A NITROGÉN-MONOXID SZABAD GYÖK KIMUTATÁSA ÉS SZEREPE A PANCREAS EXOKRIN RÉSZÉBEN DR. EMBER ZSOLT

A NITROGÉN-MONOXID SZABAD GYÖK KIMUTATÁSA ÉS SZEREPE A PANCREAS EXOKRIN RÉSZÉBEN Doktori (PhD) értekezés

DR. EMBER ZSOLT

témavezető: DR. FEHÉR ERZSÉBET egyetemi tanár

BUDAPEST 2002. SEMMELWEIS EGYETEM KLINIKAI ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A HEPATOLÓGIA SZABAD GYÖKÖS ÉS IMMUNOLÓGIAI VONATKOZÁSAI c. program

1

TARTALOM BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉSEK IRODALMI HÁTTÉR

3 4 5

A NITROGÉN-MONOXID (NO) A NITROGÉN-MONOXID SZINTÁZ (NOS) ENZIMEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A NO KUTATÁSÁBAN NO donorok L-arginin NOS inhibitorok A NO által aktivált oldható guanilcikláz (soluble guanylyl cyclase: sGC) vizsgálata A NO kimutatásának módszerei A NO HATÁSAI Érrendszer Immunrendszer Központi idegrendszer Perifériás idegrendszer A NO A PANCREAS EXOKRIN RÉSZÉBEN Morfológiai vizsgálatok A NO és az exokrin pancreas szekréció A NO jelentősége akut pancreatitisben

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

5 8 14 14 16 16 17 18 19 19 20 21 22 26 26 27 32

33

ANYAGOK KÍSÉRLETI ÁLLATOK 33 MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK 34 NADPH diaforáz enzimhisztokémia 34 NOS immunhisztokémia 34 ÉLETTANI VIZSGÁLATOK 37 Patkány pancreas szegmentumok amiláz elválasztásának mérése on-line fluorimetriás módszerrel 37 Patkány acinussejtek intracelluláris szabad kálciumion koncentrációjának mérése 39 STATISZTIKAI VIZSGÁLATOK 41

EREDMÉNYEK

42

NADPH DIAFORÁZ ENZIMHISZTOKÉMIA és NOS IMMUNHISZTOKÉMIA 42 PATKÁNY PANCREAS SZEGMENTUMOK AMILÁZ ELVÁLASZTÁSÁNAK MÉRÉSE ON-LINE FLUORIMETRIÁS MÓDSZERREL 48 PATKÁNY ACINUSSEJTEK INTRACELLULÁRIS SZABAD KÁLCIUMION KONCENTRÁCIÓJÁNAK MÉRÉSE 52

MEGBESZÉLÉS és KÖVETKEZTETÉSEK AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI

54 59

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY IN ENGLISH

60 62 82 84 86

2

BEVEZETÉS A nitrogén-monoxid (NO) története 1980-ban kezdődött az ún. endothel eredetű relaxáló faktor (endothelium-derived relaxing factor: EDRF) felfedezésével. Az akkor még ismeretlen természetű, rövid élettartamú EDRF-ről megállapították, hogy az acetilkolin és a bradikinin értágító hatását közvetíti az endothelsejtekből az érfal simaizomzata felé (1). 1987-ben sikerült bizonyítani, hogy az EDRF vazodilatátor hatása megegyezik a NO-éval, valamint azt, hogy a NO a szükséges mennyiségben szabadul fel az endothelből és diffundál a simaizomsejtekbe (2). A 90-es évek elejére fontos adatok gyűltek össze a NO-nak az idegsejtekben (3) és az immunrendszer sejtjeiben (4) betöltött biológiai funkcióiról is. A kiterjedt kutatásokat, melyek mind több szervrendszer élettani és kóros folyamataiban mutatták ki a NO szerepét (5, 6, 7, 8), nagyban előmozdította a szöveti NO produkcióért felelős nitrogén monoxid szintáz (NOS) enzimek azonosítása és klónozása (9, 10), NOS gátló illetve NO donor vegyületek előállítása (11) valamint a NO-nak a szövetekből való kimutatását célzó eljárások fejlődése (12, 13). 1992-ben a Science c. folyóirat az "év molekulájának" választotta a NO-ot (14). 1998-ban élettani/orvosi Nobel-díjjal ismerték el Furchgott, Ignarro és Murad egymástól független, a NO érhatásaival kapcsolatos korábbi kutatásait (15). Noha a tudományos társadalom egy része meglepetéssel és kétkedéssel fogadta, hogy egy kisméretű, rövid élettartamú, reakcióképes, jól diffundáló molekulagyök az élő szervezet jelátvivő anyaga lehet, a NO iránt változatlanul óriási az érdeklődés. A Medline adatbázisban 1998-ban a transzmitter hatású anyagok között a NO a második legtöbbet említett vegyület a tudományos publikációkban (16). Jóllehet a felhalmozódott ismeretanyag óriási, sok még a NO-dal kapcsolatos megválaszolatlan kérdés. A NO enzimatikus képződésének szabályozásával, a NO sejten belüli célpontjaival és reakcióival kapcsolatos nagyszámú vizsgálat folyamatosan közzétett eredményei azonban mind hozzájárulnak a szervezet élettani folyamatainak illetve számos megbetegedés etiológiájának jobb megértéséhez, és a legkülönbözőbb szakterületeken alapozhatnak meg ígéretes terápiás eljárásokat.

3

CÉLKITŰZÉSEK A NOS enzimek jelenléte, az enzimatikus NO képződés és a felszabaduló NO hatásai -sok más szövetféleség mellett- a pancreas endokrin és az exokrin részében is többféle eljárás segítségével igazolhatók. A pancreas élettani és kórélettani folyamataiban egyaránt feltételezik a NO szerepét (17, 18, 19, 20). Az exokrin szöveteken végzett nagyobb számú in vivo vizsgálat eredményei a NO közvetett, a hasnyálmirigy vérkeringésének megváltoztatásán át kifejtett hatását mutatják (21, 22). A kisebb számú in vitro kísérlet eredményei ellentmondásosabbak, az azonban valószínűnek látszik, hogy a NO közvetlenül, érhatásaitól függetlenül is hatással van az hasnyálmirigy exokrin részére (23). Az értekezésben tárgyalt vizsgálatok egyik fő célja ezen utóbbi, a pancreasban kevésbé ismert folyamatok megvilágítása. Az értekezés célkitűzései: • A nitrogén-monoxid szabad gyök (NO) termeléséért felelős nitrogén-monoxid szintáz (NOS) neuronális típusának (nNOS) fénymikroszkópos enzimhisztokémiai és immunhisztokémiai kimutatása és lokalizációja sertés és patkány hasnyálmirigy szöveteiben. • Az nNOS immunreaktivitás eloszlásának vizsgálata patkány pancreasban az életkor függvényében, négy korcsoportban. • A NO donor nitroprusszid-nátrium (sodium nitroprusside: SNP), a NOS szubsztrát L-arginin (L-Arg), a NOS inhibitor NG-nitro-L-arginin (LNNA) és a NO hatásait közvetítő ciklusos guanozin-3'5'-monofoszfát (cGMP) sejtpermeábilis analógja, a 8bromo cGMP (8-Br cGMP) in vitro patkány pancreas preparátumok (izolált pancreas szegmentumok) nyugalmi valamint idegingerléssel vagy acetilkolinnal (ACh) stimulált amiláz szekréciójára gyakorolt hatásainak vizsgálata.

• Az SNP és a 8-bromo cGMP patkány pancreas acinussejtek intracelluláris szabad kálciumion koncentrációjára [Ca++ ]i kifejtett hatásainak in vitro vizsgálata.

4

IRODALMI HÁTTÉR A NITROGÉN-MONOXID (NO) A NITROGÉN-MONOXID SZINTÁZ (NOS) ENZIMEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A NO KUTATÁSÁBAN A NO HATÁSAI A NO AZ EXOKRIN PANCREASBAN

A NITROGÉN-MONOXID (NO) A NO molekulában lévő szigma és pi kötést egy kompenzálatlan spinű elektron gyengíti, a NO tehát szabad gyök, gyakran NO•-ként is jelölik. (Az értekezésben csak a reakcióegyenletekben használom az NO• jelölést.) A kompenzálatlan spinű elektron magyarázza a NO paramágneses tulajdonságát valamint reakcióképességét (24). A NO színtelen gáz, vízben csak korlátozott mértékben oldódik, standard körülmények között kb. 2mM-os telített oldatot ad (25). Hidrofób jellege kifejezett diffúziós készséget eredményez a biológiai rendszerekben: akadálytalanul jut át a membránokon, in vivo kimutatható pl. a tüdő alveolusaiban (26). Diffúziós készségét jól jelzi a központi idegrendszerben becsült "hatósugara": adott pontból felszabadulva egy kb. 100 µm sugarú gömbön belül elhelyezkedő sejtekhez és szinapszisokhoz juthat el, viszonylag rövid fél-életideje (0.5 -5 sec) ellenére (27). Noha a nitrogén különböző oxidjainak kémiai tulajdonságai és reakciói jól ismertek, a biológiai rendszerekben lejátszódó folyamatokról kevesebbet tudunk. Az bizonyos, hogy a NO életidejét limitáló reakciók és faktorok eltérhetnek az in vitro és az in vivo rendszerekben. Szabad gyök jellegéből eredően a NO in vivo leginkább más szabad gyökökkel (pl. szuperoxid anion) illetve átmeneti fémekkel (pl. hem vas) lép reakcióba. A fenti reakciók termékei, valamint a NO oxidációs termékei illetve redox formái újabb változatos, az aktuális kémiai mikrokörnyezet által determinált reakciókban vesznek részt. A képződő másodlagos reakciótermékek számos esetben maguk is biológiailag aktív és jelentős vegyületek (28). A NO oxidálódhat nitrozonium ionná (NO+) vagy redukálódhat nitroxil anionná

5

−e

(NO—): NO+

←

+e

NO• →

NO—

A fenti folyamatok valószínűleg in vivo is végbemennek (28). Nem tisztázott, hogy a NOS enzimek pontosan melyik formát hozzák létre. A közvetlenül termelt NO forma azonosítása nehéz a kísérletekben használt puffer oldatokban lévő fémion szennyeződések valamint az enzim aktivitásához szükséges oxigén jelenléte miatt. A NO illetve redox formái élettani körülmények között olyan biológiai rendszerekben vannak jelen, ahol a reaktív oxigén intermedierek, a fémek és metalloproteinek redox státusa szigorúan meghatározott. Kölcsönhatásainak ismeretében valószínű, hogy élettani körülmények között a NO elsősorban a vastartalmú proteinekkel reagálva látja el jelátvivő feladatát (29). Ha azonban a NO az adott biológiai rendszerben magasabb koncentrációban található, akkor nagy valószínűséggel képződnek oxidációs termékei is, melyek igen reakcióképes és potenciálisan toxikus vegyületek (25). Kóros körülmények között a NO eredetű reakciótermékek sorsát lokális koncentrációjuk és az adott rendszer megváltozott redox státusa határozza meg. Gyulladásos folyamatok során a fokozott szuperoxid anion képződés társulhat a NO túlképződésével. A NO és a szuperoxid anion reakciója során először peroxinitrit (ONOO— ) keletkezik: O2•— + NO• →

ONOO—

A folyamat sebessége nM-os koncentrációk mellett konstansnak tűnik. Az ONOO— viszonylag stabil vegyület (fél-életideje kb. 1 sec), protonálódva peroxinitritsavvá (ONOOH) alakul, mely spontán bomlik nitrogén-dioxid gyökre és hidroxil gyökre (30): ONOOH

→

NO2• + •OH

A hidroxil gyök rendkívül reakcióképes, fél-életideje 10-6 sec. A nitrogén-dioxid szabad gyök tovább alakulhat magasabb oxidációs számú nitrogén oxidokká (dinitrogéntetroxid N2O4 és dinitrogén-trioxid N2O3), melyek a nitrogén-dioxidból protonációval képződő salétromossavval (HONO) együtt aminokból nitrozaminokat képezhetnek, így

6

potenciális karcinogének. A peroxinitrit lipidperoxidációt indíthat meg, oxidálhatja a tiolokat és nitrozálhatja egyes aminocsoportok funkcionális csoportjait (31, 32, 33). A NO reakcióba lép az oxihemoglobinnal, a porfirinvázban a ferro ion ferri ionná oxidálódik, methemoglobin és nitrát keletkezik (34): hem-Fe2+-O2 + NO• → hem-Fe3+ + NO3— A methemoglobin NADPH dependens módon visszalakul, a nitrátot, mely in vivo a NO stabil metabolitja, a vese választja ki és a vizelettel ürül. Már a XIX. sz. elején megfigyelték, hogy gyulladásos betegségekben szenvedők vizeletében emelkedett a nitrát szintje (25). A NO gátolhat fontos vas-kén centrumot tartalmazó enzimeket. A kölcsönhatás során olyan kis molekulasúlyú komplexek jöhetnek létre, melyek általános szerkezete Fe(RS)2(NO)2 (35). Karcinogén hatású anyagokkal illetve nitrátokkal kezelt májszövetben kimutathatók a fenti anyagok (36). Jóllehet a NO és a tiolok (RSH) fiziológiás körülmények között közvetlenül nem reagálnak egymással (37), a NO metabolizmus egyes termékeinek (peroxinitrit, nitrogén-dioxid gyök) hatására aminosavakból és fehérjékből képződhetnek Snitrozotiolok (RSNO), melyek réz ionok, fény vagy enzim által katalizált dekompoziciója tiol gyököt (RS) és NO-ot ad (38, 39). Feltételezik, hogy egyes, az élő szervezetben is kimutatható S-nitrozotiolok (S-nitrozocisztein, S-nitrozoglutation) NO-t raktározó, szállító és igény szerint felszabadító molekulák (40). (Az S-nitrozotiolokkal az értekezés "Anyagok és módszerek a NO kutatásában" c. fejezete is foglalkozik.)

7

A NITROGÉN-MONOXID SZINTÁZ (NOS) ENZIMEK Emlős sejtekben az endogén NO képződés enzimatikus. Azt az oxidációs folyamatot, melynek során L-argininből több lépésben L-citrullin és NO képződik, a NOS enzimek katalizálják. Southern blot analízissel három NOS gént sikerült kimutatni, melyek közül kettő terméke kálcium és kalmodulin dependens (calcium and calmodulin-dependent: cNOS), a harmadiké kálcium és kalmodulin independens (iNOS) enzim (41). A fenti jól használható osztályozás az enzimtípusok kalmodulinhoz való eltérő affinitásán alapszik. Az iNOS normál intracelluláris kálciumion koncentráció ([Ca++]i) esetén is szorosan köti a kalmodulint, aktivitása megtartott (42). A cNOS csak külső hatásokra (pl. acetilkolin, bradikinin, nyíróerők, preszinaptikus kálciumion (Ca++) influx) megemelkedő [Ca++]i esetén kötődik a kalmodulinhoz (43). A megkötött kalmodulinnak kulcsszerepe van a NOS molekulák aktiválásában. A NOS izoenzimek tradicionális osztályozása a cNOS és iNOS rövidítéseket más tartalommal használta. A cNOS jelölte a konstitutív enzimtípusokat, melyek expressziója külső indukáló hatás nélkül is észlelhető, az iNOS elnevezés az enzim indukálhatóságára

(a

transzkripció

szintjén

történő

szabályozottságára)

utalt.

Kimutatták azonban, hogy egyes sejtekben az iNOS expressziója nem változtatható (44, 45), és fény derült arra is, hogy mindhárom NOS típus indukálódhat az adott sejtet ért inger, főleg károsító hatás függvényében. Kóros állapotokban (idegsérülés, ischaemia) leírtak megváltozott cNOS expressziókat (46, 47). A tradicionális "konstitutív" és "indukálható" jelzők tehát nem mindig alkalmazhatók. A 90-es évek elejére a NOS enzimeknek három típusát sikerült kivonni majd klónozni idegszövetből (brain vagy neuronal NOS, b- vagy nNOS) (12, 10), makrofágokból (i- vagy macNOS) (48, 49) valamint endothelsejtekből (eNOS) (9, 50). Az elnevezések arra a szövetre utalnak, melyből elsőként sikerült az adott izoenzimet kivonni. Azóta számos szövetben azonosították az nNOS-t (51, 52, 53, 54) és az eNOS-t (55, 56, 57). Kiderült, hogy megfelelő stimulus hatására a makrofágokon kívül más sejtféleségekben is expresszálódhat a iNOS. Teret nyert a három típus egyszerűbb, szövetektől független osztályozása, római számozása is (16, 44) (1. táblázat).

8

elnevezések

cNOS

iNOS

molekulatömeg

elsődleges

szubcelluláris

(monomer)

lokalizáció

lokalizáció

I (b, nNOS)

150-160 kD

neuronok

citoszól / membrán

III (eNOS)

135 kD

endothelsejtek

membrán

mt NOS

mitokondrium

II (macNOS) 130-135 kD

makrofágok

citoszól

1.11.

1. táblázat A NOS izoenzimek

A három enzimtípus katalítikus aktivitása nagyjából egyforma (58). Kóros körülmények között a NO túltermelődése nem a fokozott enzimaktivitással, hanem az iNOS akár 1000-szeresére nőtt expressziójával magyarázható (41). A fenti három, jól ismert, szélesebb körben tanulmányozott izoenzim mellett leírták a NOS mitokondriális formáját (mtNOS), mely a vizsgálatok szerint kálciumfüggő enzim és fontos szerepe lehet a terminális oxidáció, a mitokondriális mátrix pH és membránpotenciál szabályozásában (59, 60). A NOS enzimek a citokróm P450 enzimek családjába tartoznak. Az emlős sejtekben egyedülálló módon azonban a NOS enzimekben a korábban különálló katalítikus funkciók kombinálódtak, a NOS enzimek így önmagukban működő citokróm P450 rendszerek. A NOS enzimek koszubsztrátja a redukált nikotinsavamid-adenin dinukleotidfoszfát (NADPH), kofaktorai a flavin-adenin-dinukleotid (FAD), a flavinmononukleotid (FMN) és a tetrahidrobiopterin (H4B). Mind a három ismert NOS típus 130-160 kD tömegű alegységek homodimerje. A molekulákat tripszinnel kezelve két domén keletkezik. A reduktáz doménen, a molekula karboxi terminálisa közelében találhatók a NADPH-, FAD- és FMN kötőhelyek, az oxigenáz domén hem prosztetikus csoportot (vas-protoporfirin IX), a szubsztrátokat (L-arginin és molekuláris oxigén) valamint a H4B-t kötő helyeket tartalmaz (1.ábra).

9

oxigenáz domén N nNOS 1 I

P

reduktáz domén KM

FMN

FAD

NADPH

C 1434

immunogén 1095

mir eNOS III

P

KM

FAD

NADPH

1

1203

KM

iNOS II

FMN

1289

FMN

1

FAD

NADPH 1153

1. ábra A NOS izoenzimek monomerjeinek lineáris modellje, a kofaktorokat kötő szakaszokkal. Az arab számok aminosavak sorszámai. N: amino terminális; C: karboxi terminális; KM: kalmodulint kötő szakasz; P: foszforiláció helye; mir: mirisztil csoportot kötő részlet. Az nNOS modelljén feltüntettük az immunhisztokémiai vizsgálatainkban használt poliklonális nNOS antitest előállításához használt immunogén szekvenciát. (43) és (89) alapján, módosítva.

A reduktáz domén 36%-os egyezést mutat a citokróm P450 reduktáz karboxi terminálisával, az oxigenáz domén és a citokróm P450 között is kimutatható kisebb fokú homológia (10). A monomerek az oxigenáz doméneken keresztül kapcsolódnak össze aktív homodimerré. A NOS molekulák két doménje között található a kalmodulin kötőhely. A kalmodulin megkötése indítja el az elektrontranszportot, mely végső soron a molekuláris oxigén reduktív aktivációjához szükséges. Jóllehet a domének egymástól függetlenül is működhetnek, az elektrontranszfer sztöchiometriája meghatározza együttműködésüket. Az elektronok szállítása a NADPH felől a kiváló elektronacceptor és -donor flavinokon át a hem prosztetikus csoport felé irányul. A NOS által katalizált reakció során a hem által megkötött szubsztrát (61), az L-arginin egyik guanidin csoportjának monooxidációja zajlik, két fő lépésben. Először 2 elektron átadásával, egységnyi NADPH felhasználásával NG-hidroxi-L-arginin képződik, mely szorosan kötődik az enzimhez. A köztitermék 3 elektron átadásával, fél egységnyi NADPH

10

felhasználásával gyorsan tovább oxidálódik, L-citrullin és NO képződik. Egy mól (M) L-citrullin képződéséhez 1.5 M NADPH és 2 M oxigén szükséges (58) (2.ábra). NH2+

H2N

C  NH  (CH2)3  CH +

H3N

H2N

O

C → NADPH ⇒

NADP

NH2

C  NH  (CH2)3  CH

O2 ⇒ H2O

COO−

L-arginin

NH−OH

+

+

H3N

O2

⇒ H2O

→ 0.5 NADPH ⇒ 0.5 NADP

COO−

NG-hidroxi-L-arginin

+

+

 NH  + (CH2)3  CH

H3N

NO•

COO−

L-citrullin

nitrogénmonoxid

2. ábra A NOS izoenzimek által katalizált reakció

Valójában 10 elektron átadása során két molekula szubsztrát oxidálódik. Az elektronok átadása, a molekuláris oxigén aktivációja az L-arginin szubsztrát hiányában is végbemegy, NO helyett azonban szuperoxid aniongyök és hidrogén peroxid képződik (62, 63). Úgy tűnik, hogy nemcsak az L-argininnek, hanem a kofaktor H4B-nek is telítő koncentrációban kell jelen lennie ahhoz, hogy a cNOS enzimek gazdaságosan, a reaktív oxigén intermedierek képződését elkerülve használják fel NO képzésére a molekuláris oxigént. A NOS enzimek aktivitásának szabályozása igen komplex folyamat. A cNOS enzimek aktivitását elsősorban az [Ca++ ]i megváltozása szabályozza. Endothelsejtekben az acetilkolin, bradikinin, hisztamin, adenozin-difoszfát (ADP) valamint a vérnyomás emelkedésére illetve vazokonstrikció során jelentkező nyíró erők (64) hatására fokozódik a Ca++ beáramlás és emelkedik az [Ca++ ]i. A kalmodulin-eNOS összekapcsolódás aktiválja az enzimet (65, 2). Idegsejtekben az N-metil-D-aszpartát (NMDA) receptorokhoz kötő glutamát vált ki posztszinaptikus Ca++ beáramlást, amely az nNOS enzimet aktiválja (66).

