19
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung dari bulan Mei 2011 sampai November 2012 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPHK FKH IPB), Balai Besar Penelitian Veteriner (Bbalitvet) dan Pusat Aplikasi Tehnologi Isotop dan Radiasi (PATIR) BATAN Jakarta .
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah antigen Milk Ring Test (MRT) Bbalitvet untuk screening brucellosis; media untuk isolasi: Triptone soya agar (TSA), Triptone soya broth (TSB), Brucella selective supplement (Polymixin B, Bacitracin, Cycloheximide, Nalidixic acid, Nystatin dan Vancomycin), 2 – 5% Fetal Calf Serum (FCS), saline; serta bahan untuk identifikasi : pereaksi oksidase (1% NNN’N’-tetramethyl-p-phenylene diamine dihydrochloride), H2O2 3%, Kertas Plumbum asetat (Pb asetat), urea agar base, Simon’s Citrate Agar, supplement urea 40%, Brucella monospesific M serum (M, Veterinary Laboratories Agency), Brucella monospesific A serum (A, Veterinary Laboratories Agency), CO2, fuchsin dan thionin. Bahan untuk uji serologi : antigen reagen RBT Bbalitvet, antigen CFT
Bbalitvet
, komplemen, hemolisin, sel darah merah (eritrosit) domba, kontrol
serum positif dan negatif brucellosis. Alat yang digunakan adalah Biological safety cabinets (BSC) kelas IIA, mikroskop, spektrofotometer, inkubator, irradiator Gamma chamber, microtube, tabung 10 ml, Erlenmeyer, pipet 1 - 10 ml, mikropipet, inkubator CO2, cawan Petri, cawan mikro dasar U (U bottom), rotary agglutinator, shaker, kaca pembesar (loop), cawan hemaglutinasi WHO (WHO hemagglutination plate), box lamp (lampu baca dengan cahaya putih) dan sentrifus.
20
Metode Penelitian Koleksi sampel Sampel diperoleh dari sampel susu sapi perah di Bandung Jawa Barat (91 sampel), cairan amnion sapi perah sampel diagnostik di Bbalitvet Bogor (1 sampel) dan cairan higroma sapi potong di Belu, Nusa Tenggara Timur (15 sampel). Semua sampel dikoleksi oleh Laboratorium Brucellosis Bbalitvet Bogor.
Sampel susu Sampel susu diambil secara aseptik setelah mencuci dan mengeringkan ambing keseluruhan dan desinfeksi puting. Sampel diambil dari semua kuartir, dan susu diambil 10 - 20 ml dari setiap puting sapi. Pancaran pertama dibuang dan sampel diperah langsung ke tabung steril. Sampel diuji dengan antigen Milk Ring Test dan sisanya disimpan pada suhu -20 0C sampai dilakukan isolasi bakteri.
Sampel amnion Sampel amnion diperoleh dari sampel diagnosik sapi simmental yang mengalami keguguran pada kebuntingan 6 bulan. Selain itu juga dilakukan pemeriksaan serologi terhadap serum sapi tersebut.
Sampel higroma Sampel higroma dikoleksi dengan menggunakan syringe steril kemudian cairan higroma dimasukkan ke tabung. Selain itu dilakukan pemeriksaan terhadap serum sapi yang dikoleksi untuk pemeriksaan serologi. Sampel disimpan pada suhu -20 0C sampai dilakukan isolasi.
Milk Ring Test (MRT) Milk Ring Test digunakan untuk screening B. abortus dengan antigen MRT. Uji MRT yaitu sebanyak 1 - 2 ml susu dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 0,03 – 0,05 ml antigen MRT, kemudian diaduk-aduk sehingga terlihat warna biru. Tabung diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 °C, kemudian dibaca reaksinya dengan kriteria sebagai berikut: negatif (-), lapisan krim di bagian atas berwarna putih dan bagian susu di bawahnya berwarna biru semua; positif + (+1),
21
lapisan krim berwarna sama dengan bagian susu dibawahnya; positif ++ (+2), warna biru pada cairan krim lebih tua dibandingkan dengan warna susu dibawahnya; positif +++ (+3), cincin krim jelas berwarna biru dengan sedikit biru ada pada bagian susu dibawahnya; dan positif ++++ (+4), cincin krim jelas berwarna biru dan bagian susu dibawahnya berwarna putih.
