1
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Infeksi merupakan penyakit yang sering terjadi di daerah tropis (Kuswandi et al., 2001). Infeksi dapat ditularkan dari satu orang ke orang lain atau dari hewan ke manusia yang disebabkan oleh berbagai mikroorganisme seperti bakteri, virus, riketsia, jamur, dan protozoa yang dari waktu ke waktu terus berkembang (Gibson, 1996). Penyakit infeksi dapat disebabkan oleh bakteri. Beberapa bakteri yang dapat menyebabkan infeksi di antaranya Staphylococcus aureus. Bakteri tersebut merupakan penyebab infeksi pada manusia yang paling sering. S. aureus dapat menyebabkan sepsis pada luka bedah, abses payudara wanita, mata lengket, dan lesi kulit pada bayi (Gibson, 1996). Penanggulangan infeksi oleh mikroorganisme memerlukan obat-obat yang mempunyai daya kerja optimal dan efek samping kecil. Dewasa ini, penggunaan antibiotik sangat banyak terutama dalam pengobatan yang berhubungan dengan infeksi. Kenyataan menunjukkan bahwa masalah penyakit infeksi terus berlanjut. Hal tersebut terjadi akibat resistensi bakteri terhadap antibiotik. Sehingga diperlukan usaha pengembangan obat tradisional untuk menunjang peningkatan taraf kesehatan masyarakat. Benalu telah dikenal dan diketahui oleh masyarakat luas sebagai salah satu tanaman yang mempunyai khasiat sebagai obat (khususnya benalu teh)
1
2
(Darmawan et al., 2004). Pada awalnya benalu merupakan parasit yang tidak bermanfaat, namun saat ini tanaman benalu bermanfaat sebagai agen kemopreventif, misalnya benalu teh dan benalu mangga yang dimanfaatkan sebagai obat antikanker. Pada umumnya benalu digunakan sebagai obat campak, sedangkan benalu jeruk nipis dimanfaatkan sebagai ramuan obat untuk penyakit amandel (Ikawati et al., 2008). Mangga (Mangifera indica L.) sebagai inang benalu mangga diketahui mengandung vitamin C, vitamin E, karotenoid, dan fenolik yang dapat beraktivitas sebagai antioksidan dan antikanker payudara pada tikus (Garcia-Solis et al., 2008). Kandungan mangiferin pada mangga memiliki aktivitas sebagai antioksidan, analgesik, antidiabetes, antiinflamasi, antitumor, imunomodulator, dan anti-HIV (Nunez-Selles, 2005; Masibo dan He, 2009). Berardini et al. (2006) menyatakan kandungan mangga dapat beraktivitas sebagai antioksidan antara lain pektin, polifenol, flavonol glikosida, xanton glikosida, mangiferin, dan kuersetin 3-O-glikosida. Penelitian yang dilakukan El-Mahmood (2009) menunjukkan bahwa kandungan senyawa mangga yaitu tanin, saponin, fenol, glikogen, alkaloid, flavonoid, dan glikosida jantung memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia
coli,
Streptococcus
pneumonia,
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas aeruginosa, dan Klebsiella pneumoniae. Doughari dan Manzara (2008) meneliti aktivitas antibakteri mangga dengan kandungan senyawa yang diketahui berdasarkan analisis fitokimianya antara lain tanin, glikosida, saponin, dan
fenol
terhadap
Staphylococcus
aureus,
Streptococcus
pyogenase,
Streptococcus pneumoniae, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas
3
aerugenosa, Proteus mirabilis, Salmonella thypi, dan Shigella flexnerri. Penelitian lain menunjukkan lima jenis flavonoid memiliki aktivitas sebagai antibakteri terhadap Azospirillium lipoferum dan Bacillus sp. (Kanwal et al., 2009). Benalu mangga (Dendrophthoe petandra) merupakan tanaman parasitik dari famili Loranthaceae. Bagian dari tumbuhan benalu mangga yang berkhasiat sebagai tanaman obat adalah bagian daunnya (Katrin et al., 2005). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa Dendrophthoe petandra dalam bentuk isolat flavonol glikosida ekstrak etanol aktif sebagai antioksidan dengan IC50 5,19 µg/mL (Artanti et al., 2006). Isolat flavonoid herba benalu mangga mampu menghambat pertumbuhan kanker pada mencit dengan dosis 2,44 mg/0,2 mL (Sukardiman et al., 1999). Darmawan et al. (2004) telah melakukan penelitian terhadap lima jenis benalu, jenis benalu Scurulla sp. dan Dendrophthoe pentandra memberikan hasil aktivitas antioksidan yang cukup tinggi dengan IC50 sebesar 26,7 dan 23,9 ppm, sementara benalu Dendrophthoe of Umbullata dan Macrosolen cochinchinensis juga mempunyai aktivitas antioksidan yang cukup aktif dengan nilai IC50 sebesar 66,8 dan 62,9 ppm, sedangkan benalu Helixanthera setigera mempunyai aktivitas antioksidan yang rendah dengan IC50 sebesar 118,2 ppm. Penelitian lain menyebutkan famili Loranthaceae memiliki konsentrasi bunuh minimal terhadap S. aureus sebesar 8% (Agustiningsih, 2010). Berdasarkan beberapa penelitian, senyawa yang terkandung dalam benalu adalah flavonoid, yaitu kuersetin. Senyawa ini berperan dalam aktivitas antioksidan dan antibakteri (Ikawati et al., 2008). Penelitian lain menyebutkan
4
kandungan senyawa dalam Dendrophthoe petandra adalah flavonol glikosida, yaitu kuersitrin (kuersetin-3-O-ramnosida) (Artanti et al., 2006). Fatma (2008) melakukan penelitian pada produk oksidasi kuersetin terhadap S. aureus dan E. coli dengan perolehan diameter hambat aktivitas antimikroba kuersetin pada konsentrasi larutan uji sebesar 2 hingga 3 mg/mL. Kuersetin merupakan flavonoid yang termasuk dalam kelas flavon-3-ol. Kuersetin berupa flavonoid yang banyak terkandung pada teh, bawang putih, dan apel (Ebadi, 2002). Senyawa ini memiliki struktur dengan beberapa gugus fenol. Gugus fenol ini umumnya digunakan sebagai desinfektan. Persenyawaan fenolat dapat bersifat bakterisidal atau bakteriostatik tergantung konsentrasi yang digunakan. Senyawa fenolat bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel dan merusak membran sel (Pelczar dan Chan, 1988). Waji dan Sugrani (2009) menyatakan bahwa kandungan kuersetin paling banyak tersari pada penggunaan pelarut semipolar. Hal ini dicontohkan pada tanaman costmary (Tanacetum balsamita L.). Pelarut semipolar yang digunakan dalam fraksinasi adalah etil asetat. Uji aktivitas antibakteri menggunakan fraksi semipolar ekstrak etanol Dendrophthoe petandra. Fraksi semipolar diujikan pada bakteri S. aureus menggunakan metode dilusi cair. Metode dilusi merupakan metode uji antibakteri dan senyawa aktif antibakteri yang dicampur dan diinokulasi dalam media. Hasil inokulasi dibandingkan dengan kontrol (tanpa senyawa aktif) hingga diperoleh konsentrasi senyawa aktif yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (Amsteldijk, 2001).
5
B. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan tersebut, maka dapat dirumuskan beberapa permasalahan sebagai berikut: 1.
Apakah fraksi semipolar ekstrak etanol daun benalu mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan berapakah Konsentrasi Hambat Minimalnya (KHM)?
2.
Senyawa kimia apa yang terdapat dalam fraksi semipolar ekstrak etanol daun benalu mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.) yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus?
C. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1.
Mengetahui aktivitas antibakteri fraksi semipolar ekstrak etanol daun benalu mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.) terhadap Staphylococcus aureus dengan menentukan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM)
2. Mengidentifikasi senyawa kimia dalam fraksi semipolar ekstrak etanol daun benalu mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.)
D. Tinjauan Pustaka 1.
Benalu Mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.)
a.
