MODUL PENGAYAAN MATERI PROYEK PENDAMPINGAN SMA
BIOTEKNOLOGI: Teknologi DNA Rekombinan dan Aplikasinya
Oleh: Ixora Sartika Mercuriani, M.Si
[email protected]
Jurusan Pendidikan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Yogyakarta 2008 BIOTEKNOLOGI
1
BIOTEKNOLOGI: Teknologi DNA Rekombinan Dan Aplikasinya
Kompetensi Dasar 1. Memahami struktur dan fungsi DNA 2. Memahami prinsip dasar rekayasa genetika/DNA 3. Memahami prinsip dasar perakitan tanaman transgenik 4. Memahami prinsip dasar dan manfaat PCR (Polymerase Chain Reaction)
A. Asam Nukleat Asam nukleat merupakan polimer yang tersusun atas unit-unit nukleotida (gambar 1). Terdapat 2 macam asam nukleat yaitu: DNA dan RNA.
Basa Ikatan Glikosida
Nukleosida Nukleotida monofosfat Nukleotida difosfat Nukleotida trifosfat
Gambar 1. Nukleotida. Nukleotida yang menyusun RNA mengandung gula ribosa, sedangkan nukleotida yang menyusun DNA mengandung gula deoksiribosa
B. DNA 1. Struktur DNA DNA (deoxiribonucleic acid = asam deoksiribonukleat) merupakan suatu asam nukleat
yang mengandung instruksi/informasi genetik
yang spesifik untuk
perkembangan biologis seluruh mahluk hidup dan beberapa virus (Anonim, 2006). Molekul DNA merupakan polimer yang terdiri dari unit-unit deoksiribonukleotida
BIOTEKNOLOGI
2
(gambar 2). Suatu molekul deoksiribonukleotida tersusun atas suatu basa nitrogen, suatu
gula,
dan
BIOTEKNOLOGI
kelompok
fosfat
(Lehninger,
1982
dan
Stryer,
1988).
3
Gambar 2. Deoksiribonukleotida Bagian dari molekul DNA yang membawa informasi genetik adalah basa nitrogennya, sementara gula dan phosphat berperan dalam membentuk struktur (tulang punggung) DNA. Basa nitrogen merupakan turunan dari purin dan pirimidin (gambar 3). Purin dalam DNA adalah adenin (A) dan guanin (G), sedangkan pirimidinnya adalah timin (T) dan sitosin (C). Gula di dalam deoksiribonukleotida adalah deoksiribosa. Kata deoksi menunjukkan bahwa gula (ribosa) tersebut kehilangan satu atom oksigen. Dalam suatu molekul deoksiribonukleotida, atom karbon nomer1 (C-1) dari deoksiribosa berikatan dengan atom N nomer 1 (N-1) dari pirimidin atau N nomer 9 (N-9) dari purin; sedangkan fosfat terikat/teresterifikasi pada atom karbon nomer 5 (C-5) dari gula. Nukleotida-nukleotida yang menyusun DNA terikat satu dengan yang lain melalui suatu jembatan fosfat (ikatan fosfodiester) (Gambar 4a). Pada suatu reaksi pemanjangan rantai DNA, nukleotida yang baru terikat pada atom karbon nomer 3 (C3) dari deoksiribosa. Purin
Adenin
Sitosin
Pirimidin
Urasil
Guanin
Timin
Gambar 3. Basa Nitrogen: Purin dan Pirimidin BIOTEKNOLOGI
4
Pada tahun 1940an Erwin Chargaff dan teman-teman menemukan bahwa dalam suatu molekul DNA, jumlah basa A selalu sama dengan jumlah basa T; demikian juga jumlah basa G selalu sama dengan jumlah basa C. Penemuan itu kemudian digunakan sebagai dasar dalam penentuan aturan pasangan basa dimana A berpasangan dengan T, sedangkan G berpasangan dengan C. Aturan tersebut kemudian disebut dengan aturan Chargaff. Adanya fenomena Chargaff ini mendorong Watson dan Crick (1953) menyimpulkan bahwa satu molekul DNA tersusun oleh dua utasan polinukleotida, dan antara kedua utasan terjadi perpasangan basa. Perpasangan basa ini terjadi berkat terbentuknya ikatan hidrogen antara basa yang berpasangan tersebut, dua ikatan untuk A-T dan tiga ikatan untuk G-C (Gambar 4b). 5’
3’
Phosphodiester bond
3’
a
5’
b
Gambar 4. Polinukleotida. (a) Rantai tunggal: dalam suatu rantai polinukleotida yang menyusun DNA, nukleotida yang satu berikatan dengan nukleotida yang lain melalui suatu ikatan phosphodiester. (b) Rantai ganda: dalam struktur “double helix”, kedua rantai polinukleotida berpasangan secara antiparalel.
