AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI NONPOLAR EKSTRAK ETANOL BAWANG PUTIH

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI NONPOLAR EKSTRAK ETANOL BAWANG PUTIH (Allium sativum L.) TERHADAP BAKTERI Streptococcus mutans DAN Pseudomonas aeruginosa SERTA BIOAUTOGRAFI

NASKAH PUBLIKASI

Oleh: LATIF ADI DEWANGGA K 100 090 162

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2013      

 

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI NON POLAR EKSTRAK ETANOL BAWANG PUTIH (Allium sativum L.) TERHADAP BAKTERI Streptococcus mutans DAN Pseudomonas aeruginosa SERTA BIOAUTOGRAFI ANTIBACTERIAL ACTIVITIES ETANOL EXSTRACTS AND NON POLAR FRACTION OF ETHANOL EXTRACTS OF GARLIC (Allium sativum L.) AGAINTS BACTERIA Streptococcus mutans AND Pseudomonas aeruginosa AND BIOAUTOGRAFI Latif Adi Dewangga*, Peni Indrayudha, Rima Munawaroh Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. Ahmad Yani, Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta 57102 Telp. (0271) 717417 *Email: [email protected] ABSTRAK

Infeksi merupakan penyakit yang banyak timbul di masyarakat. Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeroginosa merupakan contoh bakteri penyebab infeksi. Bawang putih memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeroginosa. Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antibakteri dari ekstrak etanol dan fraksi nonpolar ekstrak etanol bawang putih terhadap Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeroginosa serta mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol dan fraksi nonpolar yang mempunyai aktivitas antibakteri. Ekstraksi dilakukan dengan etanol 96% dan fraksinasi partisi cair-cair dengan n-heksan. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode dilusi cair untuk menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) serta Kadar Bunuh Minimum (KBM). Konsentrasi yang digunakan adalah 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL, 15,6 mg/mL, 7,8 mg/mL, 3,9 mg/mL, 1,95 mg/mL. Uji deteksi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam bawang putih dengan bioautografi. Metode KLT digunakan fase diam silica GF254 dan fase gerak toluene:etil aseta (100:30). Hasil uji aktivitas antibakteri dari ekstrak dan fraksi nonpolar bawang putih terhadap Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeroginosa diperoleh ekstrak etanol memiliki diameter zona hambat masing-masing 13,5 ±2,38 mm dan 10 ± 0 mm dan KHM pada Streptococcus mutans 31,25 mg/mL dan Pseudomonas aeroginosa 125 mg/mL. Fraksi nonpolar bawang putih diperoleh diameter zona hambat 8 ± 0 mm dan KHM sebesar 250 mg/mL terhadap Streptococcus mutans dan terhadap Pseudomonas aeroginosa diperoleh diameter zona hambat 9,6 ± 0,58 mm dan KHM sebesar 500 mg/mL. Hasil uji tidak diperoleh KBM. Uji bioautografi diperoleh hasil menunjukkan pada ekstrak etanol bawang putih memiliki hambatan terhadap Streptococcus mutans pada Rf 0,85 dan Pseudomonas aeruginosa pada Rf 0,92 dan 0,85. Pada fraksi nonpolar dari bawang putih terdapat hambatan terhadap Streptococcus mutans pada Rf 0,54 ; 0,85 dan 0,92 serta pada Pseudomonas aeruginosa pada Rf 0,85 dan 0,92. Hasil deteksi dengan reagen semprot Vanillin-Glacial Acid menunjukkan bercak abu-abu yang diduga senyawa organosulfur. . Kata kunci: Allium sativum L., Streptococcus mutans, Pseudomonas aeroginosa, KHM, KBM ABSTRACT

Infectious are diseases that commonly arise in many communities. Streptococcus mutans and Pseudomonas aeroginosa are examples of bacteria which cause the infection. Garlic has antibacterial activity against Streptococcus mutans and Pseudomonas aeroginosa. This study aims to test the antibacterial effect of the ethanol extract and polar fraction of ethanol extract of garlic on Streptococcus mutans and Pseudomonas aeroginosa also to know the compound which is contained in the ethanol extract and polar fraction of ethanol extract of garlic that has antibacterial activity. 1   