11

A iNOS aktivitását elsősorban a génexpresszió szabja meg. Makrofágokban az iNOS mRNS-ének transzkripcióját egy nukleáris transzkripciós faktor (NF-κB) idézi elő. A NF-κB transzkripcióját elsősorban γ-interferon és bakteriális eredetű lipopoliszacharidok indukálják (67, 68, 69). A cNOS enzimek esetében is feltételezik a transzkripció szintjén történő szabályozást. Idegsérüléseket követően az nNOS up-regulációját figyelték meg spinalis érző dúcsejtekben (46) és agyi neuronokban (70). Immunhisztokémiai és in situ hibridizációs vizsgálatok alapján valószínű, hogy az idegrendszer fejlődése során az nNOS expresszió mértéke változhat az agyi neuronokban (71, 72). Kóros körülmények között az eNOS down- illetve up-regulációját egyaránt leírták (73, 47). Az enzimaktivitást befolyásolja a rendelkezésre álló L-arginin mennyisége. Az L-arginin szemiesszenciális aminosav, nem minden sejtben található a NOS enzimeket telítő koncentrációban. Az L-arginin ellátást meghatározza a sejtek felvétele és a citrullinból történő újraképzés. Az arginin a májban képződik az urea ciklus során, az argináz enzim azonban bontja és urea képződik. A bélhámsejtekben glutamin → glutamát → ornitin → citrullin átalakulás zajlik, a citrullin a vérárammal jut el a szövetekhez, a citrullin transzporter juttatja be a sejtekbe. Elsősorban a vesében, az endothelsejtekben és makrofágokban képződik citrullinból arginin (74, 75, 43), mely a vérkeringéssel jut el a szövetekhez és az y+ aminosav transzporter juttatja be a sejtekbe (76). Egyes NOS inhibitorok gátolják az arginin felvételét (77). Az iNOS indukciója során megfigyelhető az y+ transzporter koindukciója (78). L-arginin hiányában nemcsak a NO képződés rátája csökken, hanem fokozódik a szuperoxid és a hidrogén peroxid képződése is. A szuperoxid és a NO egyesüléséből származó peroxinitrit lipidperoxidációban betöltött szerepe jól ismert (33). Több szövetben az intracelluláris H4B szint is meghatározza a felszabaduló NO mennyiségét (79, 80, 48). A H4B az L-arginin oxidációjában (81) és a molekuláris oxigén aktivációjában (63) -legalábbis a cNOS izoenzimek esetében- közvetlenül nem vesz részt. Egy molekula H4B mintegy 20 molekula NO képzéséhez elegendő (82). A H4B pontos szerepe nem tisztázott, feltételezik allosztérikus modulátor szerepét (a NOS

12

molekulához kötve az aktív centrum konformációjának megváltoztatásával aktiválja az enzimeket) és stabilizáló (az enzimeket dimer formában tartó) funkcióit (82). A cNOS enzimek tartalmaznak foszforilációs szakaszokat, melyek az iNOS molekulában nem találhatók meg (1. ábra). Különböző protein kinázok (PK) (cAMP-, cGMP-dependens PK, PK-C, kalmodulin aktivált PK II) mind foszforilálhatják az nNOS-t, ez az enzimaktivitás csökkenéséhez vezethet, a kísérleti eredmények azonban ellentmondásosak (83, 84, 85). A NOS enzimek foszforilációjának élettani szerepe nem tisztázott (86). Elképzelhető, hogy a foszforiláció az enzimek aktivitásán kívül azok kofaktorokhoz való affinitását vagy szubcelluláris eloszlását is befolyásolja. Az eNOS aktív formában a sejtmembránhoz kötötten fordul elő. A foszforilált enzim viszont inaktív formában ugyan, de megtalálható a sejtek szolubilis frakciójában. Az eNOS molekula akkor is megjelenik a citoszólban, ha az N-terminális részén lévő, mirisztil csoportot kötő régiója hiányzik (87) (1. ábra). Több közlemény felveti a NO negatív feedback hatását, azaz a NO a hem prosztetikus csoporthoz kötve gátolná saját szintézisét (88). A kísérletekben alkalmazott NO donorokból a fiziológiásnál magasabb koncentrációban felszabaduló exogén NO hatása azonban nem feltétlenül egyezik az enzimatikusan képződő endogén NO-nak a NOS enzimekre gyakorolt hatásával. Kivont, tisztított NOS nem gátolható NO donorokkal és nem aktiválható oxihemoglobinnal (89). Feltételezik a NOS izoenzimek endogén gátlószereit is. Metilált L-arginin származékok többféle szövetben a NOS enzimek gátlásához szükséges mennyiségben lehetnek jelen (90). Leírtak egy 10 kD molekulatömegű proteint (protein inhibitor of NOS: PIN), amely in vitro a dimerek destabilizációjával gátolja az nNOS enzimet (91).

13

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A NO KUTATÁSÁBAN NO donorok Organikus nitrátok A nitroglicerin, az izoszorbid dinitrát és mononitrát jól ismert antianginás szerek. Vazodilatátor hatásuk szisztémásan és a koszorúerekben egyaránt kimutatható. NO-ot adó bomlási folyamatukhoz szükség lehet tiol csoportokra (92). A gyakran észlelhető nitrát tolerancia hátterében állhat a szövetek csökkent tiol koncentrációja (93). Kísérletekben NO donorként elsősorban a nitroglicerint használják. S-nitrozotiolok Az S-nitrozotiolok bomlása során diszulfid és NO keletkezik. A folyamatot rézionok katalizálják (94). Az S-nitrozotiolok más tioloknak (pl. cisztein) is átadhatják a NO-ot (transznitrozáció), a keletkezett kevésbé stabil termékből újra NO szabadulhat fel (94). Egyes nitrozotiolok kimutathatók az élő szervezet több szövetében (94, 95, 96, 97). Feltételezik, hogy szerepet játszanak a NO tárolásában és szállításában. Kísérletekben

az

S-nitrozotiolok

(S-nitrozo-N-acetilpenicillamin,

S-nitrozo-N-

acetilcisztein, S-nitrozo-cisztein, S-nitrozo-glutation) simaizom relaxáló hatása kifejezettebb, mint a NO ekvivalens koncentrációié. Cisztin és NO együtt hatásosabb izomrelaxáns, mint a NO önmagában (37). Nitroprusszid-nátrium (sodium nitroprusside: SNP) A Fe2+-pentacianonitrozil komplex nátrium sóját elsősorban hipertóniás krízisben használják (98) (3. ábra). Vazodilatátor és vérnyomáscsökkentő hatása gyorsan (30 sec) kialakul, hatástartama kb. 3 perc. Feltételezik, hogy az SNP a szövetekben tiolokkal reagál, ezt követően szabadul fel NO (38). A bomlása során keletkezett cianid a májban szulfocianiddá alakul. Az utóbbi, lassan eliminálódó

14

vegyület felelős az SNP alkalmazása során észlelt egyes mellékhatásokért (fáradtság, hányás) (99). Alkalikus közegben illetve fény hatására vizes oldatban az SNP spontán bomlása

észlelhető.

Az

SNP-ből

in

vitro

felszabaduló

NO

koncentrációja

meghatározható a vizsgált rendszerben mért oxihemoglobin-methemoglobin átalakulás mennyiségi viszonyainak ismeretében (100). Az SNP-t mint NO donort számos tanulmányban alkalmazták az érrendszer (101, 102), az emésztőrendszer (103, 104) a központi (105-107) és a környéki idegrendszer (108-111) vizsgálatai során.

2−

O N N

N C

C Fe

C

+

2 Na+

C

N

N C N

3. ábra

A nitroprusszid-nátrium képlete

Szidnoniminek Heterociklikus morfolinszármazékok (pl. 3-morfolino-szidnonimin: SIN-1). Alkalikus közegben, oxigén jelenlétében spontán bomlanak, NO és szuperoxid egyidejű képződése mellett (112). Szekunder amin-NO komplexek (amin NONOát vegyületek) Szilárd formában stabil vegyületek (pl. dietilamin-NO, DEA-NO) (113), vizes oldatban azonban spontán (redox aktiváció vagy fényhatás nélkül) bomlanak. A NONOát anyagok fél-életidő tartománya meglehetősen széles (2 min - 2 h), a NO felszabadulása és koncentrációja jobban kiszámítható (114, 115).

15

L-arginin A NOS enzimek affinitása az in vivo általában µM-os koncentrációban jelen lévő L-argininhez jóval nagyobb, mint más, L-arginint metabolizáló enzimeké (43). A D-izomer nem szubsztrátja a NOS enzimeknek, a D-izomer N-szubsztituált analógjai nem gátolják a NOS aktivitását. Kísérletekben az L-arginint önmagában illetve NOS inhibitor vegyületekkel kombinációban (a kialakuló kompetitív gátlás megszüntetésére) egyaránt alkalmazzák (116). NOS inhibitorok Az L-arginin N-szubsztituált analógjai Széles körben alkalmazott vegyületek, melyek általában kompetitív és nem szelektív módon gátolják a NOS enzimeket. L-arginin adagolásával a gátlás visszafordítható. (116, 117) Legismertebbek az NG-monometil-L-arginin (LNMA), az NG-nitro-L-arginin (LNNA) (4.ábra) és az NG-nitro-L-arginin metil észter (L-NAME). NO2  HN NH2+

CH3  HN NH2+

C  NH  (CH2)3  CH +

H3N

COO−

C  NH  (CH2)3  CH +

H3N

COO−

4. ábra Az NG-nitro-L-arginin (LNNA) és az NG-monometil-L-arginin (LNMA) képlete

Az LNMA gátolja a sejtek L-arginin felvételét (77). Tartós LNMA kezelés irreverzibilisen gátolhatja a NOS enzimeket (118). Az L-NAME-t jó vizoldékonysága miatt előszeretettel alkalmazzák az in vivo vizsgálatokban. Önmagában azonban nem

16

NOS inhibitor, hatását csak LNNA-né hidrolizálva fejti ki (119). Az LNNA és az LNAME nemcsak a NO képződését, hanem a molekuláris oxigén reduktív aktivációját is blokkolja (81). Egyes vizsgálatok szerint az L-NAME a muszkarin-receptorokon is gátlást okoz (120). Egyéb szerek A 7-nitroindazolt gyakran használják az nNOS szelektív in vivo inhibitoraként. In vivo azonban a monoamino oxidázt (121), in vitro pedig az eNOS-t is gátolja (122). Az iNOS szelektív gátlószerének tekinthető az N-3-aminometil-benzil-acetamidin (1400W) (123), a trifluorometilfenil-imidazol (TRIM) a cNOS enzimeket gátolja (124, 125). A NOS enzimek működése egyéb, nem specifikus mechanizmusokkal is gátolható. A szénmonoxid a hem redox folyamatait gátolja. A metilénkék a hem-vasat oxidálja, a nitro blue tetrazolium (NBT) festék pedig a NADPH-ról származó elektronok befogásával gátolja a NO képződését. A cNOS enzimek működése felfüggeszthető kalmodulin antagonistákkal.

A NO által aktivált oldható guanilcikláz (soluble guanylyl cyclase: sGC) vizsgálata A sejtekbe diffundáló NO elsődleges receptora a citoszólban található sGC hem csoportja. A sGC hemoprotein, a NO a porfirinváz síkjából kiemeli a vasat, ezáltal aktiválja az enzimet (ld. még "A NO hatásai" c. fejezetben). A NO fiziológiás hatásait az aktivált sGC által képzett cGMP közvetíti (65, 2). A fenti folyamat tanulmányozására használatosak a cGMP sejtpermeábilis analógjai (8-Br cGMP, dibutiril cGMP) (126), a sGC aktivátor és inhibitor vegyületei (127-131) és a cGMP-t bontó foszfodiészterázok gátlószerei (132).

17

A NO kimutatásának módszerei A NO direkt kimutatása • kemilumineszcencia (133) • elektronspin-rezonancia (134)

• fluoreszcencia (135) A NO indirekt kimutatása • A NO által indukált oxihemoglobin → methemoglobin átalakulás mérése spektrofotometriával (100) • A

NO

stabil

metabolitjainak

(nitrát,

nitrit,

nitrozohemoglobin)

mérése

spektrofotometriával (136) • A NOS enzimek által katalizált, tríciummal (3H) jelölt

3

H-L-arginin → 3H-L-

citrullin átalakulás mérése (137, 9); a radioaktív terméket kromatográfiával választják el a radioaktív szubsztráttól 3

• Az arginin transzportjának mérése H-L-argininnel (138)

• A NOS izoenzimek NADPH diaforáz aktivitásának enzimhisztokémiai kimutatása (139) • A NOS izoenzimek (140), a cGMP (141), az L-citrullin és L-arginin (142) immunhisztokémiai kimutatása

18

A NO HATÁSAI A NO különféle hatásait tárgyaló közlemények száma rohamosan növekszik. Ebben a részben a NO-nak csupán a legfontosabb, legjobban dokumentált élettani és kórélettani hatásait említem meg. Az értekezés témájához leginkább illeszthető, a központi és a perifériás idegrendszerben megfigyelt folyamatokról részletesebben szólok. A NO legfontosabb célpontja, fiziológiás "receptora" a citoszólban található oldható guanilcikláz (soluble guanylyl cyclase: sGC). A sGC hemoprotein, α és β alegységből álló heterodimer. Az alegységek cikláz doménből és hem kötő doménből épülnek fel (143). A sGC aktivitása NO hatására kb. a százszorosára nő (144). A NO a porfirinváz síkjából kihúzza a vasat, az enzim konformációváltozást követően aktiválódik, a katalítikus régióba guanozin-5'-trifoszfát (GTP) köthet be (43). Az aktív enzim GTP-ből ciklusos guanozin-3'5'-monofoszfátot (cGMP) képez. A cGMP a NO élettani hatásait közvetítő másodlagos messenger. A NO-donor SNP hatására képződő cGMP immunhisztokémiai módszerrel kimutatható idegszövetben (145). A cGMP immunreaktív és az nNOS immunreaktív neuronok komplementer populációkat alkotnak (146). A sejtpermeábilis cGMP analóg 8-bromo cGMP utánozza a NO simaizom relaxáló hatását az emésztőrendszerben (147). A cGMP lebontásáért felelős foszfodiészteráz (PDE) gátlása potencírozza az SNP relaxáló hatását (147). A cGMP sejten belüli hatásmechanizmusa összetett. Aktiválhat egyes ioncsatornákat és cGMP-dependens proteinkinázokat (PK), aktiválhat illetve gátolhat foszfodiészteráz (PDE) enzimeket (16). Érrendszer Az

endothelsejtekben

aktiválódott

eNOS

által

termelt

NO

az

érfal

simaizomsejtjeibe és a trombocitákba diffundál és aktiválja a sGC enzimet. A megemelkedett cGMP szint hatására a simaizomsejtekben csökken az intracelluláris Ca++ koncentráció és relaxáció figyelhető meg (65, 2). A trombocitákban termelődő

19

cGMP az adhéziót és az aggregációt gátolja. Az eNOS izoenzim trombocitákban is kimutatható (148). A NO vérnyomáscsökkentő és antitrombotikus hatású az érrendszerben. A fenti hatások NO-donorokkal (SNP, S-nitrozotiolok, szerves nitrátok) is előidézhetők. Az endothel károsodása esetén csökkenhet az eNOS expressziója és így a NO termelése. A csökkent NO termelés állhat a pre-eclampsia tünetegyüttesének (hipertenzió, vazokonstrikció, csökkent szöveti perfúzió, ödéma) hátterében (149). Állatkísérletek során előidézett endothel károsodás szövődményei (intima proliferáció, fokozott trombocita aggregáció) NO-donorok adásával mérsékelhetők (150).

Immunrendszer Makrofágokban és neutrofil granulocitákban indukció hatására az iNOS expressziója a sokszorosára nőhet (41). A felszabaduló NO-nak és reakciótermékeinek több támadáspontja lehet a célsejtekben. A vas-kén aktív centrumú enzimek gátlása a mitokondriális oxidáció gátlásához vezet (151). A NO direkt DNS károsító hatása olyan enzimatikus folyamatokat indít be, melyek a sejt energiaforgalmát zavarják meg (152). A ribonukleotid reduktáz gátlása a DNS szintézis zavarához vezet (153). Nagy mennyiségű NO vasat szabadíthat fel az intracelluláris raktárakból: a kötött vas következményes hiánya citosztatikus hatású, a feleslegben lévő szabad vas elősegíti a toxikus reaktív oxigén intermedierek képződését (154). A NO aktiválja az 1 és 2 típusú ciklooxigenázt, prosztaglandinok és tromboxán A2 szabadulnak fel (155). Kóros állapotokban a célsejtek a szervezet saját sejtjei, melyeket az iNOS túlzott, generalizált vagy ektópiás indukciója következtében felszabaduló nagy mennyiségű NO károsít. Az endotoxin sokkban megfigyelhető általános vazodilatáció és súlyos hipotenzió (156), inzulin dependens diabetes mellitusban a β sejtek autoimmun pusztulása (157), rheumatoid arthritisben a gyulladásos tünetek (158) legalábbis

részben-

a

NO

túltermelésével

magyarázhatók.

NOS

inhibitorral

csökkenthetők az endotoxin sokk súlyos tünetei, stabilizálható a keringés (159).

20

Központi idegrendszer Az nNOS a központi idegrendszer számos régiójának neuronjaiban kimutatható NADPH diaforáz enzimhisztokémiai és nNOS immunhisztokémiai módszerekkel (10, 12, 160-162). Az nNOS eloszlása jellegzetes, a legtöbb vizsgált fajban megegyezik. Az nNOS izoenzimnek három splice variánsa ismert, az α, β, és γ nNOS közül az α adja a teljes nNOS aktivitás 95 %-át, a γ változat in vitro nem mutat aktivitást (163). Az α változat membránhoz kötött, a β és γ a citoszólban fordulnak elő (164). Az nNOS mellett az eNOS is expresszálódhat egyes idegsejtekben (165). Az nNOS legismertebb aktivátora az N-metil-D-aszpartát (NMDA) típusú glutamát receptorok ingerlése (166, 66). A posztszinaptikusan felszabaduló NO gyorsan diffundál a környező sejtekbe (5. ábra). Visszajuthat a preszinaptikus végződésbe is, ahol retrográd messengerként további transzmitter (glutamát) felszabadulást idéz elő.

axon

Ca++

axon

Glu 1.

2.

3.

TRM

NMDA-R Ca++ → nNOS → NO

gliasejt 4.a, b, c sGC → cGMP

dendrit / perikaryon

dendrit / perikaryon

5. ábra A NO hatásai a központi idegrendszerben Glu: glutamát; NMDA-R: N-metil-Daszpartát típusú glutamát receptor; TRM: transzmitter. 1. retrográd messenger funkció; 2. cGMP akkumuláció gliasejtekben; 3. transzmitter felszabadulás; 4.a szinaptikus plaszticitás változásai; 4.b neurogenezis; 4.c neurotoxicitás. (38) és (89) alapján, módosítva.

