BAKTERI LAUT ISOLAT PULAU PARI PENDEGRADASI KOMPONEN CRUDE OIL

Prosiding Seminar Nasional Penelitian, Pendidikan dan Penerapan MIPA, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Yogyakarta, 16 Mei 2009

BAKTERI LAUT ISOLAT PULAU PARI PENDEGRADASI KOMPONEN CRUDE OIL Dhama Susanthi1; I Made Sudiana2, Langkah Sembiring3 1

Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada; 2Puslit Biologi LIPI Cibinong; 3 Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi UGM.

Abstrak Dalam upaya untuk melakukan bioremediasi tumpahan minyak bumi dilakukan penelitian bakteri laut yang mampu mendegradasi komponen crude oil yaitu phenanthrene, DBT, dan paraffin. Sampel air laut Pulau Pari, DKI Jakarta diaklimasi dalam column reactor selama 2 bulan dengan 6 variasi fertilizer (Super IB, NH4NO3, Uric Acid, Hi-Control, Osmocoat, dan Chitosan). Kemudian sampel bakteri diisolasi pada medium ONR7a padat yang ditambah dengan 100 µl crude oil. Bakteri potensial pendegradasi crude oil diisolasi dan dipurifikasi pada medium marine agar secara streak plate dan disubkultur. Enambelas isolat terpilih diuji kemampuannya mendegradasi phenanthrene, DBT, dan paraffin. Isolat bakteri terpilih yaitu Dn yang terbukti dapat mendegradasi ketiga komponen crude oil. Selanjutnya isolat bakteri tersebut diuji pertumbuhannya pada 5 macam medium yaitu marine broth, polypepton, medium yang mengandung phenanthrene, DBT, dan paraffin. Uji pertumbuhan dilakukan pada kadar NaCl 2% dan 5% pada suhu 30°C serta rasio C/N/P = 100:20:3. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri tercepat pada medium yang mengandung DBT dengan kadar NaCl 2% (g = 3,029 jam), sedangkan pada medium yang mengandung paraffin kadar NaCl 2% memerlukan waktu pertumbuhan terlama (g = 9,342 jam). Pengukuran kemampuan sel bakteri melekat pada hidrokarbon (MATH) menunjukkan bahwa nilai adhesi tertinggi terhadap substrat phenanthrene yaitu 89,23%. Berdasarkan karakterisasi morfologi koloni, morfologi sel, pengecatan gram, karakterisasi fenotipik dengan kit API 20 NE, diketahui bahwa isolat Dn berbentuk diplococcus, bersifat gram negatif, dan bersifat denitrifier. Identifikasi molekular berdasarkan sequencing 16S rRNA dan konstruksi phylogenetic tree menunjukkan bahwa isolat Dn sangat mirip dengan Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132T. Dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri laut di perairan Pulau Pari yang diaklimasi dalam colum reactor beranekaragam dan terdapat isolat bakteri Dn yang mampu mendegradasi ketiga komponen crude oil dengan penambahan sumber N dan P. Kata Kunci : Bakteri Laut Pulau Pari, Crude Oil, Phenanthrene, DBT, Paraffin, Bioremediasi.

PENDAHULUAN Minyak mentah (crude oil) merupakan bahan dasar untuk keperluan bahan bakar dan industri. Kegiatan eksplorasi, transportasi, dan distribusi minyak mentah terutama melalui lautan sering terjadi kebocoran (Sudrajad, 2006). Negara penghasil minyak bumi seperti Indonesia yang juga merupakan jalur transportasi kapal pengangkut minyak menambah resiko terjadinya oil spill tersebut. Oleh karena itu, tumpahan minyak di laut menjadi salah satu masalah yang serius karena mengakibatkan kerusakan lingkungan dan menimbulkan dampak negatif untuk organisme hidup termasuk manusia. Minyak mentah terdiri dari banyak komponen penyusun. Menurut Cohen (2002) komponen penyusun minyak mentah dibagi dalam 4 kelompok yaitu hidrokarbon jenuh, aromatik, resins, dan aspalthenes. Salah satu komponen penyusun minyak mentah yaitu aromatik atau Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) merupakan salah satu komponen yang sulit terdegradasi dan B-35

