pÛvodní práce ANAL¯ZA OBSAHU METALOTHIONEINU U PACIENTÒ SE ZHOUBN¯M NÁDOREM PRSU, TLUSTÉHO ST¤EVA A NEBO MALIGNÍM MELANOMEM DETERMINATION OF METALLOTHIONEIN CONTENT IN PATIENTS WITH BREAST CANCER, COLON CANCER, AND MALIGNANT MELANOMA PETRLOVÁ J.1, BLA·TÍK O.1, PRÒ·A R.2, KUKAâKA J.2, MIKELOVÁ R.1 STIBOROVÁ M.3, VOJTù·EK B.4, ADAM V.1, ZÍTKA1 O.6, ECKSCHLAGER T.7, KIZEK R.1 1ÚSTAV CHEMIE A BIOCHEMIE, LABORATO¤ MOLEKULÁRNÍ BIOCHEMIE
A BIOELEKTROCHEMIE, MENDELOVA ZEMùDùLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA, BRNO
2ÚSTAV KLINICKÉ BIOCHEMIE A PATOBIOCHEMIE, 2. LÉKA¤SKÁ FAKULTA UK V PRAZE, 3KATEDRA BIOCHEMIE, P¤ÍRODOVùDECKÁ FAKULTA UK V PRAZE, 4ZÁKLADNA EXPERIMENTÁLNÍ ONKOLOGIE, MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV BRNO 5KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE P¤ÍRODOVùDECKÁ FAKULTA MU BRNO 6KATEDRA BIOCHEMIE, P¤ÍRODOVùDECKÁ FAKULTA MU BRNO 7KLINIKA DùTSKÉ HEMATOLOGIE A ONKOLOGIE, 2. LÉKA¤SKÁ FAKULTA UK PRAHA
Souhrn: Nádorová onemocnûní pfiedstavují velmi závaÏná onemocnûní postihující kaÏdého tfietího aÏ pátého ãlovûka v populaci. Nedávno bylo zji‰tûno, Ïe hladiny metalothioneinu (MT) je moÏné vyuÏít jako markeru prÛbûhu nádorov˘ch onemocnûní. Je známo, Ïe MT je nízkomolekulární intracelulární protein, jehoÏ primární funkcí je udrÏení homeostázy tûÏk˘ch kovÛ v Ïiv˘ch organismech. Metody: Pro anal˘zu MT jsme pouÏili (vlastní) námi navrÏen˘ elektroanalytick˘ postup vyuÏívající adsorptivní pfienosovou techniku. Elektroanal˘za probíhala na pfiístroji AUTOLAB ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tfiíelektrodovém uspofiádání v roztoku základního elektrolytu 1 mol.dm-3 amonného pufru a 1 mmol.dm-3 Co(NH3)6Cl3. Základní biochemické vy‰etfiení séra bylo provedeno na automatickém analyzátoru Advia 1650 a Centaur. Vzorky krevních sér byly získány od 28 pacientÛ se zhoubn˘mi nádory prsu, tlustého stfieva a nebo melanomem v prÛbûhu roku 2005 na klinikách FN Motol. Pfied vlastní elektroanal˘zou byl kaÏd˘ vzorek tepelnû denaturován 15 min. pfii 99 °C a centrifugován pfii 4 oC, 15 000 g po dobu 30 min. V˘sledky: Zjistili jsme, Ïe v krevním séru pacientÛ s nádory prsu byl prÛmûrn˘ obsah MT 1.6 µmol.dm-3, pfiiãemÏ u 9 pacientÛ pfiekroãila hladina MT 1 µM (64 %) a u tfií byla hladina MT vy‰‰í neÏ 2 µmol.dm-3 (21 %). U pacientÛ se zhoubn˘m nádorem tlustého stfieva byla prÛmûrná hladina MT 3,2 µmol.dm-3, tedy 2krát vy‰‰í neÏ u nádoru prsu. Obsah MT vy‰‰í neÏ 1 µmol.dm-3 byl pozorován u 8 pacientÛ (88 %) a u 3 byla hladina MT vy‰‰í neÏ 2 umol.dm - 3 (33 %). V pfiípadû pacientÛ s melanomem byla prÛmûrná hladina MT 1,97 µmol.dm-3. Vy‰‰í hladina MT byla pozorována u v‰ech pacientÛ s vy‰‰ími hodnotami jaterních enzymÛ. Velmi zajímavá shoda byla také pozorována mezi hodnotou nádorového markeru CA 15-3 a hladinou MT. Závûr: Elektroanalytick˘ch technik je