behandeling vanwege het zelden voorkomen in Noord-Amerika. Hetzelfde is ook het geval voor oogaandoeningen bij de late ziekte van Lyme (Wormser et al., 2006). In 1980 startte de eerste studie met antibiotica voor de behandeling bij 40 patiënten met chronische Lyme-artritis, meestal van de knie. Het was een dubbelblind placebo-gecontroleerde studie waarbij in de eerste fase van de studie willekeurig 20 patiënten werden behandeld met intramusculaire benzathine penicilline (7.2 miljoen eenheden) en 20 patiënten met placebo. Bij 7 patiënten van de benzathine penicilline groep (35%) trad volledige genezing op van het gewricht, tegenover geen enkele patiënt van de placebogroep (0%). De 20 patiënten uit deze laatste groep werden in de tweede fase van de studie behandeld met intraveneuze penicilline G (20 miljoen eenheden per dag gedurende 10 dagen). Spoedig na de behandeling trad bij 11 patiënten (55%) volledige genezing op. Volgens de onderzoekers kan parenterale penicilline dikwijls effectief zijn bij Lyme artritis maar de behandeling kan evenmeens bij enkele patiënten niet succesvol zijn (Steere et al., 1985). Een gerandomiseerde studie werd uitgevoerd door Dattwyler et al. (1988) met 23 patiënten met een late Lyme-artritis of een late Lyme- neuroborreliose. 10 patiënten kregen willekeurig een behandeling met intraveneuze penicilline à 20 miljoen eenheden per dag gedurende 10 dagen. 13 patiënten kregen een behandeling met intraveneus ceftriaxon à 2 gram per dag gedurende 2 weken. Van de 13 patiënten die behandeld waren met ceftriaxon trad er bij 1 patiënt (7.7%) geen verbetering op. Daarentegen hadden 5 van de 10 patiënten (50%) uit de penicillinegroep 3 maanden na de behandeling nog altijd klachten van geheugenstoornissen, moeheid of terugkerende oligo-artritis (Dattwyler et al., 1988). In een vervolgstudie van Dattwyler et al. (1988) kregen 31 patiënten met Lyme-artritis of chronische neuroborreliose een behandeling met intraveneus ceftriaxon à 2 of 4 gram per dag gedurende 2 weken. Van de 17 patiënten die behandeld werden met 4 gram ceftriaxon trad bij 3 patiënten (17.6%) geen verbetering op. Van de 14 patiënten die behandeld waren met 2 gram ceftriaxon trad bij 1 patiënt (7.1%) geen verbetering op. De onderzoekers zijn van mening dat ceftriaxon het eerste keus antibioticum is bij de late Lyme-borreliosis (Dattwyler et al, 1988). Een prospectief, open label, gerandomiseerd multicentra-onderzoek van Dattwyler et al. (2005) werd uitgevoerd met twee behandelingsregimen van ceftriaxon. Hierbij kregen 80 patiënten 14 dagen ceftriaxon en 63 patiënten kregen gedurende 28 dagen ceftriaxon. Er waren 5 mislukte behandelingen in de 14 dagen groep en geen enkele in de 28 dagen groep. In de 14 dagen groep trad 76% klinische verbetering op en dit was 70% in de 28 dagen groep (Dattwyler et al., 2005).

82 Uit bovengenoemde studies van de late Lyme-borreliose concludeerde de IDSA werkgroep dat een parenterale behandeling met ceftriaxon in een dosering van 2 gram per dag even effectief is als een behandeling van 4 gram per dag. Verder is een behandeling van 2 weken even effectief als een behandeling van 4 weken. Ondanks een intraveneuze behandeling met ceftriaxon zijn er toch patiënten bij wie een persisterende Lyme-borreliose manifest blijft (Wormser et al., 2006). In 1983 en 1984 werden door de onderzoekers Eichenfield et al.(1986) 25 kinderen met de ziekte van Lyme behandeld voor oligo-artritis. 21 van de 25 kinderen kwamen onder medische behandeling in de zomer en de herfst, een periode waarin het aantal teken op het hoogtepunt is. Deze kinderen waren woonachtig in New Jersey, een endemisch gebied voor de ziekte van Lyme (Eichenfield et al., 1986). Bij alle patiënten waren de IgM- en IgG antilichamen positief voor de spirocheet B. burgdorferi s.l. Bij 13 (52%) van de kinderen was geen erythema migrans verschenen; zij kregen direct te maken met artritis. De behandeling bestond uit oraal fenoxypenicilline (50 mg/kg/dag) of oraal tetracycline (30 mg/kg/dag) gedurende 10 tot 30 dagen en was effectief bij alle patiënten. 23 patiënten vertoonden geen verdere artritisaanvallen gedurende 4 tot 24 maanden na de behandeling. Bij 1 patiënt was een verdere intraveneuze therapie gedurende 10 dagen met penicilline nodig, alvorens genezing optrad (Eichenfield et al., 1986). Vanaf 1986 tot en met 1991 werden 48 volwassenen en kinderen met chronische Lyme-artritis behandeld met orale doxycycline 2 maal daags 100 mg of met orale amoxicilline en probenecid 4 maal daags 500 mg, beide gedurende 30 dagen. 18 van de 20 patiënten die behandeld waren met doxycycline en 16 van de 18 patiënten die behandeld waren met amoxicilline en probenecid vertoonden 13 maanden na aanvang van de behandeling geen klachten meer. Bij 5 patiënten ontwikkelde zich later neuroborreliose, waarvan 4 patiënten behandeld waren met amoxicilline/probenecid (Steere et al.,1994). Het gecombineerde gebruik van amoxicilline en probenecid zou af te raden zijn omdat probenecid de penetratie van bètalactam antibiotica in het hersenweefsel zou tegenwerken (Steere et al., 1994). In een studie met 27 volwassen patiënten met een late neuroborreliose, die bestond uit een encefalopathie of een polyneuropathie of uit beide, werd een behandeling toegepast van 2 gram/dag intraveneus ceftriaxon gedurende 2 weken. 6 maanden na de behandeling was er bij 17 patiënten (63%) een verbetering opgetreden; 6 patiënten (22%) waren verbeterd maar vielen terug en bij 4 patiënten (15%) was geen verandering opgetreden in het ziektebeeld (Logigian et al., 1990). In een volgend onderzoek van dezelfde onderzoekers werden 18 patiënten met Lyme-encefalopathie behandeld met intraveneus ceftriaxon à 2 gram/dag, maar nu gedurende 30 dagen. 6 maanden na de behandeling waren bij 14 (93%) van de 15 patiënten de symptomen verbeterd. Bij een evaluatieperiode van 12-24 maanden waren alle patiënten (100%) zonder klachten of was er verbetering opgetreden (Logigian et al., 1999). Ofschoon bovengenoemde behandelingen voor de meeste patiënten met de ziekte van Lyme effectief zijn, is er in een Noord-Amerikaans onderzoek een syndroom beschreven dat kan blijven bestaan na de antibioticabehandelingen. Dit syndroom komt voor bij ≤ 10% van de Lyme-borreliose patiënten die na een 2 - tot 3 maanden durende orale en/of intraveneuze behandeling met antibiotica een persisterende synovitis overhielden, die maanden en soms jaren voortduurde. Dit syndroom wordt antibiotica-refractaire Lyme-artritis genoemd, met vaak een negatieve PCR van de synoviaalvloeistof. Er wordt verondersteld dat auto-immuunreacties hierbij een rol spelen. Omdat de synoviale ontsteking aanhoudt, ondanks de bijna - of totale eliminatie van de spirocheet B. burgdorferi s.l. uit het gewricht met behulp van antibiotica, worden zulke patiënten met anti-inflammatoire middelen behandeld of men past arthroscopische synovectomy toe; dit is het wegnemen van de synovia via een kijkoperatie (Steere et al., 2006). Aanbeveling: Naar aanleiding van boven genoemde studies bij de late Lyme-borreliose beveelt de werkgroep van de IDSA voor Lymeartritis, zonder neurologische symptomen, een behandeling aan van 28 dagen met doxycycline (B-I), amoxicilline (B-I) of cefuroxim axetil (B-III) voor volwasse patiënten (zie tabel 5.3) (Wormser et al., 2006). Een orale behandeling is gemakkelijker toe te passen dan een intraveneuze behandeling, gaat gepaard met minder nevenverschijnselen en is minder kostbaar. Bij enkele patiënten met late Lyme-artritis die behandeld zijn met een orale antibioticumtherapie kan echter een neuroborreliose manifest worden (Wormser et al., 2006). Patiënten die een persisterende of recurrerende gewrichtszwelling blijven houden na een aanbevolen orale antibioticumkuur, dienen opnieuw behandeld te worden met een 4-weken orale antibioticumtherapie, of met een 2-4 weken intraveneuze ceftriaxon therapie (B-III)(zie tabel 5.3) (Wormser et al., 2006). De IDSA werkgroep geeft de voorkeur aan een tweede 4-weken orale antibioticumtherapie bij patiënten wier artritis is verbeterd maar nog niet geheel is genezen. De intraveneuze therapie zou toegepast moeten worden bij patiënten wiens artritis in het geheel niet verbeterde of verergerde. De artsen dienen enkele maanden te wachten met een herhalingstherapie, vanwege het langzame herstel van de ontsteking na een antibioticumbehandeling (Wormser et al., 2006). Indien er geen verbetering optreedt van de artritis na een intraveneuze therapie en de PCR van de synoviaalvloeistof is negatief, dan wordt een symptomatische behandeling aanbebolen (B-III) zoals intra-articulaire corticosteroïden-injecties, NSAID’s of DMARD’s. Ook kan een arthroscopische synovectomy een oplossing zijn bij patiënten met hevige pijn (BII)(Wormser et al., 2006).

83 Voor patiënten met een late neuroborreliose wordt intraveneus ceftriaxon aanbevolen à 2 gram /dag gedurende 2-4 weken (B-III). Als alternatieven kunnen cefotaxime en penicilline intraveneus worden toegepast (B-II) (Wormser et al., 2006).  5.3.6 Behandeling van acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) ACA is de karakterestieke huidaandoening van de late Lyme-borreliose in Europa, waar het de tweede meest voorkomende dermatoborreliose is. In de Verenigde Staten zijn maar enkele gevallen beschreven. ACA komt hoofdzakelijk bij oudere personen voor, meestal vrouwen. De meeste patiënten kunnen zich geen tekenbeet herinneren op de plaats van de huid die is aangedaan door ACA. Het merendeel van de patiënten wordt ieder jaar herhaaldelijk gebeten door teken of het betreft personen die voor hun beroep buiten werkzaam zijn in endemische gebieden voor de ziekte van Lyme, zoals tuinmannen, boswachters etc.(Müllegger, 2004). Voor ACA zijn geen prospectieve gerandomiseerde studies voorhanden. De optimale behandeling is nog niet bepaald. De patiënten worden tot nu toe met dezelfde antibioticaregimen behandeld als voor het EM, dus doxycycline, amoxicilline, cefuroxim axetil, cefotaxime, ceftriaxon en orale of parenterale penicilline. Het is echter van belang volgens de onderzoeker om ACA patiënten gedurende langere tijd te behandelen (mintens 4 weken), aangezien bij een behandeling van 2-3 weken dikwijls nog de persiterende huidaandoening werd waargenomen of er moest opnieuw behandeld worden (Müllegger, 2004). Aanbeveling Volgens de werkgroep van de IDSA kan ACA behandeld worden met dezelfde antibiotica als voor EM, dus met doxycycline (B-II), amoxicilline (B-II) en cefuroxim axetil (B-III) en dit gedurende 21 dagen, met een variatie van 14-28 dagen (zie tabel 5.3)(Wormser et al., 2006).  5.3.7 Behandeling van post-Lyme-ziekte syndroom Het “post Lyme-ziekte syndroom” wordt in de Verenigde Staten ook wel “post-behandelings chronische Lyme-borreliose” of “chronische Lyme-borreliose”genoemd. Deze Lyme patiënten hebben vaak te lijden van spierpijnen, neurocognitieve aandoeningen of vermoeidheid. Deze klachten kunnen zich al tijdens de ziekte van Lyme manifesteren of kort er na. Dit syndroom dat lijkt op het chronische vermoeidheidssyndroom of fibromyalgie, kan vaak maanden of jaren aanhouden na de standaardbehandelingen met antibiotica voor Lyme-borreliose. Er wordt verondersteld dat B. burgdorferi immunologische of neurohormonale processen in de hersenen opgang brengt die aanleiding geven tot voordurende pijnen, neurocognitieve en vermoeidheidssymptomen. Voor dergelijke patiënten wordt een symptomatische therapie aanbevolen (Steere, 2001; Steere, 2006). Verscheidene gecontroleerde studies over de behandeling bij het post-Lyme-ziekte syndroom zij gepubliceerd. In een retrospectieve cohort- studie van Shadick et al. (1994) werden 38 patiënten die een behandeling hadden ondergaan met antibiotica wegens Lyme-borreliose, vergeleken met een controlegroep van 43 personen. De groepen verschilden niet in leeftijd, geslacht, opleiding of materiële status. De gemiddelde duur vanaf het begin van de ziekte tot de studie-evaluatie was 6.2 jaar. De Lyme-groep had in vergelijking met de contrôlegroep meer gewrichtspijnen (61% versus 16%), meer distale gevoelsstoornissen (16% versus 2% ), meer concentratiestoornissen (16% versus 2%) en klaagde meer over moeheid (26% versus 9%). Van de patiëntengroep waren er 13 (34%) patiënten die de voortdurende gevolgen van de ziekte van Lyme ondervonden zoals gewrichtspijnen of artritis (n=6), geheugenstoornissen (n=4) en zenuw- of spierpijnen (n=3). De 13 patiënten met blijvende klachten hadden een langere ziektegeschiedenis van gemiddeld 35 maanden voordat zij met antibiotica behandeld werden, in vergelijking met patiënten zonder blijvende klachten, waarbij een behandeling in een eerder stadium van de ziekte na gemiddeld 2.7 maanden had plaatsgevonden. De onderzoekers veronderstellen dat een eenmaal verspreide Lymeborreliose infectie door het lichaam gepaard kan gaan met langdurige ziekteverschijnselen (Shadick et al., 1994). Een longitudinale cohortstudie met 678 patiënten uit Connecticut werd uitgevoerd door Seltzer et al.( 2000). De patiënten hadden allen van 1984 tot 1991 de ziekte van Lyme opgelopen. Tevens werden 212 patiënten random genomen uit de Lymegroep van 678 patiënten en gematcht met een controlegroep van dezelfde leeftijd. 85.6% van de 678 patiënten was behandeld met antibiotica. De evaluatie vond gemiddeld na 51 maanden na de diagnose plaats, met een variatie van 15 tot 135 maanden. De meeste patiënten (69%) hadden toenemende pijn-, moeheidsklachten of problemen met de dagelijkse activiteiten gedurende de 1 tot 11 jaar na de diagnosestelling van Lyme-borreliose. Slechts 19% van deze klachten was volgens de onderzoekers te wijten aan de ziekte van Lyme (Selzer et al., 2000). In de subgroep van 212 Lyme patiënten was het aantal klachten gelijk aan die van de contrôlegroep zonder de ziekte van Lyme (Seltzer et al., 2000). De meest omvangrijke studie bestond uit twee paralel lopende onderzoeken uitgevoerd door Klempner et al. (2001). De ene studie werd uitgevoerd met 64 seropositieve patiënten die werden verdeeld in een antibioticagroep en een placebogroep. De andere studie werd uitgevoerd met 65 seronegatieve patiënten en ook die werden verdeeld in een antibioticagroep en een placebogroep. De antibiotica-groepen van de seropositieve- en seronegatieve patiënten kregen een behandeling met 2 gram/dag intraveus ceftriaxon gedurende 30 dagen, gevolgd door een behandeling van 60 dagen oraal doxycycline à 2 x 100 mg/dag. De placebogroepen kregen een placebobehandeling van een intraveneuze dextrose oplossing gedurende 30 dagen, gevolgd door orale placebo capsules (Klempner et al., 2001). Bij een evaluatie van 180 dagen na de behandelingen was er bij 28 van de resterende 51 patiënten (55%) van de beide antibiotica-groepen samen een verbetering opgetreden volgens de Fibromialgia Impact Questionnaire (FIQ) wat betreft lichamelijk- en geestelijk welbevinden.

84 In de beide placebo-groepen was dit het geval voor 22 (42%) van de resterende 53 patiënten. Verder was bij 7 (14%) van de 51 patiënten in de antibiotica-groepen en bij 10 (19%) van de 53 patiënten in de placebogroepen, de toestand verslechterd, gemeten volgens de FIQ score. Afzonderlijke vergelijkingen volgens de FIQ score tussen de antibioticagroep en de placebogroep van de seropositieve studie toonden geen significante verschillen aan tussen deze behandelingsgroepen. Hetzelfde was het geval met de vergelijking tussen de antibioticagroep en de placebogroep van de seronegatieve studie. Er werd geen verschil geconstateerd wat betreft pijn, lichamelijk - en geestelijk welbevinden en dagelijks functioneren tussen de behandeling met placebo en de antibacteriële behandeling die bestond uit 30 dagen intraveneus ceftriaxon, gevolgd door 60 dagen doxycycline per os (Klempner, 2001). In een studie van Donta (2003) werden 235 patiënten met een post Lyme-ziekte syndroom behandeld met een macrolide: azithromycine, clarithromycine of erythromycine. De behandeling vond plaats gedurende onbepaalde tijd totdat de symptomen waren verdwenen of afgenomen. De patiënten hadden voor de aanvang van de behandeling meer dan 3 maanden klachten die bestonden uit moeheid, neurocognitieve symptomen of spier- en gewrichtsaandoeningen. Vervolgens werden 120 patienten die na de macrolidekuur waren verbeterd maar terugval vertoonden, behandeld met oraal tetracycline, intraveneus ceftriaxon of met een combinatietherapie bestaande uit een macrolide en hydroxychloroquine. De reden voor het toepassen van de combinatietherapie was het speculeren op het feit dat de ziekte van Lyme een intracellulaire persisterende infectie is en dat B. burgdorferi s.l. zich zou kunnen op houden in een zuur endosoom van sommige cellen en zodoende beschermd zou zijn tegen antibiotica die de cel niet in diffunderen. De activiteit van het macrolide zou worden versterkt door de alkalinisatie van het endosoom, waarna hydroxychloroquine een voltooiende werking zou kunnen uitoefenen. Van de 33 patiënten met de combinatietherapie waren er 32 verbeterd en bij 1 patiënt was de behandeling mislukt. Tetracycline werd aan 74 patiënten gegeven, 54 patiënten waren verbeterd en bij 20 patiënten was de behandeling mislukt. Ceftriaxon werd bij 23 patiënten toegepast; bij 9 patiënten trad verbetering op en bij 14 patiënten was de behandeling mislukt. De gemiddelde duur van de behandeling was 6 maanden, met een variatie van 1-18 maanden. Volgens de onderzoeker Donta wordt de duur van de behandeling en de genezing vooral bepaald door de periode van bestaande klachten. Hoe langer de duur van de voorafgaande symptomen is, des te langer zal de behandelingstijd vergen, alvorens een verbetering of genezing optreedt. De behandelingsduur voor de chronische Lyme patiënt bedraagt volgens de onderzoeker zeker 12-18 maanden (Donta, 2003). Aanbeveling Volgens de IDSA werkgroep is er niet voldoende overtuigend bewijs voor het bestaan van een symptomatische chronische Lyme-borreliose infectie bij patiënten die behandeld zijn volgens de aanbevolen richtlijnen van Lyme-borreliose. Er is geen bewijs dat een antibioticumtherapie hier effectief kan zijn en dit wordt niet aanbevolen bij patiënten met chronische subjectieve symptomen die zich 6 maanden of langer hebben gemanifesteerd, na het toedienen van de aanbevolen therapieën voor de ziekte van Lyme (E-I) (Wormser et al., 2006). 

5.3.8 Behandeling van de co-infectie human granulocytic anaplasmosis (HGA)/ human granulocytic Ehrlichiosis (HGE) Human granulocytic anaplasmosis (HGA), ook wel human granulocytic ehrlichiosis (HGE) genoemd, is een infectieziekte die veroorzaakt wordt door Anaplasma/ Ehrlichia phagocytophila. Het betreft Gram-negatieve bacteriën die verblijven als clusters in de vacuolen in het cytoplasma van monocyten, macrofagen en de neutrofielen (witte bloedcellen). Bij dieren met ehrlichiosis bevinden de bacteriën zich ook in trombocyten, erytrocyten en endoteelcellen (Dumler en Walker, 2001). Door een herclascificering wordt de veroorzaker van human granulocytic ehrlichiosis, Ehrlichia phagocytophilum, tegenwoordig ingedeeld bij het genus Anaplasma. Beide termen worden nog gebruikt (Dumler en Walker, 2001). De bacterie kan tegelijkertijd worden overgebracht met B. burgdorferi s.l. of met de parasiet Babesia microti (zie hierna) via de beet van een besmette Ixodes teek in de Verenigde Staten en Europa, in endemische gebieden voor Lyme-borreliose. In Europa bedraagt de besmetting van de Ixodes ricinus teek met Anaplasma(Ehrlichia) phagocytophila 0.4-66.7 % (Blanco en Oteo, 2002). In tegenstelling tot de spirocheet B. burgdorferi s.l. kan de bacterieE. phagocytophilum niet via transovariële route worden doorgegeven aan de eitjes van besmette moederteken. Er kunnen dus geen met E. phagocytophilum besmette larven uit de eitjes komen. Voor het voortbestaan van E. phagocytophilum is deze afhankelijk van zoogdierengastheren. Er wordt verondersteld dat de witvoetige muis Peromyscus leucopus en het witstaartige hert Odocoileus virginianus, de belangrijkste zoogdieren-reservoirs zijn voor E. phagocytophilum in het oosten en middenwesten van de Verenigde Staten. Dit komt overeen met dezelfde zoogdierenreservoirs voor B. burgdorferi s.l. en dezelfde gebieden die endemisch zijn voor de ziekte van Lyme. Een Ixodes teek in dit gebied kan besmet zijn met beide bacteriën en kan als vector tegelijkertijd zowel de infectieziekten HGE als Lyme-borreliose overbrengen op een zelfde patiënt (Bakken en Dumler, 2000). Verder kan de hertenteek Ixodes dammini, ook wel I. scapularis genoemd, besmet zijn met een derde micro-organisme Babesia microti, de veroorzaker van de infectieziekte babesiosis. Behalve HGE en/of Lyme-borreliose kan genoemde Ixodes teek dus ook de co-infectie babesiosis op mens en huisdier overbrengen (zie paragraaf 4.3.9 en 4.4.6)(Krause et al., 2000). Na een besmette tekenbeet met E. phagocytophilum kunnen griepachtige verschijnselen optreden, anemie, trombocytopenie, leukopenie en verhoogde leverenzymen. De diagnose van HGE wordt gesteld met de PCR test en de

