Berita Biologi Vol. 4, No. 5,Januari 1999
ANALISIS VARIASI GENETIK Saccharomyces cerevisiae Dl TAHAN ETANOL DENGAN RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)* [Genetic Variation Analysis of Ethanol Tolerance Yeast, Saccharomyces cerevisiae Dl by Using RAPD] Heddy Julistiono, Titin Yulineri dan Sukamto Hanjono i
''
'
Balitbang Mikrobiologi, Puslitbang Biologi-LIPI, Bogor
ABSTRACT Genetic variations among 3 cultures, which were treated with or without Mn of Saccharomvces cerevisiae D1, were analyzed using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA ) technique. The Mn-treatment of three cultures were as follows: the culture KMn was D1 strain, the culture Mn+ was D1 strain colony survived in ethanol 20%, which was previously treated with 0,5 mU MnSOt and the culture Mn- was a D1 colony survived in ethanol 20% without MnSOi treatment. Polymorphism of total DNA of the three cultures may indicate that mutation may occur in cells which were tolerant to ethanol. The locus or base change was not identified. However, since the oxygen uptake rate of the three cultures at catabolite derepression state were identical, the results suggest that the locus may not be in mitochondrial DNA encoding respiratory chain proteins. The relation between DNA polimorphic and ethanol tolerant cell is still to be clarified. Kafa kunci/keywords: khamir/yeast, Saccharomvces cerevisiae, RAPD, variasi genetik/genetic variation, set tahan ethanol/ethanol tolerance cell.
PENDAHULUAN Pada penelitian sebelumnya, Julistiono dan Triana (1998) menunjukkan bahwa keberadaan 0,5 mM MnSO4 dalam media pertumbuhan, dapat menaikkan jumlah sel Saccharomyces cerevisiae D2 yang tetap hidup dalam etanol 20% selama satu jam. Naiknya jumlah sel yang selamat ini diduga berkaitan dengan induksi enzim Mn-Superoksid Dismutase (Mn-SOD). Enzim superoksid dismutase (SOD) diyakini berperan dalam proses pertahanan diri sel akibat bahaya molekul oksigen reaktif (O2") (McCord, et al., 1971; Gregory el ah, 1973). Etanol diduga dapat menimbulkan adanya reduksi molekul oksigen dalam sel hati tikus sehingga ternbentuk molekul yang reaktif (Valenzuela et ah, 1979). Dalam proses fermentasi etanol, khamir mengalami stres oleh etanol yang serupa, terutama pada fase "post-diauxic" (Costa et ah, 1993). Etanol yang terbentuk sebagai hasil fermentasi dapat mengakibatkan efek toksik tersebut terhadap sel khamir. Selanjutnya, penelitian Costa et al. (1997) menunjukkan adanya
indikasi kuat bahwa molekul oksigen reaktif lebih efektif terbentuk dalam mitokhondria yang rantai respirasinya lengkap daripada yang tidak lengkap. Dari dua macam SOD khamir S. cerevisiae, yakni SOD 1 (CuZn-SOD) dan SOD 2 (Mn-SOD), SOD 2 lebih berperan sebagai faktor ketahanan sel terhadap etanol. Dengan adanya SOD 2, O2 akan dikonversi menjadi H2O2. Kemudian katalase akan merubahnya menjadi H2O dan O2 sehingga kerusakan molekul-molekul penyusun sel akibat radikal bebas dapat dihindari (Chance et ah, 1979). Adanya sel yang masih tahan hidup walau tanpa perlakukan MnSO4 sebelumnya, menimbulkan pertanyaan tentang kemungkinan adanya variasi genetik pada sel anakan yang tahan etanol, khususnya yang berasal dari DNA mitokondria. Untuk mempelajari hal ini, dianalisis polimorfisme DNA total 3 biak khamir, yakni KMn, Mn+, dan Mn-. Biak KMn adalah S.cerevisiae Dl. Biak Mn+ adalah biak yang berasal dari koloni yang sebelumnya tumbuh pada media mengandung 0,5 mM MnSO4 dan masih selamat dalam etanol 20%
• Penelitian ini dibiayai oleh Proyek Penelitian, Litbang & Peiidayagunaaii Biota Darat, Tolok Ukur K.arakterisasi Enzim Jasad renik.