Sistematika Tanaman
6
Benalu mangga merupakan salah satu keluarga Loranthaceae dengan sistematika tanaman sebagai berikut: Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Viridaeplantae
Phylum
: Tracheophyta
Subphylum
: Euphyllophytina
Class
: Magnoliopsida
Subclass
: Rosidae
Ordo
: Santalales
Family
: Loranthaceae
Genus
: Dendrophthoe
Spesies
: Dendrophthoe pentandra (L.) Miq. (Hua-Shing dan Yeou-
ruenn, 1988). b. Manfaat Tanaman Berdasarkan pengalaman, benalu yang menempel pada tumbuhan tertentu telah digunakan dalam pengobatan tradisional. Benalu pada umumnya digunakan sebagai obat campak, amandel, dan kanker (Ikawati et al., 2008). c. Kandungan Kimia Kandungan kimia yang terdapat dalam benalu adalah flavonoid, tanin, asam amino, karbohidrat, alkaloid, dan saponin. Kuersetin adalah senyawa flavonoid utama yang terkandung dalam benalu tersebut. Senyawa tersebut merupakan marker taksonomi dari keluarga Loranthaceae (Ikawati et al.,
7
2008). Katrin et al. (2005) menyebutkan dalam isolat benalu mangga mengandung senyawa golongan steroid (β-sitosterol) dan golongan flavonoid (kuersitrin). 2. Ekstraksi Ekstraksi adalah penarikan zat aktif yang diinginkan dari bahan mentah obat menggunakan pelarut yang dipilih sehingga zat yang diinginkan akan larut. Pemilihan sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimal dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1989). Ada beberapa metode dasar ekstraksi yang dipakai untuk penyarian yaitu maserasi, perkolasi, sokhletasi (Anonim, 1986). Metode penyarian yang akan digunakan tergantung dari wujud dan kandungan bahan yang akan disari. Pemilihan metode penyarian disesuaikan dengan kepentingan untuk memperoleh kandungan kimia yang diinginkan (Harborne, 1996). Penelitian ini menggunakan metode penyarian maserasi. Maserasi merupakan proses penyarian yang paling sederhana dan banyak digunakan. Teknik ini biasanya digunakan jika kandungan organik yang ada dalam bahan tumbuhan tersebut cukup tinggi dan telah diketahui jenis pelarut yang dapat melarutkan senyawa yang akan diisolasi. Maserasi dilakukan dengan cara merendam bahan-bahan tumbuhan yang telah dihaluskan dalam pelarut terpilih. Penyimpanan dilakukan dalam waktu tertentu, ruang yang gelap dan sesekali diaduk. Metode ini memiliki keuntungan yaitu cara pengerjaannya yang mudah,
8
alat yang digunakan sederhana, cocok untuk bahan yang tidak tahan pemanasan namun pelarut yang digunakan cukup banyak (Anonim, 1986). 3.
Fraksinasi Fraksinasi merupakan proses pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak
berdasarkan perbedaan tingkat kepolarannya. Salah satu metode yang dapat digunakan dalam fraksinasi adalah Kromatografi Cair Vakum (KCV) (Gambar 1). Prinsip dasar KCV ini adalah pemisahan secara adsorpsi dan partisi yang dipercepat dengan bantuan pompa vakum (Hostettmann et al., 1997). Keuntungan KCV dibandingkan dengan kromatografi konvensional terletak pada jumlah fase gerak yang digunakan. Pada KCV, konsumsi fase gerak hanya 80% atau lebih sedikit dibandingkan dengan kromatografi konvensional, sedangkan kekurangan metode ini adalah membutuhkan waktu yang cukup lama (Hostettmann et al., 1997). Kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kemasan rapat yang maksimal, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penyerap lalu di vakum kembali. Kolom dihisap sampai kering dan siap dipakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, mulai pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan (Hostettmann et al., 1997).
Gambar 1. Kromatografi Cair Vakum
9
4.
Staphylococcus aureus
a.
Sistematika Sistematika Staphylococus aureus adalah sebagai berikut:
b.
Divisi
: Protophyta
Kelas
: Schizomycetes
Bangsa
: Eubacteriales
Suku
: Micrococcaceae
Marga
: Staphylococcus
Jenis
: Staphylococcus aureus (Salle, 1961).