Dhama S, I Made S, Langkah S/ Bakteri Laut Isolat …

berbahaya bagi makhluk hidup karena dapat terakumulasi dalam rantai makanan (Hughes et al., 2003). Komponen PAHs yang terkenal sulit terdegradasi dan bersifat toksik, mutagenik, dan karsinogenik ini adalah phenanthrene dan dibenzothiophene (Kasai et al., 2002). Paraffin merupakan komponen minyak mentah dan termasuk dalam alkana rantai panjang. Degradasi paraffin sangat penting peranannya dalam bioremediasi khususnya bioremediasi in situ yang dikenal dengan MEOR (Microbial Enhance Oil Recovery). Hal ini berkaitan dengan sifat minyak yang memiliki pour point tertentu yaitu tingkat temperatur yang mengubah minyak menjadi memadat atau berhenti mengalir sehingga penting dalam prediksi kelakuan minyak di air dan penetapan strategi pembersihan minyak (Mangkoedihardjo, 2005). Penelitian membuktikan bahwa bakteri pendegradasi paraffin dapat menurunkan pour point minyak mentah Limbadora dari 37°C menjadi 31°C sehingga memudahkan dalam recovery dan remediasi (Anonim, 2008a). Ada 3 cara untuk remediasi pencemar yaitu secara fisikawi, kimiawi, dan bilogis. Remediasi secara fisikawi dan kimiawi bersifat sementara dan tidak tuntas dalam menghilangkan minyak dari lingkungan. Remediasi secara kimiawi juga kurang efektif karena menambah beban lingkungan dengan bahan kimia yang diintroduksikan. Akan tetapi, remediasi secara biologis merupakan alternatif remediasi yang ramah lingkungan. Remediasi secara biologis atau yang lebih dikenal dengan bioremediasi ini merupakan teknologi yang menggunakan mikrobia untuk mengolah pencemar melalui mekanisme biodegradasi alamiah (intrinsic biodegradation) atau meningkatkan mekanisme biodegradasi dengan menambah mikrobia, nutrien, donor elektron atau akseptor elektron (enhanced bioremediation) (Anonim, 2008b). Tujuan utama bioremediasi adalah untuk menghilangkan kontaminan dalam lingkungan sehingga dapat mengurangi dampak negatif terhadap lingkungan (Bonner et al., 1997). Sebagai usaha untuk meningkatkan bioremediasi di perairan Indonesia, perlu adanya pencarian mikrobia lokal yang berpotensi tinggi untuk mendegradasi pencemar. Bioremediasi secara umum menggunakan mikrobia yang diisolasi dari lingkungan terkontaminasi dengan penambahan growth factor, nutrien, donor elektron atau akseptor elektron dan hal ini telah dilakukan pada operasi skala besar untuk bioremediasi oil spill Exxon Valdez di Alaska (Cohen, 2002). Akan tetapi penggunaan bakteri introduced untuk bioremediasi jarang diterapkan. Beberapa ilmuwan menganggap bahwa penggunaan indigenous bakteri lebih unggul dari pada bakteri introduced. Oleh karena itu, diperlukan penelitian tentang potensi bakteri introduced dalam mendegradasi crude oil dan komponen penyusunnya yang sulit terdegradasi yaitu phenanthrene, dibenzothiophene, dan paraffin. Bakteri introduced yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri laut di perairan Pulau Pari. Pulau Pari merupakan bagian dari gugusan pulau-pulau di Kepulauan Seribu, DKI Jakarta. Kepulauan Seribu telah terkontaminasi oleh Heavy Crude oil sepanjang 2 km2 dengan tumpahan minyak setebal 5 cm pada tahun 2004 (Syakti, 2004). Oleh karena itu ada kemungkinan terdapat bakteri yang mampu mendegradasi komponen crude oil di Pulau Pari. METODE PENELITIAN Pengambilan Sampel dan Aklimasi dalam Column reactor Sampel penelitian diambil dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu DKI Jakarta. Pulau Pari terletak di sebelah utara teluk Jakarta. Sampel air laut diambil dari sumur penampungan yang telah disiapkan. Setelah itu sampel air laut diaklimasi dalam column reactor selama 2 bulan (Gambar 1). Ada 6 macam kolom dengan 6 macam fertilizer yang berbeda yaitu Super IB, NH4NO3, Uric Acid, Hi-Control, Osmocoat, dan Chitosan.

Gambar 1. Column reactor

B-36


Deteksi Kemampuan Mikrobia Mendegradasi Crude Oil Deteksi kemampuan mikrobia mendegradasi crude oil berdasarkan Kasai et al. (2002) yang dimodifikasi. Medium yang digunakan untuk isolasi adalah medium ONR7a. Sebanyak 100 µl suspensi yang diambil dari 6 macam fertilizer dengan menggunakan mikropipet diletakkan pada medium ONR7a yang ditambah dengan 100 µl Arabian Light crude oil dan diratakan dengan drigalski. Setelah itu diinkubasikan selama 7 hari pada suhu 27°C untuk melihat aktivitasnya. Apabila terbentuk zona bening di sekitarnya menunjukkan bahwa bakteri yang terdapat dalam koloni dapat mendegradasi crude oil. Deteksi Kemampuan Mikrobia Mendegradasi PAHs Koloni bakteri yang potensial sebagai pendegradasi crude oil diisolasi dengan cara streak plate pada medium ONR7a yang ditambah dengan CH3COONa 5g/L. Setelah itu, medium yang berisi koloni mikrobia disublimasi dengan PAHs (Phenanthrene (Wako Lot WKF0060) dan DBT Lot JK01 TCL). Teknik sublimasi dilakukan dengan cara memanaskan PAHs pada suhu (80-130°C) selama ±5 menit untuk menguapkan PAHs tersebut. Senyawa PAHs yang menguap akan menyublim dan terperangkap pada medium ONR7a yang diberi pendingin es batu. Setelah itu diinkubasikan selama 7 hari pada suhu 27°C. Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni menunjukkan bahwa mikrobia dapat mendegradasi PAHs. Uji Konfirmasi Kemampuan Isolat Bakteri Mendegradasi Crude Oil Koloni yang tumbuh pada medium ONR7a+CH3COONa diambil sebanyak 1 ose dan dimasukkan kedalam medium ONR7a cair yang ditambah dengan yeast extract (5g/L) dan ferric sitrat (4g/L). Lima mililiter medium diletakkan dalam tabung reaksi yang ditambah dengan 100 µl crude oil, kemudian diinkubasikan selama 3 hari pada 27°C. Hasil positif ditunjukkan dengan terdegradasinya crude oil. Crude oil yang semula kental dan berada di permukaan menjadi butiran yang lebih kecil dan tersebar di seluruh permukaan tabung. Isolasi dan Purifikasi Bakteri Pendegradasi Crude Oil Sebanyak 100 µl suspensi bakteri dari medium ONR7a cair + Crude oil diambil dengan mikropipet dan diencerkan sampai pengenceran 10-8. Setelah itu sebanyak 50 µl dari masingmasing pengenceran tersebut diambil dan diinokulasikan pada medium Difco marine agar 2216 secara pour plate. Koloni yang tumbuh dipisahkan lagi ke dalam medium marine agar yang baru sampai murni. Kemudian dipilih 16 isolat secara acak untuk diberi perlakuan selanjutnya. Uji Konfirmasi Kemampuan Isolat Bakteri Mendegradasi PAHs dan Paraffin Uji konfirmasi digunakan untuk memastikan bahwa isolat bakteri dapat mendegradasi PAHs (Kasai et al., 2002). Uji konfirmasi dilakukan terhadap 16 isolat bakteri terpilih dari hasil isolasi dan purifikasi. Uji konfirmasi I dilakukan dengan menginokulasikan 16 isolat bakteri pada medium ONR7a yang ditambah phenantrene dan DBT dengan cara menyublimkan senyawa tersebut serta diamati pembentukan zona bening atau perubahan warna medium (Gambar 2). Uji konfirmasi II dilakukan pada medium air laut steril sebanyak 50 ml ditambah dengan sumber C, N, dan P dengan rasio C/N/P=100:20:3. Sumber N terdiri dari yeast ekstrak, KNO3, (NH4)2SO4, dan Urea. Sedangkan sumber P adalah KH2PO4. PAHs tidak larut di dalam air sehingga untuk melarutkannya digunakan pelarut organik DMSO (Dimethyl sulfoxide 99.5% GC Sigma). Sebanyak 0,01 gram PAHs dilarutkan dalam 600 µl DMSO dan diencerkan menjadi 10 ml dengan akuades. Lima mililiter campuran tersebut ditambahkan ke dalam medium air laut steril. Untuk uji konfirmasi II ini diamati perubahan warna medium atau tingkat kekeruhan medium. Selanjutnya uji konfirmasi degradasi paraffin dilakukan dengan paraffin padat. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri dari 6 macam fertilizer ditambahkan ke dalam medium ONR7a cair yang ditambah 5 gram paraffin. Uji konfirmasi degradasi paraffin ini dilakukan dengan mengamati tingkat kekeruhan medium dan keteruraian padatan paraffin.