229
Berita Biologi Vol. 4, No. 5, Januari 1 999
selama 1 jam. Biak Mn- adalah biak yang berasal dari koloni yang bisa selamat dari etanol 20% selama 1 jam, tanpa perlakuan dengn MnSO4 sebelumnya. Pendekatan biologi molekular untuk identifikasi khamir dapat lebih singkat dan akurat daripada metoda lain (Messner et al., 1994). Salah satu metoda untuk analisis genetika di tingkat molekular adalah RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). William et al. (1990) membuktikan bahwa RAPD merupakan metoda penanda genetik yang baik untuk pemetaan genetik; sidik-jari DNA, terutama untuk kajian genetika populasi. Keuntungan dari metoda RAPD antara lain: tidak diperlukannya penelitian awal seperti isolasi DNA probing hasil kloning, penyiapan filter untuk hibridisasi, serta pekerjaannya cukup sederhana. Identifikasi galur atau analisis variasi genetik intraspesifik khamir Candida zeylanoides dan Debaromyces hansenii dengan RAPD telah ditunjukkan oleh Romano et al. (1996). Karena teknik ini mencerminkan polimorfisme DNA total, sedang DNA mitokondria mudah mengalami mutasi, maka biak yang masih selamat dalam etanol 20% dianalisis kemampuan respirasinya.
BAHAN DAN CARA KERJA Khamir Khamir yang diuji adalah biak KMn, Mn+, dan Mn- berasal dari 5. cerevisiae Dl (biak industri pemberian Pabrik Etanol Madukismo, Yogyakarta). Biak KMn S. cerevisiae Dl. Biak Mn+ berasal dari biak S. cerevisiae Dl yang sebelumnya tumbuh pada media mengandung MnSO4 0,5 mM dan tetap hidup setelah diinkubasi pada etanol 20 % selama 1 jam. Sedang biak Mnberasal dari biak 5. cerevisiae Dl yang sebelumnya tumbuh pada media tanpa penambahn Mn dan tetap hidup setelah diinkubasi pada etanol 20% selama 1 jam.
230
Pertumbuhan khamir Khamir ditumbuhkan pada media yang mengandung 15% sukrosa, 0,04% "yeast extract", 0,04% bacto pepton, 9,5 mM KH2PO4, 8,3 mM (NH4) 2SO4, dan 0,6 mM MgSO4. Untuk isolasi koloni tahan etanol, biak ditumbuhkan pada medium "Yeast Malt Agar" yang mengandung 3g yeast extract, 3g malt extract, 5g bacto peptone, lOg glukosa, 20g agar dan 1 liter dHbO.
Pengukuran laju konsumsi oksigen Biak berumur 2 hari disentrifus pada 3000 g selama 5 menit. Setelah pencucian dengan akuades, pelet dibuat suspensi dalam air mengandung 2% etanol. Laju konsumsi oksigen dari suspensi tersebut diukur dengan DO-meter Horriba.