85 immunofluoriscentie antilichamentest .Verder kan de veroorzaker van HGE al gedurende de eerste uren van het vastzitten van de teek wordenovergebracht. Een snelle verwijdering van de teek wil dus niet zeggen dat er geen HGE-infectie heeft plaats gevonden (Blanco en Oteo, 2002). De eerste keus behandeling bij HGE bestaat uit 2 x daags 100 mg doxycycline gedurende 7-10 dagen. Bij intolerantie voor doxycycline worden rifampine of quinolones aanbevolen (Blanco en Oteo, 2002). Aanbeveling: De werkgroep van de IDSA geeft de aanbeveling om symptomatische patiënten die verdacht worden van HGA/HGE, te behandelen met antibiotica om latere complicaties te voorkomen (A-III). Verdachte patiënten kunnen plotseling hoge koorts hebben, koude rillingen en hoofdpijn. Deze symptomen kunnen samengaan met trombocytopenia, leukopenia en/of verhoogde leverenzymen bij patiënten die drie weken eerder zijn gebeten door een Ixodes teek. Bevestiging wordt gegeven door de bepaling van antilichamen tegen Anaplasma/Ehrlichia phagocytophilum. De eerste keus behandeling voor volwassenen bestaat uit 2 x 100 mg/dag orale doxycycline (A-II) of IV, indien slikken niet mogelijk is en dit gedurende 10 dagen. Deze aanbeveling berust vooral op de klinische ervaringen in de behandeling met doxycycline aangezien er geen gecontroleerde klinische studies over de behandeling van HGA/HGE zijn (Wormser et al., 2006)(tabel 5.3).  5.3.9 Behandeling van de co-infectie babesiosis Babesiosis, babesiose of piroplasmosis wordt veroorzaakt door een intra-erythrocytaire protozoa, een ééncellige parasiet, genaamd Babesia microti. Van de vele soorten Babesia is B. microti de meest voorkomende oorzaak van infecties in de Verenigde Staten. De parasiet wordt overgebracht door Ixodes teken die tegelijkertijd de bacterie B. burgdorferi s.l. en Anaplasma/Ehrlichia phagocytophilum kunnen overbrengen. Babesia kan naast de Ixodes teek ook worden overgebracht door de Dermacentor- of de Rhipicephalus-teek. De klinische symptomen zijn gelijk aan die van malaria en kunnen variëren van asymptomatisch tot fataal. De ziekte lijkt op een virusinfectie met koorts, koude rillingen, zweten, spier- en gewrichtspijnen, anorexia, misselijk, overgeven, of moeheid. Vergrootte milt en lever met gele verkleuring van de huid kunnen voorkomen. De laboratorium uitslagen laten een hemolytische anemie zien met een verhoogd reticulocyten- (jonge erythrocyten)aantal. Trombocytopenie, proteïnurie kunnen voorkomen evenals een verhoging van de leverenzymen, ureum en kreatinine. Complicaties kunnen acute ademhalingsstoornissen zijn, verspreide intravasculaire coagulaties, congestief hartfalen, coma en nierinsufficiëntie. De diagnose kan microscopisch worden bevestigd met de giemsa-kleuring van een dun bloeduitstrijkje. Ook kunnen IgMen IgG antilichamen tegen Babesia in het serum worden bepaald, evenals DNA van B. microti met de PCR-test (Wormser et al., 2006). In een prospectieve-, gerandomiseerde-, niet-blinde studie van Krause et al. (2000) met 58 babesiose patiënten werden de antibiotica-combinaties atovaquone met azithromycine en clindamycine met quinine vergeleken. Een groep patiënten kreeg oraal 750 mg/12 uur atovaquone plus 500 mg azithromycine de eerste dag en vervolgens 250 mg/dag azithromycine gedurende 7 dagen. De andere groep kreeg de orale combinatie van 600 mg/8 uur clindamycine plus 650 mg/8 uur quinine, eveneens gedurende 7 dagen. Bij een evaluatie 3 maanden na het beëindigen van de therapie waren alle bloeduitstrijkjes en PCR testen negatief voor Babesia microti. Er waren minder nevenverschijnselen in de atovaquone/azithromycine groep dan in de clindamycine/quinine groep. Beide combinaties antibiotica werden even effectief bevonden in het genezen van babesiosis (Krause et al., 2000). Aanbeveling: De IDSA werkgroep geeft als richtlijn bij babesiose een behandeling met de antibiotica-combinatie atovaquone/azithromycine (A-I) of met de combinatie clindamycine/quinine (A-III). De dosering van de combinatie atovaquone/azithromycine voor volwassenen is oraal 750 mg/12 uur atovaquone met 5001000 mg azithromycine op dag 1 en vervolgens 250 mg/dag azithromycine gedurende 7-10 dagen. Bij immunodeficiënte patiënten kan een hogere dosering van azithromycine à 600-1000 mg/dag nodig zijn. De dosering van de combinatie clindamycine/quinine voor volwassenen is voorbehouden aan ernstige patiënten met babesiose en bedraagt intraveneus 300-600 mg/6 uur -, of oraal 600 mg/8 uur clindamycine gecombineerd met oraal 650 mg/6-8 uur quinine (Wormser et al., 2006)(tabel 5.3).  5.3.10 Niet aanbevolen therapieën Wegens gebrek aan biologische verklaringen, gebrek aan werkzaamheid, het ontbreken van ondersteunende gegevens of het mogelijk veroorzaken van schade aan de patiënt, raadt de werkgroep van de IDSA de hierna genoemde toepassingen (tabel 5.2) af, bij de behandeling van Lyme-borreliose (E-III) (Wormser et al., 2006). Tabel 5.2 Overzicht van niet aanbevolen therapieën bij Lyme-borrelios volgens de IDSA (Wormser et al., 2006). - hogere doses antibiotica dan aanbevolen door de IDSA - meervoudige, herhaalde behandelingen gedurende dezelfde Lyme-borreliose periode of langdurige behandelingen - combinatietherapieën van antibiotica - intermitterende doseringen - de antibiotica: de eerste generatie cefalosporinen, fluoroquinolonen, carbapenemen, vancomycine, metronidazol, tinidazol, amantadine, ketoliden, isoniazide, trimethoprim-sulfamethoxazol, fluconazol, benzathine penicillin-G

86 -

-

anti-Bartonella therapieën oververzadiging van zuurstof ozon koortstherapie intraveneuze immunoglobulinen cholestyramine (een anionen-wisselaar dat de galzuren met de vetoplosbare toxische lipoproteïnen van B. burgdorferi in het darmkanaal bindt en daarvoor in de plaats chloor-ionen afstaat. Hierdoor worden de toxinen van de spirocheet niet weer opgenomen via de entero-hepatische kringloop). intraveneus waterstofperoxide vitaminen of andere voedingssupplementen magnesium of bismut injecties

TABEL 5.3 Overzicht van de IDSA behandelingsrichtlijn voor Lyme-borreliose en co-infecties HGA en babesiosis voor volwassenen (Wormser et al., 2006). Profilaxe na tekenbeet: - éénmalige dosis van 200 mg doxycycline binnen 72 uur na verwijdering teek die ≥36 uur heeft vastgezeten en indien aantal besmette teken ≥ 20% in desbetreffend gebied; met/of observatie van patiënt. Vroege lokale Lyme-borreliose:EM, borrelia- lymfocytoom en vroege gedissemineerde Lyme-borreliose met EM en zonder neuroboreliose: Eerste keuzen orale antibiotica: - amoxicilline: oraal 3 x 500 mg/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-21 dagen - doxycycline: oraal 2 x100 mg/dag gedurende 10 dagen, variatie 14-21 dagen - cefuroxime axetil: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-21 dagen Alternatieve orale antibiotica: - azithromycine: oraal 1 x 500 mg/dag gedurende 7-10 dagen - clarithromycine: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 14-21 dagen (geen zwangerschap) - erythromycine: oraal 4 x 500 mg/dag gedurende 14-21 dagen Vroege neuroborreliose: meningitis, radiculopathie: Eerste keuze parenterale antibioticum: - ceftriaxon: intraveneus 1 x 2 gram/dag gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen Alternatieve parenterale antibiotica: - cefotaxime: intraveneus 1 x 2 gram/8 uur gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen - penicilline-G: 18-24 eenheden /dag, in 6 doses (iedere 4 uur), gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen Indien intolerant voor β-lactam antibiotica: - doxycycline: intraveneus of oraal 200-400 mg/dag in 2 doses, gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen Vroege neuroborreliose: verlamming van zevende hersenzenuw: facialisparalyse Eerste keuzen orale antibiotica: - amoxicilline: oraal 3 x 500 mg/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-21 dagen - doxycycline: oraal 2 x100 mg/dag gedurende 10 dagen, variatie 14-21 dagen - cefuroxime axetil: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-21 dagen Alternatieve orale antibiotica: - azithromycine: oraal 1 x 500 mg/dag gedurende 7-10 dagen - clarithromycine: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 14-21 dagen (geen zwangerschap) - erythromycine: oraal 4 x 500 mg/dag gedurende 14-21 dagen Vroege Lyme-borreliose: Lyme-carditis: Eerste keuze parenterale antibioticum: - ceftriaxon: intraveneus 1 x 2 gram/dag gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen Alternatieve parenterale antibiotica: - cefotaxime: intraveneus 1 x 2 gram/8 uur gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen - penicilline-G: 18-24 eenheden /dag, in 6 doses (iedere 4 uur), gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen Indien intolerant voor β-lactam antibiotica: - doxycycline: intraveneus of oraal 200-400 mg/dag in 2 doses, gedurende 14 dagen, variatie 10-28 dagen Eventuele orale vervolgbehandeling na parenterale behandeling of voor ambulante patiënten: Eerste keuzen orale antibiotica: - amoxicilline: oraal 3 x 500 mg/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-21 dagen - doxycycline: oraal 2 x100 mg/dag gedurende 10 dagen, variatie 14-21 dagen - cefuroxime axetil: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-21 dagen Alternatieve orale antibiotica: - azithromycine: oraal 1 x 500 mg/dag gedurende 7-10 dagen - clarithromycine: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 14-21 dagen (geen zwangerschap) - erythromycine: oraal 4 x 500 mg/dag gedurende 14-21 dagen

87 Late Lyme-borreliose: Lyme-atritis zonder neuroborreliose: Orale therapie: Eerste keuzen orale antibiotica: - amoxicilline: oraal 3 x 500 mg/dag gedurende 28 dagen - doxycycline: oraal 2 x100 mg/dag gedurende 28 dagen - cefuroxime axetil: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 28dagen Alternatieve orale antibiotica: - azithromycine: oraal 1 x 500 mg/dag gedurende 28 dagen - clarithromycine: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 28 dagen (geen zwangerschap) - erythromycine: oraal 4 x 500 mg/dag gedurende 28 dagen Late Lyme-borreliose: recurrerende Lyme-artritis: Parenterale therapie of orale therapie Parenterale therapie: Eerste keuze parenterale antibioticum: - ceftriaxon: intraveneus 1 x 2 gram/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen Alternatieve parenterale antibiotica: - cefotaxime: intraveneus 1 x 2 gram/8 uur gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen - penicilline-G: 18-24 eenheden /dag, in 6 doses (iedere 4 uur), gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen Indien intolerant voor β-lactam antibiotica: - doxycycline: intraveneus 200-400 mg/dag in 2 doses, gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen Orale therapie: zie onder late Lyme-artritis zonder neuroborreliose Late Lyme-borreliose: antibiotica-refractaire artritis: Symptomatische behandeling: - intra-articulaire corticosteroïden-injecties, NSAID’s of DMARD’s of eventueel - arthroscopische synovectomy Late Lyme-borreliose: centrale of perifere neuroborreliose Parenterale therapie: Eerste keuze parenterale antibioticum: - ceftriaxon: intraveneus 1 x 2 gram/dag gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen Alternatieve parenterale antibiotica: - cefotaxime: intraveneus 1 x 2 gram/8 uur gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen - penicilline-G: 18-24 eenheden /dag, in 6 doses (iedere 4 uur), gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen Indien intolerant voor β-lactam antibiotica: - doxycycline: intraveneus 200-400 mg/dag in 2 doses, gedurende 14 dagen, variatie 14-28 dagen Late Lyme-borreliose: ACA Orale therapie: Eerste keuzen orale antibiotica: - amoxicilline: oraal 3 x 500 mg/dag gedurende 21 dagen, variatie 14-28 dagen - doxycycline: oraal 2 x100 mg/dag gedurende 21dagen, variatie 14-28 dagen - cefuroxime axetil: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 21dagen, variatie 14-28 dagen Alternatieve orale antibiotica: - azithromycine: oraal 1 x 500 mg/dag gedurende 21 dagen, variatie 14-28 dagen - clarithromycine: oraal 2 x 500 mg/dag gedurende 21 dagen, variatie 14-28 dagen (geen zwangerschap) - erythromycine: oraal 4 x 500 mg/dag gedurende 21 dagen, variatie 14-28 dagen Postinfectieuze klachten en symptomen: post-Lyme-ziekte syndroom zonder actieve Lyme-borreliose infectie Symptomatische behandeling, geen antibiotica Co-infectie: human granulocyten anaplasmose/ehrlichiose: De eerste keus behandeling: - doxycycline: oraal 2 x 100 mg/dag of intraveneus 2 x 100 mg/dag indien slikken niet mogelijk is, gedurende 10 dagen. Co-infectie: babesiose: Combinatietherapie: - atovaquone: oraal 750 mg/12 uur met azitrhromycin: oraal 500-1000 mg op dag 1 en vervolgens 250 mg/dag gedurende 7-10 dagen. Immunodeficiënte patiënten: - atovaquone: oraal 750 mg/12 uur met - azithromycine: oraal à 600-1000 mg/dag gedurende 7-10 dagen ----------------

88 

5.4 BEHANDELING VAN LYME-BORRELIOSE VOLGENS DE ILADS BENADERING

De Centers for Disease Control and Prevention (CDC) beschouwen de ziekte van Lyme als de snelst groeiende ziekte die door een tekenvector wordt overgebracht. Het aantal nieuwe Lyme patiënten dat er per jaar bij komt ligt volgens voorzichtige schattingen tien maal hoger dan het opgegeven aantal van 17.730 gevallen in het jaar 2000. In het jaar 2004 was er volgens het CDC sprake van 24.000 nieuwe gevallen in de Verenigde Staten met een tienvoudige onderwaardering. In 2009 was er sprake van 300.000 nieuwe infectiegevallen met Lyme-borreliose in de VS. In Nederland was het aantal Lyme-patiënten met EM in 1994 6.500 en in 2001 was dit verdubbeld tot 13.000. In 2005 waren er 17.000 nieuwe infectiegevallen gemeld en in 2009 werd er door de huisartsen volgens het RIVM bij circa 22.000 personen de infectieziekte Lyme-borreliose geconstateerd. De chronische Lyme-borreliose is een zich steeds verder uitbreidende epidemie. In een retrospectief cohort bevolkingsonderzoek van Shadick et al.(1994) was het aantal chronische Lyme-borreliose gevallen 34% en in een gespecialiseerde kliniek, gelegen in een endemisch (bepaald centraal) gebied waar de ziekte van Lyme heerst, was het aantal chronische Lyme-borreliose patiënten 62% van de 215 patiënten. De patiënten in deze retrospectieve cohort studie hadden symptomen van chronische vermoeiheid, hoofdpijn en gewrichtspijnen (Asch et al., 1994). (Bij een retrospectief onderzoek gaat men terug in de tijd om de ziektegeschiedenis in kaart te brengen en bij een cohort onderzoek wordt de patiënt in de toekomst gevolgd. Een retrospectief cohort onderzoek is dus een combinatie van deze twee onderzoeken). Bovengenoemde gegevens vormde destijds in 2004 voor de International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) de aanleiding om nieuwe en uitgebreide richtlijnen op te stellen voor de diagnose en behandeling van Lyme-borreliose en aanverwante ziekten. Inmiddels zijn de richtlijnen van de ILADS door het National Guideline Clearinghouse (een instituut waar alle richtlijnen voor behandeling van ziekten zijn goedgekeurd en ondergebracht) van het web gehaald. Indien richtlijnen meer dan vijf jaar oud zijn, dienen deze te worden herzien. Voor de richtlijnen uit 2004 van de ILADS (zie tabel 5.4) is dat tot op heden nog niet gebeurd. Het wachten is dus op de nieuwe richtlijnen die ongeveer 300 pagina’s met onderzoek zullen omvatten en meer dan 1300 pagina’s met relevante “peer-reviewed” research (Cameron, 2010). De richtlijnen voor Lyme-borreliose van de ILADS uit 2004 zijn opgesteld door de ILADS-werkgroep en gebaseerd op de sterkte van het bewijs en de kwaliteit van de gegevens evenals dit het geval is voor de richtlijnen van de IDSA. De sterkte van het bewijs wordt aangeduid met categorie A-E en de kwaliteit van de gegevens met de Romeinse cijfers IIII. De aanbevelingen met een waardering “A” worden beschouwd als een goed bewijs ter ondersteuning van de aanbevelingen; een waardering “B” is een matig bewijs; waardering “C” is een neutraal bewijs met een keuzemogelijkheid; bij waardering “D” is het bewijs niet overtuigend ter ondersteuning van de aanbevelingen en bij waardering “E” wordt het bewijs beschouwd als een contra-indicatie ter ondersteuning van de aanbevelingen (Cameron et al., 2004). Verder geeft een kwaliteit van de gegevens met een Romeinse “I” aan dat tenminste één gerandomiseerd gecontroleerd onderzoek de aanbevelingen ondersteunt; een “II” betekent een ondersteuning van tenminste één goede opgezette nietgerandomiseerde klinische studie en “III” betekent dat het bewijs voor de aanbevelingen steunt op de opinie van deskundigen (Cameron et al., 2004). De richtlijnen van de ILADS voor de behandelingen van Lyme-artritis en encefalopathie worden aangeduid met de bewijscategorie “A-II”, evenals de aanbevelingen voor herhalingsbehandelingen en verlengde antibioticabehandelingen. De seronegatieve Lyme-borreliose behandeling valt onder de “A-III” bewijscategorie. De benzathine penicilline behandeling, de co-infectie behandeling, de combinatietherapieën en de empirsche behandeling worden aangeduid met een “B-III” categorie. Intra-articulaire steroïdenbehandelingen worden aangeduid met “D-III” en een arthroscopische synovectomie met categorie “D-II”; dus deze zijn te beschouwen als niet overtuigend bewijs ter ondersteuning van de aanbevelingen(Cameron et al., 2004). De ILADS werkgroep bestaat uit eerstelijns artsen (huisartsen), wetenschappers, mensen uit de maatschappelijke gezondheidszorg en patiënten. De werkgroep houdt zich bezig met de ziekte van Lyme en daaraan verwante co-infecties. De huisarts neemt een belangrijke plaats in, aangezien hij de eerste en vaak het voornaamste medische contact is voor de Lyme-borreliose patiënt. In tegenstelling tot de IDSA werkgroep is de ILADS werkgroep uitgebreider en meer klinisch georiënteerd (Cameron et al., 2004). De belangrijkste punten van de behandelingsrichtlijn uit 2004 van de ILADS voor Lyme-borreliose zijn:  de antibioticumbehandeling moet zo vroeg mogelijk beginnen om zo mogelijk een chronische Lyme-borreliose te voorkomen. De ILADS maakt onderscheid tussen de vroege en de chronische Lyme-borreliose. Tot de chronische Lyme-borreliose rekent de ILADS een persisterende -, een recurrerende (terugkerende) - of een refractaire Lymeborreliose.  de duur van de behandeling moet worden bepaald door de klinische respons van de patiënt, in plaats van een vastgestelde behandelingsduur van bijvoorbeeld 14 of 30 dagen etc..

89 

het stoppen met antibiotica wordt afgeraden in het geval van een persisterende Lyme-borreliose indien men de patiënt op eigen kracht zonder antibiotica zou willlen laten herstellen. Er wordt bij een persisterende Lyme-borreliose aangeraden de behandeling met antibiotica enkele maanden voort te zetten totdat de symptomen verdwenen zijn.

 5.4.1 Individuele behandeling Volgens de aanbevelingen van de ILADS dient de behandeling van Lyme-borreliose afgestemd te worden op de patiënt. Een geïndividualiseerde behandeling is vooral van belang bij de chronische Lyme-borreliose. De arts dient rekening te houden met de voorgeschiedenis van de patiënt, andere aandoeningen en medicatie, alsmede de gevoeligheid voor nevenverschijnselen bij antibiotica-therapieën zoals maag- darm stoornissen. Patiënten zijn tegenwoordig ook meer geinteresseerd in alternatieve therapieën zoals de traditionele Chinese geneeskunde, de natuurgeneeskunde en de homeopathie. De arts dient volgens de ILADS ook in te gaan op vragen van de patiënt hieromtrent. Dit is vaak het geval bij de chronische Lyme patiënt die vaak jaren te lijden heeft onder aandoeningen van Lyme-borreliose en waarbij (te korte) antibioticatherapieën geen resultaat hebben gehad (Cameron et al., 2004).  5.4.2 Antibiotica en dosering bij de vroege lokale Lyme-borreliose: EM, Borrelia-lymfocytoom De eerste keus orale antibiotica bij een vroege Lyme-borreliose (stadium I) zijn volgens de ILADS: amoxicilline, cefuroxime (bètalactamen); clarithromycine, azithromycine (macroliden); doxycycline en tetracycline (tetracyclinen). Met deze antibiotica zijn vergelijkbare resultaten bereikt bij patiënten met een vroege Lyme-borreliose zoals is aangetoond in de studies van Luft et al. (1996), Dattwyler et al.(1997) en Barsic et al. (2000). In een multicentra-, dubbelblinde-, gerandomiseerde-, prospectieve studie met 217 patiënten met EM, werden azithromycine in een dosering van 1x 500 mg/dag gedurende 7 dagen en amoxycilline in een dosering van 3 x 500 mg/dag gedurende 20 dagen met elkaar vergeleken. Hierbij werd aangetoond dat amoxycilline een effectiever antibioticum was dan azithromycine wat betreft het volledig genezen van het EM en in het voorkomen van recidieven gedurende 6 maanden na de behandeling. Van de 217 patiënten met EM die de studie van 20 dagen volbrachten, was 88% geheel vrij van symptomen met amoxycilline versus 76% met azithromycine en slechts 4% van de patiënten die behandeld waren met amoxicilline vielen terug, tegenover 16% van de azithromycine groep (Luft et al., 1996). Een prospectieve-, gerandomiseerde-, multicentra studie van Dattwyler et al. (1997) met 140 patiënten met een acute nietneurologische gedissemineerde Lyme-borreliose werden orale doxycycline en intraveneuze ceftriaxon met elkaar vergeleken. De patiënten kregen oraal 2 x 100 mg/dag doxycycline gedurende 3 weken of 1 x 2 gram/dag intraveneus ceftriaxon gedurende 2 weken. 63 patiënten (88%) van de 72 uit de doxycyclinegroep en 58 patiënten (85%) van de 68 uit de ceftriaxongroep werden als genezen beschouwd bij een controle negen maanden na de behandelingen. De antibiotica waren volgens de onderzoekers even effectief en er traden geen belangrijke late complicaties van de ziekte van Lyme op (Dattwyler et al.,1997). Een vergelijkende gerandomiseerde multicentra studie van Barsic et al. (2000) met de antibiotica azithromycine (n=48) en doxycycline (n=40) bij Lyme-borreliose patiënten met EM, liet een succes of verbetering zien bij 46 (95.8%) azithromycine - en bij 33 (82.5%) doxycycline patiënten (Barsic et al., 2000). Een andere Europese studie toont een succesvolle behandeling met orale doxycycline bij patiënten met een vroege neuroborreliose met de symptomen facialisparalyse en meningitis (Dotevall et al., 1999). Steeds meer artsen van de ILADS werkgroep bevelen een hogere dagelijkse orale dosering aan voor bepaalde antibiotica zoals 3000-6000 mg amoxicilline, 300-400 mg doxycycline, 500-600 mg azithromycine (Donta, 2003) Hierdoor kunnen hogere weefselconcentraties bereikt worden. Bij hogere doseringen dient men echter rekening te houden met de kans op meer nevenverschijnselen vooral op het gebied van het maag- darmstelsel. De ILADS werkgroep beveelt verder voor de behandeling van de vroege lokaleLyme-borreliose een behandelingsduur aan van 6 weken (Cameron et al., 2004).  5.4.3 Behandeling van de vroege gedissemineerde - en chronische Lyme-borreliose Intraveneuze antibiotica zijn de eerste aangewezen middelen bij de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose (stadium II) en de chronische Lyme-borreliose (stadium III). Als intraveneuze antibiotica worden ceftriaxon, cefotaxime en penicilline G het meest gebruikt (Cameron et al., 2004). Tot de vroege gedissemineerde Lyme-borreliose worden gerekend: Lyme-artritis, de vroege neuroborreliose (encefalitis, meningitis), Lyme-carditis (heartblock). Onder de chronische Lyme-borreliose verstaat de ILADS werkgroep de persisterende -, recurrerende-, en refractaire Lymeborreliose. Bij een persisterende Lyme-borreliose houden de symptomen aan ondanks een antibioticumbehandeling van 30 dagen. Bij een recurrerende Lyme-borreliose komt de infectie terug zonder nieuwe tekenbeet en bij een refractaire Lyme-borreliose reageert de patiënt slecht op de antibioticumbehandeling. Persisterende en refractaire Lyme-borreliosen worden bij voorkeur behandeld met intraveneuze en/of intramusculaire antibiotica. De intraveneuze behandeling wordt gegeven om hogere concentraties in het centrale zenuwstelsel (CZS) te bereiken (Cameron et al., 2004).