21

Exogén NO többféle neurotranszmitter felszabadulását képes befolyásolni a központi idegrendszerben (167, 168, 110). Jó diffúziós készsége és retrográd messenger jellege révén hatással van a szinaptikus plaszticitásra: az információ tárolásában és a tanulásban alapvető neurofiziológiai folyamatok, a tartós potenciáció és tartós depresszió kialakulásában szerepe lehet a NO-nak (169, 170). A neurogenezis során az nNOS átmeneti expressziója figyelhető meg a fejlődő neuronok és idegrostok egy részében (171, 71, 72). A NO szabályozhatja a fejlődő idegrendszer fontos folyamatait, pl. a szinaptikus kapcsolatok kialakulását (172) valamint az axonnövekedés irányítását (173). Az nNOS génhiányos (knock-out) egerekben tett megfigyelések részben cáfolják a fenti feltételezéseket: ezekben az állatokban ugyanis nNOS hiányában is normális a központi idegrendszer fejlődése és a tartós potenciáció is kiváltható (174). Az idegsejtekből felszabaduló NO nemcsak a környező neuronokban, hanem gliasejtekben is előidézhet cGMP akkumulációt (141). Az nNOS expresszálódhat egyes gliasejtekben is (175). Kóros körülmények között, pl. agyi keringészavar esetén az NMDA receptorok túlzott ingerlése következtében az intracelluláris Ca++ koncentráció tartósan megemelkedhet az idegsejtekben. Ez, valamint az nNOS tartós aktivációja során felszabaduló nagyobb mennyiségű NO egyaránt neurotoxikus hatású (7, 152). Primer idegsejttenyészetekben NOS inhibitorokkal gátolható a glutamáttal kiváltott sejtelhalás (176). Kóros körülmények között az nNOS és az eNOS egyaránt indukálódhat az idegrendszerben (47.). Az eNOS által termelt NO -érhatásainál fogva- neuroprotektív hatású is lehet (177). Tartós keringészavar illetve központi idegrendszeri gyulladásos folyamatok esetén az iNOS által termelt NO hatásai is számottevőek (178, 179).

Perifériás idegrendszer Az nNOS a perifériás idegrendszerben is számos helyen előfordul. NADPH diaforáz pozitív illetve nNOS immunreaktív idegelemek kimutathatók az érző dúcokban (180, 181), az emésztőrendszerben (183, 184, 185), az urogenitális rendszerben (186189), a légzőrendszerben (190, 191), a szívben (192) az erek mentén (193) valamint a corpus cavernosumban (194, 195). Az nNOS az idegsejteken kívül más sejtekben is

22

expresszálódik: harántcsíkolt izomrostokban (51), a vese macula densa sejtjeiben (53), a pancreas endokrin részében (196) valamint a légutak hámsejtjeiben (52). A NO specifikus neurotranszmitter funkcióját először patkány anococcygeus és szarvasmarha retractor penis simaizmokon végzett vizsgálatokkal igazolták. Ezekben az izmokban idegingerlés hatására összehúzódás észlelhető, melyet a noradrenalin közvetít. Ha a kontrakció gátolt, az izomtónus fokozása esetén neurogén non-adrenerg non-kolinerg relaxáció figyelhető meg. NOS inhibitorok segítségével sikerült bizonyítani a NO gátló transzmitter szerepét a fenti folyamatban (197-200). A NO által közvetített jelátvitel elnevezésére a nitrerg kifejezést javasolták a Dale által 1933-ban bevezetett kolinerg és adrenerg terminusok mintájára. A nitrerg elnevezés arra a kísérletekből nyert tapasztalatra is utal, hogy a folyamatban valószínűleg nem kizárólag a NO, hanem más NO-ot kötő és szállító anyagok (pl. S-nitrozotiolok) is résztvehetnek (201, 202). A 90-es évek elejére különböző fajok más szervrendszereiben is sikerült a nitrerg neuroeffektor transzmisszió jelenlétét igazolni (194, 203-205) (6. ábra).

nitrerg idegvégződés

idegvégződés

Ca++

Ca++ 1.

nNOS ? L-Arg → NO ⇔ S-NT

2.

VIP ACh

TRM

junkció sGC GTP → cGMP ⇒ pl. relaxáció

effektor sejt (pl. simaizomsejt)

6. ábra A NO hatásai a neuroeffektor junkcióban VIP: vazoaktív intestinális polipeptid; TRM: egyéb transzmitterek; S-NT: S-nitrozotiolok. 1. és 2. A NO és más transzmitterek közötti lehetséges kölcsönhatások 1. Különféle transzmitterek befolyásolhatják a nitrerg transzmissziót. 2. A NO prejunkcionálisan gátolhatja más transzmitterek (pl. az ACh) felszabadulását. (89), (225) és (226) alapján, módosítva.

23

A nagyszámú vizsgálat eredményei alapján a NO megfelel a transzmitterekkel szemben támasztott legtöbb általános követelménynek: • A transzmitter szintézise kimutatható: az nNOS hisztokémiai vizsgálatokkal detektálható az idegsejtekben (12), a NO bioszintézise NOS inhibitorokkal gátolható, és ez elégtelen jelátvitelhez vezet (205, 206). • A transzmitter az axonvégződésekben raktározódik: ennek a feltételnek a kisméretű, jól diffundáló, reakcióképes NO nem felel meg. A NO igény szerint képződik (207), bioszintézise azonban szigorúan szabályozott. • Idegingerlésre a transzmitter felszabadul, a szinapszisban gyorsan bomlik illetve eliminálódik: az idegingerlés hatására felszabaduló NO közvetlenül (208, 133) vagy közvetve (209) kimutatható. • A transzmitter adagolásával utánozható az idegingerlésre bekövetkezett válasz: NO donorok utánozzák a nitrerg idegingerlés simaizom relaxáló hatását (210, 211) • A transzmitter hatását befolyásoló anyagok az idegingerlésre bekövetkezett választ is befolyásolják: a NO-ot inaktiváló vegyületek, az oxihemoglobin (212), alkoholok (213), szuperoxid anion donorok (197) és scavengerek (197) gátolják a nitrerg idegingerlés simaizom relaxáló hatását.

Az emésztőrendszer intrinsic idegelemei külön enterális idegrendszert alkotnak, mely zsigeri érző és motoros neuronok komplex hálózata. Az enterális neuronok serkentő vagy gátló hatásúak a bélfali idegfonatokban (214, 215). Az enterális idegrendszer korábban ismert gátló transzmitterei a vazoaktív intestinalis polipeptid (VIP) és az adenozin-difoszfát (ADP) (203, 216). Az enterális idegrendszer neuronjainak egy részében kimutatható az nNOS (183) valamint az nNOS és VIP kolokalizációja (184). A plexus myentericus neuronjainak mintegy 20 %-a nNOS immunreaktív. Ebben a fonatban az nNOS azokban a gátló neuronokban van jelen, melyeknek viszonylag rövid axonja aborális irányba fut, és a belső körkörös réteget innerválja (184). Nagyszámú kísérletben sikerült igazolni a NO non-adrenerg nonkolinerg gátló transzmitter funkcióját az emésztőcsatorna sphinctereiben (211, 217, 218, 133), a különböző bélszakaszokban (219, 207, 220) és az epehólyagban (221). A

24

vizsgált területek simaizomzatában niterg idegingerlés vagy NO donorok hatására hiperpolarizáció és cGMP akkumuláció észlelhető (222, 211). A NO gátló transzmitter szerepét alátámasztják az nNOS génhiányos egerekben tett megfigyelések. Jóllehet ezen állatokban az nNOS nem mutatható ki, idegrendszerük fejlődése, morfológiája és funkciói nem mutatnak számottevő eltéréseket. Az egyetlen jól megfigyelhető elváltozás a pylorus körkörös izomrétegének krónikus kontrakcióból eredő masszív hipertrófiája és a következményes gyomortágulat (174). A simaizomsejteken kívül neuronokban (146, 223) és szatellitasejtekben (111) is sikerült reaktív cGMP akkumulációt kimutatni. A perifériás idegrendszerben is valószínű a NO retrográd messenger szerepe (224). A NO és más transzmitterek közötti kölcsönhatások igen valószínűek a neuroeffektor szinapszisokban is (6. ábra). A nitrerg neurotranszmissziót ACh, noradrenalin és opiátok befolyásolhatják (225), az ACh felszabadulás prejunkcionális gátlását többen feltételezik az emésztőcsatorna több szakaszának, a trachea valamint a húgyhólyag simaizomzatát ellátó idegvégződésekben (226-228). A NO-nak az idegrendszer fejlődésében betöltött szerepét a perifériás idegrendszerben végzett vizsgálatok is valószínűsítik. Az nNOS expressziójának pre- és postnatális változásai megfigyelhetők érző ganglionok neuronjaiban (229, 230). Idegsérülést követően a megfelelő spinalis dúcban jelentősen nő az nNOS tartalmú sejtek aránya (231, 46). A gerincvelő elülső gyökerének sérülése után az elülső szarv (normál körülmények között nNOS negatív) motoneuronjaiban nNOS expresszió figyelhető meg. A reaktív NO szintézis egyaránt lehet neuroprotektív vagy neurotoxikus hatású (232).

25

A NO A PANCREAS EXOKRIN RÉSZÉBEN Morfológiai vizsgálatok Az nNOS számos emlős (17, 233, 234, 235, 140, 236, 18, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243) és több madár faj (18, 244) hasnyálmirigyének idegeiben kimutatható NADPH

diaforáz

(NADPHd)

hisztokémiai

és

nNOS

immunhisztokémiai

módszerekkel. A különféle fajokból származó pancreas szövetek nitrerg beidegzésében sok a közös vonás. NADPHd aktivitás és/vagy nNOS immunreaktivitás (IR) megfigyelhető a ganglionsejtekben valamint az interlobularisan, az acinusok és kivezetőcsövek körül és az erek mentén elhelyezkedő idegrostokban (236, 17, 18). Az idevonatkozó irodalom áttekintése során feltűnik, hogy igen kevés a beszámoló a sertés pancreason végzett vizsgálatokról (245). A pancreas nitrerg idegrostjainak eredését a pancreasfejbe adott fluorogold (FG) festék retrográd axontranszportja segítségével térképezték fel patkányban. FG-dal jelölt perikaryonok kimutathatók a gyomor és a duodenum plexus myentericusában. A FG-dal jelzett sejtek egy része NADPHd pozitív: ezek az ún. nitrerg enteropancreaticus neuronok, melyek a plexus myentericus felől küldenek rostokat a pancreasba (237). A nitrerg zsigeri érző idegrostokhoz tartozó FG és NADPHd pozitív perikaryonok a gerincvelő thoracalis szegmentumainak érző dúcaiban valamint a nervus vagus ganglion inferiusában fordulnak elő (237). Az exokrin parenchyma sejtjeiben a NADPHd aktivitás és az nNOS IR eloszlása fajspecifikusabb. Szarvasmarha pancreasból kivont, Ca++ és kalmodulin dependens, LNNA-val gátolható NOS izoenzim az acinussejtekben keresztreakciót ad nNOS ellenanyaggal (246). A legtöbb morfológiai beszámoló alapján azonban úgy tűnik, hogy az acinussejtekben sem NADPHd aktivitás, sem nNOS IR nem mutatható ki. Patkányban a ductus pancreaticus major egyes hámsejtjeiben NADPHd aktivitás és nNOS IR is megfigyelhető (247), felnőtt patkányok ductus intercalarisainak hámja nNOS IR-t mutat (III). Az eredmények heterogenitása a lokális NOS izoenzimek kisebb fokú expressziójával és a változatos metodikával (különböző ellenanyagok, többféle fixáló eljárás) magyarázható (140, 196).

26

Kissszámú tanulmány foglalkozik az életkor és a NOS izoenzimek eloszlása közti összefüggésekkel. Újszülött patkány pancreas neuronjainak 40 %-a NADPHd pozitív, fiatal és felnőtt állatokban ez az arány 95 %, az idős állatokban kissé csökken (240). Patkány magzatok pancreasában a 14. naptól figyelhető meg NADPHd aktivitás (248). Patkány pancreas idegeiben és az exokrin parenchymában az nNOS eloszlása változik az életkorral, különösen szembetűnő az nNOS IR fokozódása felnőtt és idős állatok hasnyálmirigyének nem idegi szöveteiben (III). A központi idegrendszer illetve a környéki idegrendszer más területein kapott eredményekhez hasonlóan a pancreas ganglionsejtjeiben és idegrostjaiban is 100 %-os a NADPHd aktivitás és az nNOS IR kolokalizációja (17, 233, 234). Számos faj hasnyálmirigyének ganglionsejtjeiben megfigyelhető az nNOS és a VIP IR kolokalizációja (17, 234, 140, 236, 237, 249). Tengerimalac

és patkány pancreas

neuronjainak egy része kolin acetiltranszferáz és/vagy dopamin-β-hidroxiláz

és az

nNOS IR kolokalizációját mutatja (241, 242, 250), nyúl pancreas neuronjaiban az acetilkolinészteráz aktivitás és nNOS IR kolokalizációja mutatható ki (243).

A NO és az exokrin pancreas szekréció Annak ellenére, hogy a pancreas idegeiben és az exokrin parenchyma sejtjeiben több morfológiai vizsgálat utal a NO enzimatikus képződésére, csak kisszámú közlemény foglalkozik a NO és az exokrin szekréció közti összefüggések vizsgálatával. Az eredmények értékelése és összevetése nem könnyű az egymástól eltérő kísérleti módszerek (több állatfaj, in vivo illetve in vitro vizsgálatok, változatos stimulációs eljárások, különféle NO donorok illetve NOS inhibitorok használata) miatt. Az acinussejtben zajló folyamatok Az acinussejteken található specifikus receptorokhoz kötődő ACh vagy kolecisztokinin (CCK) hatására a membránban található foszfatidil inozitol 4,5 difoszfát (PIP2) enzimatikus hidrolízise következik be, melynek során inozitol 1,4,5 trifoszfát (IP3) és diacilglicerol (DAG) keletkezik (251, 252). A DAG a protein-kináz C (PKC)

27

endogén aktivátora (253), erről az enzimről feltételezik, hogy fontos szerepe van annak szabályozásában, hogy egy adott szekretagóg hatására milyen típusú és minőségű szekréció indul be (254-256). Az IP3 az i.c. Ca++-ot mobilizálja (257) (7. ábra). VIP NO a

szekretin

G

CCK

G

ACh

G G PIP2 → DAG + IP3

AC

membrán NO d Ca++

ATP → cAMP NO b

3.

Ca++

PDE PKA

PKC

1. Ca++

PK

e

NO

2. e n z i m s z i n t é z i s

NO c

e x o c i t ó z i s

7. ábra Az acinussejt működésének vázlata és a NO néhány lehetséges (közvetett vagy közvetlen) célpontja G: G-proteinek; AC: adenil-cikláz; PK: protein-kinázok; 1. IP3-ra érzékeny Ca++ raktár 2. IP3-ra nem érzékeny Ca++ raktár 3. kapacitatív Ca++ influx; a. Gproteinek aktivációja b. cAMP-t bontó foszfodiészteráz (PDE) befolyásolása c. citoszkeleton fehérjék foszforilációja d. Ca++ influx facilitációja e. Ca++ mobilizáció az IP3-ra nem érzékeny Ca++ raktárból.

Nagy dózisú ACh vagy CCK adása után megfigyelhető az [Ca++]i gyors emelkedése. Ezt a csúcsot egy alacsonyabb plató követi, mely állandó marad, amíg a szekretagóg hatása fennáll (258-260). A kezdeti emelkedés hátterében az IP3 hatására az intracelluláris raktárakból (endoplazmás retikulum és calcisomák) történő Ca++ felszabadulás áll, míg a plató fázis teljes mértékben az extracelluláris Ca++ koncentráció függvénye (257, 259, 261-263). Az intracelluláris raktárak kiürítése után megindul a Ca++ kapacitatív beáramlása (264-266). Az acinussejtbe történő Ca++ beáramlás nem feszültségfüggő

csatornákon

át

történik,

a

folyamat

ugyanis

nem függ

a

membránpotenciáltól és a szokásos Ca++ csatorna blokkolók (nifedipin, verapamil) nem befolyásolják (261, 262). Az acinussejtekbe (és általában a nem excitábilis sejtekbe) történő Ca++ influx mechanizmusa valamint az intracelluláris raktárak kiürítése és az influx közti kapcsolódási mechanizmus nem tisztázott. Több hipotézis létezik, köztük

28

olyan is, amely a NO-cGMP rendszer Ca++ influxot facilitáló szerepét veti fel (267, 268) (7. ábra). Az ACh vagy CCK fiziológiás dózisai hatására az [Ca++]i inkább oszcilláló változásokat mutat az előbb leírt csúcs-plató válasz helyett (258, 269-271). Az oszcilláció elsődlegesen az intracelluláris raktárakból történő pulzáló ürülés eredménye, de fenntartásához szükség van extracelluláris Ca++-ra is (258, 264, 272, 273). Az oszcillációk kialakulásával kapcsolatban felmerült az ún. "kettős Ca++ pool" modell, mely szerint legalább két intracelluláris Ca++ raktár létezik, az egyik érzékeny IP3-ra, a másik viszont nem (272). Feltételezik, hogy az IP3-szenzitív raktárból történő Ca++ kiáramlás váltja ki a másik Ca++ pool ürülését (7. ábra), annak ryanodin receptorainak aktivációjával (269, 270, 274-276). A cADP ribózról kimutatták, hogy képes Ca++-ot mobilizálni az utóbbi raktárból (277, 278). Tengerisün petéken végzett vizsgálatok kiderítették, hogy a cGMP a cADP ribóz képződésének serkentésével emeli az [Ca++]i t (279). Az acinussejteken és a ductalis sejteken található specifikus receptorokhoz kötődő szekretin vagy VIP hatására a membránban található adenil-cikláz aktiválódik és adenozin-trifoszfátból (ATP) ciklusos adenozin-monofoszfátot (cAMP) képez (280) (7. ábra). A cAMP a protein-kináz A fő aktivátora, fő hatása az acinussejtben a DAG és a Ca++ által kiváltott, a szekrécióhoz vezető folyamatok potencírozása. A cGMP serkentheti vagy gátolhatja a különböző ciklusos nukleotidok PDE enzimjeit, így saját és a cAMP intracelluláris koncentrációjára is hatással lehet (16).

Élettani vizsgálatok Az in vivo kísérletekből általában a NO-nak az exokrin szekrécióra gyakorolt pozitív hatása tűnik ki. Patkányokban NOS inhibitorokkal a nyugalmi és a stimulált enzimszekréció egyaránt gátolható

(19, 281), L-arginin adásával a gátlás

felfüggeszthető. Gasztrodoudenális szondával ellátott egyénekben NOS inhibitorral csökkenthető a szekretinnel vagy cöruleinnel stimulált enzimszekréció (20), nem változik azonban a bikarbonát szekréciója és a pancreasnedv mennyisége. Altatott macskában (21) az a CCK-nel és a szekretinnel kiváltott szekréciós választ is csökkenti

29

a NOS inhibitor. Éber, krónikus pancreas fistulával ellátott kutyában NOS inhibitor gátolja a stimulált enzimszekréciót, nem befolyásolja viszont a nyugalmi szekréciót (282). Kutyában és birkában a NOS inhibitorok az interdigesztív motilitást és a pancreas szekrécióját együtt befolyásolják (283, 284). A NO donorok in vivo fokozzák a nyugalmi szekréciót (21, 282, 283). Több in vivo kísérletben nemcsak a szekréció, hanem a pancreas vérátáramlásának változásait is vizsgálták. NOS inhibitorok hatására csökken a vérátáramlás (19, 282, 285). Egy másik vizsgálat szerint a NOS inhibitor a nyugalmi vérátáramlást nem befolyásolja, a stimulált szekréció során megfigyelhető vérátáramlás fokozódást viszont gátolja (22). A NOS inhibitorok által kiváltott szekréciós válaszok nem mindig állnak párhuzamban a keringés változásaival. Izolált, perfundált, intakt vagus beidegzéssel bíró sertés pancreasban a vagus elektromos ingerlése az exokrin szekréciót fokozza, és vazodilatációt vált ki. NOS inhibitorok a szekréciós választ csökkentik, a vazodilatációt azonban nem befolyásolják (286). Altatott macskában a CCK hatására jelentkező vérátáramlás fokozódást csökkenti a NOS inhibitor, a szekretin vérátáramlást fokozó hatását azonban nem befolyásolja (21). A kisszámú in vitro kísérlet eredményei ellentmondásosak. Izolált patkány acinusokban a NOS inhibitor nem befolyásolja a cöruleinnel stimulált amiláz szekréciót (281). Egy másik vizsgálatban izolált patkány acinusokban L-arginin fokozza az amiláz szekréciót, a nitrit és a cGMP képződését. A L-arginin hatásai NOS inhibitorokkal csökkenthetők (287). Patkány pancreas izolált lobulusaiban L-arginin fokozza, a NOS inhibitor LNNA csökkenti a nyugalmi amiláz szekréciót, az LNNA ugyanakkor nem befolyásolja a karbakollal stimulált amiláz elválasztást (237). Patkány pancreas szegmentumokban NOS inhibitorral gátolható a CCK-nel stimulált tripszinogén szekréció (23). A NOS inhibitorokkal és NO donorokkal végzett kísérletek megerősítik a feltevést, hogy a NO befolyásolja az exokrin pancreas működését. Az is valószínű, hogy a NO hatásait az intracellulárisan képződő cGMP közvetíti. A fenti in vivo illetve in vitro kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a NO indirekt és direkt hatással is van az exokrin szövetekre.