Ekstraksi DNA Prosedur analisis DNA mengacu pada teknik Fukatsu dan Ishikawa (1996) yang dimodifikasi. Sebanyak 2 ml suspensi biak dimasukkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml, kemudian disentrifus dengan kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit. Pelet dicuci dengan lml Te buffer dan disentrifus selama 1 menit, dengan kecepatan 15.000 rpm. Pelet diberi "Lysis buffer" (0,5% SDS dan 50 mM EDTA, pH 8) dan proteinase K, lalu ditambahkan glass beads dan dikocok selama 2 jam dengan "micro tube mixer" (Tomy MT-360). Setelah itu suspensi dipindahkan ke eppendorf yang baru dan ditambahkan 500 ul fenol dan dikocok perlahan selama 10 menit dengan menggunakan "Labo shaker" (BC-730), lalu disentrifus selama 5 menit, 15.000 rpm. Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke eppendorf lalu ditambahkan dengan 500 ul chloroform, dikocok perlahan selama 10 menit dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 15.000 rpm. Supernatan dipindahkan ke eppendorf baru dan ditambah dengan isopropanol 600 ul sehingga terjadi presipitasi DNA. Pencucian DNA dilakukan
Berita Biologi Vol. 4, No. 5, Januari 1 999
dengan penambahan alkohol 80% (dingin) dan disentrifuse dengan kecepatan 15.000 rpm selama 5 menit. Pelet (DNA) yang diperoleh kemudian dikeringkan. Setelah kering, pelet ditambahkan 20 ul "Te buffer" (10 mM Tris HC1 pH 8.0 dan 1 mM EDTA).
Pengukuran konsentrasi DNA Untuk mengukur konsentrasi DNA sebelum dilakukan amplikasi DNA "PCR", DNA hasil ekstraksi diencerkan sedemikian rupa sehingga mencapai konsentrasi sekitar 20 ug/ml dengan TE buffer. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer Beckman DU 7400, dengan panjang gelombang 260 nm.
5' -GAT GGA TTT GGG-3' (All), 5' -TTC GGA CGA A T A - 3 ' (A12).
HASIL Tabel 2. Laju konsumsi O 2 pada kondisi derepresi katabolit *) Biak
Laju konsumsi O2 (10"5mg/menit/106 sel)
KMn Mn+ Mn-
9,4 7,95 8,8
*) Keterangan: media respirasi adalah etanol 2%
-KMn
Amplifikasi segmen-segmen DNA dengan "PCR" PCR dilakukan dalam tabung eppendorf 0.5 ml, dengan "Program Temp Control System" (Quick Thermo Personal) QTP-1. Masing masing eppendorf berisi 4 ul campuran reaksi yang'terdiri dari "LA buffer (Mg++ free)" lOx, 25 mM MgC12, dNTP 1 mM tiap basa, primer 10 pmol/ ml, dH2O, tag polymerase dan 1 ja.1 sampel DNA lalu ditambahkan 1 tetes mineral oil. Kondisi PCR diawali dengan tahap denaturasi dengan suhu 94°C selama 2 menit, diikuti dengan 40 siklus terdiri atas 94°C selama 1 menit, 40°C 1 menit , 60°C 3 menit, dan tahap akhir yakni 60° 3 menit. Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis 2% gel agorose ( MUPID, 100 volt), dengan "TAE buffer". Pita-pita DNA ditampakkan dengan pengecatan ethidium bromide dan difoto dengan 'transmitted u.v. light and Polaroid film'. Polimorfisme DNA dianalisis dengan analisis "cluster" menggunakan program phylip 3.572 Power Mac Exe. Primer yang digunakan adalah: 5'-AGCAGCGCCTCA-3' (A05), 5'-TGC CTC GCA CCA - 3 ' (A07), 5' -GCC CCG TTA GCA - 3 ' (A08), 5'-CCGCAGTTAGAT-3' (A09),
Mn+
Mn-
0,1 Gambar 2. Dendogram karakter DNA total berdasarkan PCR dari S.cerevisiae Dl induk (KMn), isolat turunan yang tahan etanol dengan penambahan Mn (Mn+), dan isolat turunan tahan etanol tanpa penambahan Mn (Mn-). Contoh dari polimorfisme disajikan dalam Gambar 1. Ketidaksamaan pola DNA atau adanya polimorfisme DNA ini ditunjukkan oleh adanya "Alel spesifik" (ditunjukkan oleh simbol panah), yaitu pita yang terdapat pada satu strain tapi tidak pada strain yang lain. Matriks keberadaan alel spesifik pada masing-masing biak tersaji pada Tabel 1. Dari dendogram yang tersaji pada Gambar 2 terlihat bahwa isolat-isolat turunan yang tahan
231
Berita Biologi Vol. 4, No. 5, Januari 1 999
terhadap etanol (Mn+ dan Mn-) mempunyai sifat genetik yang berbeda dengan induknya (KMn). Kedua isolat yang tahan terhadap etanol terletak dalam satu "clade". Laju konsumsi O2 oleh biak KMn, Mn+, atau Mn- disajikan pada Tabel 2. KMn Mn- Mn+
Gambar 1. Polimorfisme DNA total biak induk (KMn), biak asal koloni tahan etanol setelah penambahan Mn (Mn+), dan biak asal koloni tahan etanol tanpa penambahan Mn (Mn-). Tanda panah menunjukkan alel spesifik.