BIOTEKNOLOGI
5
Suatu rantai DNA diawali dari ujung 5’P diakhiri pada ujung 3’OH. Ujung phosphate disebut ujung 5’P karena phospat terikat pada atom C nomer 5 dari gula ribose, sedangakan ujung OH disebut ujung 3’OH karena OH tersebut terikat pada atom C nomer 3 dari gula ribosa. Penemuan lain yang membawa kepada kesimpulan tentang struktur DNA ialah hasil studi kristalografi DNA yang dilakukan oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins (1953). Dari foto kristalografi DNA ditemukan celah sebesar 0,34 nm dan selanjutnya terdapat struktur yang berulang setiap 3,4 nm (gambar 5).
Gambar 5 . Hasil difraksi sinar -X DNA
Pada tahun 1953, seorang ahli genetika asal Amerika (James Watson) dan ahli fisika asal Inggris (Francis Crick) mendeskripsikan struktur tiga dimensi DNA dengan menghitung perpaduan data hasil difraksi sinar-X dan karakteristik perpasangan basa dalam DNA. Dari hasil tersebut, mereka menyimpulkan bahwa DNA tersusun atas dua rantai heliks yang berpilin mengelilingi aksis yang sama membentuk rantai heliks ganda (double helix) (Gambar 6). Dalam heliks tersebut, kedua rantai bersifat antiparalel (nukleotida-nukleotida yang menyusun kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan).
BIOTEKNOLOGI
6
Tulang punggung Gula fosfat
3,4 nm Pasangan basa
0,34 nm
2,0 nm
Gambar 6. Struktur heliks ganda DNA
2. Fungsi DNA 2.1. Sebagai Komponen Utama Penyusun Kromosom DNA merupakan molekul utama penyusun kromosom. Kromosom terbentuk karena adanya asosiasi DNA dengan protein. Pada umumnya sel-sel bakteri mempunyai satu kromosom yang disusun oleh satu molekul DNA berbentuk sirkuler. Namun, pada akhir tahun delapanpuluhan telah ditemukan adanya sel bakteri yang mempunyai dua kromosom dan adanya bakteri yang mempunyai kromosom linier. Tidak semua DNA yang dimiliki bakteri terdapat dalam kromosom. Bakteri juga mempunyai DNA ekstrakromosom yang disebut dengan plasmid. Molekul DNA harus berukuran sangat panjang untuk dapat mengkode sejumlah besar protein sekalipun pada sel-sel sederhana (prokaryot). DNA bakteri mempunyai ukuran sekitar 1000 kali dari panjang selnya. Sebagai contoh, bakteri Eschericia coli (E. coli) yang panjang selnya sekitar 1 sampai 2 µm, mempunyai kromosom berukuran sekitar 1360 µm. Di dalam sel, DNA yang berukuran panjang tersebut dilipat dengan bantuan protein tertentu. Pada sel bakteri, DNA dilipat dengan bantuan suatu kompleks RNA dan protein yang mirip histon (protein yang berperan dalam pelipatan DNA eukariot) (Gambar 7). Dalam inti eukariot terdapat sejumlah kromosom yang berukuran sangat besar. Kromosom yang tampak saat pembelahan sel merupakan gulungan atau kondensasi BIOTEKNOLOGI
7
serat halus yang disebut kromatin. Kromatin merupakan asosiasi satu molekul DNA yang berukuran sangat panjang dengan protein (gambar 7). Ada dua jenis protein pada kromosom yaitu protein histon dan nirhiston. Histon merupakan protein yang terdiri dari lima subunit (H1, H2A, H2B, H3, dan H4). Subunit-subunit tersebut kaya akan asam amino yang bermuatan positif atau bersifat basa seperti lisin dan arginin. Protein nirhiston merupakan protein kedua yang ada pada kromosom. Salah satu dari protein nirhiston adalah protein matriks pengikat pelipatan kromatin. Histon ini akan berasosiasi dengan DNA melalui interaksi antara protein yang bermuatan positif dengan DNA yang bermuatan negatif. Asosiasi antara satu histon dan satu segmen DNA disebut nukleosom (gambar 7). Pembentukan nukleosom merupakan tahap awal pengemasan DNA ke dalam bentuk yang kompak. Antara satu nukleosom dengan nukleosom yang lain dihubungkan oleh DNA penghubung. Rangkaian nukleosom akan berpilin karena adanya ikatan ion antara subunit H1 yang terdapat pada butiran nukleosom, sehingga nukleosom-nukleosom tersebut akan menempel membantuk suatu silinder dengan H1 berada di bagian tengah. Silinder ini disebut solenoid. Solenoid kemudian dilipat membentuk banyak simpul yang pangkalnya diikat oleh protein matriks nirhiston. Pelipatan dan kondensasi kromosom terjadi lebih lanjut sehingga membentuk kromosom yang kompak.