30

Az ACh és a CCK, amelyek az acinussejteben emelik az [Ca++]i -t, megemelik a cGMP szintjét is (288). Ugyanilyen hatású a kálcium ionofór (289). A szekretagóg anyagok hatására bekövetkező [Ca++]i emelkedéshez képest ebben az esetben másodlagos a cGMP szint emelkedése. Az első kísérletekben, melyekben a cGMP szintet membránpermeábilis származékainak (8-Br-cGMP, dibutiril cGMP) adásával növelték, nem sikerült a cGMP enzimszekrécióra gyakorolt hatását kimutatni (251, 252). A cGMP szerepe jelenleg még nem tisztázott az exokrin pancreas működéseiben, azonban feltételezik, hogy szerepe lehet a szekréciós folyamat valamely szintjén (267, 268). Tengerimalac és patkány acinussejtekben karbakol hatására fokozódik a 3H-Larginin → 3H-L-citrullin átalakulás, a Ca++ influx és nő a cGMP szintje. Mindhárom folyamat gátolható NOS inhibitorokkal (290). A szekretagóg anyagokkal vagy tapszigarginnal kiváltott Ca++ influx NOS inhibitorral és sGC inhibitorral egyaránt gátolható (130). Az intracelluláris Ca++ raktárak depléciója fokozza a NOS aktivitását (130). A cGMP hatása kettős: koncentrációjának emelésekor kezdetben fokozódik a Ca++ beáramlás, a cGMP koncentráció további emelése viszont gátolja az influxot (130). A NO-nak a szekretagóg anyagokkal stimulált acinussejtben a kapacitatív Ca++ beáramlást elősegítő funkcióját valószínűsítik azok a kísérletek, melyek NOS inhibitor vegyületek amiláz szekréciót gátló hatását mutatják (287). L-arginin hatására nő a cGMP szint és fokozódik a nyugalmi amiláz szekréció (287, 237), az acinussejt intracelluláris Ca++ raktárai ilyenkor feltöltött állapotban vannak. Hangsúlyozni kell a fenti kísérletekben alkalmazott procedúrák sokféleségét. Jól ismert, hogy a különféle szövetekben -így valószínűleg az exokrin pancreasban is- a NO-nak számos más célpontja lehet a sGC mellett (7. ábra). Aktiválhatja (cGMP képződésen keresztül) a cGMP-dependens protein-kinázt (291). Befolyásolhat PDE enzimeket, így a cAMP szintjére is befolyással lehet. A szekretin és a VIP hatásait az acinussejtben a cAMP közvetíti (280). A NO közvetlenül aktiválhatja a G-proteineket, a folyamat fokozott GTPáz aktivitással járhat (292). Ez jelentős lehet az exokrin pancreasban is, mert az acinussejtben a G-proteinek adják azt a transzmembrán jelrendszert, mely a szekretagóg receptorok és a sejten belüli kapcsolódási mechanizmusok között közvetít (280, 293, 294, 295). A NO gátolhatja a PKC aktivitását (296). A NO a citoszkeleton egyes fehérjéinek foszforilációjával

31

hatással lehet az acinussejtek citoplazmatikus motilitására, ezáltal a szekréciós folyamatra (297, 298).

A NO jelentősége akut pancreatitisben A klinikai vizsgálatok, az in vivo és in vitro állatkísérletek eredményei alapján igen valószínű, hogy a szabad gyökös reakciók, az oxidatív stressz fontos szerepet játszanak az akut pancreatitis (főleg az ödémás típus) patogenezisében (299). A NO szerepét több állatkísérletben vizsgálták, kísérletes pancreatitis körülményei között. Megfigyelhető az iNOS fokozott expressziója, a peroxinitrit által okozott szövetkárosodás és a hipotenzió (300-302). NO donor hatására a gyulladás tünetei súlyosbodnak, NOS inhibitorokkal kezelt állatokban enyhébb tünetek, kisebb fokú ödéma és oxidatív szövetkárosodás figyelhető meg (303, 304). Számos vizsgálat a NO protektív szerepét hangsúlyozza. NO donorokkal csökkenthető az ödéma valamint a tripszin aktivációs peptid szintje (305, 306), NOS inhibitorok hatására a fokozódik az ödéma és a gyulladásos elváltozások (307, 306, 117). In vitro modellben a NO donorok és NOS inhibitorok hatástalanok: ezek az eredmények a NO indirekt, a mikrocirkulációra kifejtett hatásaira utalnak (306). Az eredmények heterogenitását magyarázhatja, értékelését megnehezíti az akut pancreatitis komplex patológiája, a szabad gyökös reakciók, az arachidonsav metabolizmus és a NO képződés közti számos kölcsönhatás (308, 309) valamint a kísérletes akut pancreatitis kiváltására alkalmazott módszerek sokfélesége (117, 310, 305).

32

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ANYAGOK A morfológiai és az élettani vizsgálatokhoz felhasznált anyagok jelentős része a Sigma-Aldrich Kft. (Budapest, Magyarország) illetve a Sigma-Aldrich Company Ltd. (Poole, Dorset, England) által forgalmazott termék. Az ezektől eltérő beszerzési helyeket a szövegben külön közlöm.

KÍSÉRLETI ÁLLATOK Morfológiai vizsgálatainkat a budapesti Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézetében végeztük. A morfológiai vizsgálatokhoz három sertésből valamint összesen 28 Wistar patkányból származó hasnyálmirigyeket használtunk fel. A patkányokon végzett kísérletek során a Magyar Állatvédelmi Törvény

(243/1998)

és

a

Semmelweis

Egyetem

állatkísérletekre

vonatkozó

rendelkezéseinek megfelelően jártunk el. Élettani vizsgálatainkat Angliában, a prestoni University of Central Lancashire biológiai tanszékén végeztük. Az élettani vizsgálatokhoz összesen 28 Sprague-Dawley patkányból származó hasnyálmirigyet használtunk fel. A kísérletek során a brit Belügyminisztérium és a University of Central Lancashire Etikai Bizottságának rendelkezései és engedélyei (PPL 50/01043; PIL 50/00824) alapján jártunk el.

33

MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK NADPH diaforáz enzimhisztokémia A módszer a 60-as évek eleje óta ismert. Idegsejtekben a NADPH diaforáz NADPH jelenlétében a nitro blue tetrazolium (NBT) festéket redukálva sötétkék formazán terméket képez (16). A 90-es évek elejére vált világossá, hogy ez az enzimhisztokémiai eljárás a NBT-nak a NOS izoenzimek által katalizált redukcióját mutatja ki (12, 311) (8. ábra). A kísérletekhez fiatal felnőtt sertések (összesen 3 egyed, átlagos súly 150 kg) hasnyálmirigyeit használtuk, melyeket egy Pest Megyei vágóhídon közvetlenül az állatok leölése után egészben eltávolítottunk, kis darabokra vágtunk, és 0.1 M foszfát pufferban (phosphate buffer: PB; pH 7.4) mostunk, majd 4 %-os pufferolt paraformaldehid oldatba (pH 7.4) helyeztünk. Két hetes immerziós fixálás után a mintákból Vibroslice berendezéssel (Sorwall Inc., USA) 20-25 µm vastag metszeteket készítettünk. A metszeteket 0.01 M foszfát pufferolt sóoldatban (phosphate buffered saline: PBS; pH 7.4) mostuk, majd másfél óra hosszat 37 °C-on sötétben inkubáltuk 0.1 M PB-ben, amely 1.5 mg /ml NADPH-t, 0.75 mg/ml nitro blue tetrazoliumot (Fluka AG, Buchs, Svájc) és 30 µl /ml Triton X-100-at tartalmazott. A reakciót hideg 0.1 M PB-ben történő öblítéssel állítottuk le. A kontroll metszeteket olyan inkubáló oldatba helyeztük, amely nem tartalmazott NADPH-t. A kontroll mintákban NADPH diaforáz reaktivitást nem észleltünk. A metszeteket dehidráltuk és DePeX-szel fedtük le (IV).

NOS immunhisztokémia Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz Wistar patkányok négy korcsoportjának mindkét nembeli egyedeit használtuk fel. 5 napos újszülött patkányokat (egyedszám: 8; átlagos testsúly 10 g) éterrel túlaltattunk, a hasnyálmirigyet a viszonylag nagy és jól látható lép segítségével lokalizáltuk és egészben eltávolítottuk, kisebb darabokra vágtuk és 0.1 M PB-ben (pH 7.4) átmostuk, majd 4 %-os pufferolt paraformaldehid oldatba

34

(pH 7.4) helyeztük. Két hónapos fiatal (egyedszám: 8; átlagos testsúly 100 g), 4 hónapos felnőtt (egyedszám: 8; átlagos testsúly 200 g) és 15 hónapos idősebb (egyedszám: 4; átlagos testsúly 300 g) Wistar patkányokat intraperitonealis ketamin injekcióval (Richter, Budapest) túlaltattunk, majd a mellkast megnyitva a feltárt szív bal kamráján keresztül az aortába vezetett kanülön át fiziológiás sóoldattal (150 ml / egyed), majd paraformaldehid 4 %-os pufferolt oldatával (pH 7.4; 150 ml / egyed) perfundáltunk. A perfúziós fixálás befejeztével a hasnyálmirigyet eltávolítottuk, kisebb darabokra vágva újra 4 %-os pufferolt paraformaldehid oldatba (pH 7.4) helyeztük. Két hetes immerziós fixálás után a mintákat paraffinba ágyaztuk, majd 10-12 µm vastag metszeteket készítettünk. Kísérleteinkhez fiatal felnőtt sertések (összesen 3 egyed, átlagos testsúly 150 kg) hasnyálmirigyeit is felhasználtunk, melyeket egy Pest Megyei vágóhídon közvetlenül az állatok leölése után egészben eltávolítottunk, kis darabokra vágtunk és 0.1 M PB-ben (pH 7.4) átmostunk, majd 4 %-os pufferolt paraformaldehid oldatba (pH 7.4) helyeztünk. Két hetes immerziós fixálás után a mintákból Vibroslice berendezéssel 20-25 µm vastag metszeteket készítettünk. A patkány és sertés pancreasból készült metszeteket 10 percre 3%-os hidrogén peroxid (H2O2; Meditop, Budapest) oldatba helyeztük az endogén peroxidáz enzim blokkolása céljából. 0.01 M-os PBS-ben történő mosás után a mintákat 1 órára normál szamár szérum (Amersham, Buckinghamshire, England) 10 %-os oldatába helyeztük a nem specifikus kötődések blokkolása céljából. A normál szérum leitatása után nyúlban előállított poliklonális anti nNOS szérummal inkubáltunk 24 órán át 4 °C-on (hígítás 1: 1000, Transduction Laboratories, USA). A gyártó tájékoztatása szerint az antitest előállításához a humán nNOS egy 22.3 kD molekulasúlyú fragmentuma (1095.-1289. aminosavak) szolgáltatta az immunogént. Az antiszérum eredeti koncentrációja 0.25 mg/ml olyan oldatban, mely 50 % glicerint, 20mM/ml nátrium foszfátot, 150mM/ml NaCl-ot, 1.5 mM/ml nátrium azidot és 1 mg/ml bovin szérum albumint tartalmaztuk. A fenti törzsoldat további hígítását 0.01 M-os PBS-sel végeztük. 0.01 M-os PBS-ben történő ismételt mosások után biotinilált, szamárban előállított anti nyúl szekunder szérummal inkubáltunk 1 óra hosszat szobahőmérsékleten (hígítás 1: 70, Vector Laboratories, USA), majd 0.01 M-os PBS-ben történő mosás után streptavidin biotinilált tormaperoxidáz komplex oldatával újabb 1 órás inkubáció következett szobahőn (hígítás 1:50, Vector). Újabb mosás következett PBS-ben majd 0.05 M

35

tris(hidroximetil)-aminometán (TRIS; pH 7.6) pufferben. Az immunreaktív helyeket diaminobenzidin (DAB) oldatával (0.5 mg DAB és 12 µl 0.3 % H2O2 /ml TRIS puffer) tettük láthatóvá (8. ábra). A kontroll mintákban vagy kihagytuk a primer antiszérumot, vagy normál nyúl savóval (Amersham) helyettesítettük, vagy a biotinilált szekunder szérum helyett normál szamár savót használtunk. A kontroll minták egyikében sem észleltünk immunfestődést. A patkány pancreasból készült metszeteken hematoxilin háttérfestést alkalmaztunk. A metszeteket dehidráltuk és DePeX-szel fedtük le (II, III, IV, V, VI). sötétbarna színreakció

← diaminobenzidin P P avidin 3. P 2. 1.

L-Arg

O2

H4B

1095.

immunogén szekvencia 1289.

nNOS 1

N

1434 KM

FMN

FAD

NADPH

C

elektrontranszport

nitro blue tetrazolium →

sötétkék formazán termék

8. ábra A NADPH diaforáz enzimhisztokémiai és az nNOS immunhisztokémiai eljárások vázlata Az arab számok aminosavak sorszámai. N: amino terminális; C: karboxi terminális; 1.: nNOS KM: kalmodulint kötő szakasz; L-Arg: L-arginin; H4B: tetrahidrobiopterin; antitest (primer szérum); 2.: biotinilált szekunder antitest; 3.: streptavidin biotin tormaperoxidáz komplex; : biotin; : biotin kötőhely; P: tormaperoxidáz.

36

ÉLETTANI VIZSGÁLATOK Patkány pancreas szegmentumok amiláz elválasztásának mérése on-line fluorimetriás módszerrel Húsz darab 4 hónapos Sprague-Dawley patkányt használtunk fel a vizsgálatokhoz (átlagos súly: 200 g). Az állatok fejére mért ütés és a fej eltávolítása után gyorsan kiboncoltuk a hasnyálmirigyet, megszabadítottuk a környező zsír- és kötőszövettől, kis darabokra (100-150 mg) vágtuk, és módosított Krebs-Henseleit (KH) oldatba helyeztük (NaCl: 103; KCl: 4.7; CaCl: 2.56; MgCl: 1.1; NaHCO3: 25; NaH2PO4:1.15; D-glükóz: 2.8; nátrium piruvát: 4.9; nátrium fumarát: 2.7 és nátrium glutamát 4.9 mM/l). Az oldat pH-ja 7.4, hőmérséklete 37 °C, folyamatosan 95%O2 és 5% CO2 keverékével áramoltattuk át. A pancreas darabokat 1 ml-es Perspex átfolyó szövetkamrába helyeztük, és 37 °C-os KH oldattal, 1 ml min-1 sebességgel perfundáltuk. Az elfolyó amiláz koncentrációját on-line fluorimetriás módszerrel (312) (I, V, VI) mértük. A berendezés vázlata a 9. ábrán látható. A szövetkamrából elvezető, a perfúziós KH oldatot és a szekretált amilázt tartalmazó cső valamint a szubsztrát és a recipiens oldatokat tartalmazó csövek a pumpán át a dializáló egységhez vezetnek. A dializáló egység előtti spirális csőszakasz biztosítja a szubsztrát oldat állandó hőmérsékletét. A recipiens oldat összetétele: 2.92 g/l NaCl, 12.11 g/l TRIS, 4 ml/l Triton X-100, desztillált vízben; pH 7.0. A szubsztrát amilopektin antranilát (5 g/l recipiens oldat), ebből az amiláz hatására szabadul fel a fluoreszcens antranil rész, melyet a kuprofán dializáló membrán (Technicon, England) átereszt. A recipiens oldat szállítja a fluoreszcens reakcióterméket a dializáló egységből a fluoriméterbe (LS 2B Perkin Elmer, England). A készüléken beállított hullámhossz és skála: 414 nm illetve 0.1 fix scale. A fluoreszcenciát, mely az amiláz koncentráció lineáris függvénye, a fluoriméterhez kapcsolt Tekman görbeíró készüléken monitoroztuk. A nyugalmi és az indukált amiláz kibocsátást egyaránt egység (U) ml-1 (100 mg szövet)-1 formában fejeztük ki. Definició szerint egy egység amiláz az az enzimmennyiség, amely keményítőből 3 perc alatt 6.9 pH-n és 20 °C-on 1 mg maltózt szabadít fel. A kalibrációhoz alfa amiláz (II típus) oldatát (21 U ml-1) használtuk. A hasnyálmirigy

37

95 % O2 5% CO2

levegő elektród szubsztrát szövet szövet

KH 37 °C

drog

pumpa

dializáló

recipiens 37 °C

dializáló egység

levegő felesleg

görbeíró

fluoriméter buborékmentesítő

9. ábra Az amiláz on-line fluorimetriás mérésének vázlata KH: perfúziós oldat; drog: a vizsgált anyagok ismert koncentrációjú oldatai. (312) alapján.

szegmentumok amiláz kibocsátását elektromos mező ingerléssel (electric field stimulation: EFS) illetve acetilkolinnal (ACh, 10-5 M/l) indukáltuk. Az EFS során olyan Perspex szövetkamrát használtunk, melybe két ezüstelektród volt beágyazva. Az általunk alkalmazott EFS paraméterei: 50 V feszültség, 20 Hz frekvencia és 1 msec impulzus időtartam. Az ACh (10-5 M/l), SNP (10-3 M/l), L-Arg (10-3 M/l), LNNA (10-3 M/l) és 8-Br cGMP (10-5 M/l) oldatait közvetlenül a perfúziós KH oldathoz adagoltuk. Az SNP oldatot közvetlenül a felhasználás előtt, fénytől védett lombikban készítettük el és ilyen lombikból adagoltuk a KH oldathoz. Az EFS hatásait SNP-vel, L-Arg-nel, LNNA-nel és 8-Br cGMP-vel történő kombinációkban is megvizsgáltuk fiziológiás extracelluláris Ca++ koncentráció (2.56 mM/l) mellett. Vizsgáltuk továbbá az EFS /SNP kombináció hatásait alacsonyabb (1.25 mM/l) és magasabb (5 mM/l) extracelluláris Ca++ koncentrációk mellett. Az ACh/SNP, ACh/8-Br cGMP és az ACh/LNNA kombinációk hatásait fiziológiás Ca++ koncentrációjú milliőben vizsgáltuk meg.

38

Patkány acinussejtek intracelluláris szabad kálciumion koncentrációjának mérése A vizsgálatokhoz nyolc darab 2 hónapos nőstény Sprague-Dawley patkányt használtunk fel (átlagos súly: 150 g). Az állatok fejére mért ütés és a fej eltávolítása után gyorsan kiboncoltuk a hasnyálmirigyet, és jéghideg módosított Krebs-RingerHEPES (KRH) oldatba helyezve igen apróra vágtuk. A KRH oldat összetétele: (mM/l): NaCl: 130; KCl: 5; N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanoszulfonsav (HEPES): 20; KH2PO4: 1.2; MgSO4: 2.0; D-glükóz: 10; CaCl2: 1.0 mM/l; tripszin inhibitor: 1.0 mg ml-1 és bovin szérum albumin (BSA), 0.2%; pH 7.4. A pancreas darabkákat ezután kollagenázt (150 egység kollagenáz ml-1, III típus, Clostridium hystoliticum-ból) tartalmazó 100 % O2-nel átáramoltatott 37°C-os KRH oldatban rázógépen inkubáltuk 15 percig, majd a részben emésztett szövetet 5 percre áthelyeztük kálciummentes, 1 mM/l etilén diamin tetraacetátot (EDTA) tartalmazó KRH oldatba. Ezután friss KRH oldatban történő mosások következtek, majd újabb rázógépen történő inkubáció a kollagenázt tartalmazó (150 egység ml-1) KRH oldatban, ezúttal 60 percig. Az emésztett szövetet kis műanyag kémcsövekbe helyezve centrifugáltuk (400 fordulat/min: rpm 3 percig). A felülúszót leöntöttük, a szövetet 30 percre újra KRH oldatba helyeztük. Az acinusokat mechanikai módszerrel, csökkenő méretű pipettahegyekből (3-1 mm) álló soron történő átáramoltatással disszociáltuk. A felülúszóban lévő acinusokat 5% BSA tartalmú KRH oldatba tettük át, majd centrifugáltuk (400 rpm 4 percig). A pipettahegyekben összegyűlt acinusokat 0.5% BSA tartalmú KRH oldatba tettük át, majd centrifugáltuk (400 rpm 4 percig). A fenti eljárás eredményeképpen acinussejtekből álló szuszpenziót kaptunk. Jégen tárolva a szuszpenzió sejtjeinek 95%-a 4 órán át megőrizte életképességét (tripánkék festéssel vizsgálva). Az acinussejteket fura-2 acetoximetilészter (fura-2 AM) 2 µM/l koncentrációjú oldatában 40 percig 20 °C-on inkubáltuk, majd centrifugáltuk, a felülúszót leöntöttük és a sejteket 100 % O2-nel átáramoltatott 37°C-os BSA mentes KRH oldatban fénytől védve átmostuk. Ez utóbbi lépés során zajlik a fura-2 AM teljes deészterifikációja, a citoszól észterázok hatására. Centrifugálást követően a sejteket friss KRH oldatba helyeztük. A sejtszuszpenziót 2 ml-es adagokban (kb.106 sejt) 37°C-on állandó kevergetés mellett helyeztük a spektrofluoriméterbe (LS -50, Perkin-Elmer, England). A mérések paraméterei: excitációs hullámhossz 350 nm, emissziós hullámhossz 510 nm.