PEMBAHASAN Alel spesifik timbul akibat adanya mutasi pada suatu uratan yang tidak diketahui sehingga proses "annealing " dari primer tidak terjadi pada segmen DNA dari strain yang tidak memiliki alel spesifik. Atau mungkin juga sebaliknya, yakni mutasi terjadi pada strain yang memiliki alel spesifik sehingga proses "annealing" justru dapat terjadi. Meskipun posisi serta jenis basa yang bermutasi tidak diketahui, adanya alel spesifik ini dapat menunjukkan adanya polimorfisme DNA dari masing-masing strain. Sumber lain penyebab polimorfisme ini antara lain adalah delesi dan insersi basa pada segmen tersebut (Williams et al., 1990). Polimorfisme DNA diragukan jika hasil apiplifikasi tidak jelas. Analisis genetik dengan RAPD ini tidak dapat menunjukkan hubungan filogenetik dari biakbiak tersebut, tetapi dari dendogram ini terlihat
bahwa biak-biak yang bisa selamat dari stres etanol, memiliki karakter genetik yang mirip Kemungkinan adanya variasi genetik yang terjadi ketika segregasi selama pembelahan sel dapat berhubungan dengan adanya galur-galur tersebut. Fungsi Mn terhadap munculnya sel yang dapat selamat dalam etanol 20% mungkin berhubungan dengan karakter fisiologi, terutama pada induksi aktivitas Mn-SOD seperti yang diduga pada sel S. cerevisiae D2 dan khamir TKHM1E3 (Julistiono danTriana, 1998). Seperti disinggung di atas, bahwa salah satu penyebab kematian oleh etanol adalah akibai timbulnya oksigen radikal bebas yang sangat reaktif. Sel dengan rantai respirasi sempurna lebih rentan terhadap etanol daripada sel yang tidak dapat melakukan respirasi. Karena khamir mudah mengalami mutasi pada DNA mitokondrianya. maka ada kemungkinan bahwa Mn+ dan Mnadalah galur yang satu atau lebih gen mitokondrianya mengalami mutasi sehingga kehilangan kemampuan respirasinya. Untuk menganalisis fenomena ini, kemampuan respirasi dari masing-masing galur diharapkan dapat merefleksikan keutuhan rantai respirasi tersebut. Laju konsumsi O2 oleh sel khamir yang diinkubasikan pada media mengandung etanol sebagai sumber karbon tunggal adalah kondisi "derepresi katabolit", yakni kondisi ketika enzimenzim yang dibutuhkan untuk respirasi disintesis atau diinduksi aktivitasnya, sedang aktivitas atau sintesis kelompok enzim untuk fermentasi terhambat (de Winde et al., 1977) sehingga laju konsumsi O2 benar-benar mencerminkan aktivitas respirasi dari mitokondria. Dari Tabel 2, terlihat bahwa laju konsumsi O2 ketiga biak tersebut adalah identik. Data ini menunjukkan bahwa kemampuan respirasi galur Mn+ dan Mn- masih tinggi. Dengan demikian, mutasi pada DNA mitokondria (rantai respirasi) tidak bisa ditunjukkan. Namun demikian untuk memastikan hal ini, perlu dilakukan analisis DNA mitokondria.