Gambar 7. Pelipatan DNA eukaryot membentuk kromosom
BIOTEKNOLOGI
8
2.2. Sebagai Cetakan dalam Sintesis Protein DNA menyimpan informasi genetik yang dibutuhkan untuk mengendalikan seluruh proses metabolisme yang terjadi di dalam sel bahkan dalam tubuh suatu individu/mahluk hidup. Pengendalian tersebut dilakukan dengan cara mensintesis enzim-enzim (protein) yang berperan sebagai katalisator reaksi-reaksi biokimia sel berdasarkan kode genetik yang tersimpan dalam bentuk gen. Gen merupakan bagian dari DNA (terdapat sebagai lokus-lokus) yang berfungsi untuk mengontrol perkembangan fisik maupun perilaku dari setiap mahluk hidup (Gambar 8). Gen digunakan sebagai model atau ruas penyandi dalam pembentukan protein. Proses penterjemahan sekuen DNA yang terdapat dalam gen menjadi protein disebut sebagai ekspresi gen (Jusuf, 2001:198-199). Ekspresi gen berlangsung melalui dua tahapan utama, yaitu: transkripsi DNA membentuk mRNA (massenger RNA) dan translasi (penterjemahan mRNA membentuk protein). Pada sel eukaryota, setelah transkripsi diikuti proses pasca transkripsi yang meliputi: pembuangan intron dan penambahan polyA pada rantai RNA yang terbentuk. DNA Chromosome
Gambar 8. Ilustrasi posisi gen dalam rantai DNA.
C. PRINSIP DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Dalam
bioteknologi
modern
selalu
melibatkan
suatu
teknik
untuk
memindahkan gen dari suatu organisme ke organisme lain dengan tujuan tertentu. Teknik ini disebut rekayasa genetika/DNA, manipulasi genetika/DNA, atau rekombinasi genetika/DNA. Pada awalnya, rekayasa genetika dimanfaatkan dalam studi genetika (mempelajari struktur dan fungsi/mekanisme kerja gen). Namun, dalam
BIOTEKNOLOGI
9
perkembangannya, rekayasa genetika bertujuan untuk memecahkan berbagai masalah biologi; misalnya: terapi gen, perakitan tanaman unggul, perbaikan gizi masyarakat. Selain itu, tahapan kerja dalam rekayasa genetika seperti pemotongan DNA dan amplifikasi DNA (PCR) dapat digunakan untuk memecahkan masalah-masalah kejahatan melalui sidik jari DNA dan diagnosis penyakit. Dalam rekayasa genetika (Gambar 13) pada umumnya selalu melibatkan serangkaian proses berikut ini: 1. Isolasi DNA dari sel 2. Pemotongan DNA (baik gen yang akan disisipkan maupun DNA dari organisme yang akan disisipi) 3. Penyambungan/penggabungan kedua jenis DNA tersebut membentuk DNA rekombinan 4. Introduksi DNA rekombinan ke dalam sel 5. Seleksi sel rekombinan Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan terhadap DNA yang membawa gen yang akan disisipkan (gen target) dan DNA yang akan digunakan sebagai pembawa (vektor). DNA yang umum digunakan sebagai vektor adalah plasmid (DNA ekstrakromosomal dari bakteri), cosmid (DNA fage yang membentuk plasmid), dan DNA fage. Salah satu plasmid yang biasa digunakan sebagai vektor rekombinan adalah pUC18/19 (gambar 9).