39

Amikor az emittált jel elérte az alapvonalat, a vizsgált anyagokat (ACh 10-5 M/l, SNP 10-3 M/l, 8-Br cGMP 10-5 M/l) illetve kombinációikat (ACh/SNP illetve ACh/8-Br cGMP) a szuszpenzióhoz adtuk. Minden egyes vizsgálat után digitonint (5 µM/l) adtunk a mintákhoz, mely a sejtmembrán permeabilizációjával jelentősen megnöveli a citoszól Ca++ koncentrációját. Ezután etilén (bis)oxonitrilo tetraacetátot (EGTA) (10 nM/l) alkalmaztunk, mely a szabad Ca++ megkötésével minimálisra csökkenti a citoszól Ca++ koncentrációját. A fenti anyagok hozzáadásakor mért maximális illetve minimális fluoreszcencia értékekre a [Ca++]i kiszámításához van szükség. A fura-2 molekula excitációs spektruma Ca++-függő: a Ca++ koncentráció emelkedésével eltolódik a rövidebb hullámhosszak felé (313). A vizsgálat során feltételezzük a következőket: a fura-2 szelektív a kalcium kationra; a festék koncentrációja kellően kicsi ahhoz, hogy a fura-2-Ca komplexből származó fluoreszcencia intenzitása és a [Ca++]i között egyenes arányosság áll fenn; a fura-2 1:1 arányban képez komplexet a kalciummal; a festék intracellulárisan is ugyanúgy viselkedik, mint a kalibrációs médiumban; az adott feltételek (fura-2 koncentráció, inkubációs hőmérséklet és időtartam) esetén minimális a sejtmembránhoz kötődés és az intracelluláris kompartmentalizáció (313). Ez utóbbit a minták Triton X-100 detergenssel (1%-os oldat) történő kezelésével lehet vizsgálni: ha nő a fluoreszcencia intenzitása, az az intracelluláris membránokhoz kötött (és a detergens hatására felszabaduló) fura-2-ből származik. A prestoni laborban végzett korábbi vizsgálatok alapján intenzív fluoreszcencia és minimális kompartmentalizáció 2 µM/l fura-2 koncentráció, 40 perces inkubációs idő és 20 °C hőmérséklet mellett volt észlelhető. Adott hullámhosszon a [Ca++]i és a mért fluoreszcencia értékek között az alábbi összefüggés állapítható meg: F − Fmin [Ca++]i = Kd Fmax − F ahol

Kd a fura-2 disszociációs konstansa (190 nM), F a mért fluoreszcencia, Fmax a

maximális (digitoninnnal elért) [Ca++]i -hoz tartozó fluoreszcencia, Fmin a minimális (EGTA-val elért) [Ca++]i -hoz tartozó fluoreszcencia (313) (V, VI). STATISZTIKAI VIZSGÁLATOK

40

A kísérleteink során nyert adatokat az átlag ± standard hiba formában fejeztük ki. Az összehasonlítandó minták szórásnégyzeteit F-próbával vetettük össze. A megfelelő mintákat kétmintás t-próba segítségével hasonlítottuk össze, és csak a 0.05nál kisebb valószínűségi érték (p) esetén fogadtuk el szignifikánsnak a változást.

41

EREDMÉNYEK NADPH DIAFORÁZ ENZIMHISZTOKÉMIA és NOS IMMUNHISZTOKÉMIA Sertés pancreas NADPH diaforáz (NADPHd) reaktív illetve nNOS immunreaktív idegsejtek igen gyakran fordultak elő a sertés pancreas ganglionjaiban. Átlagos méretük 24 (± 0.13) × 34 (± 0.16) µm, n=49. Általában a perikaryonok mutattak intenzív vagy mérsékelt festődést, míg a dendritek kezdeti szakaszai ritkábban jelölődtek (10. ábra af). Jóllehet a ganglionsejtek jó része NADPHd vagy NOS pozitívnak bizonyult, majdnem minden általunk vizsgált ganglionban előfordultak nem festődő, NADPHd vagy NOS negatív neuronok is (10. ábra a, d, e, f) . NADPHd reaktív illetve nNOS immunreaktív idegrostokat a lebenykék közti kötőszövetben futó idegekben (10. ábra g) valamint az erek mentén lehetett kimutatni (10. ábra h). A NADPHd enzimhisztokémiai módszer kisebb számú (pozitív idegrost / 104 µm2) és gyengébben festődő idegrostot mutatott, míg ugyanazon szövet közeli metszetein nNOS immunhisztokémiával nagyobb számú (pozitív idegrost / 104 µm2) és intenzíven festődő interlobularis és perivaszkuláris rostot találtunk. A sertés pancreas más lokalizációjú (periductalis, peri- vagy intrainsularis) idegei nem jelölődtek a fenti két módszerrel. Az endothel, főleg a nagyobb erekben kifejezett NADPHd pozitivitást mutatott, nNOS immunhisztokémiával azonban nem jelölődött. Az enzimhisztokémiai reakció terméke az endothelben hálószerű mintázatot adott, elsősorban az endotelsejtek széli részein volt látható (10. ábra i). Az erek media és adventitia rétegei egyik fenti módszerrel sem jelölődtek. A sertés pancreas endokrin szigetsejtjeinek nagy része citoplazmájában erős vagy mérsékelt nNOS festődést adott (10. ábra j), előfordultak azonban nNOS negatív szigetsejtek is. A Langerhans szigetekben NADPHd reaktivitást nem sikerült kimutatni. A kivezetőcsövek (ductus intercalaris, intralobularis, interlobularis) hámsejtjei és az acinussejtek nem festődtek a fenti két eljárással.

42

EX

EX

* *

a

50 µm

50 µm

b

EX

EX

* * 50 µm

c

50 µm

d *

EX

EX

* e

* 50 µm

f

50 µm

10. ábra Sertés pancreas metszetei. EX: exokrin parenchyma. (a-d) NADPHd reaktív neuronok a pancreas ganglionjaiban. (a) NADPHd reaktív nyúlványok (nyilak). (a, d) NADPHd negatív idegsejtek (csillagok). (e, f) nNOS immunreaktív ganglionsejtek (nyilak) és nNOS negatív ganglionsejtek (csillagok).

43

EX

id

g

v

EX

50 µm

50 µm

h EX

EX tm

sz sz

tm

i

50 µm

j

50 µm

10. ábra (folytatás) (g) nNOS immunreaktív idegrostok (nyilak) az interlobuláris kötõszövetben futó idegben (id). (h) nNOS immunreaktív vékony idegrostok egy venula (v) mentén. (i) NADPHd reaktív endothelsejtek egy artéria hosszmetszetén. Az endothelben a reakciótermék eloszlása hálózatszerû, a tunica media (tm) NADPHd negatív. (j) nNOS immunreaktív endokrin sejtek a Langerhans-szigetekben (sz).

44

Patkány pancreas A patkány pancreasban mind a négy korcsoportban előfordultak a lebenykék közti kötőszövetben nNOS pozitív ganglionsejtek, amelyeknek a perikaryonja és esetenként

nyúlványainak kezdeti szakasza jelölődött (11. ábra a-c). A sertés

hasnyálmirigyben találtakhoz képest minden korcsoportban kevesebb nNOS pozitív perikaryont figyeltünk meg. Az újszülött és a fiatal egyedekben valamivel több nNOS pozitív ganglionsejt fordult elő, mint a felnőtt és idős állatokban. A legerősebb festődést a fiatal egyedekben lévő ganglionsejtek adták. Immunreaktív idegrostokat minden korcsoportban találtunk az interlobularis kötőszövetben, az acinussejtek közelében (11. ábra d, e) és a pancreas erei mentén (11. ábra f). A patkány pancreas immunhisztokémiai vizsgálata során egyik korcsoportban sem találtunk más lokalizációjú (periductalis, peri- vagy intrainsularis) nNOS pozitív idegeket. A ductus intercalarisok hámsejtjei felnőtt patkányokban intenzív (11. ábra h), idős egyedekben mérsékelt nNOS festődést mutattak, újszülött és fiatal patkányokban azonban nem festődtek (11. ábra g). A nagyobb kivezetőcsövek hámja egyik korcsoportban sem festődött. A felnőtt patkányok endokrin szigetsejtjeinek nagy része citoplazmájában gyenge, idős állatokban intenzívebb nNOS festődést adott (11. ábra i). Idős állatokban elsősorban a szigetek széli részein lévő endokrin sejtek jelölődtek.

45

EX

EX

50 µm

a

50 µm

b

EX

EX 50 µm

c

50 µm

d EX v

EX

e

50 µm

f

50 µm

11. ábra Patkány pancreas metszetei. EX: exokrin parenchyma. (a-c) nNOS immunreaktív ganglionsejtek (nyilak) újszülött (a), fiatal (b) és felnõtt (c) pancreasban. (c) Az idegsejtek nyúlványainak kezdeti szakasza (nyílfejek) is jelölõdött. (d, e) nNOS immunreaktív periaciner idegrostok (nyilak) újszülött (d) és fiatal (e) pancreasban. (f) nNOS immunreaktív vékony idegrostok (nyilak) egy venula (v) mentén, felnõtt pancreasban.

46

EX

EX

ic

50 µm

g

EX

h

50 µm

sz

sz

i

50 µm

11. ábra (folytatás) (g) nNOS negatív hámsejtek (nyilak) újszülött pancreas ductus intercalarisának (ic) falában. (h) nNOS immunreaktív ductus intercalaris hám (nyilak) felnõtt pancreasban. (i) nNOS immunreaktív Langerhans szigetek (sz) idõs pancreasban.

47

PATKÁNY PANCREAS SZEGMENTUMOK AMILÁZ ELVÁLASZTÁSÁNAK MÉRÉSE ON-LINE FLUORIMETRIÁS MÓDSZERREL Kísérleteinkben az átlagos (± standard hiba) bazális amiláz szekréció 6.94 ± 0.4 U ml-1 (100 mg szövet)-1 (n=30) volt. Az EFS jelentősen fokozta a pancreas szegmentumok amiláz outputját (12. ábra a; 13. ábra). Az SNP (10-3 M/l) szignifikánsan (p<0.05) csökkentette a bazális amiláz elválasztást (13. ábra). Ha az EFS eljárás és a SNP kombinációját alkalmaztuk normál vagy csökkent extracelluláris kálcium koncentráció mellett, az EFS hatásához képest szignifikánsan (p<0.05) csökkent amiláz elválasztást mértünk (12. ábra b; 13. ábra). Megemelt extracelluláris kálcium koncentráció esetén az SNP szignifikánsan nem befolyásolta az EFS hatását (12. ábra c; 13. ábra). Az ACh (10-5 M/l) jelentősen fokozta a pancreas szegmentumok amiláz outputját (12. ábra d; 13. ábra). Az SNP a kontrollal összevetve szignifikánsan nem befolyásolta az ACh-nal kiváltott szekréciós választ (12. ábra e; 13. ábra). A 8Br-cGMP (10-5 M/l) utánozta az SNP amiláz szekréciót gátló hatásait: szignifikánsan csökkentette a bazális szekréciót és szignifikánsan (p<0.05) befolyásolta az EFS amiláz elválasztásra kifejtett hatását (13. ábra). A 8-Br-cGMP a kontrollal összevetve szignifikánsan nem befolyásolta az ACh-nal kiváltott szekréciós választ (13. ábra). Az L-arginin (L-Arg; 10-3 M/l) illetve az LNNA (10-3 M/l) szignifikánsan nem befolyásolta sem a bazális szekréciót, sem az EFS amiláz elválasztásra kifejtett hatását (14. ábra); a minták szórása meglehetősen nagy volt. Az LNNA szignifikánsan nem befolyásolta az ACh-nal kiváltott szekréciós választ (14. ábra).

48

5 mM/l Ca++

12. ábra Patkány pancreas szegmentumok amiláz elválasztásának változásait mutató eredeti görbék. EFS (a) és EFS/SNP kombináció (b) hatása normál extracelluláris (e.c.) Ca++ koncentráció esetén. EFS/SNP kombináció (c) hatása megemelt e.c. Ca++ koncentráció esetén. ACh (d) és ACh/SNP kombináció (e) hatása normál e.c. Ca++ koncentráció esetén. A függõleges kalibráció minden esetben 10 U ml-1 (100 mg szövet)-1, a vízszintes kalibráció 5 min. Az egyes görbék alatt lévõ vízszintes szakaszok a stimuláció idõtartamát mutatják, a vizsgált anyagok koncentrációival. Az egyes görbék 5-8 kísérletre jellemzõ felvételek.

49

13. ábra Patkány pancreas szegmentumok átlagos maximális (± standard hiba) amiláz elválasztását mutató hisztogram. EFS (a) és EFS/SNP kombináció (b) hatása csökkentett extracelluláris (e.c.) Ca++ koncentráció esetén. SNP (c), EFS (d) és EFS/SNP kombináció (e) hatása normál e.c. Ca++ koncentráció esetén. EFS (f) és EFS/SNP kombináció (g) hatása megemelt e.c. Ca ++ koncentráció esetén. ACh (h) és ACh/SNP kombináció (i) hatása, 8-Br cGMP (j), EFS/8-Br cGMP kombináció (l) és ACh/8-Br cGMP kombináció (n) hatása normál e.c. Ca++ koncentráció esetén. Kontrollként lásd az EFS (k) és az ACh (m) hatásait. (b)-t (a)-val összevetve, (e)-t (d)-vel összevetve és (l)-t (k)-val összevetve p < 0.05. n= 5-8, minden oszlopban.

50

14. ábra Patkány pancreas szegmentumok átlagos maximális (± standard hiba) amiláz elválasztását mutató hisztogram. EFS (a), L-Arg (b), EFS/L-Arg kombináció (c), LNNA (d) és EFS/LNNA kombináció (e) valamint ACh (f) és ACh/LNNA kombináció (g) hatásai normál e.c. Ca++ koncentráció esetén. n= 5-8, minden oszlopban.

51

PATKÁNY ACINUSSEJTEK INTRACELLULÁRIS SZABAD KÁLCIUMION KONCENTRÁCIÓJÁNAK MÉRÉSE Fura-2-vel töltött acinussejtekben az átlagos (± standard hiba) bazális [Ca++]i 182 ± 7 nM /l (n=32 ) volt (16. ábra). ACh jellemzően nagyfokú [Ca++]i emelkedést váltott ki (15. ábra a; 16. ábra), míg az SNP (15. ábra b) és a 8-Br-cGMP egyaránt szignifikánsan (p< 0.05) csökkentette az [Ca++]i-t (16. ábra). Sem a SNP (15. ábra b), sem a 8-Br-cGMP szignifikánsan nem befolyásolta az ACh-nal kiváltott emelkedést (16. ábra).

52

[Ca++]i

Intracelluláris szabad Ca++ koncentráció (nM/l)

Intracelluláris szabad Ca++ koncentráció (nM/l)

idô (sec)

idô (sec)

8-Br+ACh

8-Br 10-5

SNP+ACh

ACh 10-5

SNP 10-3

bazális

Intracelluláris szabad Ca++ koncentráció (nM/l)

15. ábra Izolált patkány acinussejtek intracelluláris szabad Ca++ koncentrációjának változásait mutató eredeti görbék. ACh (a), SNP és SNP/ACh kombináció (b) hatása. A függõleges nyilak a vizsgált anyagoknak az acinussejteket tartalmazó küvettákhoz való hozzáadásának idõpontját jelzik. Az egyes görbék 5-8 kísérletre jellemzõ felvételek.

koncentráció (M/l)

16. ábra Izolált patkány acinussejtek átlagos (± standard hiba) intracelluláris szabad Ca++ koncentrációját mutató hisztogram. SNP (b), ACh (c), SNP/ACh kombináció (d) valamint 8-Br cGMP (e) és 8-Br cGMP/ACh kombináció (f) hatása. Kontrollként lásd az átlagos (± standard hiba) bazális értéket (a). (b)-t (a)-val összevetve és (e)-t (a)-val összevetve p < 0.05. (a) esetben n= 32, a többi oszlopban n= 5-8.

53

MEGBESZÉLÉS és KÖVETKEZTETÉSEK Morfológiai vizsgálataink eredményei azt mutatják, hogy az nNOS izoenzim patkányban mind a négy vizsgált korcsoportban jelen van a pancreas idegelemeiben. Az nNOS immunreaktív ganglionsejtek és idegrostok lokalizációja és festődési mintázata összhangban van az irodalomban korábban közölt eredményekkel (17, 140, 233, 239). Az nNOS enzim- és immunhisztokémiai eljárással egyaránt kimutatható a sertés pancreas ganglionsejtjeinek nagy részében és számos idegrostban. Ez, az irodalomban először általunk közölt beszámoló (IV) egybevág más emlős fajok hasnyálmirigyeiben tett megfigyelésekkel (17, 18, 233, 234, 236, 238), köztük olyan eredményekkel, melyek szerint a pancreas idegelemeiben észlelhető NADPHd aktivitást (is) teljes egészében az nNOS adja (17, 233, 234). (A sertés hasnyálmirigy hozzáférhető, jól feldolgozható, metszhető, szigetsejt xenotranszplantációra igen alkalmas (245) szövet, így a jövőben több figyelmet érdemelne a morfológiai és a funkcionális vizsgálatokban.) Az enzim- illetve az immunhisztokémiai módszer alkalmazása során kapott festődési mintázat megegyezett a sertés pancreas ganglionjaiban, az interlobuláris és perivaszkuláris idegrostok vizsgálatakor azonban adódtak különbségek. A nagyobb számban észlelt és jobban festődő nNOS immunreaktív rostok jelenlétét magyarázhatja a streptavidin-biotin-tormaperoxidáz komplex immunhisztokémiai módszer nagy érzékenysége és a sokszor kipróbált protokoll. Az enzimhisztokémiai eljárás kevésbbé standardizált: az inkubációs idő, a hőmérséklet és a reagensek koncentrációi eltérőek a különböző publikációkban (18, 237, 240). Mindezek hatással lehetnek az észlelt színreakcióra, különösen a vékony idegrostokban. A

patkány

pancreasban

több

nem idegi

szövet

is

mutatott

nNOS

immunreaktivitást. Az nNOS extraneuronális lokalizációját számos tanulmány megerősíti (51-54, 196). Felnőtt és idős patkányok ductus intercalarisainak hámsejtjei erős illetve mérsékelt nNOS immunfestődést mutattak. A kivezetőcsövek hámsejtjeiben termelődő NO szerepet játszhat azok -elsősorban szekretin és VIP által reguláltszekretoros aktivitásának szabályozásában. Az nNOS felnőtt és idősebb patkányok valamint sertés endokrin szigetsejtjeiben is kimutatható, összhangban több korábbi megfigyeléssel (196, 237). A szigetsejtekből felszabaduló NO - a pancreas endokrin működéseinek szabályozásán túl - a környező, periinsularis acinussejtek funkcióját is

54

befolyásolhatja.