90 Intramusculaire benzathine penicilline is soms effectief bij patiënten die niet reageerden op de orale - of intraveneuze antibiotica. Hierbij is een lange behandeling noodzakelijk vanwege de lage serumconcentraties. Volgens Luft et al. (1988) kan B. burgdorferi s.l. gevoelig zijn voor lage concentraties penicilline en ceftriaxon, maar onderzoek toonde aan dat de spirocheet slechts langzaam werd gedood. Volgens de onderzoekers houdt dit in dat, net als bij syfilis, langdurige concentraties van deze antibiotica noodzakelijk zijn om een volledig herstel te bereiken (Luft et al., 1988). Korte behandelingen met benzathine penicilline bij patiënten met Lyme-artritis zijn toegepast, waarbij slechts 35% van de patiënten geheel was genezen (Steere et al., 1985). Betere resultaten van langere behandelingen met benzathine penicilline werden bereikt door Cimmino en Accardo (1992) bij twee patiënten met chronische Lyme-artritis. Bij persisterende Lyme-borreliose infecties van het late stadium, zoals chronische artritis, acrodermatitis chronica atroficans en encefalitis, wordt meestal een behandeling met intraveneus ceftriaxon of met penicilline-G (benzylpenicilline) van twee weken aanbevolen. Deze behandelingen zijn echter niet altijd succesvol, zoals bij twee patiënten met chronische artritis. De ene patiënte had symmetrische artritis aan knieën en polsen. De IgG antilichamen tegen B. burgdorferi s.l. waren positief. De patiënte werd behandeld met in totaal twee kuren penicilline-G, echter zonder resultaat. Na drie maanden werd de patiënt opnieuw behandeld met intraveneus benzathine penicilline in een dosering van 1.2 miljoen eenheden per week. De behandeling werd gedurende 6 maanden voortgezet, waarna zij eind 1986 geheel zonder symptomen was. Bij een controle in 1991 was dit nog steeds het geval (Cimmino en Accardo, 1992). Een tweede Lyme-artitis patiënte met chronische synovitis van de rechterknie werd eerst behandeld met minocycline à 200 mg/dag gedurende 10 dagen, incombinatie met non-steroïdale anti-inflammatoire drugs (NSAID’s). Hierbij trad slechts een geringe verbetering op. De patiënte werd vervolgens behandeld met twee kuren intramusculair ceftriaxon à 2 gram/dag gedurende 10 dagen. Vijf maanden later was zij nog niet genezen van haar artritis. Vervolgens werd de patiënte behandeld met 1.2 miljoen eenheden benzathine penicilline per week gedurende 2 maanden, waarna de dosering werd aangepast tot 1.2 miljoen eenheden per 20 dagen wegens zwangerschap. De patiënte was genezen van haar artritis bij de bevalling in augustus 1989. Bij een controle in 1991 was zij nog steeds klachtenvrij (Cimmino en Accardo, 1992). Aangezien spirocheten zich jaren kunnen handhaven in organen, in de synoviaal membranen of intracelulair, veronderstellen de onderzoekers dat een langdurige behandeling met benzathine penicilline uiteindelijk de infectie kan uitroeien door de replicatie te verhinderen of door lysis van de spirocheten als zij tijdelijk hun schuilplaats verlaten (Cimmino en Accardo, 1992). Bij de keuze tussen een intraveneuze en een orale behandeling moet de betere intraveneuze activiteit in het CZS worden afgewogen tegenover de orale - en eenvoudige wijze van toediening; ook dienen de kosten van de twee behandelingen te worden afgewogen, aldus de ILADS werkgroep (Cameron et al., 2004).  5.4.4 Behandelingsduur Een vroege behandeling met antibiotica kan persisterende -, recurrerende - en refractaire Lyme-borreliose voorkomen. De behandelingsduur zou afhankelijk moeten zijn van de klinische respons van de patiënt, in plaats van een arbitraire tijd aan te houden van bijvoorbeeld 30 dagen (Ziska et al., 1996). Een onderzoek van Ziska et al. (1996) naar de behandelingsduur van het erythema migrans door de artsen, liet een gemiddelde van 4 weken zien. 43% van de artsen behandelde post-erythema migrans Lyme-borreliose gedurende 3 maanden of langer met antibiotica en bij een chronische Lyme-borreliose was dit het geval bij 57% van de artsen. Langere en/of herhaalde antibioticabehandelingen zijn in sommige individuele gevallen noodzakelijk om de persisterende spirocheet geheel uit te roeien (Ziska et al., 1996). Volgens de ILADS werkgroep is het duidelijk dat de duur van de behandeling bij de ziekte van Lyme van essentiëel belang is. Korte antibioticumbehandelingen laten een percentage zien van 30-62% aan recidieven binnen 3 jaar na de behandeling: In een studie van Asch et al. (1994) werden 215 patiënten opnieuw onderzocht nadat zij gemiddeld 3.2 jaar eerder behandeld waren voor de ziekte van Lyme. Bij het vervolgonderzoek hadden 82 patiënten (38%) geen klachten meer en bij 19 patiënten (9%) was dit wel het geval. Bij 114 patiënten (53%) werden persisterende klachten geconstateerd zoals gewrichtspijnen, gewrichtsontsteking, hart- of neurologische aandoeningen, met of zonder moeheid (Asch et al., 1994). In een retrospectieve cohort- studie van Shadick et al. (1994) werden 38 patiënten die een behandeling hadden ondergaan met antibiotica wegens Lyme-borreliose, vergeleken met een controlegroep van 43 personen. De groepen verschilden niet in leeftijd, geslacht, opleiding of materiële status. De gemiddelde duur vanaf het begin van de ziekte tot de studie-evaluatie was 6.2 jaar. De Lyme-groep had in vergelijking met de contrôlegroep meer gewrichtspijnen (61% versus 16%), meer distale gevoelsstoornissen (16% versus 2% ), meer concentratiestoornissen (16% versus 2%) en klaagde meer over moeheid (26% versus 9%) (Shadick et al., 1994). Van de patiëntengroep waren er 13 (34%) patiënten die de voortdurende gevolgen van de ziekte van Lyme ondervonden zoals gewrichtspijnen of artritis (n=6), geheugenstoornissen (n=4) en zenuw- of spierpijnen (n=3). De 13 patiënten met blijvende klachten hadden een langere ziektegeschiedenis van gemiddeld 35 maanden voordat zij met antibiotica behandeld werden, in vergelijking met patiënten zonder blijvende klachten, waarbij een behandeling in een eerder stadium van de ziekte na gemiddeld 2.7 maanden had plaatsgevonden (Shadick et al., 1994). In een studie van Donta (1997) werden 277 patiënten met een persisterende Lyme-borreliose behandeld met tetracycline. De behandelingsduur varieerde van één tot 11 maanden, met een gemiddelde duur van vier maanden. Na een behandeling

91 van twee maanden was er bij 33% van de patiënten een verbetering opgetreden in de afname van de klachten; na drie maanden behandelen was deze verbetering 66%. De studie toonde hiermee aan dat een langere behandeling tot betere resultaten zou kunnen leiden (Donta, 1997). In een gerandomiseerde studie van Oksi et al. (1998) werden twee groepen patiënten met een gedessimineerde Lymeborreliose behandeld met verschillende behandelingsregimen en met elkaar vergeleken. 30 patiënten kregen gedurende 100 dagen een orale behandeling van drie maal daags 200 mg cefixime gecombineerd met 500 mg probenecid. Een andere groep van 30 patiënten kregen eerst gedurende 14 dagen intraveneus ceftriaxon à 2 gram per dag, gevolgd door een orale behandeling van drie maal daags 500 mg amoxicilline in combinatie met 500 mg probenecid gedurende 100 dagen (Oksi et al., 1998). Het aantal patiënten met recidieven of een mislukte behandeling en het aantal positieve polymerase chain reacties was groter in de cefixime groep.De onderzoeker beschouwde de PCR als de enige betrouwbare test om het mislukken van een antibioticumbehandeling aan te tonen, daar antilichamen tegen B. burgdorferi s.l. gedurende jaren aanwezig kunnen blijven, ook na een succesvolle therapie (Oksi et al., 1998). De studie toonde aan dat een langere antibioticumbehandeling, in dit geval van drie tot vier maanden, bij patiënten met een gedessimineerde Lyme-borreliose tot goede resultaten leidde bij 90% van de patiënten (Oksi et al., 1998). In een studie bij 27 chronische neuroborreliose patiënten werd gedurende 14 dagen intraveneus ceftriaxon toegediend. Bij 63% van de patiënten trad een verbetering op; 22% van de patiënten verbeterde eerst maar vielen vervolgens terug en bij 15% was geen verandering te constateren (Logigian et al., 1990). In een volgend onderzoek van dezelfde onderzoekers werden 18 patiënten met Lyme-encefalopathie behandeld met intraveneus ceftriaxon à 2 gram/dag, maar nu gedurende 30 dagen. 6 maanden na de behandeling waren bij 14 (93%) van de 15 patiënten de symptomen verbeterd. Bij een evaluatieperiode van 12-24 maanden waren alle patiënten (100%) zonder klachten of was er verbetering opgetreden (Logigian et al., 1999). Een gerandomiseerde placebo-gecontroleerde studie liet geen betering zien na 1 maand intraveneus ceftriaxon gevolgd door 2 maanden orale doxycycline (Klempner et al., 2001). Deze studie is bekritiseerd omdat patiënten gemiddeld 4-5 jaar symptomen hadden van een chronische Lyme-borreliose. In dat geval is een behandeling van 1 maand intraveneus ceftriaxon, wel of niet gevolgd door een te korte en een te laag gedoseerde orale doxycycline therapie, onvoldoende voor patiënten die al zo lang ziek zijn (Donta, 2001; Cameron, 2006). Verder zou het antibioticum ceftriaxon onvoldoende intracellulair werkzaam zijn; dit is nodig om de spirocheet te bestrijden als deze zich ophoudt in de cellen (Donta, 2001). Aanbeveling: Het advies van de ILADS bij een vroege lokale Lyme-borreliose, zoals het erythema migrans en Borrelia-lymfocytoom, luidt zo vroeg mogelijk starten met de behandeling om late complicaties te voorkomen en minimaal 6 weken behandelen met bijvoorbeeld twee maal daags 200-300 mg doxycycline (zie tabel 4.4)(Cameron et al., 2004). Bij latere stadia (II, III) en de persisterende en recurrerende (chronische) Lyme-borreliose kan men de behandeling eventueel beginnen met intraveneus ceftriaxon à 2-4 gram/dag of intraveneus cefotaxim à 6-12 gram/dag gedurende 14-30 dagen. Daarna of als start van de behandeling oraal doxycycline à 400-600 mg/dag, of oraal amoxicilline à 4-6 gram/dag, of oraal azithromycine à 500-600 mg/dag, of clarithromycine à 1000-2000 mg/dag, of benzathine penicilline 1,2 miljoen eenheden 3 x week. De behandeling dient minimaal 4-6 maanden te worden toegepast en is afhankelijk van de respons van de patiënt. Vaak is een behandeling langer dan 1 jaar noodzakelijk (Cameron et al., 2004).  5.4.5 Combinatietherapie Hoewel er nog geen officiële ILADS richtlijnen zijn voor het toepassen van combinatietherapieën door gebrek aan goede klinische studies, wordt door behandelende artsen steeds meer een combinatietherapie van twee of meer antibiotica toegepast bij de refractaire en chronische Lyme-borreliosen (Donta, 2003). Deze benadering wordt ook gebruikt bij de infectieziekte babesiose, die eveneens door de teek van het geslacht Ixodes overgebracht kan worden (zie 5.4.6 co-infecties). Er zijn vier redenen voor het toepassen van een combinatietherapie bij de chronische Lyme-borreliose. - In de eerste plaats kan B. burgdorferi s.l. voorkomen in zowel de vloeibare - als de weefselcompartimenten. Tot op heden is er nog geen antibioticum gevonden dat effectief is in beide compartimenten. Men zou azithromycine kunnen combineren met penicilline (Burrascano, 2005). - In de tweede plaats kan de spirocheet zich intracellulair verschuilen en kan op deze wijze de effecten van antibiotica omzeilen. Typische combiaties zijn een extracellulair antibioticum en een intracellulair antibioticum zoals een erythromycine derivaat of het chemotherapeuticum metronidazol. Sommige experts ontraden het samen toedienen van een bactericide en een bacteriostatisch antibioticum, bijvoorbeeld de combinatie van het bactericide penicilline met het bacteriostatische tetracycline dat eiwitstofwisseling remt waardoor er geen vermenigvuldiging kan plaatsvinden, zodat een bactericide antibioticum dat werkzaam is ter hoogte van de celwandsynthese zijn activiteit niet kan uitoefenen (Burrascano, 2005).

92 - In de derde plaats kan de spirocheet in verscheidene verschijningsvormen voorkomen: de normale intakte spirocheet, de L-vorm of celwand-deficiënte vorm en de cystevorm. Zowel de L-vormen als de cystevormen hebben geen celwanden. Bèta-lactam antibiotica die werken ter hoogte van de celwanden zijn bij deze verschijningsvormen dus ineffectief. De Lvormen zijn gevoelig voor tetracyclinen en de erythromycine derivaten. B. burgdorferi s.l. kan overgaan van de ene verschijningsvorm in de andere. Het zou dus raadzaam zijn om de behandeling te richten op alle drie de verschijningsvormen door afwisselend of gecombineerd de antibiotica toe te dienen (Burrascano, 2005) - In de vierde plaats kan de spirocheet bij gebrek aan essentiële nutriënten zoals voorkomt in liquor cerebrospinalis, of door de toediening van antibiotica, overgaan van de intakte spirocheet in de cystevorm. De cyste kan lange tijd in een soort sluimertoestand met een laag metabolisme overleven totdat de situatie weer gunstig is en er reconversie plaats kan vinden naar de normale spirochetenvorm. Het is dus van belang om ook de cysten te doden door een antibioticum te combineren met de chemotherapeutica hydroxychloroquine, metronidazol of tinidazol of hydroxychloroquine die effectief blijken te zijn tegen de cysten van B. burgdorferi s.l. (Zie hoofdstuk III; Brorson en Brorson (2002); Brorson en Brorson (2004))(Burrascano, 2005). Voorbeelden van combinatietherapieën: Orale toepassing van amoxicilline, cefuroxime of cefdinir gecombineerd met een macrolide zoals azithromycine of clarithromycine zijn voorbeelden met goede resultaten in de individuele artsenpraktijk bij de persisterende -, recurrerende en refractaire Lyme-borreliose. Combinatietherapieën worden onder andere toegepast door de artsen Cameron, Burrascano, Stricker, Harris en Meer-Scherrer van de ILADS werkgroep. Zo kan men bijvoorbeeld orale azithromycine à 500 mg/dag, of orale clarithromycine à 1000 mg/dag combineren met orale cefuroxim axetil à 1000 mg/dag of met metronidazol à 1000 mg/dag en dit minimaal 3 maanden, afhankelijk van de respons van de patiënt. Combinaties van antibiotica dienen afgewisseld te worden in verband met resistentie en bijwerkingen (Burrascano, 2005). Een ander voorbeeld van een orale combinatietherapie is azithromycine of clarithromycine met het antimalaria medicijn hydroxychloroquine (Plaquenil®). Azithromycine à 250-600 mg/dag of clarithromycine à 1000-1500 mg/dag en/of tetracycline à 1500 mg/dag in combinatie met hydroxychloroquine à 400 mg/dag. Minimaal 3 maanden behandelen op geleide van het klinische beeld van de patiënt, indien nodig 1-2 jaar behandelen met elke 3-6 maanden een pauze van 1 maand (Donta, 2003; Burrascano, 2005). Een andere orale combinatietherapie bestaat uit doxycycline à 400-600 mg/dag met metronidazol (Flagyl®) à 500-1500 mg/dag of tinidazol (Fasigyn®) à 500-1500mg/dag (Hoofdstuk III). Deze combinatie dient om de week te worden toegepast (Burrascano, 2005). Een onderzoek van Ziska et al. (1996) in het noordoosten van de Verenigde Staten, een endemisch gebied voor de ziekte van Lyme, toonde aan dat 40% van de artsen bij post-erythema migrans Lyme-borreliose destijds al een combinatietherapie van antibiotica toepaste en bij de chronische Lyme-borreliose was dit percentage 42% van de artsen (Ziska et al. 1996). Combinatietherapieën verhogen het risico op nevenverschijnselen, vooral gastro-intestinaal. Het risico dient te worden afgewogen tegen de mogelijk verbeterde respons met een combinatietherapie bij Lyme patiënten bij wie een enkelvoudige antibioticumbehandeling faalde. (Ziska et al., 1996; Battaglia et al., 2000; Cameron et al., 2004). Een studie van Battaglia et al. (2000) werd uitgevoerd bij 43 psychiatrische patiënten met een atypische depressie. Verder verbleven deze patiënten vaak of permanent in een endemisch gebied voor de ziekte van Lyme en hadden geregeld tekenbeten opgelopen met verschijnselen van erythema migrans. Bovendien waren de IgM en IgG antilichamen bij deze patiënten positief voor Borrelia burgdorferi s.l.. 43 patiënten kregen gedurende 90 dagen een behandeling die bestond uit oraal 200 mg/dag doxycycline per os gedurende 5 achteréénvolgende dagen, gevolgd door 400mg/dag doxycycline per os gedurende 2 achteréénvolgende dagen. 17 patiënten kregen een tweede 90 dagen kuur die bestond uit 2 g/dag intramusculair ceftriaxon gedurende 5 dagen, gevolgd door 2 antibioticumvrije dagen. Tenslotte ondergingen 9 patiënten een derde behandelingsperiode van 180 dagen die bestond uit 2.4 miljoen eenheden intramusculaire benzathine penicilline 1 maal per week plus 500 mg/dag azithromycine per os gedurende 3 dagen, gevolgd door 7 dagen rust. Totaal waren er 27 innames. 2 patiënten ondergingen aanvankelijk tevens deze derde behandelingsperiode van 180 dagen, maar wegens terugval werd de hele medicatie vervangen door 1000 mg/dag intramusculaire vancomycine gedurende 10 dagen. Uiteindelijk was bij 40 patiënten de algemene klinische toestand geheel verbeterd. De onderzoekers kwamen tot de conclusie dat een langdurige combinatietherapie met antibiotica bij chronische neuroborreliose patiënten effectief kan zijn (Battaglia et al, 2000). In een studie van Donta (2003) werden 235 chronische Lyme-borreliose patiënten behandeld. De behandeling bestond uit een macrolide: erythromycine, azithromycine of clarithromycine, gecombineerd met het anti-malaria medicijn hydroxychloroquine. Donta (2003) veronderstelt dat de spirocheet zich gedurende lange tijd intracellulair kan ophouden. Als dit in een zuur endosoom zou zijn dan zou de lage pH de intracellulaire activiteit van een macrolide verminderen. Door toevoeging van hydroxychloroquine zou er intracellulair alkalisatie optreden, waardoor de activiteit van het macrolide antibioticum zou toenemen (Donta, 2003). In vitro onderzoek van Brorson en Brorson (2002) heeft aangetoond dat hydroxychloroquine effectief is tegen de cysten van B. burgdorferi s.l.. Samen met een macrolide antibioticum dat effectief is tegen de normale spirocheten van B.

93 burgdorferi s.l., zou dit volgens de onderzoekers een adequate behandeling zijn van Lyme-borreliose (Brorson en Brorson, 2002). Onderzoeker Donta (2003) heeft deze behandeling dus toegepast, echter op basis van een ander werkingsmechanisme. De kortste behandelingsduur was een maand, de langste was 18 maanden. Bij 80% van de patiënten trad na drie maanden behandelen meer dan 50% verbetering op. Het optreden van een verbeterde toestand was direct gecorreleerd met de duur van de symptomen voordat de behandeling begon. Hoe langer de patiënt chronische Lyme-borreliose had, des te langer duurde het voordat verbeteringen merkbaar werden (Donta, 2003). 120 patiënten die waren verbeterd aan het eind van de behandeling, vertoonden later recidieven en werden opnieuw behandeld met antibiotica. 33 patiënten kregen opnieuw een kombinatietherapie van een macrolide en hydroxychloroquine; bij 32 patiënten trad verbetering op. Verder kregen 74 patiënten tetracycline; bij 54 patiënten trad verbetering op, bij 20 patiënten mislukte de behandeling. 23 patiënten kregen intraveneus ceftriaxon toegediend; bij negen patiënten trad verbetering op, maar bij 14 mislukte de therapie. Verder onderzoek naar combinatietherapieën, de behandelingsduur en dosering is nodig om te komen tot een effectieve behandeling van de chronische Lyme-borreliose patiënt (Donta, 2003).  5.4.6 Co-infecties De arts dient tevens aandacht te schenken aan eventueel aanwezige co-infecties die veel gesignaleerd worden bij patiënten met de ziekte van Lyme. Hoewel B. burgdorferi s.l. de meest voorkomende pathogeen is die wordt overgebracht door teken van het geslacht Ixodes, dient men rekening te houden met tegelijkertijd overgebrachte pathogenen zoals Babesia- en Ehrlichia soorten, die respectievelijk babesiose of piroplasmose en de human granulocytic ehrlichiose/anaplasmose (HGE)/(HGA) kunnen veroorzaken. Verder is de bacterie Bartonella een andere veroorzaker van co-infecties bij de ziekte van Lyme. Teken kunnen dus zowel drager zijn van B. burgdorferi s.l. als van de andere genoemde pathogenen. Lyme-borreliose patiënten dienen dus tevens getest te worden op co-infecties en afhankelijk van de resultaten hiervoor tevens behandeld te worden (Cameron et al., 2004; Burrascano, 2005).  5.4.6.1 Babesiosis Babesiosis, babesiose of piroplasmose wordt veroorzaakt door Babesia, een protozoa of ééncellige parasiet, die zich vermenigvuldigt in de erythrocyten en hemolyse veroorzaakt. Babesia kan naast de Ixodes teek ook worden overgebracht door de Dermacentor- of de Rhipicephalus-teek. De diagnostische testen voor Babesia zijn vaak ongevoelig en van de vele soorten Babesia kan alleen Babesia microti serologisch getest worden via het bepalen van antilichamen of western blot. Aanbeveling De eerste keus behandeling van babesiosis bestaat uit een combinatie van het chemotherapeuticum atovaquone (2 x 750 mg/dag) en een erythromycine antibioticum zoals azithromycine (500-1200 mg/dag), clarithromycine (250-500 mg/dag) of telithromycine (800 mg/dag). De behandelingsduur is afhankelijk van het stadium van de infectie, de tijd die verlopen is voordat de diagnose werd gesteld, de gezondheidstoestand en immuunstatus van de patiënt en de aanwezigheid van een Lyme-infectie. In acute gevallen wordt een behandeling van drie weken aanbevolen en in chronische gevallen een minimum behandeling van vier maanden (Burrascano, 2005).  5.4.6.2 Ehrlichiose en Anaplasmose Ehrlichiose en Anaplasmose worden veroorzaakt door respectievelijk Ehrlichia en Anaplasma, een parasiet die verblijft in de witte bloedcellen (granulocyten) en die bij de mens de human granulocytic ehrlichiose/anaplasmose (HGE/HGA) veroorzaakt. Het testen voor Ehrlichia is vaak moeilijk door de vele soorten die er in teken kunnen voorkomen en waarvoor er vaak geen beschikbare serologische en PCR testen zijn. Ook standaard bloeduitstrijkjes om direct de pathogenen in de leucocyten onder de microscoop te zien, geven vaak weinig resultaat. Meer Ehrlichia soorten kunnen worden gedetecteerd door grotere uitstrijkjes te maken. Toch kan de Ehrlichia infectie gemist worden, zodat een klinische diagnose op de eerste plaats komt. Aanbeveling De standaardbehandeling bestaat uit 200 mg doxycycline gedurende 2 tot 4 weken (Burrascano, 2005).  5.4.6.3 Bartonella Bartonella is een gramnegatieve staafvormige bacterie die intracellulair verblijft in de erythrocyten. Een bekende bacterie is Bartonella hencelae, de veroorzaker van de kattenkrabziekte (KKZ) die kan worden overgebracht door de beet of krab van een besmette kat of via de beet van een Ixodes teek. In de Verenigde Staten heeft de chronische Lyme-patiënt waarschijnlijk te maken met een ander soort Bartonella die verschilt van de bacterie die de kattenkrabziekte veroorzaakt en Bartonella-like organism wordt genoemd (Burrascano, 2005). Verschillende aspecten van de infectie wijzen hierop zoals negatieve serologische testen voor Bartonella en de medicatie die gewoonlijk wordt toegepast bij een Bartonella- infectie leidt alleen tot onderdrukking van de symptomen, maar heft de infectie niet op. Aanbeveling De eerste keus behandeling bestaat uit het antibioticum levofloxacine, 500 mg/dag en minimaal 1 maand behandelen en 3 maanden of langer voor ernstig zieke patiënten (Burrascano, 2005).

94 Voor Bartonella is verder onderzoek in vivo nodig. In vitro zijn de antibiotica fluorquinolonen, azithromycine, doxycycline en rifampine effectief gebleken (Cameron et al., 2004). In verband met het gebrek aan studies heeft de ILADS werkgroep voor co-infecties nog geen vaste richtlijnen vastgelegd voor de dosis, de duur en het type behandeling (Cameron et al., 2004). TABEL 5.4 Overzicht van de ILADS behandelingsrichtlijn voor Lyme-borreliose voor volwassenen (Cameron et al., 2004). Vroege lokale Lyme-borreliose (stadium I): EM, borrelia- lymfocytoom - doxycycline: oraal 400-600 mg/dag gedurende 6 weken - amoxicilline: oraal 4000 mg/dag gedurende 6 weken - azithromycine: oraal 500-600 mg/dag gedurende 6 weken Vroege gedissemineerde Lyme-borreliose (stadium II) en late Lyme-borreliose (stadium III) en persisterende of terugkerende symptomen na eerdere behandeling Eventueel beginnen met: - ceftriaxon: intraveneus 2-4 gram/dag gedurende 14-30 dagen of - cefotaxim: intraveneus XXX gram/dag gedurende 14-30 dagen Gevolgd door: - doxycycline: oraal 400-600 mg/dag, minimaal 3 mnd op geleide van klinisch beeld, vaak > 1 jaar behandelen - amoxicilline: oraal 4-6 gram/dag, min. 3 mnd op geleide van klinisch beeld, vaak > 1 jaar behandelen - azithromycine: oraal 500-600 mg/dag, min. 3 mnd op geleide van klinisch beeld, vaak > 1 jaar behandelen - clarithromycine: oraal 1000-2000 mg/dag, min. 3 mnd op geleide van klinisch beeld, vaak >1 jaar behandelen - benzathine penicilline: intra-musculair 1.2 miljoen eenheden 3 x per week, min. 3 mnd op geleide van klinisch beeld, vaak >1 jaar behandelen Combinatietherapieën bij stadia II en III en bij persisterende of terugkerende symptomen (géén officiële richtlijn) - roxithromycine: oraal 2 x 300 mg/dag met - co-trimaxazol (trimethoprim 320 mg + 1600 mgsulfamethoxazol) oraal 2x daags, gedurende > 5 weken -

azithromycine: oraal 500 mg/dag of clarithromycine oraal 1000 mg/dag met cefuroxim axetil: oraal 1000 mg/dag of metronidazol: oraal 1000 mg/dag minimaal 3 maanden op geleide van klinisch beeld, met afwisselen van antibiotica

-

azithromycine: oraal 250-600 mg/dag of clarithromyne: oraal 1000-1500 mg/dag en/of tetracycline: oraal 1500 mg/dag met hydroxychloroquine: oraal 400 mg/dag, minimaal 3 maanden, afhankelijk respons patiënt, zonodig 1-2 jaar

-

doxycycline: oraal 400-600 mg/dag met metronidazol: oraal 500-1500 mg/dag of tinidazol: oraal 500-1500 mg/dag , om de week behandelen

Behandeling co-infecties (geen vaste richtlijnen) Babesiose: - atovaquone: oraal 2x 750 mg/dag met - azithromycine: oraal 500-1200 mg/dag of - clarithromycine: oraal 250-500 mg/dag of - telithromycine: oraal 800 mg/dag gedurende 3 weken in acute gevallen, 4 maanden in chronische gevallen

Ehrlichiose/anaplasmose: - doxycycline: oraal 200 mg/dag gedurende 2-4 weken Bartonella: - levofloxacine: 500 mg/dag gedurende minimaal 1 maand en 3 maanden of langer voor ernstig zieken.