Extraction is done by 96% ethanol and fractionated by liquid-liquid partition with n-hexane solvent. Antibacterial activity test is carried out by the method of diffusion and liquid dilution methods for determining liquid Minimum Inhibitory Concentration(MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC). The concentration of the extract made 1000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL, 15,625 mg/mL, 7,8 mg/mL and 3.9 mg/mL. Detection test compounds contained in garlic is conducted using bioautografi. The test results of the antibacterial activity of extracts and non-polar fractions of garlic on Streptococcus mutans and Pseudomonas aeroginosa shows ethanol extract had inhibition zone diameter respectively 13.5 ± 2.38 mm and 10 ± 0 mm and MIC in Streptococcus mutans obtained at 62,5 mg/mL Pseudomonas aeroginosa 500 mg/mL. Non-polar fraction of garlic obtained inhibition zone diameter of 8 ± 0 mm and MIC by 250 mg/mL against Streptococcus mutans and Pseudomonas aeroginosa obtained inhibition zone diameter of 4.6 ± 0.58 mm and the MIC for 500mg/mL. The test results obtained are not Minimum Bactericidal Concentration (MBC). Bioautografi Test results show the ethanol extract of garlic has barrier against Streptococcus mutans at Rf 0.85 and Pseudomonas aeruginosa at Rf 0.92 and 0.85. In the polar fraction of garlic there are barriers against Streptococcus mutans at Rf 0.54; 0.85 and 0.92 as well as on Pseudomonas aeruginosa at Rf 0.85 and 0.92. The results of the detection reagent spray-Glacial Acid Vanillin show patches of gray alleged organo sulfur compound Rf 0.54 Key words: Allium sativum L., Streptococcus mutans, Pseudomonas aeroginosa, MIC, MBC PENDAHULUAN Infeksi masih merupakan penyakit yang paling banyak diderita oleh penduduk di negara berkembang. Salah satu penyebab penyakit infeksi adalah bakteri (Radji, 2011). Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeroginosa merupakan contoh bakteri penyebab infeksi. Streptococcus mutans adalah cocci gram positif, nonmotile, mikroorganisme anaerobik fakultatif yang dapat metabolisme karbohidrat dan dianggap sebagai agen pembentuk karies gigi (Fani et al., 2007). Ada tiga faktor yang dapat menimbulkan terjadinya karies gigi. Ketiga faktor tersebut adalah : (1) bakteri kriogenik; (2) permukaan gigi yang rentan, dan (3) tersedianya bahan nutrisi untuk mendukung pertumbuhan bakteri (Putri, 2011). Pseudomonas aeroginosa merupakan bakteri yang dapat bergerak, aerob, berbentuk batang dan terlihat sebagai bentuk tunggal, ganda dan kadang-kadang dalam rantai pendek (Jawetz et al., 2005), Gram-negatif yang ditemukan pada nosokomial (Bjarnsholt et al., 2005). Pseudomonas aeroginosa merupakan bakteri patogen pada manusia, bakteri ini merupakan mikroorganisme yang dominan pada infeksi paru-paru kronis (Bjarnsholt et al., 2005). Saat ini penggunaan antibakteri dari bahan alami mulai dikembangkan. Di seluruh dunia, ratusan tanaman yang dapat digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai pengobatan untuk infeksi bakteri. Salah satu bahan alami yang digunakan sebagai antibakteri adalah bawang putih. Bawang putih sangat populer di masyarakat, memiliki nama latin Allium sativum L. Bawang putih termasuk dalam famili Liliaceae dan merupakan tanaman berumpun yang bersiung-siung. 2   

Bawang putih ditanam di seluruh dunia dan digunakan dalam banyak jenis masakan. Obat ini dijual berupa serbuk yang dibuat dari umbi lapis yang dipotong dan dikeringkan atau dikering bekukan (Heinrich et al., 2010). Infeksi usus, infeksi saluran pernafasan, kulit dan luka-luka akibat gigitan hewan berbisa (Singgih, 2005), bronkitis dan antikanker (Evans, 2002) yang dapat disembuhkan dengan obat yang ramuannya menggunakan bawang putih. Bawang putih memiliki pengaruh terapi karena mengandung senyawa aktif seperti sattive, allyl sulphide, allicin, allyl propyl disulphide, allyl vinyl suphoxide, allistatin, garlicin dan alkyl thiosulphinate. Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri adalah allicin. Efek antibakteri dari bawang putih disebabkan karena adanya senyawa tiosulfinat (seperti : allicin), ketika allicin tereduksi menjadi dialil disulfida aktivitas anti bakteri akan semakin meningkat. Allicin dalam menghambat bakteri akan menghambat langsung dan keseluruhan dari sintesis RNA, walaupun sintesis DNA dan sistesis protein juga dihambat, akan tetapi RNA merupakan target utama dari allicin ( Durairaj et al., 2010). Penelitian yang telah dilakukan adalah menguji aktivitas bawang putih dalam pelarut non polar dengan berbagai bakteri dan jamur dengan salah satu hasilnya adalah fraksi non polar dapat menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa sebesar 39% dengan kadar ekstrak 2 mg/disk (Bakht et al., 2011) dan dengan pelarut yang kurang polar ditemukan agen antimikroba yang lebih aktif dan aktivitas antibakterinya lebih besar dari pelarut yang polar (Gangadhar et al., 2012). METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alat maserasi, blender, alat gelas (pyrex), corong pisah, corong buchner, rotary evaporator (Heidolph), kompresor, penagas air, cawan porselen, batang penganduk dan neraca analitik. Petri, lampu spiritus, oven, tabung reaksi, rak tabung, ose steril, mikropipet (Socorex), shaker incubator (New Brunswick), autoklaf, inkubator (Memmert), mikroskop (Olympus), vortex(Thermolyne Corporation), sonikator, pipet ukur, Laminar Air Flow (LAF), pipet volume, pipet tetes, yellow tips, blue tips, dan alat-alat gelas yang disterilkan.Chamber, pipa kapiler Bawang putih didapatkan dari Pancot, Kalisoro, Tawangmangu. Pasta bawang putih, etanol 96%, etanol 70%, ekstrak etanol 96%, heksan.Bakteri Streptococcus mutans yang diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada dan bakteri Pseudomonas aeroginosa yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Media Mueller Hinton (MH), NA (Nutrient Agar), media Mac Conkey, media Brain Heart Infusion (BHI), standar Mc. Farland III 108 CFU/ml, akuades, etanol, CMC-Na, DMSO, Manitol Salt Agar (MSA), KIA, LIA, MIO, Agar darah. Fase gerak = toluen : etil asetat, silika gel. 3   