Sertés

pancreasban

a

NADPHd

reakciótermék

eloszlása

az

érendothelben (hálószerű mintázat) a NADPHd aktivitást szintén mutató eNOS izoenzim membránhoz kötött jellegével magyarázható (87, 314). A négy korcsoportban tett megfigyeléseink alapján a patkány pancreas szöveteiben (főleg a nem idegi szövetekben) az

nNOS tartalom (nNOS

immunhisztokémiai módszerrel vizsgálva) változik az életkorral (III). Ezt korábban csak NADPHd enzimhisztokémia segítségével és kizárólag a patkány pancreas idegelemeiben vizsgálták (240). Jól ismert, hogy mindhárom NOS izoenzim működése szabályozható a génexpresszió útján is (46, 47, 67-69), ennek eredménye a NOS molekula de novo szintézise. A felnőtt és az idősebb egyedek kivezetőcső hámsejtjeiben és szigetsejtjeiben észlelt megnövekedett nNOS tartalom alapján felvetődik, hogy az életkor előrehaladtával hangsúlyozottabb lehet a fenti sejtekből származó NO exokrin és endokrin funkciókban játszott parakrin mediátor szerepe. Az iNOS életkortól függő expresszióját sertés szigetsejtekben írták le (245). A pancreas megnövekedett NOS (cNOS és iNOS) tartalma jelentős tényező lehet az időskori endokrin és exokrin hasnyálmirigy elégtelenség kialakulásában. Hisztokémiai vizsgálataink eredményei azt mutatják, hogy a patkány és sertés pancreas exokrin állományának meglehetősen gazdag a nitrerg beidegzése. nNOS tartalmú idegelemek rendszeresen előfordulnak az acinusok és az erek közelében. Ez összhangban van számos korábbi vizsgálat eredményeivel. (17, 18, 233, 234, 236-239, 241-244). Az nNOS tartalmú idegek jelenléte és eloszlása alapján az exokrin pancreasban is felvetődik a NO transzmitter/ modulátor szerepe. Korábbi vizsgálatok kolinerg muszkarin-receptorokat mutattak ki az acinussejtekben (315), más vizsgálatok pedig igazolták, hogy az exokrin pancreast ellátó extrinsic és intrinsic idegek nagy része kolinerg (250, 316). Kísérleteinkben a patkány pancreas szegmentumok intrinsic idegeit EFS technikával ingereltük. Az eljárást korábban már számos szerző alkalmazta (316, 317, 318, 227, 319). A prestoni laborban végzett korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az atropin (10-5 M/l) szignifikánsan és nagymértékben gátolja az EFS és az ACh (10-5 M/l) patkány pancreas szegmentumok amiláz elválasztására kifejtett hatását, a kolecisztokinin oktapeptid (10-8 M/l) amiláz elválasztásra gyakorolt hatását azonban szignifikánsan nem befolyásolja (nem publikált adatok). További prestoni vizsgálatok kimutatták, hogy 3H-kolinnal előkezelt patkány pancreas szegmentumokban az EFS

55

szignifikánsan fokozza a 3H-kolin elválasztását (V). A fenti eredményekből következik, hogy az általunk használt in vitro modellben az EFS fő hatása az ACh felszabadulás serkentése az acinussejteket ellátó idegvégződésekből. A NO-nak a pancreas exokrin részében kifejtett

lehetséges hatásainak vizsgálata céljából a NO donor SNP-t

alkalmaztuk. Az SNP olcsó, az alapkutatásban és a klinikumban egyaránt jól ismert vegyület, vizes oldatának megfelelő kezelése esetén (112, 320) jól használható exogén NO forrás. Az SNP-ből in vitro felszabaduló NO kimutatható, koncentrációja meghatározható a vizsgált rendszerben mért oxihemoglobin-methemoglobin átalakulás mennyiségi viszonyainak ismeretében (100). Az SNP-t, mint exogén NO forrást vizsgálatai során számos szerző használta (101-111, 224, 298). Az SNP szignifikánsan gátolja mind a bazális, mind az EFS által kiváltott amiláz elválasztást, azonban az ACh által indukált amiláz szekrécióra nincsen szignifikáns hatással. Az SNP fenti hatásai függenek az extracelluláris (e.c.) Ca++ koncentrációtól. Magas e.c. Ca++ koncentráció esetén az SNP nem befolyásolja az EFS által kiváltott amiláz elválasztást. Az SNP amiláz szekrécióra kifejtett hatásait utánozza a cGMP membránpermeábilis analógja, a 8-Br cGMP. Az SNP-nek és 8-Br cGMP-nek a stimulált pancreas enzimelválasztásra gyakorolt hatásairól ellentmondásos irodalmi adatok érhetők el. Megfigyelték, hogy izolált

patkány

acinusokban

mindkét

vegyület

gátolja

a

kolecisztokinin(26-

33)oktapeptid által kiváltott amiláz elválasztást (321). Egy másik vizsgálat ugyanolyan kísérleti körülmények között azonban nem erősítette meg a fent észlelteket (252). Szemben az exogén NO donor SNP-vel, a NOS szubsztrát L-Arg illetve a NOS inhibitor LNNA a vizsgált koncentrációban szignifikánsan nem befolyásolja sem a bazális sem az EFS által kiváltott amiláz elválasztást. Mindkét vegyület az endogén (enzimatikus) NO szintézis folyamatára van hatással (11, 119). Valószínű, hogy az általunk vizsgált in vitro, intakt keringéssel és számottevő eNOS aktivitással nem rendelkező pancreas modell szöveteiben az L-Arg és az LNNA nem befolyásolják olyan mértékben az (in vivo rendszerekéhez képest kisebb fokú) endogén NO képződést, hogy mérhető változásokat okoznának akár a bazális akár az indukált amiláz elválasztásban. A NOS inhibitorai néhány más in vitro vizsgálat során sem gyakoroltak szignifikáns hatást az indukált amiláz szekrécióra (237, 281). Fura-2 festékkel töltött acinussejtekben az SNP és a 8-Br cGMP egyaránt csökkenti a nyugalmi [Ca++]i-t, azonban egyik vegyület sem befolyásolja szignifikánsan

56

az ACh által okozott [Ca++]i emelkedést. Izolált acinusokban korábban leírták a cGMP kettős hatását a Ca++ influx-ra. Alacsonyabb, a nyugalmi cGMP szintet a 10-szeresére emelő SNP koncentrációk mellett fokozódott a Ca++ beáramlása, míg az SNP hatására bekövetkező további, a nyugalmi érték 80-szorosára történő cGMP szint emelkedés már gátolta a Ca++ beáramlását az acinussejtekbe (130). Élettani vizsgálataink eredményei alapján igen valószínű, hogy az exogén NO kettős hatást fejt ki a patkány pancreas exokrin részében (V, VI) (17. ábra).

EFS nitrerg idegvégződés

kolinerg idegvégződés

8-Br cGMP nNOS L-Arg → NO

sGC → cGMP

–

Ca++

ACh SNP → NO 8-Br cGMP

ACh MR PIP2 → DAG + IP3

cGMP ← sGC

aktivációja → cGMP

PKC –

egyéb, cGMP-től független hatások cG PK –

membrán acinussejt

Ca++ felszabadulás

enzimszintézis exocitózis

17. ábra Az SNP és a 8-Br cGMP valószínű hatásai valamint az endogén NO feltételezett hatásai az acinussejtben és a kolinerg idegvégződésben. MR: muszkarin-receptor; cG PK: cGMP-dependens protein kináz; − : gátló hatás. A kísérletekben használt anyagok és eljárás bekeretezve. Az SNP-ből származó exogén NO az acinussejtben cGMP-dependens és cGMPindependens módon egyaránt gátolhatja az enzimszekréciót. A kolinerg végződésbe diffundáló NO cGMP-dependens módon gátolhatja az ACh felszabadulásához szükséges Ca++ beáramlást.

57

Egyrészt az acinussejtekbe diffundálva közvetlenül gátolhatja az amiláz szekrécióját. Másrészt neuromodulátor hatású lehet az acinussejteket innerváló (nagyrészt kolinerg) idegvégződésekben. Az idegvégződésekbe diffundáló NO által okozott prejunkcionális gátlás az (EFS által kiváltott) ACh felszabadulás csökkenését eredményezi, ami az amiláz elválasztás csökkenéséhez vezet. A fenti következtetéseket megerősítik, a NO neuromodulátor szerepét valószínűsítik a prestoni laborban végzett további vizsgálatok: 3

H-kolinnal előkezelt patkány pancreas szegmentumokban mind az SNP, mind a cGMP

analóg dibutiril cGMP (a kontrollhoz képest) szignifikánsan gátolja az EFS által kiváltott 3H-kolin felszabadulást (V). A NO neuromodulátor hatását megfigyelték puhatestűek buccalis dúcainak szinapszisaiban, ahol exogén NO donor és a 8-Br cGMP egyaránt gátolta az ACh felszabadulását (322). 3H-kolinnal előkezelt tengerimalac vékonybél preparátumokban különböző NO donorok (köztük az SNP) gátolták, míg a 8Br cGMP fokozta az elektromos ingerlés hatására fellépő ACh felszabadulást (108). A kolinerg neurotranszmissziónak a NO által kiváltott prejunkcionális gátlását több vizsgálat alapján feltételezik számos zsiger simaizomzatának neuroeffektor junkcióiban (225-228, 319), nem excitábilis sejtekkel (pl. mirigyhámsejtek) kapcsolatos ilyen adatok azonban nem találhatók a korábbi irodalomban. Eredményeink azt is sugallják, hogy az SNP mindkét (közvetlen illetve neuromodulátor) fenti hatását közvetítheti a cGMP (V, VI). Az SNP az e.c. Ca++ koncentráció függvényében befolyásolja az EFS amiláz szekrécióra kifejtett hatását. Az acinussejtekben az SNP és a 8-Br cGMP egyaránt csökkenti az [Ca++]i-t. A fenti megfigyelések alapján a kolinerg idegvégződésekben is elképzelhető -bár az általunk alkalmazott módszerekkel nem bizonyítható- a transzmitter felszabadulását megelőző Ca++ influx NO által (cGMP-dependens módon) kiváltott gátlása (17. ábra). Jóllehet vizsgálataink alapján valószínű, hogy az exogén NO acinussejtre kifejtett hatását a cGMP közvetítheti, más cGMP-től független mechanizmusok sem zárhatók ki (296-298) (7. ábra 55. o). Az acinussejtben és az exokrin pancreas kolinerg idegvégződéseiben exogén és endogén NO hatására lejátszódó folyamatok mechanizmusainak (a cGMP-dependens PK funkciója, a cGMP-től független számos folyamat valamint a prejunkcionális feszültségfüggő Ca++ és K+

csatornák szerepe) tisztázásához és az újabb

következtetések levonásához további funkcionális vizsgálatokra van szükség, melyek

58

során többféle NO donor, NOS inhibitor alkalmazásával, az acinussejt funkció általánosabb vizsgálatával és a neuroeffektor transzmisszió célzott tanulmányozásával kereshetjük a választ az újabb kérdésekre. Kísérletes akut pancreatitisben a fenti in vitro modell és a különféle in vivo vizsgálatok együttes alkalmazása lehetővé teszi a NO feltételezett direkt és indirekt, toxikus és protektív hatásainak differenciáltabb értékelését.

AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI Az alábbiakban összefoglalom az értekezés újnak számító eredményeit.

• Az nNOS izoenzim enzim és immunhisztokémiai eljárással kimutatható a sertés pancreas idegelemeiben (IV). • A patkány pancreas szöveteiben az nNOS immunreaktivitás eloszlása az életkor függvénye (II, III). • Az SNP-ből származó exogén NO közvetlen gátló hatással van patkány pancreas szegmentumok acinussejtjeinek amiláz elválasztására (V,VI). • Az SNP-ből származó exogén NO az acinussejteket innerváló kolinerg idegvégződésekben gátolja az ACh felszabadulását (V,VI). • Az SNP-ből származó exogén NO fenti gátló hatásait utánozza a cGMP membránpermeábilis analógja, a 8-Br cGMP (V,VI). • Az SNP-ből származó exogén NO patkány pancreas szegmentumok acinussejtjeinek amiláz elválasztására gyakorolt gátló hatása függ az extracelluláris Ca++ koncentrációtól (V,VI). • Patkány acinussejtek nyugalmi intracelluláris szabad Ca++ koncentrációját az SNP és a 8-Br cGMP egyaránt csökkenti (V,VI).

59

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton mondok hálás köszönetet mindazoknak, akik a kezdetektől követték az értekezés egyedfejlődését és segédkeztek megszületésénél. Szeretném megköszönni Dr Ernest Adeghate (United Arab Emirates University, Al-Ain, UAE) volt gyakorlatvezetőm, mentorom lelkes, önzetlen segítségét, amelyre az első pillanattól kezdve mindig számíthattam; Ernest nagy munkabírása, segítőkészsége és derűs személye okán példakép számomra. Dr Fehér Erzsébet egyetemi tanár (Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövet-és Fejlődéstani Intézet), témavezetőm határozott és komoly tapasztalatokon nyugvó útmutatásait, kutató és publikációs tevékenységem lelkiismeretes ellenőrzését és rendszeres számonkérését. Jaipaul

Singh

(University

of

Central

Lancashire,

Preston

England)

professzornak a belőle áradó energiát, az állandó motivációt, az értekezés témájának kiválasztásához, a funkcionális kísérletek megtervezéséhez és végigviteléhez nyújtott segítségét. Prezentációk és pályázatok írása terén tőle tanultam a legtöbbet. Rendkívüli határozottsága, munkabírása és főként humánuma nagy hatással volt rám közös munkáink során. Dr Donáth Tibor egyetemi tanárnak (Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövetés Fejlődéstani Intézet) a tudomány világában megtett első lépéseimhez valamint az értekezés alapjául szolgáló kutatási téma kiválasztásához adott segítségét. Dr Maria Dolores Yago (University of Granada, Spain) önzetlen és értékes tanácsait, az élettani kísérletekkel és a review cikkel kapcsolatos sok segítségét. Dr Fehér János (Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika) egyetemi tanár programvezetői munkáját. Dr Blázovics Anna (Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika) tudományos főmunkatársnak a programmal kapcsolatos fáradhatatlan szervező munkáját és a szabad gyökök világát bemutató igen hasznos PhD kurzus gondosan felépített előadásait.

60

Réti András (lassan Dr) volt hallgatóm, demonstrátor (Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövet-és Fejlődéstani Intézet) fiatalos lendületét és intelligenciáját, amellyel a sokszor monoton labormunka problémáihoz is közelített. Oszwald Erzsébet és Gulyás Pálné az Anatómiai Intézet volt asszisztensnőinek a sok-sok labormunkát, főleg a gondosan elvégzett hisztokémiai vizsgálatokat. A University of Central Lancashire biológiai tanszéke munkatársainak az élettani kísérletek feltételeinek biztosítását. Kiss József fotósnak (Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövet-és Fejlődéstani Intézet) az igényes hagyományos képfeldolgozást. Öcsémnek, Ember Zoltán reklámgrafikusnak (A4 Design Stúdió) az igényes, precíz és időt rabló grafikai munkát és digitális képfeldolgozást. A PORCIÓ-Ék Kft-nek (Albertirsa) és a Papp családnak (Dánszentmiklós) a sertés hasnyálmirigyek biztosítását. A Semmelweis Egyetem Tudományos Tanácsának az utazási támogatást. A Wellcome Trust (London, England) utazási támogatását. Családom türelmét, támogatását, bátorító szavait és nagy-nagy szeretét, melyből nap mint nap erőt meríthetek.

61

IRODALOMJEGYZÉK (1) Furchgott RF, Zawadzki JV (1980) The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288: 373-376. (2) Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S (1987) Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 327: 524-526. (3) Garthwaite J (1991) Glutamate, nitric oxide and cell-cell signaling in the nervous system. Trends Neurosci 14: 60-67. (4) Stuehr DJ, Gross SS, Sakuma I, Levin R, Nathan CF (1989) Activated murine macrophages secrete a metabolite of arginine with the bioactivity of endothelium-derived relaxing factor and the chemical reactivity of nitric oxide. J Exp Med 169: 1011-1020. (5) Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA (1991) Nitric oxide - physiology, pathophysiology pharmacology. Pharmacol Rev 43: 109-142. (6) Radomski MW, Palmer RMJ, Moncada, S (1987) The role of nitric oxide and cGMP in platelet adhesion to vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun 148: 1482-1489. (7) Nowicki JP, Duval D, Poignet H, Scatton B (1991) Nitric oxide mediates cell death after local cerebral ischemia. Eur J Pharmacol 204: 339-340. (8) Kilbourn RG, Griffith OW (1992) Over-production of nitric oxide in cytokine-mediated and septic shock. J Natl Cancer Inst 84: 1671-1672. (9) Palmer RM, Moncada S (1989) A novel citrulline-forming enzyme implicated in the formation of nitric oxide by vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 158: 348-352. (10) Bredt DS, Hwang PM, Glatt CE, Lowenstein C, Reed RR, Snyder SH (1991) Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase. Nature 351: 714-718 (11) Lambert LE, Whitten JP, Baron BM, Cheng HC, Doherty NS, McDonal IA (1991) Nitric oxide synthesis in the central nervous system, endothelium and macrophages differs in its sensitivity to inhibition by arginine analogues. Life Sci 48: 69-75. (12) Hope BT, Michael GJ, Knigge KM, Vincent SR (1991) Neuronal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase. Proc Natl Acad Sci USA 88: 2811-2814. (13) Xie QW, Cho HJ, Calaycay J, Mumford RA, Swiderek KM, Lee TD, Ding A, Troso T, Nathan C (1992) Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophages. Science 256: 225-228. (14)

Culotta E, Koshland Jr DE (1992) NO News is good-news. Science 258: 1862-1865.

(15) Gibbs WW, Nemecek S, Stix G (1999) The 1998 Nobel prizes in science. Scientific American 280(1): 8-11. (16) Grifiths C, Bon C, Garthwaite J (1998) Nitric oxide in CNS. Physiology and pathology. Neurotransmissions 14: 3-11. (17) Ekblad E, Alm P, Sundler F (1994) Distribution, origin and projections of nitric oxide synthasecontaining neurons in gut and pancreas. Neuroscience 63: 233-248. (18) Liu HP, Leong SK, Tay SS (1994) Localization of NADPH-diaphorase positive neurons in the pancreas of the mouse, rat, chick, kitten and monkey. J Hirnforsch 35: 501-510.

62

(19) Konturek SJ, Szlachcic A. Dembinski A, Warzecha Z, Jaworek J, Stachura J (1994) Nitric oxide in pancratic secretion and hormone-induced pancreatitis in rats. Int J Pancreatology 15: 19-28. (20) Konturek JW, Hengst K, Kulesza E, Gabryelewicz A, Konturek SJ, Domschke W (1997) Role of endogenous nitric oxide in the control of exocrine and endocrine pancreatic secretion in humans. Gut 40: 86-91. (21) Patel AG, Toyama MT, Nguyen TN, Cohen GA, Ignarro LJ, Reber HA, Ashley SW (1995) Role of nitric oxide in the relationship of pancreatic blood flow and exocrine secretion in cats. Gastroenterology 108: 1215-1220. (22) Satoh A, Shimosegawa T, Abe T, Kikuchi Y, Abe R, Koizumi M, Toyota T (1994) Role of nitric oxide in the pancreatic blood flow response to caerulein. Pancreas 9: 574-579. (23) Hernandez-Guijo JM, Acosta JJ, Garcia-Benito M, Lopez MA, San Roman JI, Calvo JJ (1996) Nitric oxide synthesis modulates amylase secretion after cholecystokinin stimulation in perfused pancreatic segments of the rat. Digestion 57: 236. (24) Butler AR, Williams DHL (1993) The physiological role of nitric oxide. J Chem Soc Rev 22: 233-241. (25)

Gross SG (1995) Nitric oxide: Pathophysiological mechanisms. Annu Rev Physiol 57: 737-769.

(26) Persson MG, Agvald P, Gustaffson LE (1994) Detection of nitric oxide in exhailed air during administration of nitroglycerin in vivo. Br J Pharmacol 111: 825-828. (27) Wood J, Garthwaite J (1994) Models of the diffusional spread of nitric oxide: implications for neural nitric oxide signalling and its pharmacological properties. Neuropharmacology 33: 1235-1244. (28) Stamler JS, Singel DJ, Loscalzo J (1992) Biochemistry of nitric oxide and its redox-active forms. Science 258:1898-1902. (29) Mulsch A, Mordvinteev PI, Vanin AF, Busse R (1993) Formation and release of dinitrosyl iron complexes by endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 196: 1903-1908. (30) Beckman JS, Beckmaan TW, Chen J, Marshall PA, Freeman BA (1990) Apparent hydroxyl radical formation by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA 87: 1620-1624. (31) Ischiropoulos H, Zhu L, Chen J, Tsai M, Martin JC, Smith CD, Beckman JS (1992) Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys 298:431-437. (32) Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA (1991) Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. The cytotoxic potential for superoxide and nitric oxide. J Biol Chem 266: 4244-4250. (33) Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA (1991) Peroxynitrite-induced lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys 288: 481-487. (34) Doyle MP, Hockstra JW (1981) Oxidation of nitrogen oxides by bound dioxygen in hemoproteins. J Inorg Biochem 14: 351-358. (35) Hibbs JB, Taintor RR, Vavrin Z, Granger DL, Drapier JC (1990) Synthesis of nitric oxide from a terminal guanido nitrogen atom of L-arginine: a molecular mechanism regulating cellular proliferation that targets intracellular iron. In: Nitric Oxide from L-arginine: a Cellular Bioregulatory System. eds S Moncada, JB Hibbs, Amsterdam Elsevier Sci. pp. 189-223.

63

(36) Bastian NR, Yim C-Y, Hibbs JB, Samlowski WE (1994) Induction of iron-derived EPR signals in murine cancers by nitric oxide. J Biol Chem 269: 5127-5131. (37) Liu X, Gillespie JS, Martin W (1994) Non.adrenergic, non-cholinergic relaxation of the bovine retractor penis muscle: role of S-nitrosothiols. Br J Pharmacol 111: 1287-1295. (38) Al-Sa'doni H, Ferro A (2000) S-nitrosothiols: a class of nitric oxide-donor drugs. Clin Sci 98:507-520. (39) Gaston B, Drazen JM, Loscalzo J, Stamler JS (1994) The biology of nitrogen oxides in airways. Am J Respir Crit Care Med 149: 538-551. (40) Feelisch M, te Poel M, Zamora R, Deussen A, Moncada S (1994) Understanding the controversy over the identitity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 368: 62-65. (41) 3064.

Nathan C (1992) Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J 6: 3051-

(42) Cho HJ, Xie QW, Calaycay J, Mumford RA, Swiderek KM, Lee TD, Nathan C (1992) Calmodulin as a tightly bound subunit of calcium-, calmodulin independent nitric oxide synthase. J Exp Med 176: 599-604. (43)

Stuehr DJ, Griffith OW (1992) Mammalian nitric oxide synthases. Adv Enzymol 65; 287-346.

(44)

Nathan C, Xie QW (1994) Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls. Cell 78: 915-918.