moÏné vyuÏít pro anal˘zu sérov˘ch hladin MT u pacientÛ se zhoubn˘mi nádory. Hladina MT v˘raznû vzrÛstá u vût‰iny pacientÛ se zhoubn˘mi nádory. Klíãová slova: metalothionein, MT, diagnostika, melanom, zhoubn˘ nádor prsu, zhoubn˘ nádor tlustého stfieva, Brdiãkova reakce. Introduction: Malignant tumours represent a grave illness affecting three out of every ten people in the world. Recently, it has been published that metallothionein (MT), an intracellular high molecular and cysteine-rich protein, which is able to detoxify heavy metals, could serve as a marker of tumour diseases. Methods: An adsorptive transfer stripping technique (AdTS) in connection with differential pulse voltammetry was used for the determination of metallothionein. Electrochemical measurements were performed with AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) connected to VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland), using a standard cell with three electrodes. The Brdicka supporting electrolyte containing 1 mM Co(NH 3) 6Cl 3 and 1 M ammonia buffer (NH 3(aq) + NH 4Cl, pH = 9.6) was used. Basic biochemical analyses were performed with Advia 1650 and Centaur. Human blood serum samples were obtained from 27 patients with breast cancer and malignant melanoma in 2005 at the Department of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry, 2 nd Faculty of Medicine Charles University, Czech Republic. Each sample was prepared by heat treatment. Briefly, the sample was kept at 99 °C for 15 min., and then cooled to 4 oC. The denatured homogenates were centrifuged at 4 oC, 15 000 g for 30 min. Results: We found out that the metallothionein content in human blood serum of patients with breast cancer reached an average of 1.6 µM. Moreover, the MT content in nine of the patients was higher than 1 µM (64%) and in three of them higher than 2 µM (21%). The average MT content in human blood serum of patients with colon cancer
138
KLINICKÁ ONKOLOGIE 19
2/2006
was 3.2 µM, thus 2 times higher than in breast cancer patients. Eight patients (88 %) with malignant melanoma had more than 1 µM of MT and 3 of them (33 %) more than 2 µM of MT. As for patients with malignant melanoma, their average content of MT was 1.97 µmol.dm -3. Higher level of MT was determined in all patients with higher content of liver enzymes. Moreover, we observed that CA 15-3 tumour marker levels corresponds well with the MT content. Conclusion: It is evident that it is possible to use the electroanalytical techniques for determination of MT in blood serum samples of patients with tumour diseases. We found out that MT content markedly increases in all studied blood serum samples of the patients with breast cancer, colon cancer, and malignant melanoma. Keywords: metallothionein, MT, diagnostics, melanoma, breast cancer, colon cancer, Brdicka reaction.