Metode Penelitian Identifikasi tanaman Identifikasi tanaman bawang putih dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Identifikasi dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri morfologi daun, batang, dan bunga dari tanaman bawang putih dengan pustaka. Uji aktivitas antibakteri Metode difusi cara sumuran Metode ini untuk melihat ada tidaknya efek antibakteri. Dibuat media padat pada cawan petri dan ditanami dengan bakteri sebanyak 200 µL ditunggu hingga kering (± 10 menit), kemudian dibuat sumuran dengan cork borner, sumuran diisai dengan larutan stok sebanyak 20µL. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Dihitung diameter zona hambat. Metode dilusi cair Metode yang digunakan untuk uji bakteri adalah metode dilusi cair. Metode ini mengukur MIC atau KBM (Minimum Inhibitory Concentration atau Kadar Hambat Minimum) dan MBC atau KBM (Minimum Bactercidal Concentration atau Kadar Bunuh Minimum). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba (ekstrak dan fraksi non polar) pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji (Pratiwi, 2008). Disiapkan 11 tabung steril 1 sampai 11. Tabung 2 sampai 11 diisi 0,5 ml BHI. Tabung 1 dan 2 diisi 0,5 ml ekstrak etanol dan fraksi nonpolar ekstrak etanol bawang putih. Tabung 2 diambil 0,5 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung 3, perlakuaan sama sampai dengan tabung 9. Tabung 9 dibuang 0,5 ml lalu tabung 10 tidak diisi fraksi nonpolar ekstrak etanol bawang putih. Tabung 1 sampai 10 diisi 0,5 ml suspensi bakteri. Tabung 11 digunakan sebagai kontrol media. KHM ditandai dengan kejernihan larutan uji yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri pada media BHI. Hasil inkubasi pada tabung reaksi yang bening (pertumbuhan bakteri yang terhambat), dilakukan penanaman pada media padat dengan mengambil 50µL bakteri dari masing-masing tabung uji kemudian dilakukan penanaman pada media Mueller Hinton (MH) kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. KBM ditunjukkan dengan penghambatan pertumbuhan bakteri pada media Mueller Hinton (MH) kurang lebih 99%.

4   

Uji bioautografi Disiapkan media yang telah ditanam dengan bakteri. Dilakukan tahap bioautogarafi yaitu dengan menyiapkan lempeng KLT dan chamber yang telah dijenuhi dengan fase gerak, ekstrak dan fraksi non polar ditotolkan pada plat KLT sebanyak 2µL. Selanjutnya dielusi dengan fase gerak yang sesuai (toluen : etil asetat 100:30). Plat KLT diangin-anginkan selama 60 menit. Plat diletakkan pada media yang telah ditanami bakteri selama 15 menit dan diinkubasi suhu 37oC selama 24 jam. Senyawa aktif ditunjukkan dengan zona bening pada media. HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Tanaman Penelitian ini diawali dengan melakukan identifikasi tanaman yang akan digunakan. Identifikasi tanaman adalah langkah untuk memastikan identitas dari suatu tanaman yang akan dilakukan uji sehingga menghindari kesalahan dalam penggunaan. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan terhadap pustaka “Flora of Java“ karangan Backer dan Van den Brink, 1965. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa tanaman yang diidentifikasi adalah Allium sativum L. (bawang putih). Pemilihan Larutan Penyari Pemilihan penyari dilakukan untuk mengetahui penyari yang memiliki rendemen dan