(45) Mannick JB, Asano K, Izumi K, Kieff E, Stamler JS (1994) Nitric oxide produced by human B lymphocytes inhibits apoptosis and Epstein-Barr virus reactivation. Cell 79: 1137-1146. (46) Verge VMK, Xu Z, Xu XJ, Wiesenfeld-Hallin Z, Hökfelt T (1992) Marked increase in nitric oxide synthase mRNA in rat dorsal root ganglia after peripheral axotomy: in situ hybridization and functional studies.Proc Natl Acad Sci USA 89: 11617-11621. (47) Zhang ZG, Chopp M, Zaloga C, Pollock JS, Förstermann U (1993) Cerebral endothelial nitric oxide synthase expression after focal cerebral ischemia in rats. Stroke 24: 2016-2021. (48) Tayeh MA, Marletta MA (1989) Macrophage oxidation of L-arginine to nitric oxide, nitrite and nitrate. Tetrahydrobiopterin is required as a cofactor. J Biol Chem 264:19654-19658. (49) Lyons CR, Orloff GJ, Cunningham JM (1992) Molecular clonong and functional expression of an inducible nitric oxide synthase from a murine macrophage cell line. J Biol Chem 267: 6370-6374. (50) Lamas S, Marsden PA, Li GK, Tempst P, Michel T (1992) Endothelial nitric oxide synthase: molecular clonong and characterization of a distinct constitutive enzyme isoform. Proc Natl Acad Sci USA 89: 6348-6352. (51) Nakane M, Schmidt HHHW, Pollock JS, Förstermann U, Murad F (1993) Cloned human brain nitric ocide synthase is highly expressed in skeletal muscle. FEBS Lett 316; 175-180. (52) Asano K, Chee C, Gaston B, Lilly CM, Gerard C, Drazen JM, Stamler JS (1994) Constitutive and inducible nitric oxide synthase gene expression, regulation and activity in human lung epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 91; 10089-10093. (53) Wilcox CS, Welch WJ, Murad F, Gross SS, Taylor G, Levi R, Schmidt HH (1992) Nitric oxide synthase in macula densa regulates glomerular capillary pressure. Proc Natl Acad Sci USA 89: 1199311997.

64

(54) Schmidt HH, Warner TD, Ishii K, Scheng H, Murad F (1993) Insulin secretion from pancreatic β-cells caused by L-arginine-derived nitrogen oxides. Science 258: 1376-1378. (55) Balligand JL, Kobzik L, Han X, Kaye DM, Belhassen L, O'Hara DS, Kelly RA, Smith TW, Michel T (1995) Nitric oxide-dependent parasympatetic signaling is due to activation of constitutive endothelial (type III) nitric oxide synthase in cardiac myocytes. J Biol Chem 270; 14582-14586. (56) Shaul PW, North AJ, Wu LC, Wells LB, Brannon TS, Lau KS, Michel T, Margraf LR, Star RA (1994) Endothelial nitric oxide synthase is expressed in cultured human bronchial epithelium. J Clin Invest 94: 2231-2236. (57) Wiencken AE, Casagrande VA (1999) Endothelial nitric oxide synthetase (eNOS) in astrocytes: another source of nitric oxide in neocortex. Glia 26: 280-290. (58) Feldman PL, Griffith OW, Stuehr DJ (1993) The surprising life of nitric oxide. J Chem Soc Rev 22: 233-241. (59) Ghafourifar P, Richter C (1997) Nitric oxide synthase activity in mitochondria. FEBS Lett 418: 291-296. (60) Guilvi C, Poderoso JJ, Boveris A (1998) Production of nitric oxide by mitochondria. J Biol Chem 273: 11038-11043. (61) McMillan K, Bredt DS, Hirsch DJ, Snyder SH, Clark JE, Masters BS (1992) Cloned, expressed rat cerebellar nitric oxide synthase contains stoichometric amounts of heme, which binds carbon monoxide. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11141-11145. (62) Mayer B, John M, Heinzel B, Werner ER, Wachter H, Schultz G, Böhme E (1991) Brain nitric oxide synthase is a biopterin containing and flavin containing multifunctional oxidreductase. FEBS Lett 288: 187-191. (63) Heinzel B, John M, Klatt B, Böhme E, Mayer B (1992) Ca2+/calmodulin-dependent formation of hydrogen peroxide by brain nitric oxide synthase. Biochem J 281: 627-630. (64) Buga GM, Gold ME, Fukuto JM, Ignarro LJ (1991) Shear stress-induced release of nitric oxide from endothelial cells grown on beads. Hypertension 17: 187-193. (65) Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G (1987) Endothelium-derived relaxing factor produced from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci USA 84: 9265-9269. (66) Lipton SA, Stamler JS (1994) Actions of redox-related congeners of nitric oxide at the NMDA receptor. Neuropharmacology 33: 1229-1233. (67) Schreck R, Albermann K, Baeuerle PA (1992) Nuclear factor kappa B: an oxidative stressresponsive transcription factor of eukaryotic cells. Free Radic Res Commun 17: 221-237. (68) Lowenstein CJ, Alley EW, Raval P, Snowman AM, Snyder SH, Russell SW, Murphy WJ (1993) Macrophage nitric oxide synthase gene: two upstream regions mediate induction by interferongamma and lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci USA 90; 9730-9734. (69) Xie QW, Whisant R, Nathan C (1993) Promoter of the mouse gene encoding calciumindependent nitric oxide synthase confers inducibility by interfron-gamma and bacterial lipopolysaccharide. J Exp Med 177:1779-1784. (70) Herdegen T, Brecht S, Kummer W, Mayer B, Leah J, Bravo R, Zimmermann M (1993) Longlasting expression of JUN and KROX transcription factors and nitric oxide synthase in intrinsic neurons of the rat brain following axotomy. J Neurosci 13: 4130-4146.

65

(71) Brüning G (1993) NADPH-diaphorase histochemistry in the postnatal mouse cerebellum suggests specific developmental functions for nitric oxide. J Neurosci Res 36: 580-587. (72) Matsumoto T, Pollock JS, Nakane M, Förstermann U (1993) Developmental changes of cytosolic and particulate nitric oxide synthase in rat brain. Devel Brain Res 73: 199-203. (73) MacNaul KL, Hutchinson NI (1993) Differential expression of iNOS and cNOS mRNA in human vascular smooth muscle cells and endothelial cells under normal and inflammatory conditions. Biochem Biophys Res Commun 196: 1330-1334. (74) Hecker M, Sessa WC, Harris HJ, Angard EE, Vane JR (1990) The metabolism of L-arginine and its signifikance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc Natl Acad Sci USA 87: 8612-8616. (75) Hattori Y, Campbell EB, Gross SS (1994) Argininosuccinate synthetase mRNA and activity are induced by immunostimulants in vascular smooth muscle. Role in the regeneration of arginine for nitric oxide synthesis. J Biol Chem 269: 9405-9408. (76) 1-13.

Konturek SK, Konturek PC (1995)

Role of nitric oxide in the digestive system. Digestion 56:

(77) Westergaard N, Beart PM, Schousboe AJ (1993) Transport of L-[3H]arginine in cultured neurons: characteristics and inhibition by nitric oxide synthase inhibitors. J Neurochem 61: 364-367. (78) Bogle RG, Baydoun AR, Pearson JD, Moncada S, Mann GE (1992) L-arginine transport is increased in macrophages generating nitric oxide. Biochem J 284: 15-18. (79) Warner-Felmayer G, Werner ER, Fuchs D, Hausen A, Reibnegger G, Wachter H (1990) Tetrahydrobiopterin-dependent formation of nitrite and nitrate in murine fibroblasts. J Exp Med 172: 1599-1607. (80) Sakai N, Kaufman S, Milstien S (1993) TI: Tetrahydrobiopterin is required for cytokineinduced nitric oxide production in a murine macrophage cell line (RAW 264) Mol Pharmacol 44: 6-10. (81) Klatt B, Schmidt K, Uray G, Mayer B (1993) Biochemical characterisation, cofactor requirement and the role of NG hydroxy-L-arginie as an intermediate. J Biol Chem 268: 14781-14787. (82) Giovanelli J, Campos KL, Kaufman S (1991) Tetrahydrobiopterin, a cofactor for rat cerebellar nitric oxide synthase, does not function as a reductant in the oxigenation of arginine. Proc Natl Acad Sci USA 88: 7091-7095. (83) Brüne B, Lapetina EG (1991) Phosphorylation of nitric oxide by protein kinase A. Biochem Biophys Res Commun 181: 921-926. (84) Nakane M, Mitchell J, FörstermannU, Murad F (1991) Phosphorylation by calcium calmodulin dependent protein kinase II and protein kinase C modulates the activity of nitric oxide synthase. Biochem Biophys Res Commun 180: 1396-1402. (85) Dinerman JL, Steiner JP, Dawson TM, Dawson V, Snyder SH (1994) Cyclic nukleotide dependent phosphorylation of neuronal nitric oxide synthase inhibits catalytic activity. Neuropharmacology 33: 1245-1251. (86) Nathan C, Xie QW (1994) Regulation of the biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem 269: 13725-13728. (87) Michel T, Li GK, Busconi L (1993) Phosphorylation and subcellular translocation of endothelial nitric oxide synthase. Proc Natl Acad Sci USA 90: 6252-6256.

66

(88) Griscavage JM, Rogers NE, Sherman MP, Ignarro LJ (1993) Inducible nitric oxide synthase from a rat alveolar macrophage cell line is inhibited by nitric oxide. J Immunol 151: 6329-6337. (89) Bredt DS (1995) Molecular characterization of nitric oxide synthase. In: Nitric Oxide in the Nervous System. ed SR Vincent, Academic Press, London p 33. (90) Vallance P, Leone A, Calver A, Collier J and Moncada S (1992) Endogenous dimethylarginine as an inhibitor of nitric oxide synthesis. J Cardiovasc Pharmacol 20: 60-62. (91) Jaffrey SR, Snyder SH (1996) PIN: an associated protein inhibitor of neuronal nitric oxide synthase. Science 274: 774-777. (92) Fontecave M, Pierre JL (1994) The basic chemistry of nitric oxide synthase and its possible biological reactions. Bull Soc Chim Fr 131: 620-631. (93) Pizzuli L, Hagendorff A. Zirbes M, Jung W., Luderitz B (1997) N-acetylcysteine attenuates nitroglycerine tolerance in patients with angina pectoris and normal left ventricular function. Am J Cardiol 79: 28-33. (94) Butler AR, Al-Sa'doni HH, Megson IL, Flitney FW (1998) Synthesis, decomposition and vasodilatator action of some new S-nitrosated dipeptides. Nitric Oxide Biol Chem 2: 193-202. (95) Stamler JS, Jaraki O, Osborne J, Simon DI, Keaney J Vita J, Singel D, Valeri CR, Loscalzo J (1992) Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proc Natl Acad Sci USA 89: 7674-7677. (96) Gaston B, Sears S, Woods J, Hunt J, Ponaman M, McMahon T, Stamler JS (1998) Bronchodilatator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure. Lancet 351: 1317-1319. (97) Clancy RM, Levartovsky D, Leszcynska-Piziak J, Yegudin J, Abramson SB (1994) Nitric oxide reacts with intracellular glutathione and activates the hexose monophosphate shunt in human neutrophils: evidence for S-nitrosoglutathione as a bioactive intermediary. Proc Natl Acad Sci USA 91: 3680-3684. (98) Friederich JA, Butterworth JF 4th (1995) Sodium nitroprusside: twenty years and counting. Anesth-Analg 81: 152-162. (99)

Fürst Zs ( 1997) Farmakológia

Budapest, Medicina p. 408

(100) Balcioglu A, Watkins CJ, Maher TJ (1998) Use of a hemoglobin-trapping approach in the determination of nitric oxide in in vitro and in vivo systems. Neurochem Res 23: 815-820. (101) Karaki H, Murakami K, Urakawa N (1986) Mechanism of inhibitory action of sodium nitroprusside in vascular smooth muscle of rabbit aorta. Arch Int Pharmacodyn Ther 280: 230-240. (102) Vigne P, Lund L, Frelin C (1994) Cross talk among cyclic AMP, cyclic GMP and Ca(2+)dependent intracellular signalling mechanisms in brain capillary endothelial cells. J Neurochem 62: 22692274. (103) Tanoviv A, Jimenez M, Fernandez E (2001) Actions of NO donors and endogenous nitrergic transmitter on the longitudinal muscle of rat ileum in vitro: mechanisms involved. Life Sci 69: 11431154. (104) Murai A, Satoh S, Okumura J, Furuse M (2000) Factors regulating amylase secretion from chicken pancreatic acici in vitro. Life Sci 66: 585-591.

67

(105) Li G, Wieraszko A (1994) Dual effect of sodium nitroprusside on potentials recorded from mouse hippocampal slices. Brain Res 667: 33-38. (106) Tanak J, Markerink van Ittersum M, Steinbusch HW, DeVente J (1997). Nitric oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat brain. Glia 19: 286-297. (107) Maronde E, Middendorff R, Mayer B, Olcese J (1995) The effect of NO-donors in bovine and rat pineal cells: stimulation of cGMP and cGMP-independent inhibition of melatonin synthesis. J Neuroendocrinol 7: 207-214. (108) Hebeiss K, Kilbinger H (1996) Differential effects of nitric oxide donors on basal and electrically evoked release of acetylcholine from guinea-pig myenteric neurones. Br J Pharmacol 118: 2073-2078. (109) Tamura K, Schemann M, Wood JD (1993) Actions of nitric oxide-generating sodium nitroprusside in myenteric plexus of guinea pig small intestine. Am J Physiol 265: G887-893. (110) Wu SY, Dun NJ (1996) Potentiation of IPSCs by nitric oxide in immature rat sympathetic preganglionic neurones in vitro. J Physiol (London) 495: 479-490. (111) Morris R, Southam E, Braid DJ, Garthwaite J (1992) Nitric oxide may act as a messenger between dorsal root ganglion neurones and their satellite cells. Neurosci Lett 137: 29-32. (112) Feelisch M (1991) The biochemical pathways of nitric oxide formation from nitrivasodilators: Appropriate choice of exogenous NO donors and aspects of preparation and handling of aqueous NO solutions. J Cardiovasc Pharmacol 17: S25-S33. (113) Prast H, Tran MH Fischer H, Philippu A (1998) Nitric oxide-induced release of acetylcholine in the nucleus accumbens: Role of cyclic GMP, glutamate, and GABA. J Neurochem 71: 266-273. (114) Morley D, Keefer LK (1993) Nitric oxide/nucleophile complexes: a unique class of nitric oxidebased vasodilators. J Cardiovasc Pharmacol 22: S3-S9. (115) Schmidt K, Desch W, Klatt P, Kukovetz WR, Mayer B (1997) Release of nitric oxide from donors with known half-life: a mathematical model for calculating nitric oxide concentrations in aerobic solutions. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 355: 457-462. (116) Jyotheeswaran S, Li P, Chang TM, Chey WY (2000) Endogenous nitric oxide mediates pancreatic exocrine secretion stimulated by secretin and cholecystokinin in rats. Pancreas 20: 401-407. (117) Jaworwk J, Jachimczak B, Bonior J, Kot M, Tomaszewska R, Karczewska E, Stachura J, Pawlik W, Konturek SJ (2000) Protective role of endogenous nitric oxide (NO) in lipopolysaccharide-induced pancreatic damage (a new experimental model of acute pancreatitis). J Physiol Pharmacol 51: 85-102. (118) Olken NM, Marletta MA (1993) NG-methyl-L-arginine functions as an alternate substrate and mechanism-based inhibitor of nitric oxide synthase. Biochemistry 32: 9677-9685. (119) Pfeiffer S, Leopold E, Schmidt K, Brunner F, Mayer B (1996) Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 118: 1433-1440. (120) Buxton IL, Cheek DJ, Eckman D, Westfall DP, Sanders KM, Keef KD (1993) NG-nitro-LArginine and other alkyl esters og arginine are muscarinic receptor antagonists. Circ Res 72: 387-395. (121) DiMonte DA, Royland JE, Anderson A, Castagnoli K, Castagnoli N Jr, Langston JW (1997) Inhibition of monoamine oxidase contributes to the protective effect of 7-nitroindazole against MPTP neurotoxicity. J Neurochem 69: 1771-1773.

68

(122) Klatt P, Schmidt K, Brunner F, Mayer B (1994) Inhibitors of brain nitric oxide synthase. Binding kinetics, metabolism, and enzyme inactivation. J Biol Chem 269: 1674-1680. (123) Garvey EP, Oplinger JA, Furfine ES, Kiff RJ, Laszlo F, Whittle BJ, Knowles RG (1997) 1400W is a slow, tight binding, and highly selective inhibitor of inducible nitric-oxide synthase in vitro and in vivo. J Biol Chem 272: 4959-4963. (124) Moore PK, Handy RL (1997) Selective inhibitors of neuronal nitric oxide synthase--is no NOS really good NOS for the nervous system? Trends Pharmacol Sci 18: 204-211. (125) Handy RL, Moore PK (1997) Mechanism of the inhibition of neuronal nitric oxide synthase by 1-(2-trifluoromethylphenyl) imidazole (TRIM). Life Sci 60: 389-394. (126) Yoshida H, Tsunoda Y, Owyang C (1997) Effect of uncoupling NO/cGMP pathways on carbachol- and CCK-stimulated Ca2+ entry and amylase secretion from the rat pancreas. Eur J Physiol 434: 25-37. (127) Wu CC, Ko FN, Kuo SC, Lee FY, Teng CM (1995) YC-1 inhibited human platelet aggregation through NO-independent activation of soluble guanylate cyclase. Br J Pharmacol 116: 1973-1978. (128) Gibson A, Babbedge R, Brave SR, Hart SL, Hobbs AJ, Tucker JF, Wallace P, Moore PK (1992) An investigation of some S-nitrosothiols, and hydroxyarginine, on the mouse anococcygeous. Br J Pharmacol 107: 715-721. (129) Rapoport RM, Murad F (1983) Effects of ethacrynic acid and cystamine on sodium nitroprusside-induced relaxation, cyclic GMP levels and guanylate cyclase activity in the rat aorta. Gen Pharmacol 19: 61-65. (130) Xu X, Star RA, Tortorici G, Muallem S (1994) Depletion of intracellular calcium stores activates nitric oxide synthase to generate cGMP and regulate calcium influx. J Biol Chem 269: 1264512653. (131) Garthwaite J, Southam E, Boulton CL, Nielsen EB, Schmidt K, Mayer B (1995) Potent and selective inhibition of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase by 1H-(1,2,4)oxadiazolo(4,4,a)quioxalin-1one. Mol Pharmacol 48: 184-188. (132) Mirzazadeh S, Hobbs AJ, Tucker JF, Gobson A (1991) Cyclic nucleotide content of the rat anococcygeous during relaxations induced by drugs or by nonadrenergic noncholinergic field stimulation. J Pharm Pharmacol 43: 247-257. (133) Chakder S, Rattan S (1993) Release of nitric oxide by activation of nonadrenergic noncholinergic neurons of internal anal sphincter. Am J Physiol 264: G7-12. (134) Mulsch A, Bara A, Mordvintcev P, Vanin A, Busse R (1995) Specificity of different organic nitrates to elicit NO formation in rabbit vascular tissues and organs in vivo. Br J Pharmacol 116: 2743-2749 (135) Kojima H, Nakatsubo N, Kikuchi K, Kawahara S, Kirino Y, Nagoshi H, Hirata Y, Nagano T (1998) Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem 70: 2446-2453. (136) Kurioka S, Koshimura K, Murakami Y, Kato Y (2000) Reverse correlation between urine nitric oxide metabolites and insulin resistance in patients with type 2 diabetes mellitus. Endocr J 47: 77-81. (137) Marletta MA, Yoon PS, Iyengar R, Leaf CD, Wishnok JS (1988) Macrophage oxidation of Larginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry 27: 8706-8711.

69

(138) Faraci WS, Nagel AA, Verdries KA, Vincent LA, Xu H, Nichols LE, Labasi JM, Salter ED, Pettipher ER (1996) 2-Amino-4-methylpyridine as a potent inhibitor of inducible NO synthase activity in vitro and in vivo. Br-J-Pharmacol. 119: 1101-1108. (139) Hope BT, Vincent SR (1989) Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaphorase. J Histochem Cytochem 37: 653-661. (140) Worl J, Wiesand M, Mayer B, Greskotter KR, Neuhuber WL (1994) Neuronal and endothelial nitric oxide synthase immunoreactivity and NADPH-diaphorase staining in rat and human pancreas: influence of fixation. Histochem 102: 353-364. (141) Tanaka J, Markering van Ittersum M, Steinbusch HW, DeVente J (1997) Nitric oxide mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat brain. Glia 19: 286-297. (142) Aoki E, Takeuchi IK (1997) Immunohistochemical localization of arginine and citrulline in rat renal tissue. J Histochem Cytochem 45: 875-881. (143) Hobbs AJ (1997) Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling. Trends Pharmacol Sci 18: 484-491. (144) Dierks EA, Burstyn JN (1996) Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase. Biochem Pharmacol 51: 1593-1600. (145) Southam E, Garthwaite J (1993) The nitric oxide-cyclic GMP signalling pathway in rat brain Neuropharmacology 1267-1277. (146) Young HM, McConalogue K, Furness JB, DeVente J (1993) Nitric oxide targets in the guineapig intestine identified by induction of cyclic GMP immunoreactivity. Neuroscience 55: 583-596. (147) Barbier AJ, Lefebvre RA (1992) Effect of 3-isobutyl-1-methylxanthine and zaprinast on nonadrenergic non-cholinergic relaxation in the rat gastric fundus. Eur J Pharmacol 210: 315-334. (148) Radomski MW, Palmer RMJ, Moncada S (1987) Comparative pharmacology of endotheliumderived relaxing factor, nitric oxide and prostacyclin in platelets. Br J Pharmacol. 92: 181-187. (149) Roberts JM (1998) Endothelial dysfunction in preeclampsia. Semin Reprod Endocrinol 16: 5-15. (150) Marks DS, Vita JA, Folts JD, Keaney Jr JF, Welch GN, Loscalzo J (1995) Inhibition of neointimal proliferation in rabbits after vascular injury by a single treatment with a protein adduct of nitric oxide. J Clin Invest 96: 2630-2638. (151) Geng YJ, Hansson G, Holme E (1992) Interferon-γ and tumor necrosis factor synergize to induce nitric oxide production and inhibit mitochondrial respiration in vascular smooth muscle cells. Circ Res 71: 1268-1276. (152) Zhang J, Dawson VL, Dawson TM, Snyder SH (1994) Nitric oxide activation of poly(ADPribose) synthase in neurotoxicity. Science 263: 687-689. (153) Lepoivre M, Fieschi F, Coves J, Thelander L, Fontecave M (1991). Inactivation of ribonucleotide reductase by nitric oxide. Biochem Biophys Res Comm 265: 14143-14149. (154) Drapier JC, Hirling H, Wietzerberg J, Kaldy P, Kuhn LC (1993) Biosynthesys of nitric oxide activates iron regulatory factor in macrophages. EMBO J 12: 3643-3649. (155) Salvemini D, Misko TP, Masferrer JL, Seibert K, Currie MG, Needleman P (1993) Nitric oxide activates cyclooxigenase enzimes. Proc Natl Acad Sci USA 90: 7240-7244.

