BAKTERI RESISTEN MERKURI ENDOGENIK HILIR KALIMAS SURABAYA 1
2
2
Enny ZULAIKA* Atik WIDIYANTI , dan Maya SHOVITRI 1
Mahasiswa S3 Program Studi MIPA, Universitas Airlangga, Surabaya * e-mail :
[email protected] 2 Program Studi Biologi, FMIPA ITS, Surabaya
Abstract The downstream area of The Kalimas, Surabaya is directly connected to the Tanjung Perak Harbor. It was contaminated by mercury of about 6.38 mg/L. Other side, it is well known that there is bacteria which is resistant to mercury as it reduces a toxic ion Hg2+ into a volatile and less toxic ion Hg0. In order to develop a mercury bioremediation agent, this study was aimed to isolate resistant mercury bacteria from water and sediments of the downstream Mas River, Surabaya. The used medium was 10 mg/L HgCl2 containing nutrient agar. Morphological, physiological and biochemical characters was observed based on The Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Thus this study was successfully isolated and characterized 24 mercury resistant bacteria isolates. They were mostly tended to fall into genera Bacillus, Azotobacter, Proteus, Staphylococcus, and Corynebacterium. They were also abviously observed as a metal resistant bacteria and a halotolerant bacteria, while they were able to grow in a 10 mg/L of Pb, Cd and Cu containing nutrient agar, as well as in a 50 ‰ saline nutrient agar. Keyword: the downstream area, the Kalimas, mercury resistant bacteria
1. PENDAHULUAN Merkuri adalah salah satu logam berat yang secara biologis fungsinya belum jelas tetapi dalam konsentrasi sangat rendah dapat beracun dan berbahaya, meskipun secara alamiah konsentrasi merkuri di perairan cukup rendah yaitu satu nanogram/L (Boening, 2000). Pencemaran merkuri pernah terjadi di kawasan teluk Minamata Jepang, dampak yang ditimbulkan adalah gangguan neurologis dan bayi yang lahir cacat, penyakit aneh tersebut kemudian dinamakan penyakit Minamata (Iswiari, 2008). Kalimas adalah salah satu bahan baku air minum kota Surabaya, pada tahun 2002 kadar merkurinya mencapai 0,099 mg/L hampir 100 kali dari kadar yang disyaratkan pemerintah PP. No.82/2001 2 yaitu 0,001 mg/L (Anonim , 2009), pada tahun 2009 kadar merkuri di sedimen Kalimas bagian tengah adalah 0,105 mg/L (Shovitri & Zulaika, 2010). Hilir Kalimas Surabaya lokasinya berdekatan dengan Pelabuhan Tanjung Perak yang merupakan salah satu pintu gerbang di Indonesia Timur. Di sekitar lokasi pelabuhan Tanjung Perak Surabaya terdapat industri galangan kapal seperti di Tambatan Nilam, PT. PAL Indonesia, PT. Dok dan Perkapalan Surabaya. Kondisi tersebut berpotensi meningkatkan polutan termasuk merkuri, bahkan pada tahun 2011 kadar tersebut meningkat pada saat dilakukan pengukuran di sedimen Kalimas bagian hilir yaitu 6,3 mg/L, fenomena tersebut sangat berbahaya dan perlu mendapat perhatian. Bakteri adalah mikroorganisme yang dapat hidup di berbagai macam habitat, di udara, air maupun tanah, baik di lingkungan normal atau ekstrim seperti tercemar merkuri. Bakteri yang dapat diisolasi dari lingkungan yang tercemar merkuri seringkali resisten terhadap merkuri (BRM), baik merkuri organik maupun anorganik (De & Ramaiah, 2007). Pada BRM mempunyai mekanisme enzimatis yang dapat 0 mengubah senyawa merkuri menjadi merkuri volatil (Hg ) supaya senyawa merkuri tersebut tidak meracuni tubuh bakteri tersebut (Madigan & Martinko, 2006). Adanya mekanisme enzimatis tersebut, BRM sangat berpotensi digunakan sebagai dekontaminan merkuri dan dapat dikembangkan menjadi agensia bioremediasi pencemaran merkuri atau sebagai agensia pengunduhan logam merkuri