Berita Biologi Vol. 4, No. 5, Januari 1 999
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Dengan teknik RAPD ini, dapat ditunjukkan sel-sel yang secara genetik heterogen meski berasal dari satu biak. Data ini menunjukkan terjadinya mutasi pada koloni khamir jenis S. cerevisiae galur industri Dl yang sebelumnya ditumbuhkan pada media mengandung 0,5 mM MnSO4 dan tahan dalam etanol 20% selama 1 jam (galur Mn+ ) dan yang tahan etanol tanpa perlakuan dengan MnSC>4 (galur Mn-). Walaupun demikian, lokus terjadinya mutasi serta perubahan basa DNA pada kedua galur tersebut tidak dapat ditunjukkan. Karena aktivitas enzim-enzim respirasi, yang ditunjukkan oleh laju konsumsi O2 pada kondisi derepresi katabolit pada biak-biak yang tahan etanol serta biak induknya adalah identik, maka diduga bahwa mutasi mungkin tidak terjadi pada gen-gen pengkode protein rantai respirasi. Mengingat DNA mitokondria lebih mudah bermutasi daripada DNA khromosom, maka untuk mengetahui kemungkinan terjadinya mutasi pada DNA mitokondria, telaah lebih jauh dengan target DNA mitokondria masih diperlukan. Hubungan antara polimorfisme genetik dan ketahanan etanol juga masih perlu dipelajari. Kehadiran Mn yang dapat mengefektifkan kerja Mn-SOD dalam sistem perlindungan terhadap bahaya superoksid mungkin mempunyai efek sinergik terhadap sel yang secara genetik tahan terhadap etanol.
Costa V, Reis E, Quintanilha A and MoradasFerreira P. 1993. Acquisition of ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae: the key role of the mitichondrial superoxide dismutase. Archives of Biochemistry and Biophysic 300, 608-614. Costa V, Amorim MA, Reis E, Quintanilha A and Moradas-Ferreira P. 1997. Mitochondrial superoxide dismutase is essential for ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae in the post-diauxic phase. Microbiology 143, 1649-1656. Chance B, Sies H and Boveris A. 1979. Hydroperoxide Metabolism in Mammalian Organ. Physiological Review 59, 527-605. De Winde JH, Thevelein JM, and Winderick J. 1997. From Feast to Famine: Adaptation to Nutrient Depletion in Yeast. In S. Hofmann and W.H. Mager : Yeast Stress Respons. Landes Bioscience USA, 7-52p.
UCAPAN TERIMA KASIH Tolok Ukur No 01.6316. Karakterisasi Enzim-Jasad Renik. Galur khamir diperoleh atas jasa baik rekan-rekan dari Pabrik Spiritus Madukismo, Yogyakarta. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Takema Fukatsu dari NIBH, Jepang atas bantuan teknik dalam analisis RAPD.
Fukatsu T and Ishikawa H. 1996. Phylogenetic Position of Yeast-like Symbiont of Hamiltonaphis styraci (Homoptera, Aphididae) Based on 18S rDNA Sequence . Insect Biochemistry and Molecular Biology 26, 383-388 Gregory EM, Yost Jr FJ and Fridovich I. 1973. Superoxide Dismutase of Escherichia coli: Intracellular Localization and Functions. Journal of Bacteriology 115, 987-991. Julistiono H dan Triana E. 1998. Peran Mn dalam proses fermentasi etanol pada khamir Saccharomyces cerevisiae D2 dan isolat indigenus T.K.H.M1.E3. Prosiding Seminar Nasional VI Persada Cabang Bogor, 15 Desember (in press). McCord JM, Keele Jr BB and Fridovich I. 1971. An enzyme based theory of obligate anaerobiosis; the physiological role of superoxide dismutase. Proceeding of
233
Berita Biologi Vol. 4, No. 5, Januari 1 999
terhadap etanol (Mn+ dan Mn-) mempunyai sifat genetik yang berbeda dengan induknya (KMn). Kedua isolat yang tahan terhadap etanol terletak dalam satu "clade". Laju konsumsi O2 oleh biak KMn, Mn+, atau Mn- disajikan pada Tabel 2. KMn Mn- Mn+
Gambar 1. Polimorfisme DNA total biak induk (KMn), biak asal koloni tahan etanol setelah penambahan Mn (Mn+), dan biak asal koloni tahan etanol tanpa penambahan Mn (Mn-). Tanda panah menunjukkan alel spesifik.