Gambar 9. Peta plasmid pUC18/19 (salah satu contoh plasmid (DNA vektor) dalam konstruksi DNA rekombinan
BIOTEKNOLOGI
10
Pada umumnya, vektor rekombinan harus mempunyai situs pengenalan enzim restriksi yang spesifik sehingga DNA tersebut dapat dipotong dan disisipi dengan DNA target. Situs enzim restriksi tersebut memotong suatu gen yang berfungsi sebagai penanda seleksi (selectable marker), misalnya: gen penyandi ketahanan terhadap ampisilin. Pada beberapa vektor, beberapa situs enzim restriksi yang digunakan untuk penyisipan DNA target terkumpul dalam suatu wilayah yang disebut MCS (Multiple Cloning Site) atau polylinker (Gambar 10)
Gambar 10. MCS dari plasmid pUC18
Pemotongan DNA Pemotongan dan penyambungan molekul DNA dilakukan secara enzimatis. Pemotongan pita DNA dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi yang bekerja sangat spesifik, mengenali situs tertentu dalam rantai DNA (misalnya: EcoRI mengenali dan memotong situs GAATTC) dan menghasilkan pola tertentu (Gambar 11 dan 12). Berikut ini merupakan contoh enzim restriksi yang lain beserta situs pemotongannya:
Gambar 11. Situs enzim restriksi. AluI dan HaeIII merupakan contoh enzim restriksi yang menghasilkan pola pemotongan tumpul (blunt end) karena enzim memotong tetpat di bagian tengah dari kedua rantai DNA. BamHI, HindIII, dan EcoRI merupakan enzim yang menghasilkan pola pemotongan runcing (sticky end).
BIOTEKNOLOGI
11
Gambar 12. Hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi EcoRI.
Penyambungan DNA Penyambungan pita DNA dilakukan menggunakan enzim ligase, yaitu enzim yang berperan dalam membentuk ikatan fosfodiester kembali antara dua molekul DNA pasca pemotongan. Enzim ligase yang umum digunakan adalah T4 DNA ligase.
Introduksi DNA ke dalam sel Introduksi DNA ke dalam sel (bakteri, jamur, hewan dan tumbuhan) sering disebut transformasi, sedangkan introduksi DNA fage λ ke dalam sel bakteri sering disebut transduksi atau transfeksi. Langkah pertama yang perlu disiapkan adalah sebagai berikut:
Transformasi bakteri a. Proses introduksi DNA ke dalam sel bakteri dengan perlakuan renjatan panas 1. Kultur sel bakteri dipisahkan dari mediumnya kemudian ditambahkan kationkation divalent 2. DNA yang akan diintroduksikan dimasukkan ke dalam kultur tersebut 3. Diberi perlakuan renjatan panas/’heat shock’, agar pori-pori sel bakteri membuka dan DNA dapat masuk ke dalam sel. 4. Penambahan medium pertumbuhan bakteri yang kaya nutrisi, untuk pemulihan bakteri (recovery) pasca transformasi.
BIOTEKNOLOGI
12
b. Seleksi bakteri rekombinan (bakteri yang membawa DNA rekombinan) DNA vektor yang digunakan dalam rekayasa genetika sudah membawa gen penanda seleksi, yaitu gen yang dengan tehnik tertentu bisa menunjukkan sel-sel yang berhasil direkombinasi dan yang tidak berhasil direkombinasi. Pada umumnya, gen yang digunakan sebagai penanda seleksi adalah gen-gen ketahanan terhadap antibiotika. Dengan demikian apabila bakteri yang sudah direkombinasi tersebut ditumbuhkan dalam media yang mengandung antibiotika maka bakteri yang membawa gen rekombinan akan hidup sedang bakteri yang tidak membawa gen rekombinan akan mati.
Gambar 13 . Ilustrasi proses penyisipan gen A dari lalat ke dalam sel bakteri.
Introduksi DNA rekombinan pada sel tumbuhan Pada perakitan tanaman transgenik, DNA rekombinan diintroduksikan ke dalam sel tumbuhan. Introduksi DNA rekombinan tersebut dapat dilakukan dengan 2
BIOTEKNOLOGI
13
metoda, yaitu: metoda Gene Gun (senjata gen) (Gambar 14) dan Agrobacterium (Gambar 14). Sebelum proses introduksi dilakukan tentu perlu dipersiapkan sel tumbuhan yang akan diintroduksi melalui kultur jaringan atau kultur sel. a. Metoda gen gun: 1. Isolasi gen target 2. Penempelan gen target pada partikel logam (microprojectile particles) 3. Partikel logam yang sudah ditempeli gen target dimasukkan ke dalam senjata gen (Gene Gun) dan kemudian ditembakkan pada sel tanaman. Partikel akan mempeneetrasi dinding sel tanaman sehingga masuk ke dalam sitoplasma. Partikel akan tercuci oleh cairan sel sehingga gen target yang menempel akan lepas dan kemudian masuk ke dalam nukleus dan menyisip pada kromosom sel tanaman. Setelah gen target berhasil disisipkan pada kromosom sel tanaman maka sel rekombinan harus diinduksi untuk menjadi individu baru (tanaman transgenik) dengan proses: 1. Sel
transgenik
ditumbuhkan
pada
media
multiplikasi
untuk
diperbanyak (pembentukan kalus). 2. Kultur sel/kalus kemudian
dipindahkan/ ditumbuhkan pada media
diferensiasi agar mampu
berdiferensiasi sehingga
membentuk
individu baru (plantlets) 3. Terakhir, plantlet dipindahkan ke
tanah/lahan (aklimatisasi) agar
tumbuh selayaknya tanaman normal (tanaman transgenik).