aktivitas

antibakteri yang lebih baik. Konsentrasi etanol yang digunakan yaitu 70% dan 96%. Rendemen ekstrak dengan pelarut etanol 96% hampir sama dengan etanol 70%. Diameter zona hambat ekstrak etanol 96% terhadap bakteri Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeruginosa lebih besar dibandingkan dengan ekstrak etanol 70%. KHM ekstrak etanol 96% terhadap bakteri Streptococcus mutans lebih kecil dibandingkan dengan ekstrak etanol 70%. Oleh karena itu, dipilih ekstrak etanol 96% sebagai larutan penyari. Tabel 1. Uji Pendahuluan Ekstrak Etanol bawang putih terhadap S.mutans Konsentrasi ekstrak Diameter zona KHM Penyari etanol Rendemen (%) (mg/sumuran) hambat (mm) (mg/mL) 70% 20,85 20 125 96% 20,98 20 15 31,25 Tabel 2. Uji Pendahuluan Ekstrak Etanol bawang putih terhadap P.aeruginosa Konsentrasi ekstrak Diameter zona KHM Penyari etanol Rendemen (%) (mg/sumuran) hambat (mm) (mg/mL) 70% 20,85 20 8 250 96% 20,98 20 10 125

Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Maserasi merupakan proses penyarian dengan cara merendam simplisia dalam penyari sampai meresap dan melunakkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut akan melarut (voight, 1989). Metode maserasi dilakukan selama 3-4 hari untuk melarutkan 5   

senyawa yang terkandung hingga larut (Sarker et al., 2005). Larutan penyari yang digunakan dalam maserasi adalah etanol 96%. Etanol merupakan penyari universal, yaitu dapat menyari hampir semua senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman baik polar maupun non polar. Fraksinasi Fraksinasi yang paling mudah yaitu dengan metode partisi cair-cair. Teknik ini menggunakan dua pelarut yang tidak bercampur dalam corong pisah dan senyawa didistribusikan dalam kedua pelarut sesuai koefisien partisinya. Metode ini relatif mudah dan sangat efektif sebagai langkah pertama dalam pemisahan ekstrak kasar (Sharker et al., 2006). Partisi dilakukan dengan perbandingan 1:1, untuk fraksi non polar dengan menggunakan pelarut n-heksan. Ekstrak yang digunakan dengan penyari etanol 96%. Hasil fraksinasi selanjutnya diuapkan pada waterbath untuk menghilangkan pelarut dengan suhu <60oC supaya senyawa yang terkandung tidak rusak. Hasil dari fraksinasi didapatkan rendemen sebanyak 13,19%. Tabel 3. Hasil Fraksinasi ekstrak etanol 96% Bawang putih Menggunakan n-Hexane Fraksi Rendemen (%) n-Hexane 13,19

Identifikasi Bakteri Pengecatan Gram Pengecatan Gram merupakan pengecatan diferensial yang bertujuan untuk memberi warna pada bakteri agar terlihat jelas dan untuk membedakan antara bakteri Gram positif dan negatif. Hasil pengecatan diamati dengan mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali, diperoleh hasil pengecatan bakteri Streptococcus mutans berupa Gram positif yaitu berbentuk bulat atau bulat berantai, dan berwarna ungu (Gambar 3A). Hasil pengecatan pada bakteri Pseudomonas aeruginosa menunjukkan berupa bakteri Gram negatif yaitu berbentuk batang, menyebar dan berwarna merah (Gambar 3B)

A

B

Gambar 3. Hasil Pengecatan Gram Bakteri Streptococcus mutans (A) dan Pseudomonas aeruginosa (B)

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang pada pengecatan Gram tidak tahan alkohol sehingga warna cat pertama dilunturkan dan akan mengikat warna kontras (Jawetz et al., 2005). Pada bakteri 6   

Gram positif dinding selnya terdiri dari lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga permebeabilitas dinding sel bakteri kurang sehingga kompleks ungu kristal iodium dipertahankan dan bakteri tetap berwarna ungu (Radji, 2011). Uji Biokimia Identifikasi bakteri secara biokimia digunakan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat biokimia bakteri. Streptococcus mutans menggunakan media MSA (Manitol Salt Agar). Hasil identifikasi Streptococcus mutans menunjukkan perubahan warna dari merah menjadi kuning (asam) (Gambar 4.a). Hasil menunjukkan bahwa Streptococcus mutans dapat memfermentasi manitol (Jawetz et al., 2005). Uji Streptococcus mutans pada media agar darah menunjukkan hemolisis pada sel darah merah (Gambar 4.b). Streptococcus mutans mempunyai tipe α-hemolitik yaitu melisis sel darah merah secara parsial akibat reduksi hemoglobin sehingga memperlihatkan warna kehijauan disekitar koloni (Radji, 2011). Identifikasi untuk Pseudomonas aeruginosa menggunakan media KIA (Kligler Iron Agar), LIA (Lysine Iron Agar), dan MIO (Motility Indol Ornithine). Pengamatan dilihat dari sifat asam basa pada media, ada tidaknya H2S, ada tidaknya gas, dan ada tidaknya gerakan. Hasil menunjukkan pada media KIA bagian tegak tidak terjadi perubahan warna yaitu tetap merah dan bagian miring terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning. Hal ini menunjukkan bahwa Pseudomonas aeruginosa tidak dapat memfermentasi glukosa dan bersifat basa, selain itu Pseudomonas aeruginosa tidak memproduksi H2S ditunjukkan dengan tidak terbentuknya warna hitam pada media KIA. Pada media LIA bagian tegak dan miringnya tetap berwarna ungu, hal ini menunjukkan bahwa terbentuk suasana basa dan bakteri tidak mendekarboksilasi lisin. Pada media MIO terjadi perubahan warna menjadi ungu yang menunjukkan terjadi reaksi dekarboksilasi ornitin, dan bakteri dapat bergerak (Gambar 5). Identifikasi biokimia Pseudomonas aeruginosa sesuai dengan teori yaitu dapat bergerak, tidak memfermentasi glukosa, dan tidak memproduksi H2S (Jawetz et al., 2005).