Úvod KaÏd˘m rokem je ve svûtû diagnostikováno asi 11 milionÛ pfiípadÛ onemocnûní maligním nádorem a 6,7 milionu lidí na tuto nemoc umírá. Ze v‰ech úmrtí ve svûtû pfiipadá 12 % na zhoubné nádory. Nejvíce diagnostikovan˘mi jsou karcinomy plic, prsu, stfiev, Ïaludku, prostaty, dûloÏního ãípku a jícnu, a letální, z nich jsou nejãastûj‰í karcinom plic, Ïaludku a jater. Podle údajÛ, které vypracoval Národní onkologick˘ registr, Ïije v âeské republice s maligním nádorem 302 000 osob. Ze statistik je zfiejmé, Ïe ve svûtû prÛmûrnû na 100 000 obyvatel pfiipadá asi 360 pfiípadÛ maligních nádorÛ, ale v âR je to 560 pfiípadÛ. V âR byl v roce 2000 celkov˘ poãet hlá‰en˘ch onemocnûní zhoubn˘mi novotvary u muÏÛ 27 847 a u Ïen 26 546. Ve stejném roce zemfielo na toto onemocnûní 15 878 muÏÛ a 12 661 Ïen. Podle údajÛ z roku 2002 drÏí âeská republika evropské prvenství v poãtu nemocn˘ch maligními nádory koneãníku a ledvin. Mezi nejãastûj‰í nádorová onemocnûní v‰ak v âR, obdobnû jako jinde v Evropû, patfií zhoubné nádory kÛÏe, prsu a plic. V âR postihne karcinom prsu roãnû více neÏ 4 500 Ïen, bûhem Ïivota touto chorobou onemocní kaÏdá desátá ãeská Ïena a roãnû na ni zemfie pfiibliÏnû 2 500 Ïen. Z tûchto dÛvodÛ vyhlásilo Ministerstvo zdravotnictví âR a âeská onkologická spoleãnost program zamûfien˘ na pokles v˘skytu zhoubn˘ch onemocnûní v ãeské populaci. Znaãná pozornost by mûla b˘t vûnována pfiedev‰ím (ve smyslu Národního onkologického programu âR) ; i) primární prevenci a v˘chovû k udrÏení zdraví; ii) „screeningov˘m“ programÛm vyuÏívajícím nov˘ch moderních technologií; iii) zlep‰ení ãasné diagnostiky mezi nûÏ náleÏí i nové potencionální markery; iv) vytvofiení sítû specializovan˘ch pracovi‰È; v) podpora v˘zkumn˘ch projektÛ. Nedávno Theocharis a spolupracovníci publikovali, Ïe mnoÏství metalothioneinu (MT) se mûní u fiady zhoubn˘ch nádorÛ (nádory prsu, kÛÏe a pankreatu a dal‰í) . Metalothioneiny (MT) patfií do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních na cystein velmi bohat˘ch proteinÛ (obsah Cys aÏ 30 % v molekule proteinu) o molekulové hmotnosti od 6 - 10 kDa. Je pravdûpodobné, Ïe zmûny v expresi MT mohou b˘t prognostick˘m markerem u celé fiady zhoubn˘ch nádorov˘ch onemocnûní. Z tohoto dÛvodu je potfiebné studovat zmûny MT u pacientÛ se zhoubn˘mi nádory pomocí jednoduch˘ch a rychl˘ch analytick˘ch postupÛ. Cílem této práce bylo studovat sérovou hladinu metalothioneinu u pacientÛ se zhoubn˘mi nádory prsu, tlustého stfieva a kÛÏe pomocí elektroanalytick˘ch technik. Materiál a metody Klinick˘ materiál V prÛbûhu prvního pololetí roku 2005 byly získána séra od pacientÛ léãen˘ch pro zhoubn˘ nádor prsu, tlustého stfieva a melanom na rÛzn˘ch oddûleních FN Motol (Radioterapeutické oddûlení dospûlí, KoÏní oddûlení a III. chirurgická klinika 1. LF UK). Pokud to bylo moÏné byly sledovány základní biochemické ukazatele (ALP, AST, ALT, GMT a nádorov˘ marker CA 15-3). Krevní séra byla ihned zmraÏena na -20 °C do