1
2
3
Gambar 14. Alat yang digunakan dalam metoda gen gun. (1) Pengatur gas helium, (2) wadah untuk DNA rekombinan, (3) wadah untuk kultur jaringan/sel. Pada waktu proses dijalankan, gas helium yang mengalir akan mendorong DNA menembak Kultur jaringan/sel.
BIOTEKNOLOGI
14
b. Metoda Agrobacterium Metoda ini memanfaatkan potensi alami yang dimiliki bakteri tanah Agrobacterium tumefaciens yang memiliki karakter sebagai berikut: bakteri gram negatif secara alamiah memiliki kemampuan untuk melakukan
transformasi
genetik pada tanaman memiliki plasmid Ti (tumor inducing plasmid), yang membawa: - T-DNA, yang mengandung gen-gen: iaaM/tms1, iaaH/tms2, tmr/ipt,opine, right border, left border - gen vir (virulensi) - katabolisme opine “Meskipun plasmid Ti efektif untuk dijadikan vektor alami dalam rekayasa genetika tetapi plasmid tersebut memiliki beberapa kelemahan”
Manipulasi plasmid Ti sebagai vektor kloning dalam rekayasa genetika: Produksi phytohormon (auksin dan sitokinin) pada sel transforman mengakibatkan sel terus membelah (regenerasi sel tidak mengarah pada diferensiasi menjadi individu baru/ tanaman utuh), sehingga gen-gen auksin dan sitokinin harus dihilangkan. Gen pengkode sintesis opine tidak berguna bagi tanaman transgenic dan mungkin justru akan menurunkan produktivitas tanaman transgenic sehingga gen ini perlu dihilangkan. Sebagai vektor kloning, sebaiknya plasmid dalam ukuran yang tidak terlalu besar sehingga gen-gen lain dalam plasmid Ti yang tidak penting harus dihilangkan Replikasi plasmid akan lebih mudah bila dilakukan dalam sel bakteri E.coli sehingga perlu ditambahkan ori dari E. coli Vektor kloning plasmid Ti secara umum memiliki komponen: Gen penanda seleksi (selectable marker gene): gen-gen resistensi thd antibiotik (kanamycinr, ampisilinr, tetracyclinr), gen gus, dll Ori E. coli Sekuen ‘right border’ dari T-DNA: penting untuk integrasi T-DNA pada DNA sel tanaman Multiple Cloning Site (MCS) untuk memfasilitasi insersi DNA target pada TDNA
BIOTEKNOLOGI
15
Proses Introduksi DNA dengan Agrobacterium: 1. Ke dalam kultur jaringan dimasukkan karborundrum, suatu bahan untuk menginduksi luka pada kultur jaringan tumbuhan. Dengan adanya luka maka sel akan memproduksi acetocyringone yang dapat mengundang agrobacterium ke daerah disekitar/permukaan sel. 2. Kultur bakteri yang sudah dimodifikasi dimasukkan ke dalam medium kultur jaringan. Diinkubasi selam ± 1 jam.