B-37


Gambar 2. Metode Sublimasi PAHs Karakterisasi Pertumbuhan Isolat Bakteri Pendegradasi Phenanthrene, DBT, dan Paraffin Uji pertumbuhan isolat murni terseleksi pendegradasi phenanthrene, DBT, dan paraffin dilakukan dengan variasi salinitas 2% dan 5% serta suhu 30°C. 1. Pertumbuhan Pada Marine Broth dan Polypepton Uji pertumbuhan pada marine broth dan polypepton digunakan sebagai pembanding terhadap pertumbuhan pada substrat phenanthrene, DBT, dan paraffin. Sebelum diinokulasikan, dilakukan prekultur pada medium marine broth. Satu ose bakteri dimasukkan kedalam 6 ml Difco marine broth 2216 dan diinkubasikan selama 18 jam pada suhu 30 °C. Setelah itu disentrifugasi dengan centrifuge 5411R dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit pada suhu 25°C, selanjutnya pelet dicuci dengan akuades dan disentrifugasi dengan kecepatan yang sama. Setelah itu inokulan dengan konsentrasi akhir 3% v/v dimasukkan pada medium 50 ml marine broth dan polypepton dengan variasi salinitas 2%, 5%, dan 10%. Kemudian ditentukan kekeruhannya (OD) secara spektrofotometris pada λ = 600 nm tiap 6 jam sekali selama 36 jam dengan Biospec 1601Shimadzu. 2. Pertumbuhan pada Phenanthrene, DBT, dan Paraffin Oil Medium yang digunakan untuk uji pertumbuhan adalah sea water steril yang ditambah dengan sumber C, N, dan P dengan rasio C/N/P=100:20:3. Medium sebanyak 50 ml ditambah dengan 5 ml phenanthrene Wako Lot WKF0060, DBT lot JK01 TCL, dan paraffin oil JT Baker Lot T18H00. Kemudian ditentukan kekeruhannya (OD) pada λ = 600 nm untuk tiap 3 jam selama 15 jam dengan Biospec 1601-Shimadzu. Selain itu dilakukan pula pengukuran pH setiap 3 jam sekali dengan pH meter Horiba. Konsumsi pospat dan ammonium juga dihitung serta diukur secara spektrofotometris dengan Biospec 1601-Shimadzu pada λ = 630 nm dan λ = 880 nm. Uji pertumbuhan ini berguna untuk menentukan konstanta kecepatan pertumbuhan spesifik (µ) dan waktu generasi (g). Nilai OD yang diperoleh dengan spektrofotometris digunakan untuk memperoleh nilai µ dan g tersebut. Nilai OD 1 mewakili 109 sel/ml. Nilai OD yang diperoleh ini diubah ke dalam nilai ln N. Setelah kurva ln N diperoleh, dicari persamaan liniernya. Dari persamaan linier ini, dapat diketahui nilai µ. Sedangkan nilai g diperoleh dengan cara menghitung ln 2/µ. Selain itu dilakukan pengukuran konsumsi fosfat dan amonium. Fosfat dan amonium diukur untuk melihat adanya aktivitas metabolisme. Untuk mengukur fosfat dan amonium dibutuhkan reagen yang spesifik. Reagen dibuat berdasarkan Standard Method edisi 18 (Greenberg et al., 1992). Uji Microbial Adhesion to Hydrocarbon (MATH) Uji MATH ini dilakukan berdasarkan metode Bahrens et al. (1978) yang dimodifikasi. Sumber N dan alkalinitas medium MATH ini adalah 3 g/L NH4Cl; 0,70 g/L KH2PO4; 0,35 g/L MgSO4.7H2O; 0,035 g/L ferric sitrat; 0,2 g/L MnSO4.5H2O dan 0,285 g/L H3BO3 yang dimasukkan dalam 1L air laut steril.