7   

(a) (b) Gambar 4. Hasil uji biokimia Streptococcus mutans pada media MSA(a) dan agar darah (b)

        

            

            

 

Gambar 5. Hasil uji biokimia Pseudomonas aeruginosa pada media KIA, LIA, MIO Tabel 4. Uji biokimia Pseudomonas aeruginosa KIA Pseudomonas Mir Teg H2S Mir aeroginosa K K Keterangan:

A = Asam K = Alkali Rek = Reaksi

LIA Teg

H 2S

Rek

Mot

K

-

K

+

Mot = Motilty Teg =Tegak

MIO

Mir = Miring (-) = negatif

Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol 96% Uji difusi cara sumuran untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak. Metode ini berdasarkan perpindahan secara difusi dari ekstrak ke dalam media agar dengan menaruh ekstrak ke dalam sumuran. Konsentrasi yang digunakan dalam uji adalah 100% dan volume pengambilan untuk uji adalah 20µL. Tabel 5. Hasil uji difusi ekstrak etanol 96% (n=4) diameter zona hambat (mm ± SD)

Kadar (mg/sumuran)

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus mutans

20

10 ± 0

13,5 ±2,38

Diameter zona hambat ekstrak etanol 96% terhadap bakteri Streptococcus mutans sebesar 13,5 ±2,38 mm dan Pseudomonas aeruginosa sebesar 10 ± 0 mm. Ekstrak etanol memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Uji dilusi cair untuk melihat potensi aktivitas antibakteri. Metode ini mempunyai prinsip dengan mengencerkan bahan uji menjadi konsentrasi yang berbeda-beda. Hasil pengenceran di tambahkan dengan suspensi bakteri dan pengamatan dengan melihat kejernihannya. Uji dilusi cair dilakukan untuk 8   

mendapatkan data KHM. Konsentrasi yang digunakan adalah 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL, 15,6 mg/mL, 7,8 mg/mL, 3,9 mg/mL, 1,95 mg/mL. KBM dihasilkan dengan menanam hasil dilusi cair yang jernih pada media padat. KBM ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri. Tabel 6. uji dilusi cair ekstrak etanol terhadap Streptococcus mutans(n=4) Hasil Pengamatan Kadar Larutan Uji No (mg/mL) Dilusi cair Subkultur pada media padat 1 500 --++ 2 250 --++ 3 125 --++ 4 62,5 --++ 5 31,25 --++ 6 15,6 +++ x 7 7,8 +++ x 8 3,9 +++ x 9 1,95 +++ x 10 Kontrol suspensi +++ x 11 Kontrol media --x Ket : (---) (+++)

: jernih : keruh

(x) (++)

: tidak dilakukan : ada koloni

Tabel 7. uji dilusi cair ekstrak etanol terhadap Pseudomonas aeruginosa(n=4) Hasil Pengamatan Kadar Larutan Uji No (mg/mL) Dilusi cair Subkultur pada media padat 1 500 --++ 2 250 --++ 3 125 +++ x 4 62,5 +++ x 5 31,25 +++ x 6 15,6 +++ x 7 7,8 +++ x 8 3,9 +++ x 9 1,95 +++ x 10 Kontrol suspensi +++ x 11 Kontrol media --x Ket : (---) (+++)

: jernih : keruh

(x) (++)

: tidak dilakukan : ada koloni

Uji dilusi cair pada ekstrak etanol didapatkan hasil KHM pada Streptococcus mutans sebesar 31,25 mg/mL dan Pseudomonas aeruginosa sebesar 250 mg/mL. KBM tidak diperoleh karena pada subkultur pada media padat terdapat pertumbuhan bakteri. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi non polar Uji difusi cara sumuran untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari fraksi non polar. Metode ini berdasarkan perpindahan secara difusi dari ekstrak ke dalam media agar dengan menaruh fraksi non polar ke dalam sumuran. Konsentrasi yang digunakan dalam uji adalah 100% dan volume pengambilan uji adalah 20µL. 9   