doby jejich dal‰ího zpracování. Celkem bylo analyzováno 28 sér pacientÛ; z toho pro zhoubn˘ nádor tlustého stfieva n = 9 s prÛmûrn˘m vûkem 56,4 roku; melanom n = 4 s prÛmûrn˘m vûkem 59,5 roku; a pro nádor prsu n = 15 s prÛmûrn˘m vûkem 51,5 roku. Biochemická anal˘za Hladiny vybran˘ch jaterních enzymÛ ALP (S-alkalická fosfatasa), AST (S-aspartátamino-transferasa), ALT (S-alaninamino-transferasa) a GMT (S-a-glutamyl-transferasa) byly analyzovány spektrofotometricky na automatickém biochemickém analyzátoru Advia 1650 (Bayer, Tarrytown USA) za vyuÏití setu Bayer pfii 37 °C. MnoÏství nádorového markeru CA 15-3 bylo stanoveno na analyzátoru Centaur (Bayer, Tarrytown, USA) imunochemiluminiscenãní metodou. Pfiíprava vzorkÛ pro elektroanalytické stanovení metalothioneinu Ze získan˘ch vzorkÛ krevních sér bylo odebráno 100 µl a umístûno na 15 min. pfii 99 °C do termobloku (Eppendorf 5430, USA). Poté byly vzorky ochlazeny na 4 oC a centrifugovány pfii 4 oC, 15 000 g po dobu 30 min. (Eppendorf 5402, USA). Metalothioneiny patfií k termostabilním proteinÛm, které zÛstávají pfiítomné v roztoku i po jeho tepelné denaturaci . Takto pfiipravené vzorky byly analyzovány námi upraven˘m postupem adsorptivní pfienosové techniky (AdTS) s diferenãní pulsní voltametrií (DPV). MnoÏství analyzovaného vzorku bylo 5 µl. Elektroanalytické stanovení metalothioneinu pomocí Brdiãkovy reakce metodou AdTS DPV Vzorky byly analyzovány na pfiístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tfiíelektrodovém uspofiádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuÈová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2; referenãní elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol.dm-3 Co(NH3)6Cl3 a 1 mol.dm-3 a amonn˘ pufr; NH3(aq) + NH4Cl, pH = 9,6) byl po kaÏd˘ch 5 anal˘zách vymûnûn . AdTS DPV parametry byly následující: poãáteãní potenciál -0,6 V, koneãn˘ potenciál -1,6 V, modulaãní ãas 0,057 s, ãasov˘ interval 0,2 s, potenciálov˘ krok 1,05 mV/s, modulaãní amplituda 250 mV, Eads = 0 V, teplota 0 °C . V˘sledky a diskuse Pfied více neÏ sedmdesáti lety objevil Rudolf Brdiãka katalytické vyluãování vodíku ze základního elektrolytu v pfiítomnosti proteinÛ . Elektroanalytická metoda byla dále vylep‰ena a vyuÏita pro anal˘zu proteinÛ krevních sér pacientÛ s rakovinou. Získaná experimentální data pfiinesla zajímavé v˘sledky ukazující na moÏnost vyuÏívat tzv. Brdiãkovu reakci pro studium prognózy zhoubn˘ch onemocnûní. Nebylo v‰ak zcela zfiejmé, které proteiny byly podle vypracované metodiky stanovovány. Pozdûji se podafiilo objevit skupinu mukoproteinÛ (MP-1, MP-2 a MP-3), ale proteinÛm o niωí moleku-
KLINICKÁ ONKOLOGIE
19
2/2006
139
lové hmotnosti nebyla vûnována Ïádná pozornost. Jak se v‰ak v poslední dobû ukazuje, nízkomolekulární proteiny (jako je metalothionein) a peptidy (jako je glutathion), hrají v˘znamnou roli v fiadû biologick˘ch procesÛ vãetnû regulace bunûãného dûlení. V této na‰í práci jsou popsány prvotní experimentální v˘sledky stanovení obsahu metalothioneinu u 28 pacientÛ se zhoubn˘mi nádory prsu, tlustého stfieva a kÛÏe s prÛmûrn˘m vûkem 55 let (v rÛzném stadiu a fázi onemocnûní a léãby). Vzorky krevních sér byly odebírány v prÛbûhu prvního pololetí roku 2005, a pokud to bylo moÏné, byly charakterizovány z hlediska základních biochemick˘ch ukazatelÛ (aktivita jaterních enzymÛ, pfiípadnû nádorového markeru CA 15-3); viz. (Obr. 1A,B,C). U vût‰iny pacientÛ nebyl pozorován v˘razn˘ vzestup hladiny jaterních enzymÛ (ALP, AST, ALT a GMT). Ten nebyl zv˘‰en ani u vût‰iny