dari berbagai macam limbah industri. Berdasarkan kenyataan di atas dan kondisi Kalimas yang sudah tercemar merkuri, apakah kelompok BRM dapat diisolasi dari Kalimas Surabaya terutama di bagian hilir dan bagaimanakah keanekaragaman genera BRM tersebut 2. METODE PENELITIAN 2.1. Lokasi dan Waktu Penelitian Lokasi pengambilan sampel air dan sedimen sebagai sumber inokulum BRM adalah Kalimas ° Surabaya di daerah hilir (di dekat pelabuhan Tanjung Perak) pada koordinat S: 07 11’57,8” dan E: ° 112 44’06,8”. Preparasi sampel BRM dilakukuan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi, Jurusan Biologi FMIPA ITS dan beberapa institusi lain yang terkait. Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2011 sampai dengan bulan September 2011. Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”, Surabaya 15-16 Desember 2011
1
3.2. Pengumpulan Sampel Air dan Sedimen Sumber inokulum BRM adalah sampel air dan sedimen dari Kalimas Surabaya daerah hilir. Pengambilan sampel air dan sedimen dilakukan secara terpisah, sampel air langsung dimasukkan ke dalam botol gelap steril sedangkan sampel sedimen dimasukkan ke wadah steril. Kedua tempat sampel tersebut ditutup rapat, diberi label lokasi dan tanggal pengambilan, kemudian segera dibawa ke laboratorium yang selanjutnya digunakan sebagai sumber inokulum BRM. 3.3. Isolasi BRM Metode isolasi selektif bakteri dari sampel air dan sedimen menggunakan metode pengenceran bertingkat dan metode sebar (spread plate method) secara aseptis. Satu ml air atau satu gram sedimen dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril. Tabung reaksi divortex sampai homogen -1 -1 (pengenceran 10 ), selanjutnya diambil 1 mL larutan dari pengenceran 10 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain yang berisi 9 mL akuades steril, kemudian divortex kembali dan disebut pengenceran -2 -10 -7 -10 10 dan seterusnya sampai pengenceran 10 . Dari pengenceran 10 - 10 masing-masing diambil 100 µl dengan pipet mikro dan diteteskan di atas media padat NA-HgCl2 10 mg/L (Nutrient Agar yang mengandung HgCl2 10 mg/L) dengan metode sebar. Inokulum kemudian diratakan dengan segitiga Drigalsky. Kultur biakan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37°C dan diamati setelah ± 24 jam, sampai tumbuh koloni (Harley & Prescot, 2002). Koloni yang tumbuh diasumsikan sebagai isolat BRM. 3. 4. Purifikasi Isolat BRM Koloni yang tumbuh dipurifikasi sampai diperoleh kultur murni. Satu koloni isolat bakteri diambil secara aseptis dengan jarum ose dan diinokulasikan ke permukaan media padat NA-HgCl2 10 mg/L dengan metode 16 goresan dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37°C selama ± 24 jam. Satu koloni yang tumbuh diambil lagi kemudian dipindahkan ke media baru NA-HgCl2 10 mg/L dengan metode 16 goresan. Pemindahan koloni isolat dilakukan berulang-ulang sampai didapatkan kultur murni. Untuk mengetahui apakah koloni sudah murni, maka dilakukan pengamatan bentuk sel secara mikroskopis. Isolat yang telah murni merupakan isolat yang diasumsikan hanya terdiri dari satu strain bakteri (Busse, 1996), jika dalam satu koloni hanya terdiri satu bentuk sel yang sama maka pemurnian telah menghasilkan kultur murni. Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan metode preparat apus menggunakan pewarnaan sederhana methylen blue. Satu tetes akuades diletakkan di tengah kaca obyek, kemudian satu ose bakteri dimasukkan ke tetesan tersebut dan diratakan. Preparat kemudian difiksasi di atas api bunsen sampai akuades kering selanjutnya diwarnai dengan methylen blue dan ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan sel bakteri dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan menggunakan bantuan minyak imersi (Harley & Prescot, 2002). 