Tabel 8. Hasil uji difusi fraksi non polar ekstrak etanol (n=3) diameter zona hambat (mm ± SD)

Kadar (mg/sumuran)

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus mutans

20

6,9 ± 0,58

8±0

Hasil difusi cara sumuran fraksi non polar dari ekstrak etanol mempunyai zona hambat terhadap Streptococcus mutans sebesar 8 ± 0 mm dan Pseudomonas aeruginosa sebesar 4,6 ± 0,58 mm. Hasil menunjukkan bahwa fraksi nonpolar mempunyai aktivtas sebagai antibakteri. Uji dilusi cair untuk melihat potensi aktivitas antibakteri dari fraksi non polar dari ekstrak bawang putih. Metode ini mempunyai prinsip dengan mengencerkan bahan uji menjadi konsentrasi yang berbeda–beda. Pengamatan hasil dengan melihat kejernihannya dan penentuan KBM dengan subkultur pada media padat. Tabel 9. Uji dilusi cair fraksi non polar bawang putih pada Streptococcus mutans (n=4) No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Kadar Larutan Uji (mg/mL) 500 250 125 62,5 31,25 15,6 7,8 3,9 1,95 Kontrol suspensi Kontrol media

Ket : (---) (+++)

: jernih : keruh

Dilusi cair ------+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ --(x) (++)

Hasil Pengamatan Subkultur pada media padat ++ ++ ++ x x x x x x x x

: tidak dilakukan : ada koloni

Tabel 10. Uji metode dilusi cair fraksi non polar pada Pseudomonas aeruginosa (n=4) No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Kadar Larutan Uji (mg/mL) 500 250 125 62,5 31,25 15,6 7,8 3,9 1,95 Kontrol suspensi Kontrol media

Ket : (---) (+++)

: jernih : keruh

Dilusi cair ----+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ --(x) (++)

Hasil Pengamatan Subkultur pada media padat ++ ++ x x x x x x x x x

: tidak dilakukan : ada koloni

10   

Uji dilusi cair pada fraksi nonpolar ekstrak etanol bawang putih didapatkan hasil KHM pada Streptococcus mutans sebesar 125 mg/mL dan Pseudomonas aeruginosa sebesar 250 mg/mL. KBM tidak diperoleh karena pada subkultur media padat terdapat pertumbuhan bakteri. Diameter zona hambat dari fraksi etil aseat terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Streptococcus mutans adalah 15,63±1,25 mm dan 12±0 mm dengan KHM 250 mg/mL dan 125 mg/mL. Diameter zona hambat dari fraksi etanol-air terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Streptococcus mutans adalah 10±0 mm dan 10,5±1 mm dengan KHM 250 mg/mL dan 125 mg/mL. perbandingan hasil mnunjukkan bahwa ekstrak etanol memiliki aktivitas antibakteri yang lebih baik daripada fraksinya, hal ini disebabkan karena dalam ekstrak terdapat senyawa yang kompleks dan saling mendukung dalam aktivitasnya sebagai antibakteri.  Ekstrak air bawang putih memiliki zona hambat pada Streptococcus mutans sebesar 6 mm. Sedangkan ekstrak metanol bawang putih memiliki zona hambat pada Streptococcus mutans sebesar 2 mm (Saravanan et al, 2010) dan Pseudomonas aeruginosa dengan ektrak air bawang putih yaitu konsentrasi 25% bakteri dihambat dengan diameter 7 mm (Durairaj et al., 2010). Ekstrak etanol bawang putih mempunyai KHM 150 mg/mL dan KBM 175 mg/mL terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa (Abubakar, 2009). Hasil penelitian menunjukkan perbedaan karena simplisia yang digunakan yaitu serbuk bawang putih sedangkan uji yang dilakukan dengan simplisia basah, metode ekstraksi yaitu sokletasi dan yang dilakukan adalah maserasi serta allicin sangat reaktif dan tidak stabil. Allicin dapat terurai menjadi senyawa sulfur dan aktivitas sebagai antibakteri akan kecil (Ebadi, 2002). Hasil penelitan menunjukkan bahwa KHM terhadap Streptococcus mutans lebih kecil dibandingkan dengan KHM terhadap Pseudomonas aeruginosa. Hal ini dimungkinkan Pseudomonas aeruginosa memiliki dinding sel yang lebih kompleks yaitu lapisan lipid (peptidoglikan) dan membran luar yang berfungsi untuk menghalangi masuknya agen antibakteri (Saravanan et al, 2010). Bioautografi Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dengan prinsip interaksi dengan fase gerak dan fase diam. Pemisahan yang terjadi pada senyawa adalah karena perbedaan kepolaran dari suatu senyawa. Fase gerak yang digunakan adalah toluen : etil asetat (100:30) dan fase diam adalah silica gel 254. Hasil elusi dari ekstrak diperoleh bercak pada Rf(1) 0,54; Rf(2) 0, 85 dan Rf (3)0,92. Hasil fraksi nonpolar diperoleh Rf(1) 0,54 dan Rf (3) 0,92 . Deteksi dengan reagen semprot vanillin-asam glasial memberikan warna hitam keabu-abuan. Allicin pada reagen semprot vanillin-asam glasial terlihat 11   

bercak berwarna abu-abu sampai coklat dengan Rf 0,45 (Wagner and Bladt, 1996) dengan fase gerak toluene:etil asetat (100:30) dan fase diam silica gel.