Anatomi dan Fisiologi Staphylococcus bersifat patogen, non motil, dan memproduksi katalase (Levinson, 2004). Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, tak bergerak dan dapat tumbuh pada berbagai media pada suasana aerob. Bakteri ini dapat memfermentasikan beberapa karbohidrat dan dapat menghasilkan pigmen yang berwarna, tidak dapat larut air (Jawetz et al., 2001).
c.
Patogenesis S. aureus merupakan bakteri patogen yang bersifat invasif, menyebabkan hemolisis, dapat membentuk koagulase, mencairkan gelatin, serta mampu membentuk pigmen kuning emas. S. aureus dapat memfermentasi manitol dan dapat menghemolisis sel darah merah (Warsa, 1994). Penyakit yang disebabkan oleh S. aureus antara lain pneumonia, meningitis, endokarditis, dan infeksi kulit. Beberapa antibiotik yang dapat
10
digunakan untuk menghambat S. aureus antara lain ampisilin, penisilin, tetrasiklin, kloksasilin, sefalosporin, vankomisin, dan metisilin (Jawetz et al., 2005). 5. Uji Aktivitas Antibakteri Antibakteri adalah suatu senyawa yang dalam konsentrasi kecil mampu menghambat bahkan membunuh proses kehidupan suatu mikroorganisme (Jawetz et al., 2005). Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri yang dikenal sebagai bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh bakteri dikenal sebagai bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat atau membunuh bakteri, masing-masing dikenal sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) (Ganiswara et al., 1995). Pengujian terhadap aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu: a.
Agar difusi Media yang dipakai adalah agar Mueller Hinton. Pada metode difusi ini ada
beberapa cara, yaitu: 1) Cara Kirby Bauer Beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam diambil, disuspensikan ke dalam 0,5 mL BHI cair, diinkubasikan 5-8 jam pada 37ºC. Suspensi ditambah akuades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi bakteri 108 CFU/mL. Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi bakteri lalu ditekan-tekan pada dinding tabung hingga kapasnya
11
tidak terlalu basah, kemudian dioleskan pada permukaan media agar hingga rata. Kemudian diletakkan kertas samir (disk) yang mengandung antibakteri di atasnya, diinkubasikan pada 37ºC selama 18-24 jam. Hasilnya dibaca: (a) Zona radikal yaitu suatu daerah di sekitar disk di mana sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibakteri diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal. (b) Zona iradikal yaitu suatu daerah di sekitar disk di mana pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibakteri, tetapi tidak dimatikan (Anonim, 1993). 2) Cara Sumuran Beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam pada media agar diambil, disuspensikan ke dalam 0,5 mL BHI cair, diinkubasikan 5-8 jam pada 37ºC. Suspensi ditambah akuades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi bakteri 108 CFU/mL. Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi bakteri lalu ditekan-tekan pada dinding tabung hingga kapasnya tidak terlalu basah, kemudian dioleskan pada permukaan media agar hingga rata. Media agar dibuat sumuran diteteskan larutan antibakteri, diinkubasikan pada 37ºC selama 18-24 jam. Hasilnya dibaca seperti cara Kirby Bauer (Anonim, 1993). 3) Cara Pour Plate Beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam pada media agar diambil, disuspensikan ke dalam 0,5 mL BHI cair, diinkubasikan 5-8 jam pada 37ºC. Suspensi ditambah akuades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi bakteri 108 CFU/mL. Suspensi bakteri diambil
12
satu mata ose dan dimasukkan ke dalam 4 mL agar base 1,5% yang mempunyai suhu 50ºC. Setelah suspensi kuman tersebut homogen, dituang pada media agar Mueller Hinton, ditunggu sebentar sampai agar tersebut membeku, kemudian diletakkan disk di atas media dan dieramkan selama 1520 jam dengan temperatur 37ºC. Hasilnya dibaca sesuai standar masingmasing antibakteri (Anonim, 1993). b.
Dilusi cair/ dilusi padat Pada
prinsipnya
antibakteri
diencerkan
sampai
diperoleh
beberapa
konsentrasi. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam media. Sedangkan pada dilusi padat tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar, kemudian ditanami bakteri. Metode dilusi cair adalah metode untuk menentukan konsentrasi minimal dari suatu antibakteri yang dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme. Konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan tidak adanya kekeruhan disebut Kadar Hambat Minimal (KHM) atau Minimal Inhibitory Concentration (MIC) (Anonim, 1993). 6.