B-38


Suspensi bakteri sebanyak 3% v/v yang sebelumnya telah diprekultur dalam medium MB selama 48 jam, dimasukkan ke dalam 50 ml medium MATH. Lima mililiter phenanthrene, DBT, dan paraffin padat dimasukkan ke dalam masing-masing botol yang berisi medium MATH. Glukosa sebanyak 5 gram juga dimasukkan ke dalam 50 ml medium sebagai kontrol. Medium diinkubasikan selama 2x24 jam pada suhu 30°C. Satu mililiter suspensi bakteri dari masing-masing perlakuan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm lalu pelet dicuci dua kali dengan NaCl 2% dan disentrifugasi lagi pada kecepatan yang sama setelah pencucian. Pelet diresuspensi dengan NaCl 2% sampai volume menjadi 1 ml. Kemudian kekeruhannya (OD) diukur secara spektrofotometris dengan menggunakan Biospec 1601-Shimadzu pada λ = 600 nm. Nilai OD yang pertama ini menunjukkan adanya hidrokarbon dalam sel bakteri (A0). Selain itu 5 ml suspensi bakteri dari masing-masing perlakuan juga diambil dan ditambah 500 µl paraffin oil dan divortek selama 2 menit. Setelah didiamkan selama 10 menit, OD pada λ = 600 nm dari suspensi bakteri diukur kembali. Nilai OD yang kedua ini menunjukkan besarnya hidrokarbon yang terlepas dari sel bakteri (A1). MATH diukur berdasarkan rumus dari Kaczorek et al., 2007. 1-(A0-A1) X 100% A0 Keterangan : A0 = OD bakteri + hidrokarbon dalam sel bakteri A1 = OD hidrokarbon yang dilepaskan sel bakteri Gambar 9. Rumus penghitungan MATH (Kaczorek et al., 2007). Karakterisasi dan Identifikasi Isolat Bakteri Pendegradasi Crude Oil, Phenanthrene, DBT, dan Paraffin Karakterisasi isolat bakteri dilakukan untuk tujuan identifikasi. Karakterisasi dilakukan meliputi karakter morfologi koloni dan pengecatan gram. Disamping itu dilakukan pula karakterisasi fenotipik dengan kit API 20 NE dan metode identifikasi molekular (sequencing DNA). Metode sequencing dengan 16S rRNA ini digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Preparasi DNA dilakukan dengan ekstraksi menggunakan metode Biosystem Prepman Ultra. Sebanyak 25 µl prepman ditambah dengan 1 loopfull koloni bakteri dan divortek selama 10-30 detik. Setelah itu dipanaskan selama 10 menit (100°C) dengan Astec Program temperatur Control system. Kemudian dilakukan sentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 12000 rpm dan diambil sepernatannya. Ada tidaknya DNA dicek dengan elektroforesis. Setelah diperoleh produk DNA maka dilakukan amplifikasi 16S PCR dengan 2 primer yaitu primer F27 (5’ AGAGTTGATCCTGGCTG 3’) dan primer R1541 (5’ AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3’) berdasarkan metode Bodour et al.(2003) yang dimodifikasi.. PCR dilakukan dengan 30 cycle yaitu 4 menit pada suhu 94°C (denaturasi), 1 menit pada suhu 55°C (annealing), dan 2 menit pada suhu 72°C (extension). Pada cycle terakhir dilakukan inkubasi selama 10 menit pada suhu 72°C. Kemudian untuk mendapatkan hasil yang maksimal dilakukan purifikasi produk PCR dengan qiagen purification kit. Apabila sudah murni maka dilanjutkan dengan cycle sequencing dan sequencing. Sekuen nukleotida ditentukan dengan Big Dye terminatorv3.1. Sequencing menggunakan DNA Sequencer model 377 (Applied Biosystem). Sequence nukleotida yang diperoleh dikonstruksi ke dalam Clustal X, versi 1.83 (Alignment). Setelah itu dilakukan konstruksi phylogenetic tree dari data evolusionary distance menggunakan neighbour joining method. Konstruksi phylogenetic tree ini menggunakan reference strain yang terdapat pada pangkalan data NCBI. Visualisasi phylogenetic tree menggunakan TREEV32. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Penelitian tentang bakteri laut isolat Pulau Pari merupakan penelitian awal untuk mengetahui potensi isolat bakteri dalam mendegradasi komponen crude oil yaitu phenanthrene, DBT, dan paraffin. Penelitian menggunakan sumber bakteri laut Pulau Pari yang diaklimasi dalam

B-39


column reactor dengan 6 macam fertilizer yaitu Super IB, Chitosan, Osmocoat, Hi-Control, NH4NO3, dan Uric acid menunjukkan bahwa konsorsium bakteri dapat mendegradasi crude oil, akan tetapi tidak semua isolat yang diperoleh dapat mendegradasi komponen crude oil yaitu phenanthrene, DBT, dan paraffin. Terbukti bahwa isolat bakteri dari Uric acid yang merupakan isolat tunggal tidak dapat mendegradasi crude oil. Bakteri bekerja dalam mendegradasi crude oil secara bersama-sama. Menurut Palonen et al. (2008), bakteri memiliki sistem quorum sensing atau komunikasi antar populasi bakteri yang dapat mempengaruhi degradasi crude oil. Oleh karena itu diversitas bakteri dapat mempengaruhi laju degradasi crude oil. Isolat terpilih yaitu isolat Dn dapat mendegradasi crude oil dan komponennya yaitu phenanthrene, DBT, dan paraffin. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi kemampuan bakteri dalam mendegradasi komponen tersebut. Beberapa faktor yang mempengaruhi adalah kemampuan bakteri dalam beradaptasi dengan lingkungan yang ekstrim yaitu pada salinitas dan kandungan PAHs. Sel harus menjaga cairan sitoplasma dan harus menjaga tekanan turgor untuk menjalankan fungsi dan pertumbuhan yang efektif. Menurut Webb et al. (2007) sel bakteri pada kadar NaCl tinggi harus menjaga keseimbangan tekanan osmotik disekitar medium dengan mengakumulasi ion potassium pada sel sehingga menjaga tekanan turgor. Selain itu adaptasi sel bakteri dalam kadar NaCl yang tinggi juga dilakukan dengan merubah komposisi membran lipid dan merubah ekspresi gen. Oleh karena itu hanya bakteri tertentu yang dapat hidup dalam medium dengan salinitas tinggi. PAHs merupakan komponen yang toksik bagi bakteri. Perubahan integritas membran sebagai akibat interaksi dari PAHs dengan komponen membran menyebabkan perubahan fungsi membran. Francy et al. (1991) mengatakan bahwa senyawa hidrokarbon juga mempengaruhi komponen permukaan sel yang hidrofob kehilangan integritas struktural sel dan akan melepaskan biosurfaktan ke dalam medium. Biosurfaktan inilah yang akan membantu bakteri dalam mendegradasi hidrokarbon. Oleh karena itu, kemampuan bakteri menghasilkan biosurfaktan sangat penting untuk membantu mendegradasi PAHs. Kemampuan isolat bakteri dalam mengikat PAHs juga dipengaruhi oleh kemampuan adaptasi yang tinggi terhadap adanya PAHs. Apabila sel bakteri cepat beradaptasi maka akan cepat mendegradasi hidrokarbon. Ukuran molekul hidrokarbon juga mempengaruhi permeabilitas dari sel. Phenanthrene dan DBT yang telah dilarutkan dalam DMSO menjadi partikel yang lebih kecil dibanding paraffin padat dan paraffin cair (Uji Microbial Adhesion to Hydrocarbons / MATH). Kemampuan sel bakteri melekat pada hidrokarbon menunjukkan bahwa nilai adhesi tertinggi pada substrat phenanthrene 89,23% dan yang terendah pada substrat paraffin cair 11,85% (Gambar 3). Nilai adhesi pada substrat paraffin padat 15,36%. Sedangkan pada substrat glukosa sebagai kontrol sebesar 93,59%. Secara umum hidrofobisitas permukaan sel isolat Dn pada substrat phenanthrene lebih besar dari nilai hidrofobisitas pada medium paraffin padat dan medium paraffin cair MATH (Microbial Adhesion To Hydrocarbon) 120.00%