pacientek s karcinomem prsu. Anal˘za MT byla provedena námi modifikovan˘m elektroanalytick˘m postupem (diferenãní pulzní voltametrie v kombinaci s adsorptivní pfienosovou voltametrií). Studovan˘ vzorek (pfiipraven˘ podle postupu uvedeného v sekci Materiál a metody) je adsorbován z 5 µl kapky na povrch pracovní elektrody, poté je pfiebyteãn˘ roztok z povrchu elektrody omyt a modifikovaná elektroda je umístûna do mûfiící nádobky (Obr. 2A). V pfiípadû, Ïe místo vzorku (obsahujícího proteiny) pouÏijeme vodu, získáme záznam redukce iontÛ kobaltu (Co2+) bez pozorovan˘ch katalytick˘ch signálÛ (Obr. 2B, ãárkovaná kfiivka). Adsorbovan˘ metalothionein (po dobu 120 s) o koncentraci 10 nM poskytuje tfii v˘razné katalytické signály (RS2Co, Cat1 a Cat2), jak je ukázáno na Obr. 2B. Pfii dal‰í anal˘ze MT byl vyhodnocován katalytick˘ signál Cat2. Závislost v˘‰ky pozorovaného signálu na koncentraci adsorbovaného MT na povrch pracovní elektrody byla lineární (y = 5,5233x + 0,7177; R2 = 0,9918, Obr. 2C). Vzorky krevních sér pacientÛ se zhoubn˘mi nádory prsu, tlustého stfieva a kÛÏe byly analyzovány pomocí uvedeného postupu. Získané voltamogramy jsou ukázány na Obr. 2D. Pro na‰e úãely byl opût vyhodnocován katalytick˘ signál Cat2. Na získan˘ch voltamogramech byl
pozorován rozdíln˘ prÛbûh záznamu u pacientÛ s nádory prsu, tlustého stfieva a melanomem. U pacientÛ s melanomem byl vût‰inou pozorovateln˘ signál Cat2 bez signálu Cat1. V sérech pacientÛ s nádory prsu v‰ak bylo moÏné kromû katalytického signálu Cat2 témûfi vÏdy pozorovat katalytick˘ signál Cat1. Nejv˘raznûj‰í katalytické signály byly pozorovány u pacientÛ se zhoubn˘m nádorem tlustého stfieva. V na‰í pfiede‰lé práci jsme se pokusili urãit prÛmûrnou hladinu MT u zdrav˘ch lidí, která kolísá okolo 0,6±0,3 µmol.dm-3 MT . Zjistili jsme, Ïe u pacientÛ s nádory prsu byl prÛmûrn˘ obsah MT 1,6 µmol.dm-3, pfiiãemÏ u devíti pacientÛ pfiekroãila hladina MT 1 µmol.dm-3 (64 %) a u tfií byla hladina MT vy‰‰í neÏ 2 µmol.dm-3 (21 %), jak je ukázáno na obrázku 3A. V pfiípadû pacientÛ s melanomem byla prÛmûrná hladina MT 1,97 µmol.dm-3 a u 3 pacientÛ byl obsah MT vy‰‰í neÏ 1 µmol.dm-3, viz. Obr. 3B. U pacientÛ se zhoubn˘m nádorem tlustého stfieva byla prÛmûrná hladina MT 3,2 µmol.dm-3, tedy 2krát vy‰‰í neÏ u pacientÛ s nádorem prsu (Obr. 3C). Obsah MT vy‰‰í neÏ 1 µmol.dm-3 byl pozorován u 8 pacientÛ (88 %) a u 3 byla hladina MT vy‰‰í neÏ 2 µmol.dm-3 (33 %). Vy‰‰í hladina MT byla pozorována u v‰ech pacientÛ s vy‰‰ími hodnotami jaterních enzymÛ. Velmi zajímavá shoda byla také pozorována mezi hodnotou nádorového markeru CA 15-3 a hladinou MT. Vztahu nádorového markeru CA 15-3 a hladiny MT se bude vûnovat na‰e dal‰í práce. Závûr Jak je ukázáno v na‰í práci, elektroanalytick˘ch technik je moÏné vyuÏít pro anal˘zu v˘znamn˘ch biologicky aktivních proteinÛ u pacientÛ se zhoubn˘mi nádory. Z námi získan˘ch experimentálních v˘sledkÛ je zfiejmé, Ïe hladina sérového MT v˘raznû stoupá u vût‰iny pacientÛ se zhoubn˘mi nádory. Navíc u pacientÛ se zhoubn˘m nádorem tlustého stfieva a melanomem byl nárÛst hladiny MT v˘raznû vy‰‰í ve srovnání s pacienty se zhoubn˘m nádorem prsu. Podûkování. Práce na tomto pfiíspûvku byla financována grantem: RASO 8/2005 a GAâR 525/04/P132.