3.5. Skrening Isolat BRM yang Sangat Resisten dan Toleran Terhadap HgCl2 Skrening untuk memperoleh isolat BRM yang sangat resisten dan toleran terhadap merkuri dilakukan pada konsentrasi HgCl2 15, 20 dan 25 mg/L. Metode yang digunakan adalah streak plate pada media NA-HgCl2 dan cakram difusi HgCl2 pada media Moeller-Hinton (Grove & Young, 1975). Setelah 24 jam masa inkubasi, akan terseleksi isolat BRM yang mempunyai resistensi dan toleransi tinggi terhadap merkuri yaitu bakteri dapat tumbuh pada perlakuan media NA-HgCl2, tidak membentuk zona atau mempunyai zona ≤ 1 mm pada media Moeller-Hinton. 3.6. Verifikasi Genera Isolat BRM (Generic assignment) Isolat hasil skrening di atas, dikarakterisasi berdasarkan habitat, morfologi, fisiologi dan uji biokimia, kemudian dari karakterisasi tersebut dilakukan verifikasi dengan Profile matcing terhadap karakter kunci (Generic assignment) untuk menentukan genera isolat BRM pada genera yang diduga mirip. Verifikasi mengacu pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994) Sebelum melakukan karakterisasi, isolat BRM disub kultur ke dalam media padat NA-HgCl2 10 mg/L sampai diperoleh kultur yang berumur ± 24 jam. Karakterisasi terdiri dari morfologi dan warna koloni (bentuk, warna dan transparansi), morfologi sel (bentuk, endospora, kapsula dan cysta), sifat pengecatan Gram dan tahan asam, serta uji fisiologis dan biokimiawi yang meliputi uji motilitas, metabolisme karbohidrat, aktivitas enzimatis, kebutuhan oksigen dan lain sebagainya. (Harley & Prescott, 2002). 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini didapatkan 24 isolat, dari sumber inokulum air sebanyak 11 isolat yang dikode dengan A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11 dan dari sumber inokulum sedimen didapatkan 14 isolat yang dikode dengan S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11, S12, S13Hg. Isolat tersebut dapat dikategorikan sebagai bakteri resisten merkuri (BRM) karena isolasi dilakukan dengan media selektif Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”, Surabaya 15-16 Desember 2011
2
NA yang mengandung 10 mg/L HgCl2. Menurut Canstein et al. (2002), isolat yang dapat tumbuh pada media sintetis mengandung HgCl2 ≥ 5 mg/L, merupakan isolat yang memiliki resistensi tinggi terhadap merkuri. Sedangkan menurut Gadd (1992), bakteri yang mampu mengakumulasi logam berat dapat diperoleh melalui isolasi dari sumber inokulum yang diambil dari lingkungan tercemar logam berat. Sumber inokulum BRM tersebut adalah air dan sedimen Kalimas, dimana sedimen di bagian hilir Kalimas Surabaya telah tercemar merkuri sebesar 6,3 mg/L. Setelah dilakukan skrening dengan metode streak plate pada media NA-HgCl, sebanyak tujuh isolat dapat tumbuh pada media NA-HgCl2 sampai dengan konsentrasi 25 mg/L yaitu isolat A1, A3, A7, A8, A10, S1, S8 dan S13. Pada skrening menggunakan cakram difusi HgCl2 25 ppm, dari tujuh isolat tersebut empat isolat tidak membentuk zona jernih dan 3 isolat membentuk zona jernih ≤ 1 mm (Tabel 1) Tabel 1. Resistensi dan toleransi BRM terhadap HgCl2 Isolat A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11
Tumbuh 10 ppm 25 ppm + + + + + + + + + + + + + + + -
+ : tumbuh, - tidak tumbuh
Zona (mm) 10 ppm 25 ppm + 0,25 + + + + + + + + + + + + +
Isolat S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
Tumbuh 10 ppm 25 ppm + + + + + + + + + + + + + + + +
Zona (mm) 10 ppm 25 ppm + 0,25 + + + + + + + 0,5 + + + + + +