95  5.5 Samenvatting Achteréénvolgens zijn er drie richtlijnen besproken voor de behandeling van de ziekte van Lyme: de Nederlandse behandelingsrichtlijn van het CBO (2004), de Amerikaanse richtlijn van de IDSA (2006) en de Internationale richtlijn van de ILADS (2004). De richtlijnen zijn zoveel mogelijk gebaseerd op de bewijslast van de klinische studies en vooral ook op de praktijkervaringen van de artsen. CBO De Lyme-borreliose behandelingsrichtlijnen van het CBO (2004) hebben veel overéénkomst met die van de IDSA 2000 (hier niet behandeld) en 2006. Verscheidene klinische studies die de werkgroep van het CBO heeft bestudeerd ziet men ook terug bij de klinische onderbouwing voor de aanbevelingen door de IDSA werkgroep. Bij het CBO ontbreekt de richtlijn voor de behandeling van co-infecties. De verwachting is dat deze richtlijn deel uit zal maken van de nieuwe behandelingsrichtlijnen van het CBO. Het CBO beveelt minimaal-durende antibioticumbehandelingen aan; dit in verband met het Nederlandse restictieve antibioticabeleid ter voorkoming van resistentie-ontwikkeling van bacteriën. Volgens betrokkenen van het CBO zullen de aanvullingen / aanpassingen van de richtlijn uit 2004 zich vooral richten op de relatie tussen de ziekte van Lyme en chronische aspecifieke klachten ( zogenaamde post-infectieuze klachten) en hoe deze te behandelen. Verder zal aan de orde komen hoe de arts moet handelen na een tekenbeet. Ook zal de voorspellende waarde van de diagnostische testen opnieuw worden beken. Bij de herziening zal rekening worden gehouden met de gegevens waarop de recent gepubliceerde IDSA-richtlijn (2006) en de te verwachte nieuwe ILADS-richtlijn hun conclusies en aanbevelingen baseren (Stiphout van en Siemons (CBO), 2010). IDSA De Lyme-borreliose richtlijn van de IDSA (2006) heeft in tegenstelling tot de CBO-richtlijn (2004) een aanvulling gekregen met de behandeling van de co-infecties: ehrlichiose / anaplasmose en babesiose. Verder worden er net als bij het CBO geen langdurige behandelingen aanbevolen evenals hogere doseringen van antibiotica. Post-infectieuze klachten worden net als bij het CBO niet meer behandeld met antibiotica maar met een symptomatische behandeling. Bij de IDSA (2006) worden combinatietherapieën niet aanbevolen, evenals chemotherapeutica tegen de cysten van B. burgdorferi s.l. zoals metronidazol en tinidazol. De werkgroep van de IDSA kent geen klinische betekenis toe aan de cysten, hoewel zij op de hoogte zijn van de studie van Alban (2000) waarin de levensvatbaarheid van de cysten is aangetoond. De richtlijnen van de IDSA-werkgroep uit 2006 hebben bij de Lyme-borreliose patiënten en de ILADS-werkgroep geleid tot protesten. Men is van mening dat de (chronische) patiënten met het post-Lyme ziekte syndroom niet de noodzakelijke behandelingen krijgen. In april 2008 heeft de IDSA besloten om een nieuw panel samen te stellen dat opnieuw de richtlijnen zou bekijken. In 2010 is bekend geworden dat de richtlijnen van de IDSA niet gewijzigd zullen worden. Het nieuwe panel achtte het bewijs voor de conclusies en aanbevelingen uit 2006 van de IDSA-werkgroep gerechtvaardigd (Lantos et al., 2010). ILADS Bij de ILADS staat de patiënt centraal en wordt de behandelingsduur niet arbitrair vastgesteld, maar is afhankelijk van de respons van de patiënt. Er wordt behandeld met antibiotica totdat de symptomen verdwenen zijn. De ILADS richt zich vooral op de behandeling van de chronische Lyme-borreliose patiënt met antibiotica. De ILADS hanteert niet de term postinfectieuze Lyme-borreliose, maar de term chronische Lyme-borreliose. Men gaat er vanuit dat de infectie nog altijd aanwezig is, ondanks het feit dat antilichamen, vermeerdering van cellen en verhoging van het eiwitgehalte in de liquor cerebrospinalis afwezig zijn. In vergelijking met het CBO en de IDSA worden bij de ILADS hogere doseringen en langere behandelingen met antibiotica aangehouden. Verder zou men volgens de ILADS de drie verschijningsvormen van de spirocheet B. burgdorferi moeten bestrijden door het toepassen van combinaties van verschillende antibiotica en /of chemotherapeutica die werkzaam zijn tegen de normale mobiele spirocheet, de celwanddeficiënte bacterie en de cyste. Noch het CBO, noch de IDSA houden rekening met het gedrag van de spirocheet B. burgdorferi s.l. onder invloed van antibacteriële stressfactoren, namelijk de vorming van celwanddeficiënte bacteriën of cysten, waarmee de bacterie kan overleven in afwachting van gunstiger omstandigheden. Ook het voorkomen van B. burgdorferi in zowel vloeibare - als weefselcompartimenten en een mogelijk intracellulair verblijf, zouden redenen zijn voor het toepassen van combinatietherapieën. Hoewel er nog geen officiële richtlijnen zijn over het gebruik van combinatietherapieën bij de ziekte van Lyme, wordt dit meer en meer in de praktijk van de behandelende ILADS-arts toegepast. In de ILADS richtlijn (2004) wordt er op gewezen rekening te houden met mogelijke co-infecties zoals babesiosis, ehrlichiose / anaplasmose en bartonella. In verband met het gebrek aan studies heeft de ILADS werkgroep voor co-infecties in 2004 nog geen vaste richtlijnen vastgelegd voor de dosis, de duur en het type behandeling.

96 Het wachten is op de nieuwe Lyme-borreliose behandelingsrichtlijn van de ILADS met de daarbij behorende nieuwe studies. De CBO-werkgroep wacht eveneens de nieuwe richtlijnen van de ILADS af. In dit hoofdstuk is de onderzoeksvraag: “Hoe zijn de huidige nationale - en internationale richtlijnen bij de behandeling van Lyme-borreliose” uitgebreid aan de orde gekomen.

-----------------

97 HOOFDSTUK VI SYFILIS 

6.1 INTRODUCTIE

In dit hoofdstuk zal aandacht worden besteed aan de spirochetenfamilie van de Trepanometaceae en in het bijzonder aan de spirocheet Treponema pallidum die de verwekker is van de geslachtsziekte syfilis of lues venerea. Alvorens de aandacht op deze laatste te vestigen, zullen eerst enkele andere pathogene spirocheten voor het voetlicht verschijnen; dit in verband met de hierna genoemde onderzoeksvraag. “Zijn er nog andere pathogene spirocheten dan Borrelia burgdorferi sensu lato die cystevorming vertonen onder invloed van stressfactoren; wat zijn de mogelijke gevolgen hiervan voor de antibacteriële behandeling en wat zou men hieruit kunnen leren voor de behandeling van de ziekte van Lyme?” 

6.2 SPIROCHETEN VAN DE ORDE DER SPIROCHAETALES

Tot de orde der Spirochaetales behoort de bovengenoemde familie van de Treponemataceae, die bestaat uit drie pathogene genera namelijk: Borrelia, Leptospira en Treponema. Hiertoe behoren onder andere de bekende pathogene soorten Borrelia burgdorferi s.l. de veroorzaker van Lyme-borreliose, Leptospira icterohaemorrhagiae, de veroorzaker van leptospirose of de ziekte van Weil en Treponema pallidum, de verwekker van syfilis. Genoemde soorten behoren dus tot één en dezelfde familie en hebben dien ten gevolge veel eigenschappen gemeen, waaronder de karakterestieke spiraal vorm van de bacterie en de pathogeniteit (Canale-Parola, 1977; Holt, 1978; Barbour en Hayes, 1986). Een andere spirocheet dan B. burgdorferi s.l. die tot het genus Borrelia behoort, is de spirocheet B. recurrentis, de veroorzaker van de Europese febris recurrens, relapsing fever, of ziekte van Obermeyer. Dit is een ratteziekte die door luizen of teken wordt overgebracht. In andere delen van de wereld wordt deze ziekte veroorzaakt door andere Borrelia’s zoals B. duttoni, B. novyi, B. parkeri (Holt, 1978; Barbour en Hayes, 1986). De behandeling van relapsing fever bestaat uit tetracycline (Elliott et al., 2007). De spirocheet Borrelia vincentii wordt in de mond en keel gevonden bij angina van Plaut-Vincent. De spirocheet leeft in symbiose met de bacterie Fusobacterium fusiforme, een gramnegatief staafje. De behandeling bestaat uit penicilline of metronidazol (Elliott et al., 2007) De spirocheten van het genus Leptospira komen wereldwijd in vele soorten voor en zijn verwekkers van de infectieziekte leptospirose. Hierbij dienen dieren als reservoir voor leptospirose-infecties bij de mens (Canale-Parola, 1977; Holt, 1978). Honden zijn een reservoir voor Leptospira canicola; de mens wordt besmet door de urine van besmette honden. Koeien zijn een reservoir voor L. hardjo, varkens zijn een reservoir voor L. pormona en ratten voor L. icterohemorrhagiae, de verwekker van de ziekte van Weil. Hierbij wordt de mens geïnfecteerd door middel van water dat is verontreinigd met de urine van besmette ratten. De leptospiren kunnen door de intakte huid heen dringen of via kleine wondjes. Boeren en watersporters vormen een risicogroep om leptospirose op te lopen. Voor de mens bestaat er geen vaccin. Dieren kunnen via actieve immunisatie beschermd worden tegen de ziekte. De behandeling van leptospirose bestaat uit een antibioticumtherapie met benzylpenicilline, tetracycline of doxycycline (Elliott et al., 2007). Een bekende spirocheet van het geslacht Treponema is Treponema pallidum, de verwekker van de geslachtsziekte syfilis. Dit hoofdstuk zal verder gewijd zijn aan deze spiraalvormige bacterie en aan het verloop, de epidemiologie en de behandeling van de infectieziekte syfilis. Er zal worden gekeken naar anatomische - en pathologische overeenkomsten met de spirocheet B. burgdorferi s.l.. 

6.3 ANATOMIE TREPONEMA PALLIDUM

Treponema pallidum, de verwekker van de geslachtsziekte syfilis en Borrelia burgdorferi sensu lato, de verwekker van de ziekte van Lyme, behoren beide tot dezelfde familie van de Trepanometaceae. Het zijn beide pathogene Gram-negatieve bacteriën met de typische bouw van spirocheten, namelijk spiraalvormig (Holt, 1978; Barbour en Hayes, 1986). Bij de spirocheet T. pallidum is het cytoplasma net als bij B. burgdorferi s.l. omgeven door een cytoplasma- membraan die uit drie lagen bestaat en dit membraan wordt weer omgeven door een peptidoglycanlaag die stevigheid geeft aan de bacteriecel (Holt,1978; Barbour en Hayes 1986). Tussen de peptidoglycanlaag en de buitenste wand of outer-membraan, die bestaat uit lipopolysachariden (LPS), bevinden zich de endoflagellen (periplasmaflagellen). Met behulp van de endoflagellen kan de spirocheet zich als een slang voortbewegen (Holt,1978; Barbour en Hayes, 1986). Er bestaan controverses over het al of niet aanwezig zijn van oppervlakte antigenen bij T. pallidum zoals het geval is bij B. burgdorferi s.l. (Miklossy, 2008).

98 T. pallidum is 6-20 μm lang en 0.1-0.2 μm breed en heeft 6-14 windingen. Deze anaerobe spirocheet wordt overgebracht via sexueel contact. Men is er nog niet in geslaagd om T. pallidum in een volkomen synthetisch medium in vitro te kweken, maar altijd in aanwezigheid van dierlijke cellen. De delingstijd in vivo is 30-33 uur (Miklossy, 2008). B. burgdorferi s.l. is een grotere spirocheet, 10-30 μm lang en 0.1-0.3 μm breed met 5-10 lossere windingen en wordt overgebracht via de beet van een besmette Ixodes teek. Zoals in hoofdstuk III is beschreven kan B. burgdorferi s.l. gekweekt worden in een synthetisch BSK II medium bij 30-34 ºC in een micro-aeroob milieu waarbij iedere 8-12 uur deling plaatsvindt (Miklossy, 2008). Zowel Treponema als Borrelia halen hun benodigde koolstof uit suikers en /of aminozuren. Beide spirocheten zijn neurotroop; zij richten zich bij voorkeur op het zenuwweefsel (Miklossy, 2008). 

6.4 CYSTEUZE VORMEN VAN TREPONEMA PALLIDUM

Evenals bij B. burgdorferi s.l .vertoont de spirocheet T. pallidum cystevorming onder ongunstige omstandigheden. Een in vitro onderzoek van Ovcinnikov en Delektorskij (1971) met T. pallidum onder stresscondities, toonde celwanddeficiënte bacteriën, de sferoplast-, L-vormen, aan. De stressfactoren waren penicilline en antisera. Ook reconversie van celwanddeficiënte bacteriën naar normale spirocheten is in vitro waargenomen, nadat in de cultuurmedia met T. pallidum de stressfactoren afwezig waren (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971; Miklossy et al., 2008). Eveneens zijn door dezelfde onderzoekers in vitro onder stresscondities cysten waargenomen van T. pallidum. Cystevorming wordt door de onderzoekers beschouwd als een overlevingsmechanisme van de spirocheet (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971; Miklossy et al., 2008). In vitro onderzoek heeft laten zien dat T. pallidum kan binnendringen in parenchym- en mesenchymcellen, met inbegrip van plasmacellen, macrofagen, neuronen en gliacellen. Cysteuze vormen van T. pallidum kunnen zowel intra- als extracellulair voorkomen (MacDonald, 1988; Miklossy et al., 2008). In vivo onderzoek van besmet weefsel van syfilispatiënten toonde zowel intra- als extracellulaire spirocheten van T. pallidum aan. Macrofagen, plasmacellen, endotheelcellen, monocyten en polymorfonucleaire leucocyten trachtten T. pallidum via fagocytose uit te schakelen. Gewoonlijk wordt de fagocytose niet volbracht en overheerst de endocytobiosis (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971). In vivo zijn bij neurosifilispatiënten in de hersenen zowel normale spirocheten als cysten waargenomen. Cysteuze vormen van Treponema pallidum waren intracellulair te vinden in de hersencellen (Miklossy et al., 2008). De lange latentietijd die men kan waarnemen bij de infectieziekte syfilis, gevolgd door een chronische infectie en ontsteking van het centrale zenuwstelsel, wordt veroorzaakt door aanhoudende atypische cysten- en granulenvormen van de spirocheet Treponema pallidum (Miklossy et al., 2008). De invasie van het centrale zenuwstelsel door spirocheten en de persistentie van de spirocheet Treponema pallidum na antibioticumtherapie met penicilline-G komt voor bij neurosyfilis. Ook bij spirocheten van B. burgdorferi s.l. komt invasie van het centrale zenuwstelsel voor en de persisentie van de bacteriën na antibioticumtherapieën waaronder penicilline-G (Preac-Mursic et al., 1989; Miklossy et al., 2008; Miklossy, 2008).  6.5 STADIA SYFILIS Bij de infectieziekte syfilis onderscheidt men twee vormen, namelijk de congenitale - of aangeboren vorm en de verkregen vorm. De verkregen vorm van syfilis gebeurt bij volwassenen via seksuele overdracht, door genitaal -, anaal -, of oraal contakt, waarbij direct contact met de besmette laesies noodzakelijk is. Bij de verkregen vorm verloopt de infectieziekte syfilis evenals de ziekte van Lyme in stadia. Bij de verkregen syfilis of lues venerea, die is overgebracht via seksueel contact, kan men de volgende stadia onderscheiden:  6.5.1 Primair stadium Het primaire stadium bij geslachtsziektesyfilis begint met een infectie in de huid, meestal van de geslachtsdelen, maar ook het rectum en/of de mond kunnen besmet raken. Na een incubatieperiode van ongeveer 2-4 weken ontstaat bij syfilis op de besmette plaats een primaire lesie, een “primair affect”. Dit is een zweer met harde omgeving (ulcus durum of harde sjanker) dat zich uitbreidt en een ontstekingsinfiltraat vormt bestaande uit lymfocyten, plasmacellen en histiocyten. De primaire lesie met lymfeklierzwelling in de lies houdt ongeveer 2-6 weken aan, waarna een spontane genezing volgt (Singh en Romanowski, 1999; Miklossy, 2008). De spontane genezing komt door een celgemedieerde immuunrespons waarbij de spirocheten gefagocyteerd en gedood worden door de macrofagen. Ook interferon, lymfokines en interleukine zijn hierbij betrokken. De meerderheid van de spirocheten wordt gedood, een klein deel weet zich te handhaven door veranderingen aan het celoppervlak en ontsnapt zo aan immuunrespons van de gastheer. Mogelijkerwijs speelt cystevorming door de spirocheten onder immuunstress hier een rol (Singh en Romanowski, 1999; Miklossy, 2008).

99 Primaire syfilis is te vergelijken met het eerste stadium van Lyme-borreliosis die eveneens begint met een infectie in de huid, die veroorzaakt is door een besmette tekenbeet. Een erythema migrans kan binnen 3-30 dagen na de besmetting zichtbaar worden (Miklossy, 2008).  6.5.2 Secundair stadium Ongeveer 6-8 weken na de besmetting vangt het tweede of secundaire stadium van syfilis. De spirocheet T. pallidum heeft zich in dit stadium verder verspreid via de bloedbaan en/of lymfe naar verschillende weefsels en organen. Het meest opvallend van de secundaire syfilis is een knobbelachtige niet jeukende rood tot roodbruine huiduitslag op de romp en extremiteiten, met inbegrip van handpalmen en voetzolen. Soms zijn er ook parelgrijze hyperkeratotische laesies te zien aan de anus of genitaliën: de condylomata lata. Deze laesies bevatten zeer veel spirocheten en zijn zeer besmettelijk. Ook kunnen laesies voorkomen in de slijmvliezen en op de hoofdhuid. De secundaire syfilis gaat vaak gepaard met griepachtige verschijnselen zoals malaise, koorts, spier- en gewrichtspijnen en lymfadenopathie. Verder kunnen syfilis van de lever, nieren, ogen, maag en van het evenwichtsorgaan voorkomen (Singh en Romanowski, 1999). Indien de spirocheet T. pallidum via de bloedvaten en/of de lymfebanen het centrale zenuwstelsel heeft bereikt dan worden de meninges en de leptomeningeale bloedvaten aangetast. Dit laatste betreft de bloedvaten van het zachte hersenvlies (Miklossy, 2008). Acute meningitis gebeurt bij 10% van de patiënten en bij 30% van de patiënten vindt men pleiocytose en een verhoogd proteïnegehalte in de liquor cerebrospinalis. De meningeale syfilis, kan 2-6 weken aanhouden (Miklossy, 2008). Secundaire syfilis, is te vergelijken met het tweede stadium van de ziekte van Lyme waarbij eveneens verspreiding van de infectie in het lichaam heeft plaatsgevonden en waarbij eveneens allerlei organen aangetast kunnen worden, zoals beschreven is in hoofdstuk II. Ook Lyme-neuroborreliosis komt meestal weken tot maanden na de tekenbeet tot uiting in de vorm van meningo-radiculoneuritis en gaat gepaard met ontstekingen van het centrale zenuwstelsel (Miklossy, 2008).  6.5.3 Vroeg latent stadium Na het tweede stadium treedt een periode van rust in, een latent stadium. De latente syfilis is de latentieperiode tussen secundaire en tertiaire syfilis en gaat gepaard zonder klinische symptomen en kan enkele jaren duren. Bij de vroeg latente syfilis heeft de besmetting korter dan 1 jaar geleden plaatsgevonden (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009).  6.5.4 Laat latent stadium en syfilis van onbekende duur Het laat latente stadium van syfilis is de periode van rust na het tweede stadium. In deze latentieperiode heeft de besmetting langer dan 1 jaar geleden plaatsgevonden. Indien de duur van de infectieziekte onbekend is beschouwd men dit als laat latente syfilis (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009).  6.5.5 Tertiair stadium Tot het tertiaire stadium rekent men de tertiaire orgaansyfilis, de cardiovasculaire syfilis en de neurosyfilis.  6.5.5.1 Tertiaire orgaansyfilis Twee tot vier jaar na de besmetting kan de “vroege” tertiaire orgaansyfilis ontstaan met tuberculoïde nodeuze of ulcerende afwijkingen in de huid, botten, slijmvliezen en inwendige organen. Deze afwijkingen worden gummata genoemd; dit zijn chronische proliferatieve ontstekingsprocessen die lijken op granulomen (granulatiegezwellen), dus met korrelig weefsel (Singh en Romanowski, 1999).  6.5.5.2 Cardiovasculaire syfilis Een late vorm van tertiaire syfilis is de cardiovasculaire syfilis, die 20 tot 30 jaar na de besmetting kan ontstaan. Kenmerkend is een aneurysma (verwijding) van het opstijgende deel van de aorta. De oorzaken zijn destructie van de aortaklep en een ontsteking aan de binnenwand van de voedende bloedvaten, dat leidt tot obstructie. Ook de arteriën van het centrale zenuwstelsel kunnen in de late vorm van teriaire syfilis worden aangetast: de late neurosyfilis (Singh en Romanowski, 1999).  6.5.5.3 Late neurosyfilis Het late stadium van neurosyfilis kan voorkomen in twee vormen: de meningovasculaire syfilis en de parenchymateuse neurosyfilis. Vaak ziet men een mengsel van beide vormen (Miklossy, 2008). De meningovasculaire neurosyfilis heeft betrekking op de meningen en de leptomeningale bloedvaten. Deze vorm van neurosyfilis gaat vaak gepaard met een herseninfarct en een geleidelijk progressief vasculair syndroom dat resulteert in multiple herseninfarcten. De meningovasculaire syfilis kan na enkele maanden tot 12 jaar manifest worden, gemiddeld na 7 jaar, na het begin van de infectie (Miklossy, 2008).

100 De parenchymateuse neurosyfilis wordt gekenmerkt door wijdverspreide beschadigingen aan het hersenparenchym, veroorzaakt door de direkte invasie van hersenweefsel door de spirocheet T. pallidum. Deze vorm van syfilis gaat gepaard met verlammingen en neuropsychiatrische symptomen zoals progressieve dementie. Is het ruggemerg aangetast dan spreekt men van tabes dorsalis (ruggemergstering) (Miklossy, 2008). Na het begin van de infectie wordt de neurosyfilis met verlammingen meestal na 20 jaar manifest en voor tabes dorsalis is dit na 25-30 jaar (Miklossy, 2008). Opmerking: de late Lyme-neuroborreliose komt eveneens voor in twee vormen, namelijk de meningovasculaire - en de parenchymateuse neurosyfilis (Miklossy, 2008).  6.5.6 Congenitale syfilis Bij de aangeboren vorm, de congenitale syfilis of heredosyfilis, wordt het kind dood geboren of komt met handicaps ter wereld. De syfilisbesmetting heeft plaatsgevonden tijdens de zwangerschap waarbij de foetus besmet is geraakt via de geïnfecteerde moeder door de placenta heen of de besmetting komt voort uit een besmette zaad- of eicel (Singh en Romanowki, 1999). 