Obr. 1.: Enzymová aktivita jaterních enzymÛ (ALP, AST, ALT a GMT) u pacientÛ s (A) nádory prsu, (B) melanomem (C) zhoubn˘m nádorem tlustého stfieva. Ve vloÏeném obrázku je ukázána hladina nádorového markeru CA 15-3.
140
KLINICKÁ ONKOLOGIE 19
2/2006
Obr. 2.: Elektroanalytické stanovení metalothioneinu. (A) Schéma adsorptivní pfienosové techniky (1) vytvofiená pracovní elektroda; (2) adsorpce vzorku na povrch elektrody; (3) oplach elektrody, odstranûní nadbyteãného mnoÏství vzorku; (4) anal˘za. (B) Diferenãní pulzní voltamogram základního elektrolytu (- - -) a 10 nmol.dm- 3 MT po 120 s akumulace na povrch pracovní elektrody. (C) Závislost v˘‰ky signálu Cat2 na koncentraci. (D) Typické voltamogramy pacientÛ s nádory prsu, tlustého stfieva a melanomem. AdTS DPV parametry byly následující: poãáteãní potenciál -0,6 V, koneãn˘ potenciál -1,6 V, modulaãní ãas 0,057 s, ãasov˘ interval 0,2 s, potenciálov˘ krok 1,05 mV/s, modulaãní amplituda 250 mV, Eads = 0 V, teplota 0 °C. Dal‰í podrobnosti jsou uvedeny v sekci Materiál a metody.
Obr. 3.: MnoÏství MT u pacientÛ s (A) nádory prsu a (B) melanomem (C) zhoubn˘m nádorem tlustého stfieva.
KLINICKÁ ONKOLOGIE
19
2/2006
141
Literatura 1. Abrhamova, J.: Národní onkologick˘ registr. http://www.uzis.cz/cz/nor/norindx.htm 2005. 2. Plesko, I., Obsitnikova A., Cuninkova M.: Epidemiological aspects of in situ female breast cancer in Slovakia. Klinicka Onkologie 2003, 16, 227-230. 3. NOP: Czech National cancer control program. Klinicka Onkologie 2004, 17, 36-36. 4. Aschermannova, A.: Úvodník. The Lancet Oncology - Czech 2005, 4, 81-81. 5. Skovajsova, M., Bartonkova H., Danes J.: Breast cancer screening in the Czech Republic. Klinicka Onkologie 2004, 17, 46-48. 6. Zaloudik, J.: National oncological program - anachronism or future view? Klinicka Onkologie 2004, 17, 72-74. 7. Theocharis, S. E., Margeli A. P., Klijanienko J. T., Kouraklis G. P.: Metallothionein expression in human neoplasia. Histopathology 2004, 45, 103-118. 8. Kizek, R., Vacek J., Adam V., Vojtesek B.: Metallothionein - Cisplatine and anticancer therapy. Klin. Biochem. Metab. 2004, 12, 72-78. 9. Kizek, R., Vacek J., Trnková L., Klejdus B., Havel L.: Application of catalytic reactions on a mercury electrode for metallothionein electrochemical detection. Chem. Listy 2004, 98, 160-167. 10. Kasahara, K., Fujiwara Y., Nishio K., Ohmori T., Sugimoto Y., Komiya K., Matsuda T., Saijo N.: Metallothionein content correlates with the sensitivity of human small cell lung cancer lines to cisplatin. Cancer Res. 1991, 51, 3237-3242. 11. Zelena, J., Potesil D., Vacek J., Adam V., Hradecky J., Prusa R., Kizek R., Vojtesek B.: Metallothionein as a prognostic marker of tumor disease. Klinicka Onkologie 2004, 17, 190-195. 12. Kizek, R., Trnkova L., Palecek E.: Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopotentiometry. Anal. Chem. 2001, 73, 4801-4807. 