Persentase

100.00% 80.00% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 1

2

3

4

Gambar 3. Nilai MATH isolat Dn pada phenantrene(1), paraffin padat(2), paraffin cair (3), dan glukosa(4). Nutrien juga diperlukan untuk membantu mempercepat degradasi PAHs. Sumber N dan P berfungsi untuk membantu dalam mendispersi komponen PAHs (Reisfeld et al., 1972). Sehingga diharapakan dengan penambahan sumber N dan P, degradasi dapat berjalan lebih cepat. Medium cair yang dipakai adalah sea water dengan C/N/P rasio 100:20:3. Menurut Mangkoediharjo (2005) saat terjadi tumpahan minyak di laut, suplai karbon kedalam air laut meningkat sehingga C/N/P rasio meningkat melebihi komposisi normal untuk pertumbuhan mikrobia. Oleh karena itu untuk mengoptimalkan pertumbuhan mikrobia diperlukan penambahan nutrien N dan P pada tingkat

B-40


C/N/P rasio sebelum terjadi tumpahan minyak. Isolat terpilih (Isolat Dn) pendegradasi crude oil, phenanthrene, DBT, dan paraffin ditumbuhkan pada medium Polypepton (PP) dan Marine Broth (MB) untuk mengetahui pola pertumbuhannya. Pada percobaan pertumbuhan pada medium polypepton dan marine broth dengan kadar NaCl 10%, bakteri dapat bertahan hidup, akan tetapi bakteri harus melakukan mekanisme penyesuaian diri yang panjang dibandingkan dengan tumbuh pada medium dengan kadar NaCl 2% dan 5% (Gambar 4). K urva P e rtum buha n Isola t Dn P a da m e dium Marine B roth ka da r Na C l 2%

K urva P e rtum buha n Isola t Dn P a da m e dium P olypepton K a da r Na C l 2%

1.5

2.5 O D 600 n m

1.5

OD 600 nm

A

2 1 0.5

D

1 0.5

OD

0

0 0

6

0

12 18 24 30 36

6

12

K urva pe rtumbuha n Isola t Dn pa da Me dium P olypepton ka da r Na C l 5%

36

OD 600 nm

OD

E

1 0.5

OD

0

6

12

18

24 30

36

0

6

12

J a m ke

18

24

30

36

Jam ke

Kurva Pe r tum buhan Is olat Dn Pada M e dium M a ri ne Broth k adar NaCl 10%

Kurva Pertum buhan Isolat Dn Pada Medium Polypepton kadar NaCl 10% 2.5

1.5

C

2 1.5

OD600 nm

OD 600 nm

30

Kurva Pertumbuhan Isolat Dn Pada Medium Marine Broth kadar NaCl 5%

B 0

OD

1

F

1

OD 0.5

0.5 0

0

0

6

12

18

24

30

36

0

6

12

jam ke

Gambar 4.

24

1.5

2.5 2 1.5 1 0.5 0

O D 600 nm

18 J a m ke

J a m ke

18

24

30

36

jam k e

Kurva Pertumbuhan Pada Medium Polypepton dan Marine Broth dengan kadar NaCl 2%, 5%, & 10% pada Suhu 30 °C. (A) Kurva pertumbuhan pada medium polypepton dengan kadar NaCl 2%, (B) Kurva pertumbuhan pada medium polypepton dengan kadar NaCl 5%, (C) Kurva pertumbuhan pada medium polypepton dengan kadar NaCl 10%, (D) Kurva pertumbuhan pada medium marine broth dengan kadar NaCl 2%, (E) Kurva pertumbuhan pada medium marine broth dengan kadar NaCl 5%, (F) Kurva pertumbuhan pada medium marine broth dengan kadar NaCl 10%.

1.4

0.008

1.2

0.007

1

0.006

8

0.005

0.8

0.004

Fosfat

0.003

Amonium

0.4

0.002

OD

0.2

0.001

0.6

0

0 0

3

6

9 Jam ke

12

15

Nilai pH

Absorbansi

Menurut Mangkoedihardjo (2005) kenaikan salinitas akan menurunkan laju degradasi hidrokarbon sebesar 3,3-28,4%. Akan tetapi untuk mengimbangi salinitas yang tinggi, bakteri melakukan proteksi dirinya dengan cepat membelah diri menggunakan sumber nutrien yang tersedia. Menurut Pelczar & Chan (1986) nutrien dan kondisi fisik medium berpengaruh pada kecepatan generasi dari bakteri. Isolat bakteri Dn juga ditumbuhkan pada medium yang mengandung phenanthrene, DBT, dan paraffin. Fase stasioner pada medium yang mengandung phenanthrene dengan kadar NaCl 2% & 5% terjadi setelah kultur berumur 12 jam (Gambar 5). Nilai pH medium P henanthrene Kurva Pertumbuhan Isolat Dn Vs A B deng an kadar NaC l 5% Konsumsi fosfat & amonium 6 4 pH