6.6 EPIDEMIOLOGIE VAN SYFILIS

Syfilis behoort tot de sexueel overdraagbare aandoeningen (SOA’s) samen met: Chlamidia trachomatis-infectie, gonorroe, humaan papillomavirusinfectie, hepatitis-B-virusinfectie, human immunodeficiëntie virus (HIV) / acquired immune deficiency syndrome (AIDS), herpes genitalis, herpes neonatorum, cytomegalovirus-infectie, scabies en vaginale trichomonas-infectie (Bleker et al., 2002). Syfilis komt nog steeds wereldwijd voor. Volgens de WHO kwamen er in 1995 12 miljoen nieuwe gevallen bij, waarvan het merendeel in Zuid- en ZuidOost-Azië met 5.8 miljoen nieuwe syfilisgevallen. In sub-Sahara Afrika werd het aantal nieuwe syfilis gevallen in 1995 geschat op 3.5 miljoen, waarbij het aantal per 100.000 gevallen (incidentie) tussen 4 en 15% op rekening komt van zwangere vrouwen (Singh en Romanowski, 1999). In de Russische Federatie was de incidentie van het aantal syfilisgevallen 4.2/100.000 in 1988 en in 1996 steeg de incidentie naar 263/100.000; een 62-voudige toename sinds 1988 (Singh en Romanowski, 1999). In de Verenigde Staten en West-Europa werd er na de tweede wereldoorlog een geleidelijke daling waargenomen van het aantal syfilisgevallen. Dit kwam vooral door de behandeling van syfilis met penicilline en een gedragsverandering in verband met HIVbesmettingen (Williams et al., 1999; Singh en Romanowski, 1999). Van 1944 tot 1954 daalde in de Verenigde Staten het aantal gemelde syfilisgevallen van alle stadia met meer dan 75%, namelijk van 368/100.000 tot 83/100.000. De daling van primaire - en secundaire syfilisgevallen was nog opvallender, namelijk van 62/100.000 naar 4.5/100.000. In 1975 was het totale aantal syfilisgevallen in vergelijking met 1944 met bijna 90% gedaald, namelijk van 368/100.000 tot 37/100.000. Bij de congenitale syfilisgevallen was de daling nog spectaculairder, namelijk van 521/100.000 in 1944 naar 29/100.000 in 1975 (Douglas, 2009). Ook het aantal sterftegevallen door syfilis daalde met meer dan 98%, van ongeveer 14/100.000 in 1940 tot minder dan 0.2/ 100.000 in 1975. Deze daling van het aantal sterftegevallen liep paralel met de komst van de penicilline (Douglas, 2009). Na deze dalingen echter, was er in de jaren 1997-1998 in de Verenigde Staten een stijging te constateren van primaire - en secundaire syfilisgevallen (Williams et al., 1999; Golden et al., 2003). Deze stijging zette zich verder voort in het begin van de 21e eeuw in de grote steden van de Verenigde Staten, West-Europa en Australië (Klausner, 2009). De stijging van syfilisgevallen gedurende de laatste 10 jaar wordt vooral veroorzaakt door de risicogroepen van homosexuelen, prostituéés en HIVgeïnfecteerden. Het betreft vooral de homosexuelen en andere mannen die sex hebben met mannen (MSM). Het zijn hoofdzakelijk de HIV-geïnfecteerde MSM die hun veilige sexuele gedrag ter zijde hebben geschoven sinds er betere behandelmethoden zijn voor HIV/AIDS (Klausner, 2009; Douglas 2009). Het percentage HIV-geïnfecteerde onder syfilisgevallen bedraagt tussen de 50% en 75%; dit is twee tot drie maal hoger dan het voorkomen van HIV-geïnfecteerden onder de MSM-populatie.. De HIV-geïnfecteerde MSM worden beschouwd als de groep bij uitstek die bijdraagt aan de verspreiding van syfilis (Blocker, 2000; Klausner, 2009). In West-Europa is er vooral een daling te constateren van acute bacteriële sexueeloverdraagbare infectieziekten vanaf 1991 tot 1995. In de meeste West-Europese landen daalt het aantal gonoroegevallen met 40-70% en het aantal syfilisgevallen met 10-60% (tabel 6.1). Deze dalingen vallen samen met de wereldwijde HIV/AIDS epidemie, die leidde tot fundamentele sexuele gedragsveranderingen, mede dankzij de HIV campagnes in die tijd (Fenton en Lowndes, 2004).

101

Tabel 6.1. Recente trends van gonrrorhoea en syfilis in de Europese landen (Fenton et al., 2004). Sinds 1995 echter is er in de meeste West-Europese landen weer een stijging te constateren van acute seksueeloverdraagbare infectieziekten. In Groot-Brittannië, Ierland en Zweden zijn het aantal gonorroegevallen meer dan verdubbeld sinds 1995. Een zelfde toename van syfilisgevallen is waargenomen in België, Groot-Brittannië en Ierland (tabel X).Hoewel in mindere mate, is ook een stijgend aantal gevallen van zowel gonorroe als syfilis geconstateerd in Spanje, Denemarken, Oostenrijk, Frankrijk, Finland, Nederland en Zweden. In al deze gevallen gaat het voornamelijk om jonge mensen, homoseksuele mannen en bewoners van grote steden. Ook hebben commerciële sexnetwerken een rol in de toename van de geslachtsziekten, evenals illegaal drugsgebruik en het toenemende wereldwijde reisgedrag (Fenton en Lowndes, 2004). Men veronderstelt dat een toename van onveilig seksueelgedrag wordt veroorzaakt door betere hiv-behandelingen (Singh et al., 1999; Williams et al., 1999). In Engeland en Wales werden in 1995 in totaal slechts 132 gevallen van syfilis gediagnostiseerd bij vrouwen, heterosexuele - en homosexuele mannen. In 2000 was dit aantal gestegen tot 326 syfilisgevallen, waarvan een groot deel werd veroorzaakt door homosexuele mannen (figuur 6.1) (Nicoll en Hamers, 2002).

Figuur 6.1.Trends van primaire - en secundaire syfilisgevallen waargenomen in klinieken voor sexueel overdraagbare aandoeningen. Syfilis ontstaan door sex van heterosexuelen en door homosexuele mannen in Engeland en Wales, 19952000 (Nicoll en Hamers, 2002). In Nederland was er ook een daling van het aantal syfilisgevallen tot het midden van de jaren negentig. Een uitzondering vormde een syfilisepidemie in Rotterdam onder straatprostituees in de jaren 1995-1996 (van de Laar et al., 2002). In de jaren 1997-1999 is het aantal syfilisgevallen in Nederland weer gestabiliseerd. Vanaf 1999 is er een flinke stijging van syfilis waargenomen in de Amsterdamse SOA-kliniek en vanaf 2001 eveneens in heel Nederland (figuur 6.2) (van de Laar et al., 2002). De stijging in Nederland van het aantal syfilisgeïnfecteerden in 1999 en 2000 wordt vooral veroorzaakt door de homo- en biseksuele mannen; een zelfde trend werd waargenomen in Amsterdam in 1999 en 2000. Uit figuur 6.2 blijkt dat het totale aantal soa’s een sterke stijging laat zien in het jaar 2001 (van de Laar et al., 2002).

102

Figuur 6.2 Trend in het aantal soa-gevallen, als percentage van het aantal gevallen in 1991 (geïndexeerd op 100%; n=aantal in 1991, soa registratie 1991-2001, alleen voor gonorroe, chlamydia en syfilis zijn de gegevens van de GG&GD Amsterdam in de figuur opgenomen) (van de Laar et al., 2002). Om een vergelijking te maken tussen de cijfers van 2001 en 2000 zijn de aantallen van primaire syfilis, secundaire syfilis, syfilis latens recens en ongespecificeerde syfilis samen genomen. Het betreft hier de cijfers voor heel Nederland. Telt men de vier vormen van syfilis bij elkaar op, dan blijkt dat de diagnose syfilis 139 maal gesteld werd in het jaar 2001. Dit is 22% meer dan in het jaar 2000 met 114 syfilisgevallen. Bij vrouwen is het aantal syfilisgevallen ten opzichte van het jaar 2000 met 15% gestegen in 2001 en bij mannen is deze stijging 30%. Splitst men deze 30% verder uit, dan blijkt dat het aantal syfilisgevallen bij heteroseksuele mannen met 14% is gedaald en dat er een stijging is van 130% die wordt veroorzaakt door homo- en biseksuele mannen (tabel 6.2) (van de Laar et al., 2002).

Tabel 6.2. Aantal diagnoses in Nederland van primaire en secundaire syfilis in 2001; primaire syfilis, secundaire syfilis, syfilis latens recens en ongespecialiseerde syfilis in 2000 en 2001 (van de Laar et al., 2002). In Rotterdam werden in 2000 16 gevallen van primaire -, secundaire - en vroeg latente syfilis gediagnostiseerd. In 2001 betrof het 24 syfilisgevallen en in 2002 was dit aantal gestegen tot 56. Een stijging van 350% (Fenton et al., 2004). In 2004 werd een daling waargenomen van het aantal positieve syfilisgevallen in Nederland. In 2008 werden 599 nieuwe syfilisgevallen geregistreerd, waarvan 90% homosexuele mannen (RIVM, 2009). Wat betreft de congenitale syfilis in Nederland is het aantal gevallen gedurende de afgelopen 12 jaar, 0-4 per jaar. Vanaf 1998 bestaat er geen meldingsplicht meer voor congenitale syfilis (RIVM, 2009). 

6.7 DIAGNOSE SYFILIS

De diagnose van primaire syfilis kan gesteld worden met behulp van donkerveldmicroscopie door in afgenomen geïnfecteerd weefsel eventueel aanwezige spirocheten aan te tonen. Met een directe fluorescentietest kunnen eventueel aanwezige antigenen van de bacterie T. pallidum uit specimen direct zichtbaar gemaakt worden met fluorescerende antilichamen en worden bekeken met fluorescentiemicroscopie. De bevestiging van een syfilisinfectie vindt plaats door het uitvoeren van de T. pallidum polymyrase chain reaction (PCR). Verder kan bevestiging van syfilis plaatsvinden via serologie. Men dient er rekening mee te houden dat in het begin van de

103 infectie de antilichamen nog afwezig zijn. De klinische diagnose is dan het belangrijkst, aangevuld met donkerveldmicroscopie (Singh en Romanowsky, 1999). De primaire screeningstest is de Treponema Pallidum Haemagglutination Assay (TPHA) met als confirmatietest de Fluorescent Treponemal Antibody absorption test (FTA-Abs-test), een fluorescerende antilichaamtest. De TPHA-test wordt drie tot twaalf weken na de besmetting positief en de FTA-Abs-test vanaf de tweede tot de derde week na de besmetting (Singh en Romanowsky, 1999). Verder kan een Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)-test uitgevoerd worden. De V.D.R.L.-reactie is een vlokkingsreactie en is genoemd naar het Venereal Diseases Research Laboratory in de Verenigde Staten. Bij de vlokkingsreactie wordt serum van de patiënt gevoegd bij een antigeenemulsie van T. pallidum. Bij een positieve test vindt uitvlokking plaats. De VDRL-test wordt gebruikt om de activiteit van de infectie te meten en wordt vier tot vijf weken na de besmetting positief. Na behandeling van een recentelijk verkregen syfilisinfectie kan de VDRL-test binnen één tot twee jaar negatief worden. Bij een langer bestaande infectie wordt de VDRL-test na behandeling soms niet meer negatief en behoudt het bloedserum vele jaren een geringe activiteit. Indien syfilis niet behandeld is, daalt de VDRL ook of wordt negatief (Singh en Romanowsky, 1999). De diagnose van andere vormen van syfilis kan plaatsvinden door het bepalen van antistoffen tegen T. pallidum met TPHA/TPPA testen, Elisa en bevestiging met FTA-abs/immunoblot-testen. (Zie voor Elisa en immunoblot hoofdstuk II). Bij de diagnose van neurosyfilis dient liquoronderzoek plaats te vinden met bepaling van albuminen, aantal leucocyten en IgG-antilichamen tegen T. pallidum. Bij syfilis in de zwangerschap kunnen TPHA/TPPA, FTA-abs en Elisa uigevoerd worden. Eventueel aangevuld met foetale IgM en echo op foetale afwijkingen (Singh en Romanowsky, 1999). 

6.8 BEHANDELING EN FOLLOW-UP SYFILIS

 Behandeling vroege syfilis (stadium 1,2 en vroeg latente syfilis) en follow-up Vroeger, toen er nog geen antibiotica waren, werd syfilis behandeld met het arseenpreparaat salvarsan en de zware metalen bismuth en kwik. Later met de ontdekking van antibiotica bestond de behandeling uit penicilline-G. De huidige behandeling bestaat nog steeds uit hoge doses penicilline (Singh en Romanowski). De behandelingsregimen volgens het Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg CBO, het Landelijk Coördinatiecentrum Infectieziektebestrijding (LCI) en het Rijks Instituut voor Volksgezondheid Milieuhygiëne (RIVM): De behandeling in Nederland van de vroege syfilis (stadium 1,2 en vroeg latente syfilis) bestaat uit 2.4 miljoen internationale eenheden (IE) intra-musculair (I.M.) benzathine benzylpenicilline op dag 1. Voor zwangere vrouwen: idem op dag 1,8 en 15. Als alternatieve behandeling wordt 2x daags doxycycline à 100 mg gedurende 14 dagen toegepast. Uitzonderingen zijn hivpositieve - en bij neurosyfilispatiënten wegens het veelvuldig mislukken van de therapie, verder zwangere vrouwen wegens onvoldoende concentratie in de placenta (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009) Volgens het CBO is er onvoldoende wetenschappelijk bewijs om een advies te geven over de optimale dosering en duur van de behandeling met benzathine benzylpenicilline bij de vroege syfilis. Verder is het niet aangetoond dat de behandeling bij hiv-geïnfecteerden agressiever moet zijn dan bij niet-hiv-geinfecteerden (Rolfs et al., 1997). Follow-up Syfilispatiënten en HIV-positieven worden het 1e jaar 3 maandelijks gecontroleerd en het 2e jaar 6 maandelijks door middel van VDRL-reactie. Hiv-positieven worden na 1 jaar gescreend op neurosifilis (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM 2009).  6.8.2 Behandeling laat latente syfilis of syfilis van onbekende duur en follow-up De behandeling van laat latente syfilis of syfilis van onbekende duur bestaat uit het toedienen van 2.4 miljoen IE i.m. benzathine benzylpenicilline op dag 1,8 en 15. Als alternatieve behandeling wordt 2x daags doxycycline à 100 mg gedurende 28 dagen toegepast, met uitzondering van hivpositieve -, neurosyfilispatiënten en zwangere vrouwen (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009). Follow-up Patiënten worden gecontroleerd op neurosyfilis door middel van neurologisch onderzoek en liquoronderzoek indien symptomen aanwezig zijn voor de aanvang van de antibioticumbehandeling. Indien er geen symptomen zijn, dan kan controle op neurosyfilis na 1 jaar plaatsvinden. Verder is VDRL-controle van toepassing: het 1e jaar 3 maandelijks en het 2e jaar 6 maandelijks (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009).  6.8.3 Behandeling tertiaire syfilis en follow-up Behandeling vindt plaats in klinische setting door dermatoloog en infectioloog. Follow-up Patiënten worden gecontroleerd op neurosyfilis en orgaansyfilis; verder jarenlang testen op VDRL (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009).

104  6.8.4 Behandeling neurosyfilis en follow-up De behandeling bestaat uit 18-24 miljoen eenheden Penicilline-G die per infuus wordt toegediend in klinische setting door dermatoloog, neuroloog en infectioloog. Follow-up Patiënten krijgen na 3 maanden liquoronderzoek en daarna iedere 6 maanden totdat de uitslagen normaal zijn. Verder is jarenlange VDRL- controle van toepassing (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009).  6.8.5 Congenitale syfilis en follow-up De behandelingbij congenitale syfilis vindt plaats door een kinderarts in klinische setting. Follow-up De patiëntjes worden 3 maandelijks gecontroleerd gedurende 2 jaar met VDRL test(CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009).

Tabel 6.3. Samenvatting behandeling en follow-up van syfilis (CBO, 2002; LCI, 2004; RIVM, 2009). 

6.9 SAMENVATTING

In dit hoofdstuk staat de spirocheet Treponema pallidum centraal. Deze verwekker van de geslachtsziekte syfilis vertoont anatomisch en pathologisch veel overeenkomsten met de spirocheet Borrelia burgdorferi s.l. zoals: - familie van de Treponemataceae - kenmerkende anatomie van spirocheten, spiraalvormige gramnegatieve bacteriën. - in vitro en in vivo intra- en extracellulaire cystevorming onder invloed van stressfactoren, zoals de antibiotica. - vorming van celwanddeficiënte bacteriën, de sferoplast-, L-vormen onder invloed van penicilline of hypertonische oplossingen in vitro. - vorming van celwanddeficiënte bacteriën, de sferoplast-, L-vormen onder invloed van penicilline in vivo. - pathogene spirocheten; infecties beginnen in de huid, waarna er verspreiding plaatsvindt in het lichaam, waarbij alle organen aangetast kunnen worden. - ziekteverloop van syfilis en Lyme-borreliose in stadia. - diagnose door het zichtbaar maken van spirocheten in besmet materiaal via donkerveldmicroscopie en directe fluorescentietest; bevestiging via PCR. - diagnose latere stadia door antilichamenbepaling. - overeenkomstig ziektebeeld late neurosyfilis en late Lyme-neuroborreliosis: meningovasculaire neurosyfilis / meningovasculaire neuroborreliosis en parenchymateuse neurosyfilis / parenchymateuse neuroborreliose, met invasie van neuronen en gliacellen met als gevolg dysfunctioneren hiervan en progressieve celdood. Klinisch beeld is progressieve dementie. - antibacteriële behandeling tegen normale spirocheten en niet tegen cysten. De WHO schat dat er wereldwijd 12 miljoen nieuwe syfilisgevallen bij komen, waarvan het merendeel voorkomt in de ontwikkelingslanden van Afrika en Azië. Ook in Oost-Europa is het aantal syfilisgevallen van 1988 tot 1997 sterk gestegen. In de Verenigde Staten en West-Europa is er vooral een stijging van syfilis sedert het begin van de 21ste eeuw.

105 Deze trend laat zich ook in Nederland zien. De stijging van het aantal syfilisgevallen wordt met name veroorzaakt door homosexuele mannen en mannen die sex hebben met mannen (MSM). Men veronderstelt dat betere behandelingsmethoden van hiv-infecties de aanleiding zijn voor toenemend onveilig sexueel gedrag. Terugkomend op de onderzoeksvraag: “Zijn er behalve Borrelia burgdorferi sensu lato nog andere spirocheten die cystevorming vertonen onder invloed van stressfactoren; wat zijn de mogelijke gevolgen hiervan voor de antibacteriële behandeling en wat zou men hieruit kunnen leren voor de behandeling van de ziekte van Lyme?”  6.9.1 pathogene spirocheten met cystevorming Met betrekking tot het eerste deel van de vraag blijkt dat er drie pathogene genera van spirocheten zijn met cystevorming onder invloed van stressfactoren: Borrelia, Leptospira en Treponema. Het genus Borrelia met B. recurrentis, B. duttoni, B. novyi en B. parkeri; allen verwekkers van de infectieziekte relapsing fever. B. vincentii die samen met de bacterie Fusobacterium fusiforme de angina van Plaut-Vincent veroorzaakt. Het genus Leptospira met L. canicola, L. hardjo L. pormona L. icterohemorrhagiae; allen verwekkers van de infectieziekte leptospirose, waarvan de laatst genoemde de veroorzaker is van de bekende ziekte van Weil. Het genus Treponema met Treponema pallidum de veroorzaker van de geslachtsziekte syfilis. Deze spirocheet is in dit hoofdstuk uitgebreid behandeld wegens de hierboven gemelde overeenkomsten met B. burgdorferi s.l..  6.9.2 Gevolgen van cystevorming voor de behandeling Met betrekking tot het tweede deel van de vraag over de gevolgen van cystevorming voor de behandeling in het algemeen, kan het volgende gezegd worden. Het is van belang in te zien dat cystevorming met inbegrip van sferoplast-, L-vorming, het klinische beeld van het ziekteverloop verandert en invloed heeft op de virulentie, pathogeniciteit en het antigene vermogen van de spirocheten. In de cystevorm veroorzaakt door antibacteriële stress, zijn deze eigenschappen (tijdelijk) niet manifest. Bovendien biedt de cystevorm bescherming tegen het afweermechanisme van de gastheer en tegen de meeste antibiotica (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971). Wat betreft de verdere gevolgen van cystevorming voor de behandeling zou dit kunnen betekenen dat na het beëindigen van de antibioticumtherapie er na onbepaalde tijd reconversie plaats kan vinden van de cystevorm naar normale spirocheten, met als gevolg dat de infectie weer manifest kan worden. Reconversie van Treponema-cysten naar spirocheten is in vitro aangetoond (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971; Miklossy et al., 2008; Miklossy, 2008). De onderzoekers Ovcinnikov en Delektorskij (1971) waren er destijds al van overtuigd dat de waargenomen reconversies in vitro ook in vivo plaats konden vinden na het beëindigen van de antibioticumbehandeling. De invasie van het centrale zenuwstelsel door spirocheten en de persistentie van de spirocheet Treponema pallidum na antibioticumtherapie met penicilline-G komt voor bij neurosyfilis. Ook bij spirocheten van B. burgdorferi s.l. komt invasie van het centrale zenuwstelsel voor en de persisentie van de bacteriën na antibioticumtherapieën waaronder penicilline-G ( Preac-Mursic et al.,1989; Miklossy et al., 2008; Miklossy, 2008).  6.9.3 Behandeling syfilis als voorbeeld voor de behandeling van Lyme-borreliose Het bovenstaande leidt tot het derde deel van de onderzoeksvraag in zake de behandeling van Lyme-borreliose, met de behandeling van syfilis als voorbeeld. De infectieziekte syfilis werd na de ontdekking van het antibioticum penicilline hiermee met succes behandeld; althans, dat dacht men. De lange latentietijden tussen de stadia zouden hierbij foutief als “genezing” geïnterpreteerd kunnen zijn geworden. Het is nu bekend dat de spirocheet T. pallidum zich in het centrale zenuwstelsel weet te te handhaven ondanks een therapie met penicilline-G (Preac-Mursic, 1989). Vanwege het aanvankelijke “succes” van de behandeling van syfilis met penicilline-G, vormde dit antibioticum waarschijnlijk de basis voor de behandeling van Lyme-borreliose (Preac-Mursic et al., 1987). Uit in vitro en in vivo onderzoek is gebleken dat B. burgdorferi s.l echter minder gevoelig was voor Penicilline-G dan men eerst veronderstelde. Gezien de hoge MIC-90 waarden (4 mcg/ml) van peniciline-G en het vaak mislukken van de antibioticumtherapie werd penicilline-G niet aanbevolen als eerste keus antibioticum bij Lyme-borreliose (Preac-Mursic et al., 1987). Het verband tussen de Borrelia infectie en de late klinische symptomen van Lyme-neuroborreliose is nog steeds onderwerp van debat met tegengestelde meningen over wel of niet behandelen. Bij persisterende klachten na een eerder behandelde Lyme-borreliose, wordt er niet meer behandeld met antibiotica tenzij er een actieve infectie kan worden aangetoond (IDSA, 2006; CBO, 2004). Verdeeldheid was er ook 100 jaar geleden, toen rees de vraag of men de chronische vorm van neurosyfilis, het tertiaire stadium met verlammingen en progressieve dementie wel moest behandelen.