Proses seleksi sel rekombinan: Seleksi sel rekombinan dilakukan dengan menumbuhkan sel/jaringan pada medium yang mengandung antibiotika. Sel yang membawa DNA rekombinan akan bertahan hidup dan tumbuh (membentuk kalus) sedangkan sel yang tidak mengandung DNA rekombinan akan mati. Proses rekombinasi DNA tanaman dengan menggunakan Agrobacterium adalah sebagai berikut:
Gambar . Ilustrasi proses introduksi DNA pada sel tumbuhan
Gambar
BIOTEKNOLOGI
15. Ilustrasi proses perakitan tanaman transgenik dengan metoda Agrobacterium. Atas, potensi alami A. tumefaciens mentransfer gen. Bawah, perakitan tanaman transgenik
16
D. PCR (Polymerase Chain Reaction) Salah satu tehnologi DNA yang berkembang, baik tehnik maupun aplikasinya, saat ini adalah PCR. PCR merupakan suatu proses amplifikasi DNA dengan menggunakan sekuen DNA tertentu sebagai cetakan (template). Reaksi tersebut melibatkan suatu proses yang mirip dengan replikasi DNA tetapi terjadi secara in vitro yang dilakukan berulang-ulang (beberapa siklus). Hasil akhir PCR adalah sejumlah besar sekuen DNA yang sama dengan template. Komponen-komponen yang dibutuhkan dalam PCR adalah: 1. Primer 2. DNA template 3. Enzim DNA polymerase 4. dNTP mix: dATP, dTTP, dGTP, dCTP 5. Buffer Primer Primer merupakan sekuen DNA pendek (oligo nukleotida) yang dibutuhkan untuk mengawali PCR. Sekuen DNA dalam primer harus komplemen/dapat berpasangan dengan sekuen awal DNA template. Primer dapat dibeli atau disintesis sendiri. DNA template DNA template merupakan molekul DNA cetakan yang akan diperbanyak dengan PCR. DNA tersebut dapat berupa potongan DNA, plasmid, cosmid, atau DNA total. Tergantung dari Kit PCR yang digunakan, sumber DNA dapat berupa DNA terisolasi ataupun DNA yang masih di dalam sel. Enzim DNA polymerase Enzim DNA polymerase merupakan enzim yang secara alamiah berperan dalam polimerasi rantai DNA (dalam replikasi). Enzim DNA polymerase yang digunakan dalam PCR umumnya merupakan enzim yang tahan panas, karena salah satu proses dalam PCR adalah denaturasi yang dilakukan pada suhu ± 95 oC. Enzim Taq polymerase merupakan enzim yang umum digunakan dalam PCR. Enzim tersebut diisolasi dari bakteri thermofilik yaitu Thermus aquaticus.
BIOTEKNOLOGI
17
dNTP mix dNTP mix merupakan campuran nukleotida yang merupakan bahan baku dalam sintesis rantai DNA. dNTP mix terdiri atas dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. Buffer Buffer merupakan suatu larutan yang berisi garam-garam mineral yang dibutuhkan untuk optimalisasi kerja enzim.
Dalam PCR, seluruh komponen yang dibutuhkan dicampur dalam suatu tabung kemudian dimasukkan dalam mesin PCR (thermocycler) (gambar
16). PCR
melibatkan beberapa tahapan proses, yaitu: denaturasi, annealing, dan polimerasi (gambar
). Denaturasi merupakan suatu proses pemisahan rantai ganda DNA
sehingga DNA menjadi berantai tunggal. Denaturasi dilakukan dengan mengatur suhu reaksi pada kisaran 94-98 oC. Tahap berikutnya adalah annealing yang merupakan suatu proses penempelan primer pada rantai tunggal DNA template. Proses ini dilakukan pada suhu tertentu tergantung pada jenis primernya, pada umumnya berkisar antara 50-65 oC. Penempelan primer kemudian diikuti oleh proses/reaksi pemanjangan rantai DNA (elongasi/polimerisasi) sehingga dihasilkan molekul DNA rangkap yang mempunyai urutan basa seperti DNA template. Proses PCR biasanya dilakukan berulang-ulang (dalam beberapa siklus)
PCR mempunyai beberapa manfaat, diantaranya adalah: 1. Penentuan sidik jari DNA (DNA Fingerprinting) 2. Deteksi berbagai penyakit 3. Analisis DNA purba 4. Kloning Gen a
5. Pengurutan DNA b
Gambaranalisis 15. (a) Mesin (b) Metoda DNAPCR. fingerprint Proses PCR: denaturasi, annealing, dan elongasi/polimerisasi/ekstensi