PEMBAHASAN Alel spesifik timbul akibat adanya mutasi pada suatu uratan yang tidak diketahui sehingga proses "annealing " dari primer tidak terjadi pada segmen DNA dari strain yang tidak memiliki alel spesifik. Atau mungkin juga sebaliknya, yakni mutasi terjadi pada strain yang memiliki alel spesifik sehingga proses "annealing" justru dapat terjadi. Meskipun posisi serta jenis basa yang bermutasi tidak diketahui, adanya alel spesifik ini dapat menunjukkan adanya polimorfisme DNA dari masing-masing strain. Sumber lain penyebab polimorfisme ini antara lain adalah delesi dan insersi basa pada segmen tersebut (Williams et al., 1990). Polimorfisme DNA diragukan jika hasil apiplifikasi tidak jelas. Analisis genetik dengan RAPD ini tidak dapat menunjukkan hubungan filogenetik dari biakbiak tersebut, tetapi dari dendogram ini terlihat
bahwa biak-biak yang bisa selamat dari stres etanol, memiliki karakter genetik yang mirip Kemungkinan adanya variasi genetik yang terjadi ketika segregasi selama pembelahan sel dapat berhubungan dengan adanya galur-galur tersebut. Fungsi Mn terhadap munculnya sel yang dapat selamat dalam etanol 20% mungkin berhubungan dengan karakter fisiologi, terutama pada induksi aktivitas Mn-SOD seperti yang diduga pada sel S. cerevisiae D2 dan khamir TKHM1E3 (Julistiono danTriana, 1998). Seperti disinggung di atas, bahwa salah satu penyebab kematian oleh etanol adalah akibai timbulnya oksigen radikal bebas yang sangat reaktif. Sel dengan rantai respirasi sempurna lebih rentan terhadap etanol daripada sel yang tidak dapat melakukan respirasi. Karena khamir mudah mengalami mutasi pada DNA mitokondrianya. maka ada kemungkinan bahwa Mn+ dan Mnadalah galur yang satu atau lebih gen mitokondrianya mengalami mutasi sehingga kehilangan kemampuan respirasinya. Untuk menganalisis fenomena ini, kemampuan respirasi dari masing-masing galur diharapkan dapat merefleksikan keutuhan rantai respirasi tersebut. Laju konsumsi O2 oleh sel khamir yang diinkubasikan pada media mengandung etanol sebagai sumber karbon tunggal adalah kondisi "derepresi katabolit", yakni kondisi ketika enzimenzim yang dibutuhkan untuk respirasi disintesis atau diinduksi aktivitasnya, sedang aktivitas atau sintesis kelompok enzim untuk fermentasi terhambat (de Winde et al., 1977) sehingga laju konsumsi O2 benar-benar mencerminkan aktivitas respirasi dari mitokondria. Dari Tabel 2, terlihat bahwa laju konsumsi O2 ketiga biak tersebut adalah identik. Data ini menunjukkan bahwa kemampuan respirasi galur Mn+ dan Mn- masih tinggi. Dengan demikian, mutasi pada DNA mitokondria (rantai respirasi) tidak bisa ditunjukkan. Namun demikian untuk memastikan hal ini, perlu dilakukan analisis DNA mitokondria.