Serologi Rose Bengal Test (RBT) dan Complement Fixation Test (CFT) digunakan untuk diagnosa serologi terhadap brucellosis.
Rose Bengal Test (RBT). Sebanyak 25 µl serum diambil menggunakan mikropipet dan dicampurkan dengan 25 µl antigen RBT (Bbalitvet) di masukkan ke dalam sumur cawan. Larutan dicampur hingga rata dengan menggerakkan cawan berputar kekiri dan ke kanan kemudian cawan digoyang di atas rotary agglutinator selama 4 menit. Pada setiap pengujian selalu menggunakan kontrol positif dan negatif. Hasil reaksi dinilai negatif (-): tidak ada aglutinasi, tidak ada batas pinggir dan campuran antigen dan serum homogen; positif (+1), terlihat penggumpalan yang halus dan batas pinggir terjadi seperti garis putus-putus; positif (+2) terlihat jelas penggumpalan yang halus dengan garis tepi yang lebar; positif (+3) terlihat penggumpalan yang kasar dan cairan terlihat jernih.
Complement Fixation Test (CFT). Setiap sumur cawan mikro dengan dasar U (U bottom) pada baris A masing-masing diisi serum 0.05 ml (termasuk serum kontrol positif dan negatif), kemudian diinaktivasi pada suhu 58 ºC selama 30 menit di penangas air. Semua sumur kecuali baris A diisi saline sebanyak 0,025 ml. Selanjutnya serum diencerkan dalam saline dengan cara memindahkan 0,025 ml serum dari A ke sumur cawan di baris B, seterusnya sampai baris H, sehingga diperoleh enceran serum ½, ¼, 1/8, 1/16 dan seterusnya. Setiap sumur pada baris C sampai H diisi dengan antigen 0,025 ml. Kemudian baris B sampai H ditambah 0,025 komplemen pada setiap sumur. Semua sumur pada baris B ditambah diluen 0,025 ml dan digunakan sebagai kontrol terhadap adanya aktivitas komplementer. Cawan kemudian diinkubasi pada temperatur 37 ºC selama 30 menit. Setelah
22
masa inkubasi selesai, setiap sumur dari baris B sampai H ditambahkan 0,025 ml eritrosit yang telah disensitifkan dengan hemolisin. Kemudian cawan diinkubasi pada temperatur 37 ºC selama 30 menit sambil dikocok dengan alat pengocok (shaker). Cawan mikro diputar pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit atau didiamkan pada suhu 4 ºC semalam. Hasil reaksi CFT dibaca sebagai negatif (-), terjadi hemolisis sempurna, cairan dalam sumur berwarna merah, tidak ada endapan eritrosit didasar sumur; Positif + (+1), terjadi hemolisis hampir sempurna, cairan dalam sumur berwarna merah, terdapat sedikit endapan eritrosit didasar sumur; Positif ++ (+2), sebagian besar hemolisis, cairan berwarna merah, endapan eritrosit agak melebar dengan tepi rata; +++ (+3), sebagian besar eritrosit tidak lisis, warna cairan agak merah, endapan eritrosit terlihat jelas; ++++ (+4), tidak terjadi hemolisis, cairan dalam sumur bening, endapan eritrosit terlihat nyata dengan batas pinggir rata. Interpretasi hasil uji pengikatan komplemen berdasarkan terjadinya 50% hemolisis pada pengenceran serum tertinggi. Serum dengan titer CFT 1:4 (1/4) atau lebih dikategorikan positif.
Isolasi B. abortus Isolasi sampel. Isolasi dilakukan berdasarkan Alton et al. (1988) dan OIE (2009). Sampel susu Sampel susu disentrifugasi pada 3000 rpm selama 30 menit dalam tabung tertutup. Krim dan endapan diaduk kemudian dikultur menggunakan swab dari kapas ke media TSB yang mengandung FCS dan Brucella selective supplement. selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 37 °C dengan 5 % CO2 selama 3 - 4 hari di inkubator CO2 untuk diamati kekeruhannya. Kemudian bakteri dikultur ke cawan Petri yang mengandung media TSA dan Brucella selective supplement. Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 °C dengan 5 % CO2 selama 3 - 4 hari di inkubator CO2. Bakteri yang dicurigai kemudian disubkultur pada media selektif TSA di cawan Petri dan diinkubasi suhu 37 °C dengan 5 % CO2 selama 3 - 4 hari di inkubator CO2. Koloni B. abortus dimurnikan untuk identifikasi lebih lanjut.