106 Men is het eens geworden dat de tertiaire vorm van neurosyfilis behandeld dient te worden met antibiotica. Bij neurosyfilispatiënten met dementie leidt de antibacteriële behandeling tot aanzienlijke verbeteringen (Miklossy, 2008). Aangezien de meningovasculaire - en de parenchymateuze vorm van de late neurosyfilis en de late neuroborreliose dezelfde pathologie laten zien, kan het behandelen op zich van de late neurosyfilis als voorbeeld dienen voor het wel behandelen van de late neuroborreliose met antibiotica. De huidige behandeling bij syfilis bestaat uit hoge doses penicilline of doxycycline, gericht tegen normale spirocheten van T. pallidum. Er is geen behandeling die gericht is tegen de cysten van T. pallidum. De normale spirocheet B. burgdorferi s.l. bij Lyme-borreliose wordt eveneens behandeld met genoemde en andere antibiotica (zie hoofdstuk V behandeling). Er is de afgelopen 10 jaar veel onderzoek gedaan in vitro naar therapeutica tegen de cysten van B. burgdorferi s.l. met name door de onderzoekers Brorson en Brorson (hoofdstuk III). Er wordt inmiddels ook onderzoek gedaan in vivo door de onderzoekers van de ILADS-werkgroep naar een effectieve behandeling tegen de cysten van B. burgdorferi s.l.. Het wachten is op de resultaten en de nieuwe richtlijnen van de ILADS. Andersom zou men dus bij de behandeling van syfilis gebruik kunnen maken van de bevindingen van de (toekomstige) behandelingen bij Lyme-borreliose, dus een behandeling gericht tegen zowel de normale spirocheten als tegen de extra- en intracellulaire cysten. (zie verder discussie). -----------------------------------------------------

107 HOOFDSTUK VII DISCUSSIE Lyme-borreliose of de ziekte van Lyme wordt momenteel beschouwd als de snelst groeiende infectieziekte van de wereld en het aantal patiënten met deze door Ixodes-teken overgebrachte ziekte neemt wereldwijd dan ook steeds verder toe. De toenemende bevolkingsdruk en de toename van recreanten in de natuur spelen hierbij een rol. Wat betreft de tekenbeetconsultaties bij de huisartsen in Nederland, nam de incidentie toe van 191/100.000 in 1994, naar 446/100.000 in 2005, een verdubbeling (Den Boon et al., 2004; Hofhuis et al., 2006). In 2009 was de incidentie voor tekenbeetconsulten gestegen naar 564 per 100.000 inwoners in Nederland, een verdrievoudiging sinds 1994 (Hofhuis et al., 2011). In 1994 was de incidentie van erythema migrans 39/100.000 en in 2005 was de incidentie van erythema migrans ten opzichte van 1994 verdrievoudigd tot 103/100.000. De incidentie van het aantal erythema migrans gevallen was in 2009 134/100.000. Indien men het aantal erythema migrans gevallen en tekenbeetconsulten omrekent naar de totale Nederlandse bevolking betekent dit dat in 2009 de huisartsen ongeveer 22.000 patiënten zagen met erythema migrans en 93.000 patiënten met een tekenbeet (Hofhuis et al., 2011). In een studie van Coumou et al. (2011) wordt gesproken van een “minority of patients” ongeveer 10 tot 20%, die aspecifieke symptomen zouden houden na behandeling met antibiotica. Aspecifieke symptomen worden gerekend tot het post-Lyme disease syndroom (PLDS), waarbij men er vanuit gaat dat er geen Lyme-borreliose infectie meer aanwezig is, vandaar het woordje “post”. Inmiddels heeft de CBO-werkgroep voor de Lyme-borreliose richtlijn echter de aanbeveling gedaan om de term PLDS niet te gebruiken, aangezien er geen ondersteunend bewijs is dat de infectie werkelijk geweken is (Kullberg et al., 2011). De gegevens over de “minority of patients” zijn afkomstig van een studie van Marques (2008). Hierbij wordt uitgegaan van Lyme-borreliose patiënten waarbij de diagnose erythema migrans is gesteld en waarbij een “adequate” behandeling met antibiotica heeft plaats gevonden, zodat men ervan uit mag gaan dat de infectieis verdreven. Tot de aspecifieke symptomen behoren onder andere: moeheid, spierpijn, gewrichtspijn, hoofdpijn, stijve nek, parestesieën (onjuiste gevoelsgewaarwordingen), slapeloosheid, geirriteerdheid, depressie, geheugen- en concentratiestoornissen etc. Genoemde klachten kunnen zich persistent of intermitterend manifesteren en van milde tot matige intensiteit zijn. Het is gebleken dat deze aspecifieke symptomen zich bij 10- tot 20% van de Lyme-borreliose patiënten voordoen 12 maanden na het beëindigen van een “adequate” antibioticumbehandeling voor erythema migrans (Marques, 2008). Indien men in Nederland uitgaat van 22.000 patiënten per jaar met erythema migrans (Hofhuis et al., 2011) dan betekent dit dat 2200 (10%) tot 4400 (20%) patiënten per jaar aan het chronische Lyme-borreliose legioen worden toegevoegd. En dan te bedenken dat het erythema migrans zich slechts in 50% van de gevallen voordoet. Dit betekent dus een verdubbeling van de 10- tot 20% van het aantal mogelijke chronische Lyme-borreliose gevallen; een “minority” van 4400 tot 8800 patiënten! De bovengenoemde 10- tot 20% lijken misschien weinig, maar als deze percentages betrekking hebben op, in dit geval 22.000, dan betekent dit een groot aantal patiënten. Dat er jaarlijks enkele duizenden chronische Lyme-borreliose patiënten bij komen komt overeen met de gegevens van de Nederlandse vereniging van Lyme patiënten (NVLP). Volgens de NVLP zouden er in 2009 in Nederland ruim 70.000 personen zijn die min of meer te lijden zouden hebben van de neurologische gevolgen van een besmette tekenbeet. Het totale aantal chronische Lyme patiënten zou volgens de NVLP enige honderdduizenden groot zijn. Het exacte aantal is echter niet bekend. Wat wel bekend is, is dat het chronische Lyme-borreliose legioen met persisterende klachten alleen maar groeiende is. Deze patiënten met hun aspecifieke chronische klachten, bij wie geen aantoonbare infectie meer aanwezig is, worden niet verder behandeld met antibiotica, maar krijgen een symptomatische behandeling. Deze patiënten krijgen vaak de opmerking te horen: “het zit tussen de oren” en blijven vaak in de kou staan. Recentelijk hebben een aantal onderzoekers in Nederland zich het lot van deze chronische Lyme-borreliose patiënten aangetrokken, waardoor deze patiënten hopelijk toch verder geholpen zullen worden met een adequate behandeling (Kullberg et al., 2011). Ondanks “adequate” antibioticabehandelingen in de vroege - en vroege gedessimineerde Lyme-borreliose is de verwekker van de ziekte van Lyme, de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato, een spiraal vormige bacterie, regelmatig in staat tot overleving in de weefsels. Dit heeft tot gevolg dat veel patiënten vroeg of laat toch te maken krijgen met recidieven en/of een chronische Lyme-borreliose. Het mislukken van “adequate” antibioticumbehandelingen bij Lyme-borreliose werd voor het eerst gemeld door onderzoeker Preac-Mursic (1989) meer dan 20 jaar geleden. Bij patiënten die met antibiotica waren behandeld, werd de persistentie van de spirocheet bevestigd met positieve culturen van B. burgdorferi s.l. van huidbiopsies, synoviaalvocht, liquor en bloed. Falende antibioticumbehandelingen bij Lyme-borreliose vormde de aanzet in Europa om uitgebreid in vitro onderzoek te doen naar het gedrag van de bacterie onder invloed van diverse antibiotica. De onderzoekers Kersten et al. (1995) vroegen zich af of de antibiotica misschien zelf de oorzaak vormden tot het mislukken van een “adequate” antibioticumbehandeling bij Lyme-borreliose. Hoe “adequate” is “adequate”? De volgende vraag staat dan ook centraal in dit verslag: “Ontbreken er fundamentele schakels in de antibacteriële behandeling bij Lyme-borreliose?”

108 Om deze vraag te beantwoorden dient men eerst eens te kijken naar het gedrag van de bacterie onder verschillende omstandigheden in vitro. Als men eerst het in vitro onderzoek nader beschouwt zoals beschreven in hoofdstuk III, dan blijkt dat de spirocheet B. burgdorferi s.l. onder ongunstige omstandigheden als het ware onderduikt. Onder de invloed van diverse stressfactoren zoals ‘serum-starvation’ of voedselgebrek (Brorson en Brorson, 1997; Alban et al., 2000; Murgia et al., 2002), pH-veranderingen, zuurstof-, temperatuurvariaties, hypotone stress (Murgia en Cinco, 2004) en antibacteriële stress (Kersten et al., 1995; Preac Mursic et al; 1996; Murgia et al., 2002; Brorson en Brorson, 1999; Brorson en Brorson, 2001; Brorson en Brorson, 2002; Brorson en Brorson, 2004; Brorson en Brorson, 2005; Brorson en Brorson, 2007; Brorson et al., 2009: Yang et al., 2009), evenals veroudering (Alban 2000), kan de bacterie B. burgdorferi s.l. transformeren van een normale mobiele spirocheet in een inerte cyste (spreek uit: kieste). Een cyste is een afgegrensd ruststadium waarin de spirocheet zich verbergt en waarbij de buitenste membraan zich als een “cocon” om de spirocheet heeft gelegd. De cyste biedt zodoende bescherming tegen de meeste antibiotica en andere genoemde stressfactoren en ook tegen eventuele antilichamen van de gastheer. Men dient zich te realiseren dat de spirocheet razendsnel kan overgaan in de cystevorm zodra de stressfactor aanwezig is. Zo heeft een in vitro onderzoek van Brorson en Brorson (1998) laten zien dat na één minuut 95% van de spirocheten van B. burgdorferi s.l. was overgegaan in cysten onderinvloed van hypotone stress (aquadest) en na 4 uur werd er geen mobiele intakte spirocheet meer waargenomen. Bovengenoemde in vitro onderzoeken hebben ook laten zien dat na het verdwijnen van de stressfactor, dus als de omstandigheden weer gunstig worden voor de spirocheet B. burgdorferi s.l., deze reconversie kan vertonen van de cystevorm naar een normale spiraalvormige spirocheet. De reconversie kan afhankelijk zijn van de concentratie van een stressfactor en/of de tijdsduur van de beïnvloeding hiervan. Reconversie kan ook razendsnel gaan, zoals een onderzoek van Alban et al. (2000) heeft aangetoond bij cysten van 48 uur oud, die waren gevormd onder invloed van serum-starvation. Reconversie vond binnen 10 seconden plaats na toevoeging van konijnenserum aan het medium van de cysten. Uit de cysten kwamen onbeweeglijke maar intakte spirocheten. De spirocheten herkregen hun beweeglijkheid na 12 tot 15 uur na het uitkomen van de cysten (Alban et al., 2000). Met het in vitro onderzoek voor ogen, zou men zich een voorstelling kunnen maken van het gedrag van de spirocheet B. burgdorferi s.l. in vivo. Onder invloed van een antibioticumbehandeling wordt een deel van de spirocheten gedood en een deel kan overgaan in cysten. Dat er in vivo onder ongunstige omstandigheden inderdaad cystenvorming plaats kan vinden is aangetoond in een onderzoek van Preac-Mursic et al. (1996a). Hierbij werden bij Lyme-borreliose patiënten tijdens antibioticabehandelingen met penicilline-G en met ceftriaxon, cysten aangetoond in liquor, huidbiopsies en bloed. Bij patiënten die geen antibioticumbehandeling hadden gekregen werden intakte spirocheten geïsoleerd. Na het beëindigen van de therapie, dus als de omstandigheden weer gunstig zijn voor de spirocheet, kan reconversie naar een normale virulente spirocheet plaatsvinden, die weer aanleiding kan geven tot recidieven. Dat er inderdaad reconversie van cysten naar normale spirocheten kan plaatsvinden, is aangetoond in muizen waarbij intraperitoneaal cysten werden getransplanteerd en waarbij normale spirocheten werden teruggevonden in de harten van twee van de 15 getransplanteerde muizen (Gruntar et al., 2001). Bij een recidiverende Lyme-borreliose vindt opnieuw een antibioticumbehandeling plaats. Dit houdt in dat de cyclus opnieuw begint: cystevorming, reconversie na het beëindigen van de therapie en mogelijk weer een recidiverende Lymeborreliose etc. een “jo-jo-effect”. Men kan zich misschien voorstellen dat cystevorming onder invloed van een antibioticumbehandeling en reconversie naar normale spirocheten na het beëindigen van de kuur, van klinisch belang kunnen zijn in verband met het wel of niet slagen van de behandeling. Behalve als normale mobiele spirocheet en in de cystevorm, kan B. burgdorferi s.l. ook nog voorkomen als celwanddeficiënte bacterie. Onder invloed van celwandsynthese-remmende antibiotica, zoals de penicillinen en de cephalosporinen (bèta-lactam antibiotica) kunnen celwand-deficiënte (CWD) bacteriën of sferoplast-, L-vormen, ontstaan (Mattman, 2001). Deze spirocheten hebben geen spiraalvorm meer omdat zij een deel van hun celwand hebben verloren. In deze vorm veroorzaken ze ook geen antilichamenrespons en de ELISA en Western Blot zijn dus negatief. L-vormen kunnen verder leven zonder celwand en kolonies vormen die vaak diep verborgen zijn in de weefsels van de gastheer. Antibiotica die hun invloed uitoefenen op de celwand hebben dus geen effect op celwand-deficiënte bacteriën. Deze bacteriën zouden ook weer kunnen veranderen in intakte spirocheten en zouden zodoende een recidiverende Lyme-borreliose kunnen veroorzaken (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971; Preac-Mursic et al., 1996; Onwuamaegbu et al., 2005; Elliot et al., 2007). De bacterie kan dus voorkomen in drie verschijningsvormen: de intakte mobiele spirocheet, de cyste en de celwanddeficiënte bacterie. Oorspronkelijk werden alle afwijkende verschijningsvormen van de normale spirocheet “cysten” genoemd en tegenwoordig ook “round bodies” (RBs) (Brorson et al., 2009). Hiertoe behoren blebs, afgestoten blebs of gemmae, granulen, sferoplast-, L-vormen en cysten; allemaal cysteuze vormen onder de verzamelnaam cysten (Holt, 1978; Barbour en Hayes 1986).

109 Ook worden de sferoplast-, L-vormen apart tot de celwanddeficiënte (CDW) bacteriën gerekend (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971; Mattman, 2001; Preac-Mursic et al., 1996; Onwuamaegbu et al., 2005; Elliot et al., 2007). De spirocheet B. burgdorferi s.l. beschikt net als de spirocheet Treponema pallidum, de verwekker van geslachtsziekte syfilis, over verscheidene overlevingsstrategieën om zich te handhaven in het lichaam van zijn gastheer. Behalve bovengenoemd pleiomorfisme vormt het intra-cellulaire verblijf van de spirocheet een andere overlevingsstrategie. B. burgdorferi s.l. is waargenomen in vele celtypen, zoals gliacellen, neuronen, endotheelcellen, Kupffercellen, synoviaalcellen, fibroblasten en macrofagen. De spirocheet is zodoende beschermd tegen het immuunsysteem van zijn gastheer en tegen de werking van de antibiotica waarvan het merendeel niet intracellulair werkzaam is. Indien men de levensduur van intracellulaire vormen van B. burgdorferi s.l.beschouwt als gelijk aan die van de levensduur van de lichaamscellen, dan komen de spirocheten regelmatig vrij als gevolg van de natuurlijke celdood of apoptose. De levensduur van dergelijke cellen is afhankelijk van het type cel en variëert van 2-3 weken tot 6-8 maanden. Als het immuunsysteem de vrijgekomen spirocheten niet kan elimineren of er is geen antibioticum aanwezig, dan vormt het intracellulaire verblijf van de spirocheet, evenals de reconversie van cysten, een voortdurende bedreiging tot het ontstaan van een recidiverende Lyme-borreliose (Cowden et al, 2004). Dat de bacterie B. burgdorferi s.l. beslist geen eenvoudige bacterie is, blijkt ook uit het feit dat hij zich actief kan verplaatsen in het lichaam van zijn gastheer. Dankzij een speciaal bewegingsmechanisme dat bestaat uit endoflagellen en een axiaalfibril, kan de spirocheet zich actief als een worm voortbewegen in visceus milieu in het lichaam van zijn gastheer. Vandaar dat spirocheten oorspronkelijk werden gerekend tot het dierenrijk in plaats van het plantenrijk, waartoe bacteriën werden ingedeeld omdat zij net als plantencellen in het bezit zijn van een celwand. Het woordje “cyste” in plaats van “spore” herinnert nog aan de oude indeling van het dierenrijk. Er waren oorspronkelijk maar twee Rijken: het Dierenrijk en het Plantenrijk. Tegenwoordig worden de bacteriën ingedeeld in het Rijk Monera. Doordat spirocheten zich actief kunnen verplaatsen, zijn zij in staat om razendsnel de plaats van de tekenbeet te verlaten en zich te verspreiden in het lichaam van de gastheer. Hierdoor is het mogelijk is dat er geen erythema migrans ontstaat maar dat de patiënt enige tijd na de tekenbeet op een andere plaats in het lichaam een ontsteking krijgt. Via endotheelcellen van de bloedvaten kan B. burgdorferi s.l. de bloedbaan verlaten, om zich diep in de weefsels te vestigen, met een voorkeur voor zuurstofarme milieu’s zoals de gewrichten en het centrale zenuwstelsel. De spirocheet B. burgdorferi s.l. kan dus voorkomen als normale mobiele spirocheet, als cyste of als celwanddeficiënte bacterie. Hij kan zich ophouden in vloeistof- en in weefselcompartimenten en zich actief verplaatsen in het lichaam van zijn gastheer. Bovengenoemde bevindingen van in vitro - en in vivo onderzoek maken het duidelijk dat een antibioticumbehandeling die alléén gericht is tegen de normale spirocheet, onvoldoende is. Het feit dat de bacterie pleiomorfisme kan vertonen afhankelijk van het type - en de aan- of afwezigheid van de anti-bacteriële stressfactor, betekent in feite dat men de behandelingsstrategie zo breed mogelijk zou moeten toepassen. De therapie zou gericht moeten zijn tegen mobiele normale spirocheten, intracellulaire spirocheten, intra- en extracellulaire cysten met inbegrip van celwanddeficiënte vormen van de spirocheet B. burgdorferi s.l.. Aangezien er momenteel geen therapeuticum is tegen alle verschijningsvormen van de spirocheet, zou het beste een combinatietherapie zijn, die bestaat uit het simultaan of intermitterend toedienen van diverse antibiotica die ieder afzonderlijk gericht zijn tegen één of meerdere verschijningsvormen van B. burgdorferi s.l.. Uiteraard is verder onderzoek nodig naar dergelijke brede behandelingsstrategieën tegen Lyme-borreliose. Hoe is het gesteld met de huidige behandelingsrichtlijnen voor Lyme-borreliose? Tot op heden zijn alle officiële behandelingsrichtlijnen van het Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg (CBO), de Infectious Diseases Society of America (IDSA) en de International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) alleen gericht op de bestrijding van de normale spirocheet. De andere verschijningsvormen blijven buiten schot. In de richtlijnen van de CBO-werkgroep (2004) worden alleen aanbevelingen gedaan voor de behandeling van de normale spirocheet. Mogelijkerwijs is men niet op de hoogte van het verschijnsel cystevorming van de Borrelia spirocheet onder invloed van antibacteriële stressfactoren en de reconversie na het beëindigen van de therapie. Ondanks het feit dat er de afgelopen 15 tot 20 jaar veel Europees onderzoek is verricht in de buurlanden door de onderzoekers Brorson en Brorson in Noorwegen, Preac-Mursic et al. in Duitsland, Kersten et al. en Aberer in Oostenrijk , is dit kennelijk aan de aandacht van de CBO-werkgroep ontsnapt. De CBO-werkgroep wacht met de nieuwe richtlijnen op de te verwachte richtlijnen van de ILADS-werkgroep om deze eventueel over te nemen of te weerleggen. De ILADS-werkgroep zal waarschijnlijk komen met aanbevelingen voor combinatietherapieën en zal zich vooral richten op de chronische Lyme-borreliose. Het is te verwachten dat er in ieder geval CBO-richtlijnen zullen komen voor de behandeling van de co-infecties Babesia, Anaplasma, Ehrlichia of Bartonella, die tegelijkertijd met de Borrelia spirocheet kunnen worden overgebracht via een besmette tekenbeet. De IDSA-werkgroep is op de hoogte van de verschijningsvorm “cyste” van B. burgdorferi s.l. In de Lyme-borreliose richtlijn van 2006 wordt het standaard werk van Alban et al. (2000) aangehaald. Deze studie laat zien dat er leven aanwezig

110 is in de cysten die gevormd werden onder invloed van serum-starvation (voedselgebrek). Er was namelijk een actieve eiwitstofwisseling in de cysten aan te tonen. Ook werd er door de onderzoekers Alban et al. (2000) reconversie van de cysten naar normale spirocheten aangetoond, na transfer van de cysten naar een verrijkte voedingsbodem; dat wil zeggen dat de omstandigheden gunstig werden voor de spirocheet na opheffing van de stressfactor serum-starvation. Het is ongelooflijk dat de IDSA-werkgroep geen klinische betekenis hecht aan het fenomeen “cystevorming”. Misschien door het feit dat er in de studie van Alban et al. (2000) niet geëxperimenteerd is met antibiotica als stressfactoren, zoals de Europese studies hebben laten zien. Overigens komt een stress-toestand van serum-starvation in vivo voor in de liquor cerebrospinalis. Als de spirocheet daar terecht mocht komen dan kan er cystevorming plaatsvinden door gebrek aan voedingsstoffen. Aangezien het vaak moeilijk is om uit de cysten normale spirocheten te kweken, dit kan alleen in zeer gespecialiseerde laboratoria, zal de kweek dikwijls ten onrechte als negatief beoordeeld worden. In de IDSA Lyme-borreliose richtlijnen van 2006 worden verder combinatietherapieën en de chemotherapeutica metronidazol en tinidazol, die juist werkzaam zijn tegen de cysten, afgekeurd. Volgens de IDSA-werkgroep wegens gebrek aan biologische verklaringen, gebrek aan werkzaamheid, het ontbreken van ondersteunende gegevens of het mogelijk veroorzaken van schade aan de patiënt. Overigens worden de studies van Brorson en Brorson (1999) met metronidazol en van Brorson en Brorson (2004) met tinidazol niet genoemd in de referenties van 2006 door de IDSAwerkgroep. Waarom worden deze studies door de IDSA werkgroep genegeerd? De laatste behandelingsrichtlijnen van de IDSA voor Lyme-borreliose uit 2006 hebben bij de Lyme-borreliose patiënten en de ILADS-werkgroep geleid tot protesten. Men is van mening dat vooral de chronische Lyme-borreliose patiënten niet de noodzakelijke behandelingen krijgen. In april 2008 heeft de IDSA besloten om een nieuw panel samen te stellen dat opnieuw de richtlijnen zou bekijken. In 2010 is bekend geworden dat de richtlijnen van de IDSA niet gewijzigd zullen worden. Het nieuwe panel achtte het bewijs voor de conclusies en aanbevelingen uit 2006 van de IDSA-werkgroep gerechtvaardigd (Lantos et al., 2010). De werkgroepen van het CBO(2004) en de IDSA (2006) hanteren verder een post-Lyme disease syndroom (PLDS) voor patiënten die aspecifieke klachten en symptomen blijven houden na “adequate” antibioticabehandelingen. Tot de aspecifieke symptomen behoren onder andere moeheid, spierpijn, hoofdpijn, geheugenstoornissen en gewrichtspijn. Bij deze post-infectieuze klachten en symptomen gaat men ervan uit dat er geen sprake meer is van een Lyme-borreliose infectie, aangezien de liquor cerebrospinalis normale uitslagen laat zien zonder pleiocytose (vermeerdering van cellen) en IgG-antilichamen. De patiënt krijgt vaak te horen: “het zit tussen de oren”. Post-infectieuze klachten dienen volgens de CBO- en IDSA-werkgroep niet verder met antibiotica maar symptomatisch behandeld te worden. De werkgroepen van het CBO en de IDSA beroepen zich hierbij op de studie van Klempner (2001), waarbij geen verschil werd geconstateerd wat betreft pijn, lichamelijk - en geestelijk welbevinden en dagelijks functioneren tussen de behandeling met placebo en de antibacteriële behandeling die bestond uit 30 dagen intraveneus ceftriaxon, gevolgd door 60 dagen doxycycline per os (Klempner et al., 2001). Op basis van bovengenoemde studie van Klempner et al. (2001) komt de CBO-werkgroep (2004) de IDSA-werkgroep (2006) tot de conclusie dat een langdurige (90 dagen) antibioticabehandeling bij patiënten met een post-Lymeziektesyndroom zonder dat een persisterende infectie aangetoond kan worden, geen positief effect heeft op de klachten en het funtioneren. Tegenover de Lyme-borreliose richtlijnen van het CBO (2004) en van de IDSA (2006) staan de richtlijnen van de ILADS (2004). De ILADS-werkgroep richt zich vooral op de behandeling van de chronische Lyme-borreliose patiënten met persisterende klachten en noemde dit het persisterende Lyme-disease syndroom (PLDS). (vergelijk PLDS van de IDSA, dat dus een geheel andere betekenis heeft). Deze termen zijn dus verwarrend. Tegenwoordig gebruikt de ILADS-werkgroep ook de term chronic Lyme disease (CLD). In tegenstelling tot de CBO-werkgroep (2004) en de IDSA-werkgroep(2006) erkent de ILADS-werkgroep geen postinfectieuze klachten en symptomen. Als er na antibioticabehandelingen toch chronische klachten blijven bestaan, dan wordt er door de ILADS-werkgroep vanuit gegaan dat de infectie, hoewel niet aantoonbaar, toch op de één of andere wijze aanwezig blijft en dat er verder behandeld dient te worden met antibiotica. Er is geen bewijs dat de infectie verdwenen is. De eerder genoemde studie van Klempner et al. (2001) is bekritiseerd door de ILADS-werkgroep omdat patiënten gemiddeld 4-5 jaar symptomen hadden van een chronische Lyme-borreliose. In dat geval is een behandeling van 1 maand intraveneus ceftriaxon, wel of niet gevolgd door een te korte en een te laag gedoseerde orale doxycycline therapie, onvoldoende voor patiënten die al zo lang ziek zijn (Donta, 2001; Cameron, 2006). Volgens de onderzoeker Donta (2001b) wordt de duur van de behandeling en de genezing vooral bepaald door de periode van bestaande klachten. Hoe langer de duur van de voorafgaande symptomen is, des te langer zal de behandelingstijd vergen, alvorens een verbetering of genezing optreedt. De behandelingsduur voor de chronische Lyme patiënt bedraagt volgens de onderzoeker zeker 12-18 maanden.Verder zou het antibioticum ceftriaxon onvoldoende intracellulair werkzaam zijn; dit is nodig om de spirocheet te bestrijden als deze zich ophoudt in de cellen (Donta, 2001).