2 0 0

3

6

9

J a m ke

B-41

12

15


Kurva Pertumbuhan Isolat Dn Vs Konsumsi fosfat & amonium

pH Phenanthrene 5% NaCl 0.008 0.007

1

0.006 0.005

0.8

0.004

0.6

0.003

0.4

0.002

0.2

0.001

0

8 6 N ilai pH

1.2

Absorbansi

Absorbansi

1.4

Fosfat Amonium

3

6

9

12

pH

0

0 0

4 2

OD

0

15

3

6

9

12

15

Jam ke

Jam ke

C

D

Gambar 5. Kurva Pertumbuhan Isolat Bakteri Dn pada medium yang mengandung Phenanthrene dengan kadar NaCl 2% & 5% dan Suhu 30 °C. (A)Kurva pertumbuhan Isolat Dn, kandungan fosfat dan Amonium pada medium dengan kadar NaCl 2%, (B)Nilai pH medium yang mengandung phenanthrene dengan kadar NaCl 2%, (C)Kurva pertumbuhan Isolat Dn, kandungan fosfat dan amonium pada medium dengan kadar NaCl 5%, (D)Nilai pH medium yang mengandung phenanthrene dengan kadar NaCl 5%. Pertumbuhan isolat bakteri Dn pada medium yang mengandung DBT dengan kadar NaCl 2% & 5% mencapai fase stasioner pada jam yang berbeda. Kultur bakteri pada medium yang mengandung DBT dengan kadar NaCl 5% cepat sekali mengalami fase stasioner (Gambar 6). Sedangkan kurva pertumbuhan bakteri pada medium yang mengandung paraffin dengan kadar NaCl 2% dan 5%, fase stasioner terjadi pada saat umur kultur 15 jam (Gambar 6). K urva P ertumbuhan Is olat D n Vs K ons ums i fos fat & amonium

8

0.03 0.025

1.5

0.02 0.015

1

OD

4 pH 2

0.005

0

0

0 0

3

6

9

1

12

2

3

A

J a m ke

K urva P ertumbuhan Is olat D n Vs kons ums i fos fat & amonium

2.4 2.2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

4

5

B

Jam ke

Nilai ph Medium DBT dengan kadar NaCl 5% 0.035

8

0.03

0.02 0.015 0.01

6 F os fat A monium

Nilai pH

0.025

A bs orban s i

4 pH 2

OD

0.005

0

0 0

3

6

9

0

12

3

6

C

J a m ke

9

12

D

Jam ke

Nilai pH medium Paraffin dengan kadar NaCl 2%

K urva P ertumbuhan Is olat D n Vs K ons ums i fos fat & amonium

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

8

0.07 0.06

0.04 0.03 0.02

6 A b s o rb an s i

0.05

F os fat Amonium

N ilai pH

A b s orbans i

F os fat

0.01 0.5

A b s o rb an s i

6 Amonium

Nilai pH

2 A b s o rb a n s i

pH DBT 2% NaCl 0.035 A b s o rb a n s i

2.5

4 pH 2

OD

0.01

0

0 0

3

6

9

Absorba nsi

12

0

15

E

3

6

9 Jam ke

B-42

12

F

15

Nilai pH medium Paraffin dengan kadar NaCl 5% 0.07

8

0.06 0.05 0.04 0.03 0.02

6 F os fat A monium OD

N ilai pH

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

K urva P ertumbuhan Is olat Dn Vs K ons ums i fos fat & amonium

A b s o rb a n s i

A b s o rb a n s i


4 pH 2

0.01

0

0 0

3

6

9

J a m ke

12

0

15

G

3

6

9 Jam ke

12

15

H

Gambar 6. Kurva Pertumbuhan Isolat Bakteri Dn pada medium yang mengandung DBT(A,B,C,D) dan yang mengandung paraffin (E,F,G,H) dengan kadar NaCl 2% & 5% dan Suhu 30 °C. (A)Kurva pertumbuhan Isolat Dn, kandungan fosfat dan Amonium pada medium dengan kadar NaCl 2%, (B)Nilai pH medium yang mengandung DBT dengan kadar NaCl 2%, (C)Kurva pertumbuhan Isolat Dn, kandungan fosfat dan amonium pada medium dengan kadar NaCl 5%, (D)Nilai pH medium yang mengandung DBTdengan kadar NaCl 5%. (E)Kurva pertumbuhan Isolat Dn, kandungan fosfat dan Amonium pada medium dengan kadar NaCl 2%, (F)Nilai pH medium yang mengandung Paraffin dengan kadar NaCl 2%, (G)Kurva pertumbuhan Isolat Dn, kandungan fosfat dan amonium pada medium dengan kadar NaCl 5%, (H)Nilai pH medium yang mengandung Paraffin dengan kadar NaCl 5%.

Ada kemungkinan bahwa bakteri akan mendegradasi hidrokarbon pada saat fase stasionernya. Bakteri dengan cepat membentuk biomassa untuk mencapai fase stasionernya. Pada keadaan osmotik yang tinggi, sel bakteri yang tidak dapat bertahan akan mengalami lisis. Menurut penelitian pada saat fase stasoiner, bakteri akan membentuk biosurfaktan yang dapat membantu dalam mendegradasi hidrokarbon (Fatimah, 2007). Isolat Dn yang ditumbuhkan pada 3 substrat yang berbeda yaitu medium yang mengandung phenantrene, DBT, dan paraffin dengan variasi kadar NaCl 2% dan 5% juga dihitung µ (kecepatan pertumbuhan spesifik) dan g (waktu generasi). Hal ini diperlukan untuk mengetahui waktu yang digunakan untuk membelah menjadi 2 sel sehingga diketahui efektivitasnya dalam mendegradasi substrat. Tabel 1. Nilai µ dan g isolat Dn pada substrat yang berbeda dengan kadar NaCl 2% dan 5%. Substrat µ (Jam -1) g (Jam) (Ln 2/µ) MB dengan kadar NaCl 2% 0,0262 26,456 MB dengan kadar NaCl 5% 0,0473 14,654 MB dengan kadar NaCl 10% 0,0456 15,200 PP dengan kadar NaCl 2% 0,0392 17,682 PP dengan kadar NaCl 5% 0,0709 9,776 PP dengan kadar NaCl 10% 0,0392 17,682 Phenanthrene dengan kadar NaCl 2% 0,0869 7,976 Phenanthrene dengan kadar NaCl 5% 0,1211 5,723 DBT dengan kadar NaCl 2% 0,2288 3,029 DBT dengan kadar NaCl 5% 0,1881 3,685 Paraffin dengan kadar NaCl 2% 0,0742 9,342 Paraffin dengan kadar NaCl 5% 0,1358 5,142 Dari Tabel 1 dapat diketahui bahwa g (waktu generasi) dari isolat Dn tercepat pada substrat yang mengandung DBT dengan kadar NaCl 2% (3,029 jam). Sedangkan pada substrat paraffin dengan kadar NaCl 2% memerlukan waktu generasi paling lama yaitu 9,342 jam. Isolat terpilih yaitu isolat Dn ini memiliki karakteristik morfologi yaitu warna koloni kuning pucat, bentuk koloni iregular, tekstur koloni halus, permukaan berlendir, bersifat motil, fakultatif aerob, positif terhadap uji H2O2. Sedangkan dari pewarnaan gram diketahui bahwa isolat Dn bersifat gram negatif dan berbentuk diplococcus. Dari hasil identifikasi fenotipik dengan kit API 20 NE dapat diketahui bahwa isolat dapat tumbuh pada medium yang mengandung potassium nitrat, mannitol, maltosa, glukonat, caprate, B-43