23
Sampel amnion Isolasi B. abortus dari cairan amnion sapi simental yang mengalami abortus pada kebuntingan 6 bulan. Cairan amnion dimasukkan ke dalam tabung berisi TSB, FCS dan Brucella selective supplement. Selanjutnya cairan amnion diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 - 4 hari di inkubator CO2 untuk diamati kekeruhannya. Setelah terlihat kekeruhannya maka bakteri dikultur pada media yang mengandung TSA dan Brucella selective supplement. Koloni yang terpisah dan dicurigai disubkultur pada media TSA dan diinkubasi selama 3 - 4 hari di inkubator CO2. Sampel higroma Isolasi B. abortus dari cairan higroma sapi yang dicurigai menderita brucellosis kronis. Sebanyak 0,5 ml cairan higroma dimasukkan ke dalam tabung berisi 3 ml TSB yang mengandung FCS dan Brucella selective supplement. Selanjutnya dilakukan isolasi seperti cairan amnion.
Identifikasi dan biotyping B. abortus Identifikasi dan bioytping mengikuti metode Alton et al. (1988), Barrow & Feltham (1993) dan OIE (2009). Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 °C dengan 5 % CO2 selama 4 hari di inkubator CO2 untuk mengetahui keberadaan koloni Brucella. Identifikasi bakteri Brucella meliputi morfologi koloni, pewarnaan Gram dan uji biokimiawi (oksidase, katalase dan uji sitrat) dilanjutkan dengan biotyping isolat terhadap penggunaan CO2, produksi H2S, aktifitas urease, pertumbuhan pada zat warna basic fuchsin dan thionin dan uji aglutinasi dengan Brucella monospesific M serum dan Brucella monospesific A serum. Pewarnaan Gram. Gelas objek dibersihkan dari lemak dengan alkohol 70 % dan diberi label. Satu tetes akuades steril diletakkan pada permukaan gelas objek. Isolat diambil dengan jarum Őse kemudian di campur dengan akuades dan diulas merata pada permukaan gelas objek. Preparat difiksasi dengan melewatkan di atas api sampai terlihat kering. Larutan crystal violet diteteskan pada preparat sampai merata dan diamkan selama 1 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir.
24
Kemudian larutan iodine lugol diteteskan pada preparat sampai merata, dan diamkan
selama
1
menit.
Preparat
dicuci
dengan
air
mengalir
dan
dikeringanginkan. Larutan alkohol aseton diteteskan pada preparat sampai merata dan diamkan. Preparat dicuci dengan air mengalir. Larutan safranin diteteskan pada preparat sampai merata dan diamkan selama 15 detik. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 100. Sifat bakteri gram positif ditandai dengan sel bakteri berwarna ungu dan gram negatif ditandai dengan sel bakteri berwarna merah. Uji Oksidase. Kertas saring dibasahi dengan pereaksi oksidase. Satu loop isolat bakteri diambil dengan jarum Őse dan digoreskan pada kertas saring yang diberi
pereaksi
oksidase
(1%
NNN’N’-tetramethyl-p-phenylene
diamine
dihydrochloride). Reaksi dinyatakan negatif jika tidak ada perubahan warna pada kertas saring dan positif jika terjadi perubahan warna biru keunguan pada goresan dalam waktu 10 detik. Uji katalase. Gelas objek ditetesi larutan H2O2 3% 1 tetes. Isolat diambil dengan jarum Őse kemudian dicampurkan pada reagen H2O2 pada gelas objek. Reaksi positif apabila terbentuk gelembung-gelembung udara kurang dari 10 detik. Uji Sitrat. Pengujian dilakukan dengan menginokulasikan isolat ke Simmon’s citrate agar. Tabung diinkubasi pada suhu 37 °C selama 4 hari di inkubator CO2. Hasil uji positif apabila media biru. Penggunaan CO2. Bakteri dilakukan pengujian kebutuhan karbondioksida dengan melakukan subkultur pada dua agar miring dan diinkubasi, satu tabung dengan menambahakan 5 % CO2 dan tabung lainnya tanpa CO2. Pengamatan dilakukan setelah 3 - 4 hari inkubasi. Penentuan kebutuhan CO2 berdasarkan kemampuan bakteri tumbuh pada tabung dengan CO2 atau tanpa CO2. Produksi H2S. Pengujian dilakukan dengan menginokulasikan isolat ke TSA miring dan dilengkapi dengan strip kertas yang mengandung Pb asetat 10% yang ditempatkan di lubang tabung, tapi tidak kontak dengan medium. Kertas Pb asetat akan berubah menjadi hitam apabila diproduksi H2S. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 4 hari.