BIOTEKNOLOGI
18
Analisis sidik jari DNA (DNA fingerprint) dapat digunakan untuk berbagai tujuan, seperti: analisis keturunan dan membantu menentukan pelaku tindak kejahatan. Analisis tersebut diawali dengan pengambilan sampel yang dapat berupa darah atau serpihan bagian tubuh terterntu (misalnya: rambut, jaringan kulit, sperma, kuku, dan lain-lain). DNA kemudian diisolasi dari sample tersebut dan digunakan sebagai template dalam proses PCR. Setelah semua komponen yang dibutuhkan untuk proses PCR disiapkan dalam suatu tabung, maka PCR dilakukan mengikuti prosedur umum dengan menggunakan mesin PCR. Dalam analisis keturunan maka primer yang digunakan biasanya multiple primer (banyak primer dalam suatu reaksi), sedangkan dalam deteksi penyakit primer yang digunakan biasanya hanya satu/satu pasang (yaitu primer spesifik terhadap DNA pathogen tertentu). Hasil PCR kemudian divisualisasikan dengan menggunakan elektroforesis. Berikut adalah salah satu contoh visualisasi hasil PCR:
Gambar 16. Hasil elektroforesis fragmen DNA yang dihasilkan dari PCR untuk analisis keterunan. (1) Ayah (2) Anak (3) Ibu. Anak mempunyai pola sidik jari yang mirip (gabungan) kedua orang tuanya sehingga pola tersebut menjadi unik/spesifik
BIOTEKNOLOGI
19
RANGKUMAN 1. DNA merupakan polimer yang tersusun atas unit-unit monomer, yaitu nukleotida. 2. DNA mempunyai struktur heliks ganda (doble helix) yang berpasangan secara antiparalel. 3. Perpasangan basa-basa antara dua rantai DNA sesuai dengan aturan Chargaff, dimana basa Adenin (A) berpasangan dengan Timin (T) sedangkan Guanin (G) berpasangan dengan Sitosin (C). 4. Prinsip dasar Teknologi DNA Rekombinan (TDR) selalu melibatkan proses: a.pemotongan DNA secara enzimatis menggunakan enzim restriksi (endonuklease) b.penggabungan DNA secara enzimatis menggunakan enzim ligase c.introduksi DNA rekombinan ke dalam sel target d.seleksi sel rekombinan e.regenerasi sel rekombinan 5. Introduksi DNA rekombinan ke dalam sel tanaman dapat dilakukan dengan beberapa metoda, diantaranya adalah: gene gun dan memanfaatkan potensi alami Agrobacterium tumefaciens. 6. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik di dalam TDR yang melibatkan reaksi mirip dengan proses replikasi DNA. PCR mempunyai aplikasi luas, misalnya: penentuan sidik jari DNA untuk pemecahan kasus criminal dan deteksi penyakit.
TES FORMATIF 1. Yang manakah dari tipe-tipe ikatan di bawah ini yang merupakan ikatan antara basa-basa yang berpasangan dalam suatu rantai heliks ganda DNA? a. ikatan fosfodiester b.ikatan elektrostatik c. ikatan hidrogen d ikatan disulfida e. ikatan hidrofobik 2. Bila diketahui komposisi basa dalam DNA Eschericia coli mengandung 12 % adenin, maka komposisi basa guanin dan sitosin (G + C) adalah ...... a. 24 % b. 48 % c. 50 % d. 64 % e. 76 %
BIOTEKNOLOGI
20
3. Di dalam sel, DNA dikemas sedemikian rupa sehingga menjadi sangat kompak. Proses pengemasan tersebut mlalui beberapa tahapan, dengan tahapan pertama adalah pembentukan nukleosom. Nukleosom dibentuk oleh DNA dan protein yang disebut dengan ... a. histon b. calmodulin c. kinase d. intron e. fosfolipase 4. Diketahui bahwa suatu mRNA memiliki urutan basa sebagai berikut 5’AACGGUAUGGAUAAACAA ...90 (basa)... GGGAGGCGGAGAUAAAAA3’ Dari keterangan di atas, hasil translasi dari mRNA tersebut adalah... a. rantai polipeptida dengan 28 asam amino b. rantai polipeptida dengan 30 asam amino c. rantai polipeptida dengan 38 asam amino d. rantai polipeptida dengan 40 asam amino e. rantai polipeptida dengan 42 asam amino 5. DNA dengan bentuk sirkular dan terdapat di luar DNA kromosom bakteri disebut ... a. Plasmid b. Plasmin c. Prion d. Transposon e. Viroid 6. Dalam