sitrat, dan phenyl acetate. Isolat mampu mereduksi nitrat (NO3) menjadi NO2, akan tetapi tidak dapat mereduksi sampai menjadi N2. Isolat bakteri bersifat denitrifier dan dapat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron pada saat kondisi anaerob (Khartikeyan & Bhandari, 2001). D21 D24 D23 D22 D20 D17 Alcanivorax borkumensis MARC4A16 Alcanivorax sp. JL860

Dhico3 D15

Dhico4phe Dh D11 D10 DDBT7

Marinospirillum minutum ATCC 19193 Dn Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132T Marinobacter sp. LCA6 Marinobacter sp. DMS054 Cycloclasticus pugetii PS-1 Cycloclasticus spirillensus PY97N Vibrio mimicus ATCC 33653T Vibrio mediterranei CIP 10320T Vibrio campbellii ATCC 25920T D5 Listonella pelagia ATCC 25916T Pseudoalteromonas ruthenica KMM300 D14 Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046 Moritella marina ATCC 15381T Pseudoalteromonas marina mano4 D25 Alcanivorax borkumensis MARC4D

Pseudoalteromonas undina NCIMB 2128T

D19 D16 D18 0.1

Gambar 7. Phylogenetic Tree berdasarkan Neighbour-Joining yang menunjukkan hubungan antara reference strain dari klas γ Proteobacteria dengan isolat bakteri laut di Perairan Pulau Pari pendegradasi komponen crude oil atas dasar sequence 16S rRNA.

B-44


Dn Marinobacter sp. LCA6 Marinobacter hydrocarbonoclasticus T ATCC 27132 Marinobacter sp. DMS054 Marinospirillum minutum ATCC 19193 Cycloclasticus pugetii PS1 Cycloclasticus spirillensus PY97N

--94,72

45/853 ---

Cycloclasticus spirillensus PY97N

Cycloclasticus pugetii PS-1

Marinospirillum minutum ATCC 19193

Marinobacter sp. DMS054

Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC T 27132

Marinobacter sp. LCA6

Dn

Tabel 7. Nilai similaritas 16S rRNA (%) dan jumlah nukleotida yang berbeda antara reference strain dari klas γ Proteobacteria dengan isolat bakteri laut Pulau Pari (Isolat Dn) pendegradasi komponen crude oil .

2/1503 45/851

35/599 14/533

150/1456 103/847

164/1481 121/850

61/726 57/512

---

35/597 ---

150/1454 73/599

163/1486 77/598

61/724 67/578

---

181/1450

77/726

---

1/726

99,87 94,16

94,71 97,37

89,7

87,84

89,68

87,81

88,93

85,76

89,03

87,12

87,52

91,6

88,87

91,57

88,41

89,39

94,14

99,86

---

Dari Tabel 7 dan phylogenetic tree (Gambar 7) diketahui bahwa isolat bakteri Dn yang dapat mendegradasi ketiga komponen crude oil sangat mirip dengan Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132T sebesar 99,87%. Sekuen nukleotida yang berbeda sebesar 2 dari total nukleotida 1503.

Listonella pelagia ATCC 25916

--99,65 99,51 96,99 93,24

5/1424 --99,31 97,04 93,22

43/1429 43/1454 46/1461 --93,6

T

D5 D5 T Listonella pelagia ATCC 25916 T Vibrio ampbellii ATCC 25920 T Vibrio mediteterranei CIP 10320 T Vibrio mimicus ATCC 33653

Vibrio mimicus ATCC 33653T

Vibrio mediteterranei CIP 10320

7/1429 10/1450 --96,85 93,31

T

Vibrio ampbellii ATCC 25920

T

Tabel 8. Nilai similaritas 16S rRNA (%) dan jumlah nukleotida yang berbeda antara reference strain dari klas γ Proteobacteria dengan isolat bakteri laut Pulau Pari (Isolat D5) pendegradasi komponen crude oil .

96/1420 98/1446 97/1450 93/1454 ---

Dari tabel 8 diketahui bahwa isolat Dn sangat mirip dengan Listonella pelagia ATCC 25916T (99,65%) dan nukleotida yang berbeda sebesar 5 nukleotida dari total nukleotida 1424.

B-45


D14 Pseudoalteromonas undina NCIMB T 2128 T

Moritella marina ATCC 15381 Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046 Pseudoalteromonas marina mano4 Pseudoalteromonas ruthenica KMM300

--96,51 96,59

Pseudoalteromonas ruthenica KMM300

Pseudoalteromonas marina mano4

Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046

T

Moritella marina ATCC 15381

D14

Pseudoalteromonas undina NCIMB 2128

T

Tabel 9. Nilai similaritas 16S rRNA (%) dan jumlah nukleotida yang berbeda antara reference strain dari klas γ Proteobacteria dengan isolat bakteri laut Pulau Pari (Isolat D14) pendegradasi komponen crude oil .