25
Aktifitas urease. Pengujian dilakukan dengan menginokulasikan isolat ke ke urea agar base miring yang mengandung urea supplement 4%.
Tabung
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 4 hari di inkubator CO2. Hasil uji positif apabila media berubah menjadi purple – pink. Pertumbuhan pada zat warna basic fuchsin dan thionin. Isolat ditumbuhkan pada medium TSA yang mengandung thionin dengan kadar 1 : 25.000, 1 : 50.000 dan 1: 100.000 dan basic Fuchin dengan kadar 1 : 50.000 dan 1: 100.000. Pengamatan dilakukan setelah 3 sampai 4 hari. Isolat yang peka maka tidak tumbuh pada media TSA yang mengandung zat warna tersebut, dan sebaliknya yang tidak peka maka akan tumbuh. Uji
aglutinasi.
Isolat
Brucella
diuji aglutinasi
dengan
Brucella
monospesific A serum (A) dan Brucella monospesific M serum (M). Pengujian dilakukan dengan mencampur masing-masing serum monospesifik A atau M dengan suspensi isolat pada gelas objek. Reaksi positif ditunjukkan dengan terjadinya aglutinasi.
Iradiasi sinar Gamma B. abortus Jumlah koloni B. abortus sebelum perlakuan iradiasi dapat dihitung secara tidak langsung dengan membuat kurva standar B. abortus. Pembuatan kurva standar adalah sebagai berikut isolat B. abortus dari TSA miring diinokulasikan ke 75 ml TSB, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 hari di inkubator CO2 dengan penambahan 5% CO2. Selanjutnya suspensi diukur absorbansi (Optical Density, OD) menggunakan spektrofotmeter pada panjang gelombang 640 nm. Suspensi yang telah diukur absorbansinya selanjutnya dilakukan pengenceran berseri dan ditanam ke TSA. Bakteri diinkubasi selama 3 hari dengan menambahakan 5 % CO2 di inkubator CO2. Kemudian jumlah koloni dihitung pada masing - masing pengenceran, dan dibuat kurva standar dengan menggambar hubungan antara nilai absorbansi dengan jumlah koloni bakteri. Iradiasi dilakukan mengikuti metode El – Zawahry & Grecz 1981; Cassidy II 2010; Enright et al. 2001. B. abortus dikultur pada media TSA miring pada suhu 37° C selama 3 hari. Bakteri dipanen dari TSA dengan menambahkan 5 ml larutan saline. Kemudian suspensi dimasukkan ke botol Roux yang mengandung
26 TSA, botol Roux digoyang – goyang supaya suspensi menyebar rata pada permukaan botol. Brucella diinkubasi sesuai fase log titik pertumbuhan tercepat pada suhu 37°C selama 3 hari di inkubator CO2. Kultur dipanen dengan menambahkan larutan saline ke botol Roux kemudian kultur disentrifugasi selama 10 – 15 menit pada 3000 rpm dengan sentrifuse Sorvall berpendingin (2 - 4°C). Supernatan dibuang dan pelet dicuci dua kali dengan larutan saline. Setelah pencucian, kepadatan sel dihitung dengan menggunakan spektrofotometer sehingga konsentrasi 108 Colony forming units (CFU)/ml. Suspensi ditempatkan dalam 5 microtube untuk diradiasi pada dosis 0, 50, 100, 150, dan 200 Gy dalam iradiator Gamma Chamber di PATIR BATAN. Setelah itu suspensi bakteri ditanam pada media TSA dan diinkubasi selama 3 – 5 hari pada 37 °C dengan 5 % CO2. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh dihitung sehingga dapat ditentukan dosis radiasi yang menyebabkan kematian 50% (Lethal Dose 50, LD50). Uji in vivo B. abortus iradiasi ke marmot (Cavia cobaya) Metode pengujian in vivo merupakan modifikasi OIE (2009). Pengujian ini digunakan untuk mengetahui efek pemberian strain B. abortus iradiasi yang dilemahkan sebagai kandidat vaksin. Pada penelitian ini menggunakan 8 ekor marmot jantan dengan bobot badan kira – kira 650 gram. Marmot diaklimatisasi selama 1 minggu sebelum penelitian dan dibagi dalam 8 kelompok (Tabel 2). Tabel 2 Kelompok, volume dan dosis bakteri perlakuan pada uji in vivo Perlakuan
Perlakuan
Volume injeksi (ml) 0,1
Dosis bakteri (CFU)/marmot 103
KI
B. abortus SBDG-13C strain lapang, SC
KII
B. abortus CH09-BL strain lapang, SC
0,1
103
KIII
B. abortus CAM-08/306 strain lapang, SC
0,1
103
KIV
B. abortus SBDG-13C iradiasi, SC
0,1
108
KV
B. abortus CH09-BL iradiasi, SC
0,1
108
KVI
B. abortus CAM-08/306 iradiasi, SC
0,1
108
KVII
vaksin B. abortus S19 (kontrol positif), IM
0,13
109
KVIII
kontrol negatif, SC
0,1
Saline
Keterangan : SC = subcutan; IM = intramuscular
27
Jumlah CFU/ml dihitung dengan pengenceran berseri berdasarkan standard plate counts pada media TSA untuk mengkonfirmasi perkiraan jumlah koloni tersebut (Olsen 2000). Pengujian dilakukan selama 3 minggu. Kelompok kontrol negatif (KVIII) dipelihara diruang terpisah dari kelompok lainnya. Marmot diberi pakan rumput, ubi dan konsentrat. Pengambilan data serum dilakukan setiap minggu yaitu pada minggu ke 0 (sebelum perlakuan), minggu ke-1, minggu ke-2, dan minggu ke-3. Marmot dibius terlebih dahulu untuk pengambilan darah dengan ketamin dosis 40 mg/kg berat badan dan xylazin dosis 5 mg/kg berat badan secara intraperitoneal (Meredith & Redrobe 2002). Tiga minggu setelah infeksi, semua marmot dieuthanasi dengan pemberian ketamin dan xylacin. Limpa dari marmot diambil secara aseptik selanjutnya ditimbang dan dibuat suspensi dan dibiakkan pada media TSA yang ditambahkan Brucella selective supplement. Sampel serum dipisahkan dari darah kemudian disimpan pada suhu - 20°C untuk pemeriksaan serologi RBT dan CFT. Parameter yang digunakan untuk mengetahui uji ini yaitu pengamatan lesi (pembesaran limpa dan atau nodul), jumlah koloni per gram limpa dan perbandingan berat limpa/bobot badan. Perhitungan bakteri dalam limpa marmot. Masing-masing limpa dilepaskan secara aseptik dan ditimbang beratnya. Selanjutnya limpa dihancurkan menggunakan pelumat secara aseptik dengan menambahkan larutan saline 1 : 1 kemudian suspensi limpa dibuat seri pengenceran. Setiap pengenceran dikultur pada media TSA yang ditambahkan Brucella selective supplement kemudian diratakan dengan spreader dan diamkan beberapa menit. Bakteri diinkubasi pada 37 ºC selama 3 – 4 hari di inkubator CO2 dengan 5 % CO2. Jumlah koloni Brucella per gram limpa yang tumbuh dilakukan penghitungan (Alton et al. 1988; OIE 2009).
Analisis data Data yang diperoleh dianalisa menggunakan statistik deskriptif dengan menyajikan dalam bentuk tabel dan grafik serta dianalisa menggunakan software Graffit versi 13 (Mattjik & Sumertajaya 2002).