+ : tidak ada zona
Isolat yang mempunyai resistensi dan daya toleransi tinggi pada HgCl2 25 mg/L merupakan bakteri yang sangat resisten terhadap merkuri dan merupakan kelompok bakteri yang potensial digunakan sebagai agensia bioremediasi pencemaran merkuri. Menurut Spain & van Veld (1983) tingkat adaptasi suatu mikrobia terhadap senyawa xenobiotic berperan penting untuk menentukan kemampuannya mendegradasi senyawa tersebut di lingkungan. Hal ini juga berkaitan dengan kapasitas metabolik mikrobia dalam menggunakan senyawa xenobiotic sebagai substrat pertumbuhannya yang sifatnya novel (van der Meer et al., 1992). Melihat kemampuan isolat di atas tumbuh di medium yang mengandung 25 mg/L HgCl2, ke tujuh isolat tersebut mempunyai suatu mekanisme untuk mengatasi cekaman merkuri. Berdasarkan hasil karakterisasi morfologi, fisiologi, dan biokimia yang kemudian dilakukan verifikasi dengan Profile matcing terhadap karakter kunci untuk menentukan genera (Generic assignment) yang mengacu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994), dari tujuh isolat terkelompokkan menjadi lima genera yaitu Azotobacter, Staphylococcus, Corynebacterium, Proteus, dan Bacillus (Tabel 2). Bakteri dapat resisten terhadap merkuri karena pada BRM mempunyai gen resisten merkuri yang disebut gen mer-operon. Gen mer-operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan gen organomerkuri liase (merB) (Nascimento dan Souza, 2003; Chien et al., 2010). Gen merB akan mengkatalisis pemutusan ikatan Me-Hg menghasilkan 2+ 2+ 2+ senyawa organik dan ion Hg , ion Hg akan terikat pada merC atau merT. Sedangkan Hg diluar lingkungan bakteri akan masuk ke periplasma dengan pasangan residu sistein merP. Kemudian merP 2+ 2+ mentransfer Hg ke residu sistein merT atau merC. Selanjutnya ion Hg menyeberang membran sitoplasma melalui proses reaksi pertukaran ligan menuju NADPH yang bergantung pada merkuri 2+ reduktase (gen merA). Merkuri reduktase memberikan 2 elektronnya kepada NADPH sehingga Hg 0 berubah menjadi Hg yang bersifat volatil tanpa menghasilkan energi untuk bakteri tersebut, selanjutnya 0 Hg dikeluarkan dari sel (Brown et al., 2002). Kesimpulan Berdasar hasil penelitian dapat disimpulkan, dari 24 isolat BRM hanya 7 isolat yang sangat resisten terhadap merkuri, ke tujuh isolat tersebut terkelompokkan ke dalam genera Azotobacter, Proteus, Staphylococcus, Corynebacterium, dan Bacillus. Genera tersebut merupakan genera unggul sebagai agensia bioremediasi pencemaran merkuri.
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”, Surabaya 15-16 Desember 2011
3
A3 + + + + + NA + + + + + + + + + + + + + + + + + +
A7 + NA + NA + + + + + + + + + + + + + + + +
A10 + NA NA + + + + + + + + + + + + + + + + + +
S1 + NA + + NA + + + + + + + + + + + + + + + + +
S8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
S13 + NA NA + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Proteus
Bacillus
Azotobacter
Proteus
Kesimpulan : termasuk Genera
A1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Corynebacterim
Karakter Sel bentuk batang Sel bentuk kokus Sel bentuk ovoid ø sel 1,5 - 2,0 Pewarnaan Gram Pewarnaan Acid Fast Endospora Cysta Motilitas Aerob Anaerob fakultatif Kemoorganotrof (O/F) Kemoorganotrof (O) Katalase Oksidase Urease Amilase Ornitin dekarboksilase MR VP Indol Citrat H2S Toleran NaCl 5% Toleran NaCl 10% Fermentasi glukosa Fermentasi fruktosa Fermentasi manosa Fermentasi manitol Fermentasi laktosa Fermentasi galaktosa Fermentasi sukrosa Fermentasi xylosa Fermentasi sorbitol Yellow Pigment Colony PbCl2 (10 mg/L) CdCl2 (10 mg/L) CuCl2 (10 mg/L)
