Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013
Analisis Sekuen Gen Proteinase Inhibitor (TcPIN) Terkait dengan Ketahanan Terhadap Penggerek Buah Kakao Mayta Novaliza Isda1 dan Tetty Chaidamsari2 1
2
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Riau, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia E-mail:
[email protected]
Abstrak. Hama utama yang menyerang produksi kakao di Indonesia termasuk Asia Tenggara adalah penggerek buah kakao (PBK) (Conopomorpha cramerella). Kerugian yang ditimbulkan oleh PBK dapat mencapai 80%. Proteinase Inhibitor (PIN) adalah bagian tumbuhan yang memiliki sifat ketahanan terhadap hama dengan menghasilkan senyawa antinutrisi yang bersifat racun untuk banyak serangga seperti Lepidoptera. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen pin dari biji buah kakao dan analisis sekuens gen proteinase inhibitor dengan menggunakan program BLAST. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen pin dari biji buah kakao telah berhasil diisolasi dibuktikan dengan hasil sekuensing bahwa fragmen gen PIN berukuran 580 bp dan analisis dengan program BLAST menandakan bahwa fragmen gen PIN mempunyai homologi yang tinggi dengan gen PIN penyandi protein berukuran 21 kDa pada biji buah kakao. Kata Kunci: Gen Proteinase Inhibitor,Isolasi gen, Lepidoptera, Penggerek Buah Kakao
PENDAHULUAN Hama utama yang menyerang perkebunan kakao di Indonesia dan juga di Asia Tenggara adalah penggerek buah kakao (PBK) (Conopomorpha cramerella Snellen). Larva PBK sangat merugikan karena menyerang bagian yang sangat penting yaitu bagian kulit buah yang mengandung biji kakao sebagai bahan utama untuk pembuatan coklat. Saat ini PBK menyerang hampir seluruh pertanaman kakao di Indonesia dan sangat merugikan petani. Hama ini memakan plasenta yang merupakan saluran makanan menuju ke biji sehingga mengakibatkan penurunan hasil dan mutu biji. Menurut Wardoyo kerugian yang ditimbulkan oleh PBK dapat mencapai 80% yang disebabkan oleh menurunnya berat, mutu biji, dan meningkatnya biaya panen karena pemisahan biji pada buah terserang memerlukan waktu yang lama. Serangan hama PBK merupakan ancaman yang serius bagi kelangsungan usaha perkebunan kakao karena belum ditemukan pengendalian
hama yang efektif dan efisien. Pengendalian hama PBK secara konvensional sudah sering dilakukan, seperti kultur teknis, secara kimia dengan penyemprotan insektisida, dan secara biologis menggunakan jamur Beauveria bassiana. Pengendalian tersebut dapat dikatakan kurang efektif karena lebih dari 50 % dari siklus hidup hama PBK berada di dalam buah. Telah dilaporkan bahwa gen cry dari Bacillus thuringensis teruji efektif terhadap larva PBK, namun adanya penolakan terhadap produk pangan transgenik karena menggunakan gen dari bakteri telah melemahkan upaya rekayasa genetik tersebut. Meskipun gen Bt maupun protein yang disandinya aman dikonsumsi manusia. Berdasarkan hal ini maka perlu dicari metode yang lain untuk mengendalikan PBK. Metode lain yang mungkin dilakukan agar kakao transgenik dapat diterima masyarakat adalah dengan memanfaatkan gen pertahanan alami pada tanaman kakao itu sendiri, yaitu gen proteinase inhibitor (PIN). PIN merupakan protein berukuran kecil yang mampu menghambat aktifitas Semirata 2013 FMIPA Unila |97
Mayta Novaliza Isda: Analisis Sekuen Gen Proteinase Inhibitor (TcPIN) Terkait dengan Ketahanan Terhadap Penggerek Buah Kakao
proteinase dalam sistem pencernaan serangga. Gen PIN merupakan gen yang dapat menghasilkan senyawa antinutrisi yang dapat menghambat kerja enzim proteolitik (proteinase) di dalam perut serangga. Proteinase inhibitor merupakan protein yang berukuran 4 kDa sampai 85 kDa terutama pada kisaran 8-20 kDa. Pada kakao, protein ini berukuran 21 kDa dengan homologi yang cocok dengan inhibitor tripsin pada kedelai (kumitz) dari proteinase inhibitor. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen PIN dari biji kakao (Theobroma cacao L.). METODE PENELITIAN RNA kakao diisolasi dengan metode. Larutan RNA hasil isolasi dianalisis kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui konsentrasi dan kemurniannya. Uji kualitatif dilakukan melalui teknik elektroforesis RNA dalam gel agarosa 1% untuk melihat pita hasil elektroforesis, selain itu diukur dengan melihat perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm. Kemurnian RNA yang tinggi dapat dilihat dari perbandingan A260/280 yang berkisar antara 1,8-2,0. Uji kuantitatif dilakukan dengan cara mengukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm. Isolasi dan uji ekspresi dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan primer spesifik yang dirancang berdasarkan urutan basa gen PIN pada kakao yang telah dipublikasikan (bank data gen. Primer kemudian digunakan dalam RT-PCR untuk amplifikasi daerah gen PIN. Sebelum dilakukan sekuensing, fragmen hasil RTPCR dimurnikan terlebih dahulu. Fragmen gen PIN yang telah dimurnikan kemudian disekuen di Lembaga Biologi Molekuler Eijkman Jakarta. Hasil sekuensing kemudian dianalisis BLASTX (www.ncbi.nih.gov).