13. Trnkova, L., Kizek R., Vacek J.: Catalytic signal of rabbit liver metallothionein on a mercury electrode: a combination of derivative chronopotentiometry with adsorptive transfer stripping. Bioelectrochemistry 2002, 56, 57-61. 14. Strouhal, M., Kizek R., Vacek J., Trnkova L., Nemec M.: Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica. Bioelectrochemistry 2003, 60, 29-36. 15. Olafson, R. W., Olsson P. E.: Electochemical detection of metallothionein. Methods in Enzymol. 1991, 205, 205-213. 16. Brazdova, M., Kizek R., Havran L., Palecek E.: Determination of glutat-
142
KLINICKÁ ONKOLOGIE 19
2/2006
hione-S-transferase traces in preparations of p53 C-terminal domain (aa320393). Bioelectrochemistry 2002, 55, 115-118. 17. Petrlova, J., Potesil D., Mikelova R., Blastik O., Adam V., Trnkova L., Jelen F., Prusa R., Kukacka J., Kizek R.: Attomole voltammetric determination of metallothionein. Electrochim. Acta 2005, submitted. 18. Brdicka, R.: Polarographic studies with the dropping mercury kathode. -Part XXXI. - A new test for proteins in the presence of cobalt salts in ammoniacal solutions of ammonium chloride. Coll. Czech. Chem. Commun. 1933, 5, 112-128. 19. Heyrovsky, M.: Rudolf Brdiãka a fyzikální chemie. Od polarografie po hmotnostní spektrometrii. Vesmír 2005, 84, 257-259. 20. Brdicka, R.: Polarographic investigation in serological cancer diagnosis. Nature 1937, 139, 1020-1021. 21. Brdicka, R.: Application of the polarographic effect of proteins in cancer diagnosis. Nature 1937, 139, 330-330. 22. Brdicka, R.: Zur frage nach der natur der polarographisch feststellbaren serumverandrungen bei Krebs. Klinische Wochenschrift 1938, 18, 305-308. 23. Heyrovsky, J.: Polarographic research on cancer. Nature 1938, 142, 317-319. 24. Kalous, V.: 70 let od objevu Brdiãkovy polarografické reakce bílkovin. Klin. Biochem. Metab. 2004, 12, 265-267. 25. Prusa, R., Blastik O., Potesil D., Trnkova L., Zehnalek J., Adam V., Petrlova J., Jelen F., Kizek R.: Metallothioneins as a marker of tumor diseases. Clin. Chem. 2005, 51, A56-A56. 26. Prusa, R., Kizek R., Vacek J., Trnkova L., Zehnalek J.: Study of relationship betwenn metallothionein and heavy metals by CPSA method. Clin. Chem. 2004, 50, A28-A29. 27. Prusa, R., Potesil D., Masarik M., Adam V., Kizek R., Jelen F.: Fast and sensitive electrochemical detection of native, denatured, and aggregated forms of tumor suppressor protein p53. Mol. Bio. Cell 2004, 15, 249A-249A. 28. Petrlova, J., Blastik O., Prusa R., Kukacka J., Potesil D., Mikelova R., Adam V., Zehnalek J., Kizek R.: Using of electrochemical methods for studying of metallothionein content in the human blood serum of a patient poisoned by lead and treated by platinum. Biomedical Papers 2005, 149, in press. 29. Petrlova, J., Blastik O., Zitka O., Adam V., Potesil D., Mikelova R., Prusa R., Stiborova M., Trnkova L., Zehnalek J., Kizek R.: An electrochemical study of metallothionein as a potential tumour disease marker. Annals the Polisch Chemical Society 2005, in press. Do‰lo: 20. 8. 2005 Pfiijato: 13. 1. 2006