TDR, fragmen DNA yang diinginkan dalam rangka perbanyakan gen atau produksi protein tertentu disebut … a. DNA inang b. DNA vektor c. DNA target d. DNA rekombinan e. DNA plasmid 7. Transformasi dalam TDR merupakan proses ... a. Rekombinasi DNA b. Insersi DNA c. Kultur bakteri rekombinan d. Introduksi DNA ke dalam sel bakteri e. Introduksi DNA asing ke dalam plasmid 8. Situs pengenalan/pemotongan enzim restriksi pada suatu rantai DNA bersifat ”palindrom” yang berarti... a. situs tersebut mampunyai urutan basa sejenis b. pola pemotongan enzim restriksi terhadap situs tersebut sangat spesifik BIOTEKNOLOGI
21
c. kedua rantai DNA pada situs tersebut mempunyai urutan basa yang sama bila dibaca dari arah yang sama (5’ →3’) d. hanya ada satu situs pengenalan enzim restriksi tertentu di sepanjang rantai DNA yang akan dipotong e. terdapat beberapa situs pengenalan enzim restriksi tertentu di sepanjang rantai DNA yang akan dipotong Untuk soal 4 – 8, perhatikan situs-situs enzim restriksi (ER) di bawah ini: EcoRI: 5’ G↓ A A T T C 3’ PstI : 5’ C T G C A↓G 3’ C T T A A↑G G↑A C G T C BamHI: 5’ G↓ G A T C C 3’ C C T A G↑G
Sau3AI : 5’ ↓ G A T C 3’ C T A G↑
HpaI : 5’ G T T ↓ A A C 3’ C A A ↑T T G
HaeIII : 5’ G G ↓ C C 3’ C C↑ G G
9. ER yang menghasilkan pola pemotongan ’blunt end’ adalah .. a. HpaI dan Hae III b. EcoRI, PstI, BamHI, dan Sau3AI c. EcoRI dan BamHI d. BamHI dan Sau3AI e. Sau3AI saja 10. ER yang menghasilkan pola pemotongan ’sticky end’ adalah .. a. HpaI dan Hae III b. EcoRI, PstI, BamHI, dan Sau3AI c. EcoRI dan BamHI d. BamHI dan Sau3AI e. Sau3AI saja 11. Pemotongan ER yang menghasilkan fragmen DNA 3’ overhang adalah .. a. EcoRI dan BamHI b. EcoRI, PstI, BamHI, dan Sau3AI c. PstI saja d. BamHI dan Sau3AI e. Sau3AI saja 12. Suatu rantai DNA yang mempunyai urutan basa sebagai berikut: 5’AGTAGCCGGATCCAAAGTGTCGGAATTCGATCCGATGGACGATCC 3’ 3’TCATCGGCCTGGGT TTCACAGCCTTAAGCTAGGCTACCTGCTAGG 5’ dapat dipotong dengan enzim restriksi ... a. HpaI dan Hae III b. EcoRI dan PstI c. PstI dan Sau3AI d. EcoRI, BamHI, dan Sau3AI e. Sau3AI saja
BIOTEKNOLOGI
22
13. Bila rantai DNA tersebut (soal no.7) dipotong dengan enzim restriksi Sau3AI maka jumlah fragmen DNA yang dihasilkan adalah ... a. 5 b. 4 c. 3 d2 e. 1 14. Enzim yang digunakan untuk membentuk ikatan fosfodiester antara ujung 5’P dari fragmen/potongan DNA yang satu dengan 3’OH dari fragmen DNA yang lain dalam konstruksi DNA rekombinan adalah ... a. enzim restriksi b. enzim ligase c. enzim endonuklease d. enzim eksonuklease e. enzim DNA polimerase 15. Salah satu contoh gen penanda seleksi yang sudah anda kenal adalah .. a. gen penyandi insulin b. gen penyandi Bt toksin c. gen penyandi resistensi terhadap antibiotik d. gen CryI e. gen virulensi
BIOTEKNOLOGI
23
KUNCI JAWABAN 1. c
5. a
9. a
13.b
2. e
6. c
10.b
14.b
3. a
7. d
11.c
15.c
4.d
8. c
12.d
UMPAN BALIK DAN TINDAK LANJUT Hitunglah jumlah skor jawaban anda yang benar, dan gunakan rumus di bawah ini untuk mengetahui tingkat penguasaan materi kegiatan belajar ini. Tingkat Penguasaan
=
Jumlah Skor Jawaban Benar 15
X
100%
Arti tingkat penguasaan yang anda capai: 90 – 100%
= Baik Sekali
80 – 89%
= Baik
70 – 79%
= Sedang
… ≤ 69
= Kurang
Jika tingkat penguasaan anda mencapai 80% ke atas, anda dapat meneruskan dengan kegiatasn belajar selanjutnya. Akan tetapi jika tingkat penguasaan masih di bawah 80%, anda harus mengulangi kegiatan belajar, terutama pada bagian yang anda naggap belum dikuasai.
Daftar Pustaka: Jusuf M, 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta: Agung Seto. Wolfe SL, 1993. Molecular and Cellular Biology. California: Wadsworth Inc. Lehninger AL, 1982. Principle of Biochemistry. New York: Worth Publishers Inc.
BIOTEKNOLOGI
24