A1

A2 B1 B2 Ekstrak Fraksi nonpolar Gambar 6. Plat hasil kromatografi lapis tipis ekstrak dan fraksi nonpolar ekstrak etanol bawang putih fase gerak toluene : etil asetat (100:30) dan Fase diam : Silica gel GF254 Deteksi : A1: pengamatan plat hasil elusi pada UV 366 A2 : pengamatan plat hasil elusi dengan pereaksi semprot vanillin-asam glasial B1: pengamatan plat hasil elusi pada UV 366 B2: pengamatan plat hasil elusi pereaksi semprot vanillin-asam glasial

Uji bioautografi adalah uji untuk mengetahui senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri dengan metode KLT. Konsentrasi stok adalah 50% dan jumlah totolan 2 µL dengan konsentrasi totolan 1mg.

A B Gambar 7. Hasil uji bioautografi ekstrak bawang putih terhadap (A) P.aeruginosa (B) S.mutans. fase gerak toluene:etil asetat(100:30), fase diam silica GF254

12   

Gambar 8. Hasil uji bioautografi fraksi nonpolar ekstrak bawang putih terhadap (A) P.aeruginosa (B) S.mutans. fase gerak toluene:etil asetat(100:30), fase diam silica GF254

Hasil bioautografi menunjukkan pada ekstrak etanol bawang putih mempunyai hambatan terhadap Streptococcus mutans pada Rf 0,85 (gambar 7.B) dan pada Pseudomonas aeruginosa pada Rf 0,92 dan 0,85 (gambar 7.A). Pada fraksi nonpolar dari bawang putih terdapat hambatan terhadap Streptococcus mutans pada Rf 0,54 ; 0,85 dan 0,92 (gambar 8.A) serta pada Pseudomonas aeruginosa pada Rf 0,85 dan 0,92 (Gambar 8.B). Senyawa dengan Rf 0,92;  0, 85 dan 0,54 pada fase gerak toluen:etil asetat (100:30) dan fase diam silika GF254 adalah senyawa-senyawa nonpolar. Telah dilaporkan senyawa-senyawa nonpolar dalam ekstrak bawang putih adalah phenolic, diallyl sulfide dan allicin (Leelarungrayub et al., 2004), sebagian besar senyawa tersebut adalah golongan organosulfur.  Senyawa yang diduga adalah golongan organosulfur.  Bawang putih dilaporkan mengandung senyawa aktif golongan organosulfur yaitu sattive, allyl sulphide, allicin, allyl propyl disulphide, allyl vinyl suphoxide, allistatin, garlicin dan alkyl thiosulphinate. Bawang putih memiliki aktivitas farmakologi seperti antibakteri, antioksidan dan antihipertensi. Senyawa yang dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri adalah allicin (Heinrich et al., 2010) dengan KHM 150 mg/mL dan KBM 175 mg/mL terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa (Abubakar, 2009) dan diameter zona hambat terhadap Streptoccus mutans 6 mm (Saravanan et al., 2010). KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat diambil kesimpulan bahwa: 1. Ekstrak etanol dan fraksi nonpolar bawang putih (Allium sativum L.) mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap Streptococcus mutans dan Pseudomonas aeruginosa. Diameter zona hambat 13   