HASIL DAN PEMBAHASAN Buah kakao dilindungi oleh kulit buah yang matang antara 5 sampai 7 bulan, dimana selama proses pematangan, banyak buah yang gugur atau yang dikenal juga layu pentil. Buah kakao yang matang mempunyai panjang antara 15 sampai 35 cm dan diameter buah antara 10-15 cm. Buah kakao biasanya mengandung 30 hingga 40 biji yang dikelilingi oleh lendir dan daging buah pada saat buah matang. Buah tidak menjadi lunak pada saat matang, dan non-dehiscent. Biji kakao tidak mengalami masa dormansi, proses germinasi segera setelah biji dipindahkan dari buah. Pada Gambar 1. dapat dilihat sayatan melintang buah kakao matang. Bagian buah kakao terdiri dari kutikula yang tipis, yang berwarna hijau pada buah muda dan berubah menjadi kuning dan merah tua dan akhirnya menjadi dinding buah. Dinding buah kakao mengandung dua lapisan yaitu bagian luar dan dalam dinding buah kakao yang dipisahkan oleh lapisan keras yaitu sclerenchym yang mengandung jaringan vascular. Di dalam dinding buah terdapat biji yang dihubungkan terhadap plasenta dan dikelilingi oleh lendir daging buah. RNA diperlukan untuk mengisolasi gen spesifik pada jaringan tertentuPada penelitian ini diperlukan RNA total dari biji kakao dengan tujuan untuk mendapatkan gen PIN dari jaringan tersebut. Secara umum isolasi RNA lebih sulit dibanding isolasi DNA karena RNA sangat mudah terdegradasi oleh RNase (ribonuklease) sehingg membutuhkan penanganan khusus dalam mengisolasinya. OPW IPW
B
Pu
PL
Gambar 1. Sayatan melintang buah kakao
98|Semirata 2013 FMIPA Unila
Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013
28S
18S
Gambar 2. Hasil elektroforesis RNA total biji kakao
Isolasi RNA total dari biji kakao berhasil dilakukan dengan baik, dilihat dari hasil analisis elektroforesis gel agarosa 1,2% dalam 0,5X larutan penyangga TBE dengan voltase 25 volt selama 1,5 jam. Pada Gambar 2, terlihat bahwa RNA yang dihasilkan mempunyai integritas yang baik. Pita yang terbentuk dalam gel agarosa merupakan rRNA yang berukuran 28S dan 18S, sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa hasil isolasi RNA dikatakan baik apabila dalam elektroforesis gel agarosa menghasilkan 2 pita RNA ribosom (rRNA), yaitu 28S dan 18S yang merupakan rRNA sitoplasma utama pada tanaman. Hasil pengukuran secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 dan 280 nm diperoleh absorban masing-masing sebesar 0,490 dan 0,239. Berdasarkan hasil tersebut didapatkan konsentrasi RNA total biji kakao sebesar 2940 ng/µl dan nisbah absorban (A) 260/280 sebesar 2,050. Menurut Sambrook bahwa hasil isolasi RNA dikatakan murni jika mempunyai nilai A260/280 sebesar 1,8-2,0. Berdasarkan sekuen gen PIN yang didapat maka primer dirancang dengan melihat cds (coding segmen) yang dimiliki oleh gen tesebut.
Urutan basa gen PIN yang didapat dari bank data gen mempunyai cds yang diawali dari basa ke-31 sampai ke-696. Sehingga dibuat primer F21 sebagai forward dengan urutan basa yang dimulai dari kodon awal dan primer R11 sebagai reverse dengan urutan basa (yang berada pada kodon akhir. Dengan menggunakan teknik RT-PCR yang dilakukan dengan suhu annealing 58°C dan 35 siklus. Kandidat ukuran gen PIN dengan pasangan primer tesebut adalah sebesar 662 bp. Sekuensing dapat dilakukan dengan menggunakan produk PCR langsung atau melalui hasil kloning. Pada penelitian ini dilakukan sekuensing menggunakan plasmid DNA yang membawa ukuran insert sebesar 662 bp. Analisis sekuen meliputi analisis homologi dengan program BLASTX dari bank data gen (www.ncbi.nih.gov/BLAST). Sekuensing dapat dilakukan di Lembaga Biologi Molekuler Eijkman. Data hasil sekuensing berupa electrophoregraph yang menggambarkan urutan basa fragmen gen PIN berukuran 580 bp (Gambar 2). Urutan basa yang didapatkan dari hasil sekuensing kemudian dianalisis BLASTX. BLAST merupakan alat pembanding suatu sekuen yang dicari dengan sekuen yang telah diketahui dengan cepat yang dapat menjelaskan sekuen tersebut memiliki similaritas cukup signifikan. Pada Tabel 1 analisis BLASTX yang dilakukan terhadap urutan basa gen PIN .Analisis BLASTX, dengan melihat parameter skor lebih dari 150 dan e-value yang kurang dari 10-4 maka tingkat homologi yang dihasilkan cukup baik. Semakin tinggi skor (bits) maka tingkat homologinya semakin baik, semakin rendah e-value maka semakin baik pula tingkat homologinya. Selain nilai skor dan e-value, tingkat homologi juga dapat dilihat dari garis berwarna merah pada grafik hasil BLASTX (data tidak dilampirkan).