111 Hoewel er nog geen officiële ILADS richtlijnen zijn voor het toepassen van combinatietherapieën bij Lyme-borreliose door gebrek aan klinische studies hiervan, wordt in de individuele ILADS-artsenpraktijk steeds meer een combinatietherapie van twee of meer antibiotica toegepast bij de recidiverende en chronische Lyme-borreliosen (Burrascano, 2005). Tevens wordt er in de huidige ILADS-richtlijnen (2004) een hogere dosering aanbevolen dan bij de huidige CBO (2004) - en IDSA (2006) richtlijnen; dit ter verkrijging van voldoende concentraties in weefsel- en vloeistofcompartimenten (Burrascano, 2005). Ook worden er in de ILADS-richtlijnen van 2004 langere behandelingen aanbevolen dan in de richtlijnen van het CBO (2004) en de IDSA (2006). Volgens de ILADS-werkgroep is het duidelijk dat de duur van de behandeling bij de ziekte van Lyme van essentiëel belang is. Korte antibioticumbehandelingen laten een percentage zien van 30-62% aan recidieven binnen 3 jaar na de behandeling (Asch et al. (1994). Als men dit percentage betrekt op de jaarlijkse 22.000 patiënten die in Nederland behandeld worden voor erythema migrans, dan betekent dit dat 6600 tot 13.640 patiënten te maken kunnen krijgen met een recidiverende Lyme-borreliose binnen 3 jaar na een “adequate” antibioticumbehandeling. Een onderzoek van Ziska et al. (1996) naar de behandelingsduur van het erythema migrans door de artsen, liet een gemiddelde behandeling van 4 weken zien. 43% van de artsen behandelde post-erythema migrans Lyme-borreliose gedurende 3 maanden of langer met antibiotica en bij een chronische Lyme-borreliose was dit het geval bij 57% van de artsen. Langere en/of herhaalde antibioticabehandelingen zijn in sommige individuele gevallen noodzakelijk om de persisterende spirocheet geheel uit te roeien. De behandelingsduur zou afhankelijk moeten zijn van de klinische respons van de patiënt, in plaats van een arbitraire tijd aan te houden van bijvoorbeeld 30 dagen (Ziska et al., 1996). In een studie van Donta (1997) werden 277 patiënten met een persisterende Lyme-borreliose behandeld met tetracycline. De behandelingsduur varieerde van één tot 11 maanden, met een gemiddelde duur van vier maanden. Na een behandeling van twee maanden was er bij 33% van de patiënten een verbetering opgetreden in de afname van de klachten; na drie maanden behandelen was deze verbetering 66%. De studie toonde hiermee aan dat een langere behandeling tot betere resultaten zou kunnen leiden (Donta, 1997). Een mogelijke verklaring voor het feit dat een langere behandeling van de antibacteriële stressfactor kan leiden tot betere resultaten, is af te leiden uit de eerder genoemde in vitro studie van Gruntar et al. (2001). Hoe langer de tijdsduur van de stressfactor van invloed was op de cysten, des te langer liet de reconversie van nog levensvatbare cysten naar normale spirocheten op zich wachten. Onder een langdurige antibioticumbehandeling zou de levensvatbaarheid van de gevormde cysten af kunnen nemen, waardoor er minder normale virulente spirocheten vrij zouden kunnen komen, wat de kans op recidieven doet afnemen. Waarschijnlijk zullen met de nieuwe richtlijnen van de ILADS-werkgroep ook de eerste klinische studies met combinatietherapieën die gericht zijn tegen de diverse verschijningsvormen van de spirocheet, met name tegen de cystevorm, verschijnen. Bij aanhoudende klachten of verergering van de symptomen na behandeling(en) met antibiotica voor Lyme-borreliose dient men eerst na te gaan of er misschien sprake kan zijn van co-infecties zoals Babesia, Anaplasma, Ehrlichia of Bartonella. Verder kan men zich de vraag stellen of er inderdaad bij aanhoudende chronische neuroborreliose klachten toch sprake is van een aanhoudende infectie of dat men deze klachten kan beschouwen als “post-infectieus”. Er is echter een toenemend bewijs dat de spirocheten van B. burgdorferi s.l. zich weten te handhaven in geïnfecteerd weefsel, met inbegrip van de hersenen, ook na antibioticumtherapiën waaronder penicilline-G. De spirocheten zouden zich intracellulair ophouden in neuronen en gliacellen van het centrale zenuwstelsel (Preac-Mursic et al., 1989; Miklossy et al., 2008; Miklossy, 2008). Indien de spirocheet intracellulair verblijft dan wordt er geen immuunrespons meer opgewekt door de antigenen van de spirocheet. De IgG antilichamentiter zal dalen en uiteindelijk negatief worden en de liquor cerebrospinalis kan normale uitslagen laten zien. Maar de infectie is nog steeds intracellulair actief en dient behandeld te worden. Valt er misschien iets te leren van de geslachtsziekte syfilis met betrekking tot de behandeling hiervan voor de chronische Lyme-neuroborreliose? De verwekker van de geslachtsziekte syfilis, de spirocheet Treponema pallidum, vertoont anatomisch en pathologisch veel overeenkomsten met de spirocheet Borrelia burgdorferi s.l. zoals: - familie van de Treponemataceae - kenmerkende anatomie van spirocheten, spiraalvormige gramnegatieve bacteriën. - in vitro en in vivo intra- en extracellulaire cystevorming onder invloed van stressfactoren, zoals de antibiotica. - vorming van celwanddeficiënte bacteriën, de sferoplast-, L-vormen onder invloed van penicilline of hypertonische oplossingen in vitro. - vorming van celwanddeficiënte bacteriën, de sferoplast-, L-vormen onder invloed van penicilline in vivo. - pathogene spirocheten; infecties beginnen in de huid, waarna er verspreiding plaatsvindt in het lichaam, waarbij alle organen aangetast kunnen worden. - ziekteverloop van syfilis en Lyme-borreliose in stadia.

112 -

diagnose door het zichtbaar maken van spirocheten in besmet materiaal via donkerveldmicroscopie en directe fluorescentietest; bevestiging via PCR. diagnose latere stadia door antilichamenbepaling. antibacteriële behandeling tegen normale spirocheten en niet tegen cysten. overeenkomstig ziektebeeld late neurosyfilis en late Lyme-neuroborreliosis: meningovasculaire neurosyfilis / meningovasculaire neuroborreliosis en parenchymateuse neurosyfilis / parenchymateuse neuroborreliose, met invasie van neuronen en gliacellen met als gevolg dysfunctioneren hiervan en progressieve celdood. Klinisch beeld is progressieve dementie (Miklossy, 2008).

Het laatst genoemde punt van overeenkomst zal hierna nader worden bekeken. Het ziektebeeld van de chronische Lyme-neuroborreliose vertoont veel overeenkomsten met het ziektebeeld van de late neurosyfilis (Miklossy, 2008). In de late stadia van neurosyfilis en van neuroborreliose kunnen twee vormen voorkomen: de meningovasculaire neurosyfilis/-neuroborreliose en de parenchymateuse neurosyfilis/-neuroborreliose. Vaak ziet men een mengsel van zowel de meningovasculaire als de parenchymateuze vorm (Miklossy, 2008). De meningovasculaire neurosyfilis/-neuroborreliose wordt gekenmerkt door een circulatiestoornis in de hersenen. Cerebrale vasculitis met multiple stenoses van de grote hersenarteriën en onregelmatigheden van de wanden van de kleine bloedvaten kunnen multiple herseninfarcten veroorzaken (Miklossy, 2008). De parenchymateuze neurosyfilis/-neuroborreliose, wordt gekenmerkt door wijdverspreide beschadigingen aan het hersenparenchym die worden veroorzaakt door een directe invasie van het hersenweefsel door de spirocheten van Treponema pallidum/ Borrelia burgdorferi sensu lato. Door het intracellulaire verblijf van de spirocheten in neuronen en gliacellen kunnen de hersencellen ontregeld raken met mogelijke apoptosis tot gevolg. Dit kan leiden tot verlammingen en vele neuropsychiatrische symptomen waaronder progressieve dementie (Miklossy et al., 2008, Miklossy, 2008). Ongeveer 20 jaar geleden zijn de eerste gevallen van dementie bij chronische neuroborreliose patiënten bekend geworden. Hierbij zijn Borrelia spirocheten gevonden in de hersenen of konden worden gekweekt uit hersenweefsel (Miklossy, 2008). Hierbij komt het dilemma van de behandeling van de chronische neuroborreliose weer ter sprake. Verdeeldheid was er namelijk ook 100 jaar geleden, toen de vraag rees of men de chronische vorm van neurosyfilis, het tertiaire stadium met verlammingen en progressieve dementie wel moest behandelen. Uiteindelijk is men het eens geworden dat de tertiaire vorm van neurosyfilis behandeld dient te worden met antibiotica. Bij neurosyfilispatiënten met dementie leidt de antibacteriële behandeling tot aanzienlijke verbeteringen (Miklossy, 2008). Aangezien de meningovasculaire - en de parenchymateuze vorm van de late neurosyfilis dezelfde pathologie laten zien als de meningovasculaire - en de parenchymateuze chronische neuroborreliose, kan het behandelen met antibiotica van de late neurosyfilis op zich als voorbeeld dienen voor het wel behandelen van de late neuroborreliose. Maar dat is niet voldoende, ook bij de neurosyfilis is er geen specifieke behandeling tegen de cysten die gevormd worden tijdens de eerste antibioticumtherapieën. Toch was men in de 19e en 20ste eeuw wel degelijk op de hoogte van het verschijnsel cystevorming door de Treponema spirocheet (Ovcinnikov en Delektorskij, 1971). Het onderstaande is in feite ook van toepassing op een meer effectieve bestrijding van de spirocheet Treponema pallidum. Hier wordt verder alleen B. burgdorferi s.l. genoemd. Aanbevelingen voor verder onderzoek Het merendeel van de huidige wetenschappers waaronder microbiologen en artsen staren zich blind op de normale spiraalvormige bacterie B. burgdorferi s.l.. Ten onrechte gaat men ervan uit dat een “adequate” antibioticumbehandeling voldoende zou zijn om de spirocheet te bestrijden. Een spirocheet is echter geen “gewone” bacterie zoals een Escherichia coli en weet op slinkse wijze voor onbepaalde tijd te ontsnappen aan de antibacteriële stressfactor als intra- of extracellulaire cyste, als celwanddeficiënte bacterie of gewoon als intracellulaire spirocheet. Wil men een (micro)-organisme bestrijden dan dient men op de hoogte te zijn van het gedrag van dit (micro)-organisme, om zodoende tot volledige uitroeiing hiervan te komen. Bij een worminfectie bestrijdt men immers niet alleen de wormen maar ook de wormeieren. Indien men een adequate behandeling van Lyme-borreliose wil toepassen dan dient deze gericht te zijn tegen alle mogelijke verschijningsvormen van de bacterie: de normale spirocheet, de intra-cellulaire spirocheet, de celwanddeficiënte bacterie, en de intra- en extracellulaire cysten van Borrelia burgdorferi s.l.. Er dient dus een brede behandelingsstrategie toegepast te worden bestaande uit een combinatietherapie van antibiotica en chemotherapeutica, opdat men deze bacterie op alle fronten kan aanvallen. Een combinatietherapie zou bijvoorbeeld kunnen bestaan uit: 1) doxycycline dat actief is tegen normale spirocheten en celwanddeficiënte bacteriën, 2) azithromycine dat ook intracellulair werkzaam is, 3) tinidazol (Brorson en Brorson, 2004) of hydroxychloroquine (Brorson en Brorson, 2002), die beide actief zijn tegen cysten van B. burgdorferi s.l..

113 Men dient onderzoek te doen naar de meest effectieve combinatietherapieën wat betreft de samenstelling, de toedieningswijze, de doses en duur van de behandelingen, afhankekijk van het Lyme-borreliose stadium. Het is van belang reeds bij de eerste behandeling van de vroege lokale en /of vroege gedessimineerde Lyme-borreliose rekening te houden met cystevorming door de spirocheten ten gevolge van de antibioticumtherapie. Er dient dus tevens een therapeuticum tegen cysten toegediend te worden, het zij tegelijkertijd het zij intermitterend. Met het doden van de cysten voorkomt men reconversie naar normale virulente spirocheten zodat hiermee de kans op recidieven en late complicaties zoveel mogelijk wordt voorkomen. Tevens is het van belang om het gebruik van bèta-lactam antibiotica (penicillinen, cefalosporinen) zoveel mogelijk te vermijden, wegens de kans op het ontstaan van celwanddeficiënte bacteriën (sferoplast-, L-vormen). Patiënten die met een combinatietherapie voor Lyme-borreliose behandeld zijn, dienen de komende jaren gevolgd te worden in een prospectieve studie om de effectiviteit van de behandeling te evaluëren. Het aantal recidieven dat binnen drie jaar normaliter tussen 30 en 62% ligt, zou aanzienlijk moeten dalen, als ook het aantal late complicaties bij de chronische Lyme-borreliose. Verder onderzoek zal dit moeten uitwijzen. Een positieve bijkomstigheid van het terugbrengen van het aantal recidieven en late complicaties van Lyme-borreliose door het direct toepassen van een brede behandelingsstrategie die ook gericht is tegen de cysteuze vormen van de spirocheet, zou kunnen zijn dat het antibioticagebruik in zijn geheel zal afnemen. Verder onderzoek zal dit moeten aantonen. Een combinatietherapie is ook van toepassing op de chronische neuroborreliose patiënten met aspecifieke klachten zonder aantoonbare infectie. Zoals eerder vermeld laat de liquor cerebrospinalis normale uitslagen zien zonder pleiocytose en intrathecale antilichamen. Indien de spirocheet intracellulair verblijft in neuronen en gliacellen of aanwezig is als cyste, dan is hij veilig voor het immuunsysteem van de gastheer en wordt er geen immuunrespons meer opgewekt. De antilichamentiter kan dalen en zelfs negatief worden, net als bij de tertiaire neurosyfilis. Dit is echter geen bewijs dat de infectie is geweken. Dat de Lyme-borreliose infectie intracellulair in neuronen en gliacellen aanwezig kan zijn, is aangetoond door Miklossy et al. (2004), MacDonald (2006c) en Miklossy (2008). Het betreft de parenchymateuze neuroborreliose die net als de tertiaire neurosyfilis kan leiden tot verlammingen en vele neuropsychiatrische symptomen waaronder dementie. Verder zou een onderzoek bij patiënten met dementie of andere neuropsychiatrische klachten zinvol zijn, om na te gaan of er een Lyme-borreliose infectie aan ten grondslag ligt. Dit kan zeker het geval zijn indien de patiënt woont of heeft gewoond in een endemisch gebied voor de ziekte van Lyme en waarbij een tekenbeet onopgemerkt is gebleven en /of een Borrelia infectie niet is gediagnostiseerd. Een geschikte antibacteriële combinatietherapie bij de parenchymateuze neuroborreliose dient verder te worden onderzocht. Conclusie Het is gebleken dat het merendeel van de artsen er ten onrechte vanuit gaat dat een gewone antibioticumbehandeling voldoende zou zijn om de spirocheet B. burgdorferi s.l. te bestrijden. Een spirocheet is echter geen “gewone” bacterie zoals een Escherichia coli en weet op slinkse wijze door een snelle actieve verplaatsing en pleiomorfie voor onbepaalde tijd te ontsnappen aan de antibacteriële stressfactor. Concluderend kan men stellen dat een behandeling met een enkelvoudig “adequaat” antibioticum dat alleen gericht is tegen de normale spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato, onvoldoende is. Men dient rekening te houden met het gedrag van de bacterie tijdens de antibacteriële stressfactor. Wil men de infectieziekte Lyme-borreliose uitbannen dan dient men ook de intra- en extracellulaire cysten met inbegrip van de celwanddeficiënte bacteriën (sferoplast-, L-vormen) en intracellulaire spirocheten te bestrijden. Een brede behandelingsstrategie tegen alle verschijningsvormen van de spirocheet Borrelia burgdorferi sensu lato is hierbij van toepassing.

-----------------------

114 REFERENTIES -

Aberer E, Breier F, Stanek G, Schmidt B. 1996. Success and failure in the treatment of acrodermatitis chronica atrophicans. Infection 24(1): 85-87. Aberer EMD, Kersten AMD, Klade HMD, Poitschek C, Jurecka WMD. 1996. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi in the skin. The American Journal of Dermatopathology 18(6): 571-579. Alban PS, Johnson PW, Nelson DR. 2000.Serum-starvation-induced changes in protein synthesis and morphology of Borrelia burgdorferi. Microbiology 146(Pt 1): 119-127. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD, 1994. Molecular biology of the cell. (pp: 172,187) Third edition. New York, Garland Publishing Incorperated. Asch ES, Bujak DI, Weiss M, Peterson MG, Weinstein A. 1994. Lyme disease: an infectious and postinfectious syndrome. Journal of Rheumatology 21(3): 454-456. Bakken JS, Dumler JS. 2000. Human granulocytic ehrlichiosis. Clinical Infectious Diseases 31: 554-560. Barbour AG. 1984. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. The Yale journal of Biology and Medecine 57: 521-525. Barbour AG, Hayes SF. 1986. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews 50(4): 381-400. Barbour AG. 1996. Lyme Disease: the Cause, the Cure, the Controversy.(pp.146-147). Baltimore and London: The Johns Hopkins University Press. Barsic B, Maretic T, Majerus L, Strugar J. 2000. Comparison of azithromycin and doxycycline inthe treatment of erythema migrans. Infection 28(3): 153-156. Barthold SW, Hodzic E, Imai DM, Feng S, Yang X, Luft BJ. 2010. Ineffectiveness of Tigecycline against persistent Borrelia burgdorferi. Antimicrobioal Agents and Chemotherapy 54(2): 643-651. Battaglia HR, Alvarez G, Mercau A, Fay M, Campodónica M, 2000. Psychiatric symtomatology associated with presumptive Lyme-disease: clinical evidence. Journal of Spirochetal Tick Diseases 7: 22-25. Bayer ME, Zhang L, Bayer MH. 1996. Borrelia burgdorferi DNA in the urine of treated patients with chronic Lyme disease symptoms. A PCR study of 97 cases. Infection 24(5): 347-353. Berger BW. 1988. Treatment of erythema chronicum migrans of Lyme disease. Annals of the New York Academie of Sciences 539: 346-351. Bergström S, Noppa L, Gylfe Ä, Östberg Y. 2002. Molecular and Cellular Biology of Borrelia burgdorferi sensu lato. (pp. 47-63) in Lyme Borreliosis: Biology, Epidemiology and Control. Edited by Gray JS, Kahl O, Lane RS, Stanek G. Wallingford, UK: CABI Publishing. Bigaignon G, Van Bambeke F, Ninane J. 1996. La maladie de Lyme: Pour une approche diagnostique et thérapeutique rationelle. Bron op 28 juni 2006 van: http://www.md.ucl.ac.be/infect/lyme/lyme_texte.htm Blanco JR, Oteo JA. 2002. Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. Clinical Microbiology and Infection 8(12): 763-772. Bleker OP, Meyden WI van der, Wittenberg J, Bergen JEAM van, Boeke AJP, Doornum GJJ van, Henquet CJM, Galama JMD, Postma MJ, Prins JM, Voorst Vader PC van. Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheiszorg (CBO). 2002. Richtlijn Sexueel overdraagbare aandoeningen en herpes neonatorum. Blocker ME, Levine WC, St. Louis ME. 2000. HIV prevalence in patients with syphilis, United States. Sexually Transmitted Diseases 27(1): 53-59. Bockenstedt LK, Mao J, Hodzic E, Barthold SW, Fish D. 2002. Detection of attenuated, non-infectious spirochetes in Borrelia burgdorferi infected mice after antibiotic treatment. Journal of Infectious Diseases 186: 1430-1437. Boon S den, Schellekens JFP, Schouls LM, Suijkerbuik AWM, Doctors van Leeuwen B, Pelt W van. 2004. Verdubbeling van het aantal consulten voor tekenbeten en Lyme-borreliose in de huisartsenpraktijk in Nederland. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde 48(14): 665-670. Borg R, Dotevall L, Hagberg L, Maraspin V, Lotric-Furlan S, Cimperman J, Strle F. 2005. Intravenous ceftriaxone compared with oral doxycycline for the treatment of Lyme neuroborreliosis. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 37: 449-454. Bradford RW, Allen HW, Bradford Research Institute. 2006. Biochemistry of Lyme Disease: Borrelia burgdorferi Spirochete/Cyst. Townsend letter.The Examiner of Alternative Medecine. February-March 2006. Brorson O, Brorson SH. 1997. Transformation of cystic forms of Borrelia burgdorferi to normal, mobile spirochetes. Infection 25(4): 240-245. Brorson O, Brorson SH. 1998a. A rapid method for generating cystic forms of Borrelia burgdorferi and their reversal to mobile spirochetes. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 106(12): 1131-1141. Brorson O, Brorson SH. 1998b. In vitro conversion of Borrelia burgdorferi to cystic forms in spinal fluid, and transformation to mobile spirochetes by incubation in BSK-H medium. Infection 26(3): 144-150. Brorson O, Brorson SH. 1999. An in vitro study of the susceptibility of mobile and cystic forms of Borrelia burgdorferi to metronidazole. Acta Pathlogica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 107(6): 566576. Brorson O, Brorson SH. 2001. Susceptibility of motile and cystic forms of Borrelia burgdorferi to ranitidine bismuth citrate. International Microbiology 4: 209-215. Brorson O, Brorson SH. 2002. An in vitro study of the susceptibility of mobile and cystic forms of Borrelia

115 -

-

burgdorferi to hydroxychloroquine. International Microbiology 5: 25-31. Brorson O, Brorson SH. 2004. An in vitro study of the susceptibility of mobile and cystic forms of Borrelia burgdorferi to tinidazole. International Microbiology 7: 139-142. Brorson O, Brorson SH. 2006. An in vitro study of the activity of Telithromycin against mobile and cystic forms of Borrelia afzelii. Infection 34(1): 26-28. Brorson O, Brorson SH. 2007. Grapefruit seed extract is a powerful in vitro agent against motile and cystic forms of Borrelia burgdorferi sensu lato. Infection 35: 206-208. Brorson O, Brorson SH, Scytes J, MacAllister J, Wier A, Margulis L. 2009. Destruction of spirochete Borrelia burgdorferi round-body propagules (RBs) by the antibiotic Tigecycline. Proceedings of the National Academy of Sciences 106(44): 18656-18661. Bruck DK, Talbot ML, Cluss RG, Boothby JT. 1995. Ultrastructural characterization of the stages of spheroplast preparation of Borrelia burgdorferi. Journal of Microbiological Methods 23: 219-228. Burrascano JJ. 2005. Advanced topics in Lyme disease. Diagnostic hints and treatment guidelines for Lyme and other tick borne illnesses. Fifteenth Edition. http://www.ilads.org. Cameron D, Gaito A, Harris N, Bach G, Bellovin S, Bock K, Bock S, Burrascano J, Dickey C, Horowitz R, Philips S, Meer-Scherrer L, Raxien B, Sherr V, Smith H, Smith P, Stricker R; ILADS Working Group. 2004. Evidence-based guidelines for the management of Lyme disease. Expert Review of Anti-Infective Therapy 2(1 Suppl): S1-13. Cameron DJ. 2006. Generalizability in two clinical trials of Lyme disease. Epidemiologic Perspectives and Innovations 3:12. Canale-Parola C. 1977. Physiologie and Evolution of Spirochetes. Bacteriological Reviews 41(1): 181-204. Carroll JA, El-Hage N, Miller JC, Babb K, Stevenson B. 2001. Borrelia burgdorferi RevA antigen is a surface-exposed outer membrane protein whose expression is regulated in response to environmental temperature and pH. Infection and Immunity 69: 5286-5293. Cimmino MA, Accardo S. 1992. Long term treatment pf chronic Lyme arthritis with benzathine penicillin. Annals of the Rheumatic Diseases 51(8): 1007-1008. Coumou J, Poll T van der, Speelman P, Hovius JWR. 2011. Tired of Lyme borreliosis. Lyme borreliosis in the Netherlands. The Netherlands Journal of Medecine 69(3): 101-111. Cowden WL, Moayad H, Vandergriff J, Romero L, Ivanova S. 2004. Lyme disease: nutraceutical breakthrough using TOA-free Cat’s Claw. Allergy Research Group, Focus, Januari 2004: 3-4. Currell BR, James JW Leach CK, Patmore LA, van Dam-Mieras MCE, de Jeu WH, de Vries J. 1993. Defence Mechanisms (pp.45, 218-297) Oxford: Butterworth-Heinemann Ltd. Dattwyler RJ, Halperin JJ, Volkman DJ, Luft BJ. 1988. Treatment of late Lyme-borreliosis-randomized comparison of ceftriaxone and penicillin. Lancet 1: 191-194. Dattwyler RJ, Volkman DJ, Conaty SM, Platkin SP, Luft BJ. 1990. Amoxycillin plus probenecid versus doxycycline for treatment of erythema migrans borreliosis. The Lancet 336: 1404-1406. Dattwyler RJ, Luft BJ, Kunkel MJ, Finkel MF, Wormser GP, Rush TJ, Grunwaldt E, Agger WA, Franklin M, Oswald D, Cockey L, Maladorno D. 1997. Ceftriaxone compared with doxycycline for the treatment of acute disseminated Lyme disease. The New England Journal of Medicine 337(5): 289-294. Dattwyler RJ, Wormser GP, Rush TJ, Finkel MF, Schoen RT, Grunwaldt E, Franklin M, Hilton E, Bryant GL, Agger WA, Maladorno D. 2005. A comparison of two treatment regimens of ceftriaxone in late Lymedidease. Wiener Klinische Wochenschrift 117(11-12): 393-397. Dienes L, Bullivant S. 1968. Morphology and Reproductive Processes of the L Forms of bacteria. II Comparative Study of L forms and Mycoplasma with the Electron Microscope. Journal of Bacteriology 95(2): 672-687. Donta ST. 1997. Tetracycline therapy for chronic Lyme disease. Clinical Infectious Diseases 25 (supplement 1): S52-56. Donta ST. 2001. Treatment of patients with persistent symptoms and a history of lyme disease. New England Journal of Medecine 345(19): 1424-1425 Donta ST. 2003. Macrolide therapy of chronic Lyme disease. Medical Science Monitor 9: 1136-1142 Dotevall L, Hagberg L. 1999. Successful oral doxycycline treatment of Lyme disease-associated facial palsy and meningitis. Clinical Infectious Diseases 28: 569-574. Douglas JM. 2009. Penicillin treatment of syphilis. Clearing away the shadow on the land. Journal of the American Medical Association 302(7): 769-771. Dumler JS, Walker DH. 2001. Tick-borne ehrlichiosis. The Lancet Infectious Diseases 1: 21-28. Eichenfield AH, Goldsmith DP, Benach JL, Ross AH, Loeb FX, Doughty RA, Athreya BH. 1986. Childhood Lyme-arthritis: experience in an endemic area. The Journal of Pediatrics 109(5): 753-758. Elliot T, Worthington T, Osman H, Gill M. 2007. Medical Microbiology & Infection. Blackwell Publishing Ltd. Fourth Edition. pp: 66-67. Embers ME, Ramamoorthy R, Philipp MT. 2004. Survival strategies of Borrelia burgdorferi, the etiologic agent of Lyme disease. Microbes and Infection 6: 312-318. Fallon BA, Nields JA. 1994. Lyme disease: a neuropsychiatric Illness. The American Journal of Psychiatry 151(11): 1571-1583.