ekstrak etanol terhadap dua bakteri tersebut masing-masing 13.5 ± 2.38 mm dan 10 ± 0 mm dan KHM 31,25 mg/mL dan 125 mg/mL. Diameter zona hambat fraksi nonpolar 8 ± 0 mm dan 6,9 ± 0,58 dan KHM 125 mg/mL dan 250 mg/mL. Hasil KBM tidak diperoleh.  2. Senyawa yang terkandung didalam ekstrak etanol dan fraksi nonpolar bawang putih yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri adalah golongan senyawa organosulfur. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk deteksi senyawa allicin dan isolasi serta dilakukan uji hasil isolasi. Penelitian tentang aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol dan fraksi non polar ekstrak etanol bawang putih dengan kombinasi antibiotik. DAFTAR PUSTAKA Abubakar, El-Mahmood Muhammad, 2009, Efficacy of Crude extracts of garlic (Allium sativum Linn.) againts nosocomical Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa, Journal of Medicinal Plants Research, 3(4), 179-185. Bjarnsholt, T., Jensen, Peter O., Rasmussen, T. B., Christophersen, L., Calum, H., & Hentzer, M et al., 2005, Garlic blocks quorum sensing and promotes rapid clearing of pulmonary Pseudomonas aeruginosa infections , Microbiology, 151, 3878-3880. Bakht, J., Tayyab, M., Ali, H., Islam, A., & Shafi, M., 2011, Effect of different solvent extracted sample of Allium sativum(Linn) on bacteria and fungi, African Journal Of Biotechnology, 10(31), 5910-5915. Departemen Farmakologi dan Terapeutik, 2007, Farmakologi dan Terapi, 587, Balai Penerbit FKUI, Jakarta. Durairaj, S., Srinivasan, S., & Lakshmanaperumalsamy, P., 2010, In vitro Antibacterial Activity and Stability of Garlic Extract at Different pH and Temperature , Electronic Journal Of Biologi, 6(4): 92-91. Ebadi, M., 2002, Pharmacodynamic Basic of Herbal Medicine, 538, CRC Press, New York. Fani, MM., Kohanteb, J., & Dayaghi. M., 2010, Inhibitory activity of garlic (Allium sativum) extract on multidrug-resistant Streptococcus mutans, Journal Of Indian Society Of Pedodontics and Preventive Dentistry, 25, 164-168. Gangadhar, M., Shraddha, K., & Ganesh, M., 2012, Antimicrobial screening of Garlic (Allium sativum) extracts an their effect on Glucoamylase activity in-vitro, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2 (1), 106-108. Harborne, J.B., 2006, Metode Fitokimia Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan, 6, 7, ITB, Bandung. Heinrich, M., Barnes, J., Gibbson, S., Williamsom, M.E., 2010, Farmakognosi dan Fitoterapi, 246, 247, 279, 280, Buku Kedokteran EGC, Jakarta. 14   

Iwalokun, B.A., Ogunledun, A., Ogbolu, D.O., Bamiro, S.B., & Jimi-Omojala, J., 2004, In Vitro Antimicrobial Properties of aqueous Garlic Extract Againts Multidrug-Resistant Bacteria and Candida species from Nigeria, Journal of Medicinal Food, 7(3), 327-333. Jawetz, E., Melnick, J. L., & Adelberg, E. A., 2005, Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Maulany, R. F., dan Edinugroho, 49, 335, 372, Salemba Madika, Jakarta. Leelarungrayub1, N., Chanarat, N., and Rattanapanone, V., 2004, Potential Activity of Thai Shallot (Allium ascalonicum L.) Extract on the Prevention of Hemolysis and Glutathione Depletion in Human Erythrocyte from Oxidative Stress, CMU. Journal 3(3), 225-234. NCBI, 2013, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi (diakses tanggal 11 januari 2013) Pratiwi, S., 2008, Mikrobiologi Farmasi, 154-160, 190-192, Penerbit Erlangga, Jakarta. Putri, Megananda Hiranya; Heri Julianti, Elisa & Nurjannah, Neneng., 2011, Ilmu Pencegahan Penyakit Jaringan Keras dan Jaringan Pendukung Gigi, 155, Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Radji, Maksum & Manurung, Juli., 2011, Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi Kedokteran, 98, 99, 107, 153, Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Ross, Z.M., O’gara, E.A., Hill, D.J., Sleightholme, H.V., & Maslin, D.J., 2001, Antimicrobial Properties of Garlic Oil against Human Enteric Bacteria: Evaluation of methodologies and Comparisons with Garlic Oil Sulfides and Garlic Powder, Journal of American Society for Microbiology, 67, 1, 475-480. Sarker, D.,Satyajit., Latif, Z., & Gray, I.A., 2005, Natural Products Isolation, 2nd Ed, 36, 270, 271, New Jersey, Humana Press. Saravanan, P., Ramya, V., Sridhar, H., Balamurugan, V., & Umamaheswari, S., 2010, Antibacterial Activity of Allium sativum L. on Pathogenic Bactrial Strains, Global Veterinaria, 4 (5), 519522. Shobana, S., Vidya, V.G., & Ramya, M., 2009, Antibacterial activity of Garlic Varietes (ophioscordon and sativum) on Enteric Pathogens, Journal of Biological Sciences, 1(3), 123-126. Tjay, H.Tan.,& Rahardja, K., 2007, Obat-Obat Penting, PT.Elex Media Komputindo, Jakarta. Tsao, S & Yin, M, 2001, In Vitro Acitivity of Garlic Oil And Four Diallyl Sulphides Againt AntibioticResistant Pseudomonas aeruginosa And Klebsiella pneumonia, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 47, 655-670. Wagner, H., & Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, Second Edition, 302, Springer-Verlag, Berlin. Wibowo, S., 2005, Budidaya Bawang: Bawang Putih, Bawang Merah, Bawang Bombay, 2-13, Penebar Swadaya, Jakarta. 15