Semirata 2013 FMIPA Unila |99
Mayta Novaliza Isda: Analisis Sekuen Gen Proteinase Inhibitor (TcPIN) Terkait dengan Ketahanan Terhadap Penggerek Buah Kakao
Tabel 1. Hasil analisis BLASTN urutan basa fragmen gen PIN
Gen yang bersesuaian T.cacao mRNA for 21 kDa seed protein homolog to soybean trypsin T. cacao putative 21 kDa trypsin inhibitor gene, complete cds T. cacao clone 34-4 trypsin inhibitor gene partial cds T. bicolor clone 5-2 trypsin inhibitor gene partial cds
skor (bit) 377
e-value 2e-101
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Yusron Farieh, Prof. Dr. Mansyurdin dan Prof. Dr. Musliar Kasim, MS. DAFTAR PUSTAKA
340
-90
3e
309
8e-81
248
2e-62
Garis warna merah menunjukkan tingkat homologi sangat tinggi, diikuti dengan garis merah muda, hijau, biru, dan hitam. Berdasarkan Tabel 1 dapat diketahui bahwa urutan basa fragmen gen PIN bersesuaian dengan gen penyandi protein 21 kDa dari biji kakao. Selain itu fragmen ini juga mempunyai homologi dengan T. cacao putative 21 kDa trypsin, T. cacao clone 344 trypsin inhibitor gene partial cds, dan T. bicolor clone 5-2 trypsin inhibitor gene partial cdsakao yang merupakan proteinase inhibitor (PIN). KESIMPULAN Fragmen Gen PIN dari biji kakao telah berhasil diisolasi dibuktikan dengan hasil sekuensing bahwa fragmen gen PIN berukuran 580 bp dan analisis dengan program BLAST (www.ncbi.nih.gov/BLAST) menandakan bahwa fragmen gen PIN mempunyai homologi yang tinggi dengan gen PIN penyandi protein berukuran 21 kDa pada biji kakao. Saran pada penelitian ini adalah perlunya dipelajari lebih detail tentang ekspresi gen PIN pada klon buah kakao yang tahan dan tidak terhadap PBK. 100|Semirata 2013 FMIPA Unila
UCAPAN TERIMA KASIH
Wardoyo S. (1996). PHT untuk mengatasi penggerek buah kakao. Disampaikan pada pertemuan ilmiah tentang Evaluasi Daerah Sebar Hama PBK di Indonesia. Makassar. Santoso D et al. 2004. Activity of Bacillus thuringiensis toxins against cocoa pod borer larvae. Pest Manag Sci 60:735– 738 (online: 2004). Depparaba F.(2002). Penggerek buah kakao (Conopomorpha cramerella Snellen) dan penanggulangannya. Jurnal Litbang Pertanian. 21:2. Chaidamsari T. (2005). Biotechnology for Cacao Pod Borer Resistance in Cacao. Plant Research International. The Netherlands : Wagenigen University. Maagd R A, Bravo A, Crickmore N. 2001. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends Genet. 17: 193-199. Fritz H. 2000. Foreword. In K. Von der Helm et al. Protease as targets for therapy. Springer-Verlag. V-VI. Ryan CA. 1998. Proteinase Inhibitors in Plants: Genes for improving defenses against insect and pathogens. Annu. Rev. Phytopayhol 28: 425-449. Ashida Y et al. 2000. Isolation and sequencing of a cDNA clone encoding a 20 kDa protein with trypsin inhibitory activity. Bioschi Biotechnol Biochem 64 (6): 1305-1309. Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: Laboratory Manual. New York : Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013
Thai et al. 1991. Nucleid acid sequence of 21 kDa cocoa seed protein with homology to the soybean trypsin inhibitor (Kumitz) family of protease inhibitor. Plant Mol. Biol 16:913-915.
Claveri JM, dan C.Notredame . 2003. Bioinformatics for Dummies. Ed ke-2. New York : Wiley Publishing
Semirata 2013 FMIPA Unila |101
102|Semirata 2013 FMIPA Unila