116 -

Fenton KA, Lowndes CM, the European Surveillance of Sexually Transmitted Infections (ESSTI) Network. 2004. Recent trends in the epidemiology of sexually transmitted infections in the European Union. Sexually Transmitted Infections 80: 255-263. Gerber MA, Shapiro ED, Burke GS, Parcelis VJ, Bell GL. 1996. Lyme disease in children in Southeastern Connecticut. The New England Journal of Medecine 335(17): 1270-1274. Golden MR, Marra CM, Holmes KK. 2003. Update on syphilis. Resurgence of an old problem. Journal of the American Medical Association 290 (11): 1510-1514. Gruntar I, Malovrh T, Murgia R, Cinco M. 2001. Conversion of Borrelia garinii cystic forms to motile spirochetes in vivo. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 109: 383-388. Hassler D, Zöller L, Haude M, Hufnagel H-D, Heinrich F, Sonntag H-G. 1990. Cefotaxime versus penicillin in the late stage of Lyme disease – prospective, randomized therapeutic study. Infection 18(1): 16-20. Hodzic E, Feng S, Holden K, Feet J, Barthold SW. 2008. Persistence of Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. Antimicrobiological Agents and Chemotherapy 52 (5): 1728-1736. Hofhuis A, Giessen JW van der, Borgsteede FH, Wielinga PR, Notermans DW, Pelt W van. 2006. Lyme borreliosis in the Netherlands: strong increase in GP consultations and hospital admissions in past 10 years. Euro Surveillance 11(6): E060622.2. Hofhuis A, Pelt W van, Giessen JWB van der, Herremans MMPT, Notermans DW, Sprong H. 2011. Epidemiologie van tekenbeten en erythema migrans. Infectieziekten Bulletin 22(2): 52-53. Holt SC. 1978. Anatomy and Chemistry of Spirochetes. Microbiological Reviews 42(1): 114-160. Jacobs JJWM, Noordhoek GT, Brouwers JMM, Wielinga PR, Jacobs JPAM, Brandenburg AH. 2008. Kleine kans op Lymeborreliose na een tekenbeet op Ameland: onderzoek in een huisartsenpraktijk. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde 152(37): 2022-2026. Johnson RC, Schmid GP, Hyde FW, Steigerwaldt AG, Brenner DJ. 1984. Borrelia burgdorferi sp.nov.: etiologic agent of Lyme disease. International Journal of Systematic Bacteriology 34, 496-497. Kahl O, Gern L, Eisen L, Lane RS. 2002. Ecological Research on Borrelia burgdorferi sensu lato: Terminology and some Methodological Pitfalls. (pp 37-40) in Lyme Borreliosis: Biology, Epidemiology and Control. Edited by Gray JS, Kahl O, Lane RS, Stanek G. Wallingford, UK: CABI Publishing. Kalish RA, Kaplan RF, Taylor E, Jones-Woodward L, Workman K, Steere AC. 2001. Evaluation of study patients with Lyme disease, 10-20 year follow-up. Journal of Infectious Diseases 183: 453-460. Karkkonen K, Stiernstedt SH, Karlsson M. 2001. Follow –up of patients treated with oral doxycycline for Lyme borreliosis. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 33: 259-262. Kersten A, Poitschek C, Rauch S, Aberer E. 1995. Effects of penicillin, ceftriaxone, and doxycycline on morphology of Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39(5): 1127-1133. Klausner JD. 2009. Frequency of syphilis testing in HIV-infected patients. More and more often. Sexually Transmitted Diseases 36(2): 1-2. Klempner MS, Noring R, Rogers RA. 1993. Invasion of human skin fibroblasts by the Lyme disease spirochetes, Borrelia burgdorferi. The Journal of Infectious Diseases 167: 1074-1081. Klempner MS, Hu LT, Evans J, Schmid CH, Johnson GM, Trevino RP, Norton D, Levy L, Wall D, McCall J, Kosinski M, Weistein A. 2001. Two controlled trials of treatment in patients with persistent symptoms and a history of Lyme disease. The New England Journal of Medecine 345(2): 85-92. Kohlhepp W, Oschmann P, Mertens H-G. 1989. Treatment of Lyme borreliosis: randomized comparison of doxycycline and penicilline G. Journal of Neurology 236(8): 464-469. Krause PJ, Lepore T, Sikand VK, Gadbaw J, Burke G, Telford SR, Brassard P, Pearl D, Azlanzadeh J, Christianson D, McGrath D, Spielman A. 2000. Atovaquone and azithromycin for the treatment of babesiosis. The New England Journal of Medecine 343: 1454-1458. Kuiper H, Dam AP van, Spanjaard L, Jongh BM de, Widjojokusumo A, Ramselaar TCP, Cairo I, Vos K, Dankert J. 1994. Isolation of Borrelia burgdorferi from biopsy specimens taken from healthy looking skin of patients with Lyme borreliosis. Journal of Clinical Microbiology 32(3): 715-720. Kuiper H. 2004. Klinisch spectrum en incidentie van neuroborreliose in Nederland. Nederlands tijdschrift voor Geneeskunde 48(14): 670-673. Kullberg BJ, Brende A, Meer JWM van der. 2011. The challenge of Lyme disease: tired of the Lyme wars. The Netherlands Journal of Medecine 69(3): 98-100. Kurtenbach K, Schäfer SM, Michelis S de, Etti S, Sewell H-S. 2002.Borrelia burgdorferi sensu lato in the Vertebrate Host. (pp.117-134) in Lyme Borreliosis: Biology, Epidemiology and Control. Edited by Gray JS, Kahl O, Lane RS, Stanek G. Wallingford, UK: CABI Publishing. Kurtti TJ, Munderloh UG, Johnson RC, Ahlstrand. 1987. Colony formation and morphology in Borrelia burgdorferi. Journal of Clinical Microbiology 25(11): 2054-2058. Lantos PM, Charini WA, Medoff G, Moro MH, Mushatt DM, Parsonnet J, Sanders JW, Baker CJ. 2010. Final report of the Lyme disease review panel of the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 51(1):1-5. Laar MJW van de, Haks K, Coenen AJJ. 2002, Registratie van soa en HIV consulten bij GGD- en soapoliklinieken. Jaarverslag 2001. RIVM report 441500014/2002. Logigian EL, Kaplan RF, Steere AC. 1990. Chronic neurologic manifestations of Lyme disease. The New England Journal of Medecine 323(21): 1438-1444. Logigian EL, Kaplan RF, Steere AC. 1999. Successful treatment of Lyme encephalopathy with intravenous

117 -

ceftriaxone. The Journal of Infectious Diseases 180 (2): 377-83 Luft BJ, Volkman DJ, Halperin JJ, Dattwyler RJ. 1988. New chemotherapeutic approches in the treatment of Lyme borreliosis. Annals of the New York Academy of Sciences 539: 352-361. Luft BJ, Dattwyler RJ, Johnson RC, Luger SW, Bosler EM, Rahn DW, Masters EJ, Grunwaldt E, Gadgil SD. 1996. Azithromycin compared with amoxicillin in the treatment of erythema migrans. A double blind, randomized, controlled trial. Annals of Internal Medecine 124(9): 785-791. Luger SW, Paparone P, Wormser GP, Nadelman RB, Grunwaldt E, Gomez G, Wisniewski M, Collins JJ. 1995. Comparison of cefuroxime axetil and doxycycline in treatment of patients with early Lyme Disease associated with erythema migrans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39(3): 661-667. MacDonald AB. 1988. Concurrent neocortical borreliosis and Alzheimer’s disease. Demonstration of a spirochetal cyst form. Annals New York Academy of Sciences 539: 468-470. MacDonald AB, Berger BW, Schwan TG. 1991.Clinical implications of delayed growth of the Lyme borreliosis spirochete, Borrelia burgdorferi. Acta Tropica 48(2): 89-94. MacDonald AB. 2006a. Plaques of Alzheimer’s disease originate from cysts of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease spirochete. Medical Hypotheses 67(3): 592-600. MacDonald AB. 2006b. A life cycle for Borrelia spirochetes. Medical Hypotheses 67(4): 810-818. MacDonald AB. 2006c. Spirochetal cyst forms in neurodegenerative disorders,… hiding in plain sight. Medical Hypotheses 67(4): 819-832. Marques A. 2008. Chronic Lyme disease: An appraisal. Infectious Disease Clinics of North America 22 (2): 341-360. Mattman LH. 2001.Cell wall deficient forms- stealth pathogens (pp. 240-241). 3rd Edition. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington D.C. Miklossy J, Kuntzer T, Bogousslavsky J, Regli F, Janzer RC. 1990. Meningovascular form of neuroborreliosis: similarities between neuropathological findings in a case of Lyme disease and those occuring in tertiary neurosyphilis. Acta Neuropathologica 80: 568-572. Miklossy J, Khalili K, Gern L, Ericson RL, Darekar P, Bolle L, Hurlimann J, Paster BJ. 2004. Borrelia burgdorferi persits in the brain in chronic lyme neuroborreliosis and may be associated with Alzheimer disease. Journal of Alzheimer’s Disease 6: 639-649. Miklossy J. 2008. Transmissable diseases, chapter 72, Biology and neuropathology of dementia in syphilis and Lyme disease (pp 826-844). In Handbook of Clinical Neurology, Volume 89 (3rd series), Dementias. Edited by Duyckaerts C, Litvan I. Elsevier B.V. Miklossy J, Kasas S, Zurn AD, McCall S, Yu S, McGeer PL. 2008. Persisting atypical and cystic forms of Borrelia burgdorferi and local inflammation in Lyme neuroborreliosis. Journal of Neuroinflammation 5: 4061 Müllegger RR. 2004. Dermatological manifestations of Lyme borreliosis. European Journal of Dermatology 14(5): 296-309. Murgia R, Piazetta C, Cinco M. 2002. Cystic forms of Borrelia burgdorferi sensu lato: induction, development, and the role of RpoS. Wiener Klinische Wochenschrift 114/13-14: 574-579. Murgia R, Cinco M. 2004. Induction of cystic forms by different stress conditions in Borrelia burgdorferi. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 112(1): 57-62 Nadelman RB, Pavia CS, Magnarelli LA, Wormser GP. 1990. Isolation of Borrelia burgdorferi from the blood of seven patients with Lyme disease. The American Journal of Medecine 88: 21-26. Nadelman RB, Luger SW, Frank E, Wisniewski M, Collins JJ, Wormser GP. 1992. Comparison of ceroxime axetil and doxycycline in the treatment of early Lyme disease. Annals of Internal Medecine 117(4): 273-280. Nadelman RB, Nowakowski J, Fish D, Falco RC, Freeman K, McKenna D, Welch P, Marcus R, AgüeroRosenfeld ME, Dennis DT, Wormser GP. 2001. Prophylaxis with single-dose doxycycline for the prevention of Lyme disease after an Ixodes scapularis tick bite. The New England Journal of Medecine 345 (2): 79-84. Nicoll A, Hamers FF. 2002. Are trends in HIV, gonorrhoea, and syphilis worsening in western Europe? The Brittisch Medical Journal 324: 1324-1327. Oksi J, Kalimo H, Marttila RJ, Marjamäki M, Sonninen P, Nikoskelainen J, Viljanen MK. 1996. Inflammatory brain changes in Lyme borreliosis. A report on three patients and review of literature. Brain 119: 2143-2154. Oksi J, Nikoskelainen J, Viljanen MK. 1998. Comparison of oral cefixime and intravenous ceftriaxon followed by oral amoxicilline in disseminated Lyme borreliosis. European Journal of Clinical Infectious Diseases 17: 715-719. Onwuamaegbu ME, Belcher RA, Soare C. 2005. Cell wall-deficient bacteria as a cause of infections: a review of the clinical significans. The Journal of International Medical Research 33: 1-20. Pfister HW, Preac-Mursic V, Wilseke B, Schielke E, Sorgel F, Einhaupl KM. 1991. Randomized comparison of ceftriaxone and cefotaxime in Lyme neuroborreliosis. Journal of Infectious Diseases 163(2): 311-318. Preac Mursic V, Wilske B, Schierz G, holmburger M, Süss E. 1987 In vitro and in vivo susceptibility of Borrelia burgdorferi. European Journal of Clinical Microbiology 6 (4): 424-426. Preac-Mursic V, Weber K, Pfister HW, Wilske B, Gross B, Baumann A, Prokop J. 1989. Survival of Borrelia burgdorferi in antibiotically treated patients with Lyme borreliosis. Infection 17(6): 355-359. Preac-Mursic V, Patsouris E, Wilske B, Reinhardt S, Gross B, Mehraein P. 1990. Persistence of Borrelia burgdorferi and histopathological alterations in experimentally infected animals. A comparison with

118 -

-

-

histopathological findings in human Lyme disease. Infection 18 (6): 332-341. Preac-Mursic V, Pfister HW, Spiegel H, Burk R, Wilske B. Reinhardt S, Böhmer R. 1993. First isolation of Borrelia burgdorferi from an iris biopsy. Journal of Clinical Neuroophthalmology 13(3): 155-161. Preac-Mursic V, Marget W, Busch U, Pieterski Rigler D, Hagl S. 1996a. Kill kinetics of Borrelia burgdorferi and bacterial findings in relation tot the treatment of Lyme borreliosis. Infection 24(1): 9-16. Preac-Mursic V, Wanner G, Reinhardt S, Wilske B, Busch U, Marget W. 1996b. Formation and cultivation of Borrelia burgdorferi spheroplast-L-forms variants. Infection 24 (3): 218-226. Priem S, Burmester GR, Kamradt T, Wolbart K, Rittig MG, Krause A. 1998. Detection of Borrelia burgdorferi by polymerase chain reaction in synovial membrane, but not in synovial fluid from patients with persisting Lyme arthritis after antibiotic therapy. Annals of the Rheumatic Diseases 57(2): 118-121. Rijpkema S, Nieuwenhuis J, Franssen FFJ, Jongejan F. 1994. Infection rates of Borrelia burgdorferi in different instars of Ixodes ricinus ticks from the Dutch North Sea island of Ameland. Experimental and Applied Acarology, 18: 531-542. Rijpkema S, Bruinink H. 1996. Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato by PCR in questing Ixodes ricinus larvae from the Dutch North Sea island of Ameland. Experimental and Applied Acarology 20: 381385. Rolfs RT, Joesoef MR, Hendershot EF, Rompalo AM, Augenbraun MH, Chiu M, Bolan G, Johnson SC, French P, Steen E, Radolf JD, Larsen S. 1997. A Randomised trial of enhanced therapy for early syphilis in patients with and without human immunodeficiency virus infection. The New England Journal of Medecine 337(5): 307-314. Shadick NA, Phillips CB, Logigian EL, Steere AC, Kaplan RF, Berardi VP, Duray PH, Larson MG, Wright EA, Ginsburg KS, Katz JN, Liang MH. 1994 The long-term clinical outcomes of Lyme disease. A population-based retrospective cohort study. Annals of Internal Medecine 121(8): 560-567. Singh AE, Romanowski B. 1999. Reviews. Syphilis: Review with emphasis on clinical epidemiologic and some biologic features. Clinical Microbiology Reviews 12(2): 187-209. Singh SK, Girschick HJ. 2004. Lyme borreliosis: from infection to autoimmunity. Clinical Microbiology and Infection 10(7): 598-614. Smith RP, Schoen RT, Rahn DW, Sikand VK, Nowakowski J, Parenti DL, Holman MS, Persing DH, Steere AC. 2002. Annals of Internal Medecine 136: 421-428. Speelman P, de Jongh BM, Wittenberg J, Bakker JPJ, Blaauw AAM, Dam AP van, Dubbelboer JS, Jaspars EH, Kuiper H, Kullberg BJ, Lennep-Sanders ARJ van, Lombarts MJMH, Nohlmans-Paulssen MKE, Nijman FC, Schellekens JFP, Steenbergen JFP van, Stinis HPJ, Tazelaar DJ, Touw DJ, Westerhof PW, Wolfs ThFW. Werkgroep Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg (CBO). Richtlijn Lyme-borreliose 2004. Speelman P. 2007. Antwoord op: “Is het zinvol om bij een tekenbeet preventief eenmalig doxycycline 200 mg oraal te geven om besmetting met Borrelia burgdorferi te voorkomen?” Nederlandstijdschrift voor Geneeskunde 151(34): 1901. Stanek G, Strle F, Gray J, Wormser GP. 2002. History and Chararteristics of Lyme-borreliosis. (pp.3-11, 1617) in Lyme Borreliosis: Biology, Epidemiology and Control. Edited by Gray JS, Kahl O, Lane RS, Stanek G. Wallingford, United Kingdom: CABI Publishing. Steere AC, Hutchinson GJ, Rahn DW, Sigal LH, Craft JE, DeSanna ET, Malawista SE. 1983. Treatment of the early manifestations of Lyme disease. Annals of Internal Medecine 99(1): 22-26. Steere AC, Malawista SE, Bartenhagen NH, Spieler PN, Newman JH, Rahn DW, Hutchinson GJ, Green J, Snydman DR, Taylor E. 1984. The clinical spectrum and treatment of Lyme disease. The Yale Journal of Biology and Medicine 57: 453-461. Steere AC, Green J, Schoen RT, Taylor E, Hutchinson GJ, Rahn DW, Malawista SE. 1985. Successful parenteral penicillin therapy of established Lyme artritis. The New England Journal of Medicine 312: 869874. Steere AC. 1994. Lyme disease: a growing threat to urban populations. Proceedings National Academic of Science 91(7): 2378-2383. Steere AC, Levin RE, Molloy PJ, Kalish RA, Abraham JH, Liu NY, Schmid CH. 1994. Treatment of Lyme arthritis. Arthritis and Rheumatism 37(6): 878-888 Steere AC. 2001. Lyme disease. The New England Journal of Medecine 321: 586-596. Steere AC, Coburn J, Glickstein L. 2004.The emergence of Lyme disease. Journal of Clinical Investigation 113: 1093-1101. Steere AC, Angelis S. 2006. Therapy for Lyme arthritis: strategies for the treatment of antibiotic-refractory arthritis Arthritis Rheumatology 54: 3079-3085. Steere AC. 2006. Lyme borreliosis in 2005, 30 years after initial observations in Lyme Connecticut. Wiener Klinischer Wochenschrift 118(21-22): 625-633. Straubinger RK, Summers BA, Chang Y-F, Appel MIG. 1997. Persistence of Borrelia burgdorferi in experimentally infected dogs after antibiotic treatment. Journal of Clinical Microbiology 35(1): 111-116. Stricker RB. (2007). Cointerpoint: Long-term antibiotic therapy improves persistent symptoms associated with Lyme disease. Clinical Infectious Diseases 45(2): 149-157. Strle F, Preac-Mursic V, Cimperman J, Ruzic E, Maraspin V, Jereb M. 1993. Azithromycin versus doxycycline for treatment of erythema migrans: clinical and micrbiological findings. Infection 21 (2): 83-88.

119 -

Strle L, Maraspin V, Lotric-Furlan E, Ruzic-Sabljic E, Cimperman J. 1996. Azithromycin and doxycycline for treatment of Borrelia culture-positive erythema migrans. Infection 24(1): 64-68. Strle F, Maraspin V, Pleterski-Rigler D, Lotric-Furlan S, Ruzic-Sabljic E, Jurca T, Cimperman J. 1996. Treatment of Borrelial Lymphocytoma. Infection 24(1): 82-86. Stryer L. (4-th ed.) (1995). Biochemistry.(pp. 46-47,61-62, 132-135). New York: Freeman W.H. and Company. Tijsse –Klasen E, Jacobs JJ, Swart A, Fonville M, Reimerink JH, Brandenburg, AH, Giessen JWB van der, Hofhuis A, Sprong H. 2011. Small risk of developing symptomatic tick-borne diseases following a tick bite in the Netherlands. Parasites and Vectors 4:17. Vanderhoof - Forschner K. (2003). Everything you need to know about Lyme Disease and other tick-born disorders. (pp. 8-9). Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Incorperated. Weber K, Preac-Mursic V, Neubert U, Thurmayr R, Herzer P, Wilske B, Schierz G, Marget W. 1988. Antibiotic Therapy of early European Lyme borreliosis and acrodermatitis chronica atrophicans. Annals of the New York Academy of Sciences 539: 324-345. Weber K, Preac-Mursic V, Wilseke B, Thurmayr R, Neubert U, Scherwitz C. 1990. Arandomized trial of ceftriaxone versus oral penicillin for the treatment of early European Lyme borreliosis. Infection 18(2): 9196. Weber K, Wilske B, Preac-Mursic-V, Thurmayer R. 1993. Azithromycin versus penicillin V for the treatment of early Lyme borreliosis. Infection 21(6): 367-372. Whitaker JA. 2004. Q-RIBb a new quantitative rapid test for diagnosing Lyme disease. Allergy Research Group, Focus, January 2004: 7, 12-13. Williams HI, Klausner JD, Whittington WLH, Hansfield HH, Celum C, Holmes KK. 1999. Elimination and reintroduction of primary and secondary syphilis. American Journal of Public Health 89(7): 1093-1096. Wormser GP, Ramanathan R, Nowakowski J, McKenna D, Holmgren D, Visintainer P, Dornbush R, Singh B, Nadelman RB. 2003. Duration of antibiotic therapy for early Lyme Disease. Annals of Internal Medecine 138(9): 697-704. Yang X, Nguyen A, Qiu D, Luft BJ. 2009. In vitro activity of tigecycline against multiple strains of Borrelia burgdorferi. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 63: 709-712. Zhanel GG, Homenuik K, Nichol K, Noreddin A, Vercaigne L, Embil J, Gin A, Karlowsky JA, Hoban DJ. 2004. The glycylcyclines: a comparative review with the tetracyclines. Drugs 64(1): 63-88. Ziska MH, Donta ST, Demarest FC. (1996). Physician preferences in the diagnosis and treatment of Lyme disease in the United States. Infection 24(2): 182-186. OVERIGE INFORMATIEBRONNEN laatste raadplegingsdatum per website

-

-

-

-

Bibliotheek Open Universiteit. Geraadpleegd in mei 2011 op http://www.ou.nl/ub Bolderdijk R. Borreliose.nl. Geraadpleegd in november 2010 op http://www.borreliose.nl Cameron D. (2010). The International Lyme and Associated Diseases Society. Update on the ILADS Lyme Guidelines. Geraadpleegd 30 maart 2011op http://www.ilads.org/news/Educational/69.html CBO, Kwaliteitsinstituuut voor de Gezondheidszorg, CBO. Richtlijn Lyme-Borreliose. Geraadpleegd in april 2011 op http://www.cbo.nl/thema/Richtlijnen/Overzicht-richtlijnen/ College voor Zorgverzekeringen (2007). Farmacotherapeutisch Kompas. Geraadpleegd 14 april 2007 op http://www.fk.cvz.nl Google. Lyme borreliosis. Geraadpleegd in mei 2011 op http://www.google.com Infectious Diseases Society of America. The treatment guidelines. Geraadpleegd in april 2011 op http://www.idsociety.org Hofhuis A, Giessen JW van der, Borgsteede FH, Wielinga PR, Notermans DW, Pelt W van. (2006). Lyme borreliosis in the Netherlands: strong increase in GP consultations and hospital admissions in past 10 years. Eurosurveillance. Geraadpleegd 18 januari 2007 op http://www.eurosurveillance.org/ew/2006/060622.asp International Lyme And Associated Diseases Society, ILADS. The treatment guidelines. Geraadpleegd in april 2011 op http://www.ilads.org. Pro Health Medical. Centraal Laboratorium voor Immunologische / Microbiologische Geneeskunde.Geraadpleegd in november 2010 op http://www.prohealth.nl PubMed. Anatomy and chemistry and spirochetes. geraadpleegd 27 mei 2011 op http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu. Lymeborreliose. Geraadpleegd 25 februari 2011 op http://www.rivm.nl/cib/infectieziekten-A-Z/infectieziekten/lymeborreliose/index.jsp?in Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu. Syfilis. Geraadpleegd 25 februari 2011 op http://www.rivm.nl/cib/infectieziekten-A-Z/infectieziekten/Syfilis/index.jsp?include=i Stiphout WAHJ van, Siemons GHA.(2010). ZonMw, Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie. Project detail Lyme-borreliose. Geraadpleegd 17 augustus 2010 op http://www.zonmw.nl/nl/system/zoekresultaten/delfi/projecten-database/project-detail/

120 -

TS Products. Geraadpleegd in januari 2010 op http://www.tsproducts.nl Wikipedia. Gerbils. Geraadpleegd 11 oktober 2010 op http://nl.wikipedia.org/wiki/Gerbils

Foto titelblad: Scanning- elektronenmicroscopie toont cysten gebonden aan een spirocheet B. burgdorferi s.l.na 48 uur incubatie met penicilline-G in modified Kelly-Pettenkofer (MKP) medium bij 33ºC (Preac-Mursic et al., 1996b).

----------------