50/1433

49/1435

44/1411

53/1370

69/1486

---

53/1412

44/1399

50/1359

72/1425

---

8/1387

22/1347

60/1418

17/1355

60/1409

---

50/1368

96,25

96,88

96,85

99,42

96,13

96,32

98,37

--98,75

95,36

94,95

95,77

95,74

96,35

---

Dari Tabel 9 diketahui bahwa isolat D14 sangat mirip dengan Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046 sebesar 96,88%. Nukleotida yang berbeda sebesar 44 nukleotida dari total 1411 nukleotida. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Bakteri Laut pendegradasi komponen crude oil di perairan Pulau Pari yang diaklimasi dalam coloum reactor dengan 6 variasi fertilizer (Super IB, NH4NO3, Uric Acid, Hi-Control, Osmocoat, dan Chitosan) beranekaragam. Konsorsium bakteri dapat mendegradasi crude oil. Akan tetapi tidak semua bakteri dapat mendegradasi komponen crude oil yaitu phenanthrene, dibenzothiophene, dan paraffin. Isolat bakteri Dn mampu mendegradasi ketiga komponen crude oil tersebut dengan penambahan sumber N dan P. Berdasarkan metode sequencing 16S rRNA dan konstruksi phylogenetic tree diketahui bahwa isolat Dn sangat mirip dengan Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132T. Saran Penelitian tentang bakteri laut di perairan Pulau Pari pendegradasi komponen crude oil yaitu phenanthrene, dibenzothiphene, dan paraffin untuk bioremediasi tumpahan minyak bumi merupakan penelitian tahap awal. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk : 1. Menguji kemampuan isolat bakteri maupun konsorsium bakteri yang berasal dari laut Pulau Pari untuk mendegradasi komponen crude oil lainnya seperti aspalthenes. 2. Mencari komposisi fertilizer yang lebih optimal untuk bioaugmentasi. 3. Menguji degradasi pada variasi salinitas yang lebih tinggi/ halosaline yang dapat diterapkan pada laut yang salinitasnya tinggi. 4. Menguji degradasi paraffin oleh bakteri pada suhu yang lebih tinggi dan tekanan tinggi untuk kepentingan Microbial Enhance oil Recovery (MEOR).

B-46


DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2008a. Development Of Biocatalyst to Enhance The Growth Rate Of Paraffin Degrading Bacterial Consortium (Sponsor : Oil And Natural Gas Corporation Ltd.). The Energy And Resources Institute. Anonim. 2008b. Global Marine Oil Pollution Information Gateway. http://oils. gpa.unup.org. diakses tanggal 20 Juni 2008. Bonner, J.J, D. LaRiviere, & L. Autenrieth. 2008. Biodegradation Of Oil Contaminated Sediment : Effect Of Dispersant And Natural Organic Matter. USA. pp.765-778. Cohen, Y. 2002. Bioremediation Of Oil by Marine Microbial Mats. Instant. Microbiol 5:189-193. Fatimah. 2007. Uji Produksi Biosurfaktan Oleh Pseudomonas sp. Pada Subsrat Yang Berbeda. Berkala Penelitian Hayati 12 : 181-185. Francy, D.S, Thomas J.M., RL Raymond, dan CH Ward. 1991. Emulsification of Hydrocarbons by Surface Bacteria. J. Ind. Microbiol 8:234-246. Greenberg, A.E., L.S. Clescen, & A.D. Eaton. 1992. Standard Methods 18th edition For the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association, Washington DC. Hughes, J.B., V. Jee, & C.H. Ward. 2003. Bioremediation of Contaminated Sediments. Rice University. Houston. pp. 236-242. Hunt, J. M. 1996. Petroleum Geochemistry and Geology. 2nd edition. New York. Kaczorek, E., L. Chrzanowski, A. Pijanowska, & A. Olszanowski. 2008. Yeast And Bacterial Cell Hydrophobicity And Hydrocarbon Biodegradatin in the Presence of Natural Surfactants :Rhamnolipides and Saponins. Bioresource Technology 99 : 4285-4291. Karthikeyan, R dan A. Bhandari. 2001. Anaerobic Biotransformation of Aromatic and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Oil Micricosms : A Review. Journal of Hazardous substance Research. Volume three. Kansas State university. pp. 1-13. Kasai, Y, H. Kishira, & S. Harayama. 2002. Bacteria Belonging to The genus Cyclocasticus Play Role in The Degradation of Aromatic Hydrocarbons Released in a Marine Environment. Applied And Environmental Microbiology 68(11): 5625-5633. Mangkoedihardjo, S. 2005. Seleksi Teknologi pemulihan Untuk Ekosistem Laut tercemar Minyak. Seminar Nasional Teori dan Aplikasi Teknologi Kelautan ITS. Surabaya. pp.1-9. Palonen, E.K., A.M. Brandt & J.T. Soini. 2008. In Search For Novel Quorum Sensing molecules In Fermenting Fungi Using Oligonucleotide-Based Microarrays. Turku Center For Biotechnology. University Of Turku & Abo Academi University. Pelczar, M.J. & E.C.S. Chan. Dasar-dasar Mikrobiologi (Terj.). 1986. Penerbit Universitas Indonesia (UI Press). Jakarta. Pp. 131-156. Reisfeld, A., E. Rosenberg, dan D. Gutnick. 1972. Microbial Degradation of Crude Oil: Factors Affecting The Dispersion In Sea Water by Mixed and Pure Cultures. Applied Microbiology 24(3) : 363-368.

B-47


Sudrajad, A. 2006. Tumpahan Minyak di laut dan Beberapa Catatan Terhadap Kasus di Indonesia. INOVASI vol.6/XVIII/Maret 2006. Syakti, A.D. Bioremediasi Lingkungan. Staf Divisi Bioteknologi (Bioremediasi Lingkungan) Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan Lautan Institut Pertanian Bogor. http://www.freelist.org. Webb, M.D, C.Pin, M.W. Peck, & S.C Stringer. 2007. Historical and Contemporary NaCl Concentrations Affect The Duration and Distribution of Times From Individual spores of Nonproteolytic Clostridium botulinum. Applied&Environmental Microbiology 73(7) : 2218-2127.

B-48

BAKTERI LAUT ISOLAT PULAU PARI PENDEGRADASI KOMPONEN CRUDE OIL

Recommend Documents