Staphylococcus
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
Azotobacter
Tabel 2. Karakterisasi dan Verifikasi BRM
Keterangan : + menunjukkan reaksi positip; NA : Not Aplicable
Saran Untuk mengetahui kemampuan genera BRM yang unggul dalam mengakumulasi merkuri diperlukan suatu penelitian lebih lanjut tentang kemampuan bioakumulator BRM di atas. Disamping itu jalur degradasinya perlu ditelaah lebih mendalam berkaitan dengan keberadaan enzim merkuri reduktase 2+ 0 (merA) yang berperanan dalam mereduksi Hg menjadi Hg . Pustaka 2
Anonim . (2009): Pencemaran merkuri di Kali Surabaya. http://www.antarafoto. com/peristiwa/ v1269335101/tingkat-pencemaran-merkuri, diunduh tanggal Juli 2009. Boening, D.W. (2000): Ecological effects, transport and fate of mercury: A General Review, Chemosphere, vol. 40, pp. 1335-1351. Brown, N., Shih, Y., Leang, C., Glendinning, K., Hobman, J., Wilson, J. (2002): Mercury transport and Resistance. Biometals. International Biometals Symposium. Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”, Surabaya 15-16 Desember 2011
4
Busse, H.J., Denner, E.B.M and Lubitz, W. (1996): Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics, Journal of Biotechnology. 47: 3- 38. Canstein, H.V., Li, Y., Leonhauser, J., Haase, E., Felske, A., Deckwer, W.D. and Dobler, I.W. (2002): Spatially oscillating activity and microbial succession of mercury-reducing biofilms in a technicalscale bioremediation system. Appl. Environ. Microbiol, vol. 68,pp. 1938-1946. Chien, M.F., Narita, M., Lin, K.H., Matsui, Huang, C.C. and Endol, G., (2010): Organomercurials removal by heterogeneous merB genes harboring bacterial strains, Journal of Bioscience and Bioengineering, VoL. xx No. xx: xxx–xxx. De, J. and Rahmaniah, N. (2007): Characterization of marine bacteria highly resistant to mercury exhibiting multiple resistances to toxic chemicals, Ecological Indicators, vol. 7, pp. 511– 520. Gadd, G.M. (1992). Metals and Microorganisms; A Problem of Definition. FEMS Microbiol. Lett. 100 : 197-204. Grove, D.J. and Young, F.E. (1975): Epidemiology of Antibiotic and Heavy Metal Resistance in Bacteria: Resistance Patterns in Staphylococci Isolated from Populations Not Known to be Exposed to Heavy Metals, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol 7, no 5: 614 -621. Harley, J.P. and Prescott, L.M. (2002): Laboratory Exercises in Microbiology 4th Edition. The McGraw−Hill Companies : New York. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, H.A., Staley, J.T. and Wiliam, S.T. (1994): Bergey’s Manual of th Determinative Bacteriology 9 Ed, William & Wilkins, Baltimor. Iswiari (2008): Paradigma Kejadian Penyakit Pajanan Merkuri (Hg), Sequence of Diseases of Mercury Poison, Puslitbang Ekologi dan Status Kesehatan. th Madigan, M.T. and Martinko, J.M. (2006): Brock Biology of Microorganisms 11 , Pearson Education Inc., New Jersey. Nascimento, A.M.A. and Souza, E. (2003): Operon mer : Bacterial Resistance to Mercury and Potential for Bioremediation of Contamined Environments. Journal Genetics and molecular Research, 2(1): 92-101 Shovitri, M., Zulaika, E. dan Koentjoro, M.P. (2010). Reduction of Toxic Mercuric Ion by Isolated Bacteria from the Mas River Surabaya. Inovasi Bioproduk dalam Pembangunan Berkelanjutan van der Meer, J.R., De Vos, W.M., Harayama, S. And Zehnder, A.J.B. (1992): Molecular Mechanism of Genetic Adaptation to Xenobiotic Compound. Microbiological Reviews 56 (4): 677-694.
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”, Surabaya 15-16 Desember 2011
5