Kromatografi Jenis kromatografi yang digunakan untuk menganalisis senyawa secara
kualitatif dan kuantitatif adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Kromatografi Lapis Tipis berupa bahan yang berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan sebagai bercak atau pita. Setelah pelat diletakkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang
13
yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan atau dideteksi (Stahl, 1985). Hasil KLT ditentukan oleh fase diam (penyerap), fase gerak (pelarut), dan teknik kerja. Teknik kerja meliputi atmosfer bejana dan jenis pengembangan. Kondisi awal keberhasilan metode ini ditentukan oleh fase diam, fase gerak, bejana pemisah, cuplikan, cara dan jumlah penotolan, pembuatan cuplikan, dan deteksi senyawa yang dipisahkan (Harborne, 1996). Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penjerap. Besar kecil dan homogenitas penjerap sangat berpengaruh dalam proses pemisahan. Salah satu cara untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penjerap yang butirannya halus (Sastrohamidjojo, 1991). Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas beberapa pelarut yang bermutu baik. Pelarut tunggal dapat menggerakkan bercak terlalu jauh, untuk mengatasi hal tersebut digunakan pelarut campuran (Stahl, 1985). a.
Penilaian visual Pada penilaian visual kromatogram, hal yang dapat diamati adalah:
1) Jarak pengembangan komponen larutan cuplikan dibandingkan dengan jarak pengembangan larutan pembanding. 2) Fluoresensi/pemadaman fluoresensi (warna). 3) Perbandingan dan luas bercak memberikan informasi angka banding kuantitatif (Stahl, 1985).
14
b.
Pereaksi kimia Beberapa pereaksi kimia yang dapat digunakan untuk mendeteksi kandungan
kimia yang terdapat dalam fraksi aktif, antara lain: 1) Pereaksi vanilin-asam sulfat, untuk mendeteksi terpenoid, propilpropanoid, senyawa pedas dan pahit, dan saponin. Reagen ini stabilitasnya kecil dan tidak akan berfungsi lagi ketika warna berubah dari merah-violet. 2) Pereaksi Dragendorff, untuk mendeteksi alkaloid dan komponen nitrogen heterosiklik. 3) Pereaksi sitroborat, untuk mendeteksi senyawa flavonoid. Bercak berwarna kuning setelah pemanasan dilihat di UV 366 nm. 4) Pereaksi FeCl3, untuk mendeteksi senyawa fenolik. Bercak berwarna abu-abu hingga hijau sampai biru setelah pemanasan. 5) Pereaksi Liebermann Burchard, untuk mendeteksi triterpen, steroid (saponin, rasa pahit). Saponin steroid bercak berwarna biru atau hijau, untuk triterpenoid bercak berwarna merah, merah jambu, ungu/violet (Stahl, 1985).
E. Landasan Teori Benalu mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.) mengandung senyawa kimia flavonoid, tanin, asam amino, karbohidrat, alkaloid, dan saponin. Ekstrak etanol benalu spesies Dendrophthoe petandra (L.) Miq. mengandung senyawa flavonoid kuersetin, yaitu suatu flavonol glikosida yang merupakan marker taksonomi dari famili Loranthaceae (Ikawati et al., 2008). Kuersetin memiliki struktur fenol sehingga dapat beraktivitas sebagai antibakteri. Fenolat ini berperan
15
dalam mendenaturasi protein dan merusak membran sel bakteri (Pelczar dan Chan, 1988). Kuersetin dapat dipisahkan dari ekstrak dengan penambahan pelarut semipolar etil asetat (Waji dan Sugrani, 2009). Menurut Fatma (2008) kuersetin memiliki aktivitas antibakteri pada S. aureus dan E. coli pada konsentrasi larutan uji sebesar 2-3 mg/mL.
F. Hipotesis Fraksi semipolar ekstrak etanol daun benalu mangga (Dendrophthoe petandra (L.) Miq.) mengandung senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.