70

(156) Wang D, Wei J, Hsu K, Jau J, Lieu MW, Chao TJ, Chen HI (1999) Effects of nitric oxide synthase inhibitors on systemic hypotension, cytokines and inducible nitric oxide synthase expression and lung injury following endotoxin administration in rats. J-Biomed-Sci. 6: 28-35. (157) Sekine N, Ishikawa ,T Okazaki T, Hayashi M, Wollheim CB, Fujita T (2000) Synergistic activation of NF-kappab and inducible isoform of nitric oxide synthase induction by interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha in INS-1 cells. J-Cell-Physiol. 184: 46-57. (158) Hilliquin P, Borderie D, Hernvann A, Menkes CJ, Ekindijan OG (1997) Nitric oxide as Snitrosoproteins in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 40: 1512-1517. (159) Schilling J, Cakmakci M, Batting U, Geroulanos S (1993) A new approach in the treatment of hypotension in human septic shock by NG-monomethyl-L-arginine, an inhibitor of the nitric oxide synthetase. Intensive Care Med 19: 227-231. (160) Kitchener PD, Diamond J (1993) Distribution and colocalization of choline acetyltransferase immunoreactivity and NADPH diaphorase reactivity in neurons within the medial septum and diagonal band of Broca in the rat basal forebrain. J Comp Neurol 335: 1-15. (161) Ohta A, Takagi H, Matsui T, Hamai Y, Iida S, Esumi H (1993) Localization of nitric oxide synthase-immunoreactive neurons in the solitary nucleus and ventrolateral medulla oblongata of the rat: their relation to catecholaminergic neurons. Neurosci Lett 158: 33-35. (162) Johnson MD, Ma PM (1993) Localization of NADPH diahorase activity in monoaminergic neurons of the rat brain. J Comp Neurol 332: 391-406. (163) Eliasson MJ, Blackshaw S, Schell MJ, Snyder SH (1997) Neuronal nitric oxide synthase alternatively spliced forms: prominent functional localizations in the brain. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3396-3401. (164) Brenman JE, Chao DS, Gee SH, McGee AW, Craven SE, Santillano DR, Wu Z, Huang F, Xia H, Peters MF, Froehner SC, Bredt DS (1996) Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95 and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains. Cell 84: 757-767. (165) Dinerman JL, Dawson TM, Schell MJ, Snowman A, Snyder SH (1994) Endothelial nitric oxide synthase localized to hippocampal pyramidal cells: implications for synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci USA 91: 4214-4218. (166) Garthwaite J, Garthwaite G, Palmer RM, Moncada S (1989) NMDA receptor activation induces nitric oxide synthesis from arginine in brain slices. Eur J Pharmacol 172: 413-416. (167) Schrammel A, Behrends S, Schmidt K, Koesling D, Mayer B (1996) Characterization of 1H[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one as a heme-site inhibitor of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Br J Pharmacol 123: 299-309. (168) Wu SY, Dun NJ, Förstermann U, Dun NJ (1997) Nitric oxide synthase immunoreactivity in the rat, mouse, cat and squirrel monkey spinal cord. Neuroscience 79: 237-245. (169) Son H, Hawkins RD, Martin K, Kiebler M, Huang PL, Fishman MC, Kandel ER (1996) Longterm potentiation is reduced in mice that are doubly mutant in endothelial and neuronal nitric oxide synthase. Cell 87: 1015-1023. (170) Kantor DB, Lanzrein M, Stary SJ, Sandowal GM, Smith WB, Sullivan BM, Davidson N, Schuman EM (1996) A role for endothelial NO synthase in LTP revealed by adenovirus-mediated inhibition and rescue. Science 274: 1744-1748. (171) Bredt DS, Snyder SH (1994) Transient nitric oxide synthase neurons in embryonic cortival plate, sensory ganglia and olfactory epithelium. Neuron 13: 301-313.

71

(172) Gally JA, Montague PR, Reeke GN, Edelman GM (1990) The NO hypothesis: possible effects of a short-lived, rapidly diffusible signal in the development and function of the nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 87: 3547-3551 (173) Edelman GM, Gally JA (1992) Nitric oxide: linking space and time in the brain. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11651-11652. (174) Huang PL, Dawson TM, Bredt DS, Snyder SH, Fishman MC (1993) Targeted disruption of the neuronal nitric oxide synthase gene. Cell 75: 1273-1286. (175) Kugler P, Drenckhahn D (1996) Astrocytes and Bergmann glia as an important site of nitric oxide synthase I. Glia 16: 165-173. (176) Dawson VL, Dawson TM, London ED, Bredt DS, Snyder SH (1991) Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci USA. 88: 6368-6371. (177) Dalkara T, Moskowitz MA (1997) Neurotoxic and neuroprotective roles of nitric oxide in cerebral ischaemia. Int Rev Neurobiol 40: 319-336. (178) Iadecola C (1997) Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. Trends Neurosci 20: 132-139. (179) Parkinson JF, Mitrovic B, Merill JE (1997) The role of nitric oxide in multiple sclerosis. J Mol Med 75: 174-186. (180) Blottner D, Grozdanovic Z, Gossrau R (1995) Histochemistry of nitric oxide synthase in the nervous system. Histochem J 27: 785-811. (181) Vizzard MA, Erdman SL, deGroat WC (1995) Increased expression of neuronal nitric oxide synthase in dorsal root ganglion neurons after systemic capsaicin administration. Neuroscience 67: 1-5. (182) Förster ER, Southam E (1993) The intrinsic and vagal innervation of the rat stomach contains nitric oxide. Neuroreport 4: 275-278. (183) Belai A, Schmidt HH, Hoyle CH, Hassall CJ, Saffrey MJ, Moss J, Forstermann U, Murad, Burnstock G (1992) Colocalization of nitric oxide synthase and NADPH-diaphorase in the myenteric plexus of the rat gut. Neurosci Lett 143: 60-64. (184) Costa M, Furness JB, Pompolo S, Brookes SJ, Bornstein JC, Bredt DS, Snyder SH (1992) Projections and chemical coding of neurons with immunoreactivity for nitric oxide synthase in the guinea-pig small intestine. Neurosci Lett 148: 121-125. (185) Aimi Y, Kimura H, Kinoshita T, Minami Y, Fujimura M, Vincent SR (1993) Histochemical localization of nitric oxide synthase in rat enteric nervous system. Neuroscience 53: 553-560. (186) Grozdanovic Z, Baumgarten HG (1996) Colocalisation of NADPH-diaphorase with neuropeptides in the uterovesical ganglia of humans. Acta Histochem 98: 245-253. (187) Vizzard MA, Erdman SL, Forstermann U, deGroat WC (1994) Differential distribution of nitric oxide synthase in neural pathways to the urogenital organs (urethra, penis, urinary bladder) of the rat. Brain Res 646: 279-291. (188) Saffrey MJ, Hassall CJ, MoulesEW, Burnstock G (1994) NADPH diaphorase and nitric oxide synthase are expressed by the majority of intramural neurons in the neonatal guinea pig urinary bladder. J-Anat. 185: 487-495.

72

(189) Shew RL, Papka RE, McNeill DL, Yee JA (1993) NADPH-diaphorase-positive nerves and the role of nitric oxide in CGRP relaxation of uterine contraction. Peptides 14: 637-641. (190) Fischer A, Mundel P, Mayer B, Preissler U, Philippin B, Kummer W (1993) Nitric oxide synthase in guinea pig lower airway innervation. Neurosci Lett 149: 157-160. (191) Hassall CJ, Saffrey MJ, Burnstock G (1993) Expression of NADPH-diaphorase activity by guinea-pig paratracheal neurones. Neuroreport 4: 49-52. (192) Tanaka K, Hassall CJ, Burnstock G (1993) Distribution of intracardiac neurones and nerve terminals that contain a marker for nitric oxide, NADPH-diaphorase, in the guinea-pig heart. Cell Tissue Res 273: 293-300. (193) Kummer W, Mayer B (1993) Nitric oxide synthase-immunoreactive axons innervating the guinea-pig lingual artery: an ultrastructural immunohistochemical study using elastic brightfield imaging. Histochemistry 99: 175-179. (194) Rajfer J, Aronson WJ, Bush A, Dorey FJ, Ignarro LJ (1992) Nitric oxide as a mediator of relaxation of the corpus cavernosum in response to nonadrenergic, noncholinergic neurotransmission. N Engl J Med 326: 90-94. (195) Ehmke H, Junemann KP, Mayer B, Kummer W (1995) Nitric oxide synthase and vasoactive intestinal polypeptide colocalization in neurons innervating the human penile circulation. Int J Impot Res 7: 147-156. (196) Burrel MA, Montuenga LM, Garcia M, Villaro AC (1996) Detection of nitric oxide synthase (NOS) in somatostatin-producing cells of human and murine stomach and pancreas. J Histochem Cytochem 44: 339-346. (197) Gillespie JS, Sheng H (1989) The effects of pyrogallol and hydroquinone on the response to NANC nerve stimulation in the rat anococcygeus and bovine retractor penis muscles. Br J Pharmacol 99: 194-196. (198) Gibson A, Mirzazadeh S, Hobbs AJ, Moore PK (1990) L-NG-monomethyl arginine and L-NGnitro arginine inhibit non-adrenergic, non-cholinergic relaxation of the mouse anococcygeus muscle. Br J Pharmacol 99: 602-606. (199) Li CG, Rand MJ (1989) Evidence for a role of nitric oxide in the neurotransmitter system mediating relaxation of the rat anococcygeus muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol 16: 933-938. (200) Ramagopal MV, Leighton HJ (1989) Analysis of the presence of postjunctional alpha-2adrenoceptors in the rat anococcygeus muscle. J Pharmacol Exp Ther 250: 492-499. (201) Ignarro LJ (1990) Nitric oxide. A novel signal transduction mechanism for transcellular communication. Hypertension 16: 477-483. (202) Rajanayagam MA, Li CG, Rand MJ (1993) Differential effects of hydroxocobalamin on NOmediated relaxations in rat aorta and anococcygeus muscle. Br-J-Pharmacol. 108: 3-5. (203) Sanders KM, Ward SM (1992) Nitric oxide as a mediator of nonadrenergic noncholinergic neurotransmission. Am J Physiol 262: G379-392. (204) Stark ME, Bauer AJ, Szurszewski JH (1991) Effect of nitric oxide on circular muscle of the canine small intestine. J Physiol 444: 743-761.

73

(205) Lyster DJ, Bywater RA, Taylor GS, Watson MJ (1992) Effects of a nitric oxide synthase inhibitor on non-cholinergic junction potentials in the circular muscle of the guinea pig ileum. J Auton Nerv Syst 41: 187-196. (206) Gibson A, Babbedge R, Brave SR, Hart SL ,Hobbs AJ, Tucker JF, Wallace P, Moore PK (1992) An investigation of some S-nitrosothiols, and of hydroxy-arginine, on the mouse anococcygeus. Br J Pharmacol 107: 715-721. (205) Lyster DJ, Bywater RA, Taylor GS, Watson MJ (1992) Effects of a nitric oxide synthase inhibitor on non-cholinergic junction potentials in the circular muscle of the guinea pig ileum. J Auton Nerv Syst 41: 187-196. (207) Stark ME, Bauer AJ, Sarr MG, Szurszewski JH (1993) Nitric oxide mediates inhibitory nerve input in human and canine jejunum. Gastroenterology 104: 398-409. (208) Bult H, Boeckxstaens GE, Pelckmans PA, Jordaens FH, Van-Maercke YM, Herman AG (1990) Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. Nature. 345: 346-347. (209) Grider JR, Jin JG (1993) Vasoactive intesitinal peptide release and L-citrulline production from isolated ganglia of the myenteric plexus: evidence for regulation of vasoactive intesitinal peptide by nitric oxide. Neuroscience 54: 521-526. (210) Gibson A, Mirzazadeh S (1989) N-methylhydroxylamine inhibits and MB 22948 potentiates relaxations of the mouse anococcygeus to non-adrenergic, non-cholinergic field stimulation and to nitrovasodilator drugs. Br J Pharmacol 96: 637-644. (211) Conklin JL, Du C (1992) Guanylate cyclase inhibitors: effect on inhibitory junction potentials in esophageal smooth muscle. Am J Physiol 263: G87-90. (212) Gillespie JS, Sheng H (1989) A comparison of haemoglobin and erythrocytes as inhibitors of smooth muscle relaxation by the NANC transmitter in the BRP and the rat anococcygeus and by EDRF in the rabbit aortic strip. Br J Pharmacol 98: 445-450. (213) Rand MJ, Li CG (1994) Effects of ethanol and other aliphatic alcohols on NO-mediated relaxations in rat anococcygeus muscles and gastric fundus strips. Br J Pharmacol 111: 1089-1094. (214) 1583.

Gershon MD, Erde SM (1981)

The nervous system of the gut. Gastroenterology 80: 1571-

(215) Taylor GS, Bywater RA (1989) Novel autonomic neurotransmitters and intestinal function. Pharmacol Ther 40: 401-438. (216) Furness JB, Young HM, Pompolo S, Bornstein JC, Kunze WA, McConalogue K (1995) Plurichemical transmission and chemical coding of neurons in the digestive tract. Gastroenterology 108: 554-563. (217) Allescher HD, Tougas G, Vergara P, Lu S, Daniel EE (1992) Nitric oxide as a putative nonadrenergic noncholinergic inhibitory transmitter in the canine pylorus in vivo. Am J Physiol 262: G695-702. (218) Kaufman HS, Shermak MA, May CA, Pitt HA, Lillemoe KD (1993) resting sphincter of Oddi activity. Am J Surg 165: 74-80. (219) Yamato S, Spechler SJ, Goyal RK (1992) opossum. Gastroenterology 103: 197-204.

74

Nitric oxide inhibits

Role of nitric oxide in esophageal peristalsis in the

(220) Knudsen MA, Tottrup A (1992) A possible role of the L-arginine-nitric oxide pathway in the modulation of cholinergic transmission in the guinea-pig taenia coli. Br J Pharmacol 107: 837-841. (221) Mourelle M, Guarner F, Molero X, Moncada S, Malagelada JR (1993) Regulation of gall bladder motility by the arginine-nitric oxide pathway in guinea pigs. Gut 34: 911-915. (222) He XD, Goyal RK (1993) Nitric oxide involvement in the peptide VIP-associated inhibitory junction potential in the guinea-pig ileum. J Physiol 461: 485-499. (223) Suthamnatpong N, Hata F, Kanada A, Takeuchi T, Yagasaki O (1993) Mediators of nonadrenergic, noncholinergic inhibition in the proximal, middle and distal regions of rat colon. Br J Pharmacol 108: 348-355. (224) Yuan SY, Bornstein JC, Furness JB (1995) Pharmacological evidence that nitric oxide may be a retrograde messenger in the enteric nervous system. Br-J-Pharmacol. 114: 428-432. (225) Li CG, Rand MJ (1989) Prejunctional inhibition of non-adrenergic non-cholinergic transmission in the rat anococcygeus muscle. Eur J Pharmacol 168: 107-110. (226) Lefebvre RA, DeVriese A, Smits GJ (1992) Influence of vasoactive intestinal polypeptide, and NG-nitro-L-arginine methyl ester on cholinergic neurotransmission in the rat gastric fundus. Eur J Pharmacol 221: 235-242. (227) Sekizawa K, Fukushima T, Ikarashi Y, Maruyama Y, Sasaki H (1993) The role of nitric oxide in cholinergic neurotransmission in rat trachea. Br J Pharmacol 110: 816-820. (228) Andersson KE, Persson K (1993) The L-arginine/nitric oxide pathway and non-adrenergic, non-cholinergic relaxation of the lower urinary tract. Gen Pharmacol 24: 833-839. (229) Wetts R, Vaughn JE (1993) Transient expression of beta-NADPH diaphorase in developing rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res Dev Brain Res 76: 278-282. (230) Vizzard MA, Erdman SL, deGroat WC (1996) Increased expression of neuronal nitric oxide synthase in bladder afferent pathways following chronic bladder irritation. J Comp Neurol 370: 191-202. (231) Fiallos-Estrada CE, Kummer W, Mayer B, Bravo R, Zimmermann M, Herdegen T (1993) Long-lasting increase of nitric oxide synthase immunoreactivity, NADPH-diaphorase reaction and c-JUN co-expression in rat dorsal root ganglion neurons following sciatic nerve transection. Neurosci-Lett. 150: 169-173. (232) Wu W, Li L (1993) Inhibition of nitric oxide synthase reduces motoneuron death due to spinal root avulsion. Neurosci Lett 153: 121-124. (233) Umehara K, Kataoka K, Ogura T, Esumi H, Kashima K, Ibata Y, Okamura H (1997) Comparative distribution of nitric oxide synthase (NOS) in pancreas of the dog and rat: Immunocytochemistry of neuronal type NOS and histochemistry of NADPH-diahorase. Brain Res Bull 42: 649-678. (234) Liu HP, Tay SS, Leong SK (1996) Nitrergic neurons in the pancreas of newborn guinea-pig: their distribution and colocalization with various neuropeptides ans dopamine-beta.hydroxylase. J Auton Nerv Syst 61: 248-256. (235) Tay SS, Moules EW, Burnstock G (1994) Colocalisation of NADPH-diaphorase with nitric oxide synthase and vasoactive intestinal polypeptide in newborn pancreatic neurons. J Anat 184: 545552.

75

(236) Shimosegawa T, Abe T, Satoh A, Abe R, Kikuchi Y, Koizumi M, Toyota T (1993) NADPHdiaphorase activity in neurons of the mammalian pancreas: coexpression with vasoactive intestinal polypeptide. Gastroenterology 105: 999-1008. (237) Kirchgessner AL, Liu MT, Gershon MD (1994) NADPH diaphorase (nitric oxide synthase)containing nerves in the enteropancreatic innervation: Sources, co-stored neuropeptides and pancreatic function. J Comp Neurol 342: 115-130. (238) Furuzawa Y, Ohmori Y, Watanabe T (1996) Immunohistochemical studies of neural elements in pancreatic islets of the cat. J Vet Med Sci 58: 641-646. (239) Shimosegawa T, Abe T, Satoh A, Asakura T, Yoshida K, Koizumi M, Toyota T (1992) Histochemical demonstration of NADPH-diaphorase activity, a marker for nitric oxide synthase, in neurons of the rat pancreas. Neurosci Lett 148: 67-70. (240) Tay SS, Burnstock G (1994) Localization of age-related changes in NADPH-diaphorase activity in pancreatic neurons. Neurosci 61: 597-602. (241) Liu HP, Tay SS, Seng SK, Schemann M (1998) Colocalization of ChAT, DβH and NADPH-d in the pancreatic neurons of the newborn guinea pig. Cell Tissue Res 294: 227-231. (242) Liu MT, Kirchgessner AL (1997) Guinea pig pancreatic neurons: morphology, neurochemistry, electrical properties, and response to 5-HT. Am J Physiol 273: G1273-G1289. (243) Love JA, Szebeni K (1999) Morphology and histochemistry of the rabbit pancreatic innervation. Pancreas 18: 53-64. (244) Mensah-Brown EP, Pallot DJ (2000) Peptidergic and aminergic neurotransmitters of the exocrine pancreas of the Houbara bustard (Chlamydotis undulata). J Morphol 244: 23-29. (245) Feng X, Yi S, Hawthorne WJ, Patel AT, Walters SN, O'Connell PJ (2000) Inducible nitric oxide is expressed in adult but not fetal pig pancreatic islets. Xenotransplantation 7: 197-205. (246) Nam SW, Seo DW, Sung DS, Han JW, Hong SY, Lee HW (1998) Nitric oxide synthase from bovine pancreas: purification and characterization. Arch Pharm Res 21: 128-134. (247) Kugler P, Hofer D, Mayer B, Drenckhahn D (1994) Nitric oxide synthase and NADP-linked glucose-6-phpsphatase dehydrogenase are co-localized in brush cells of rat stomach and pancreas. J Histochem Cytochem 42: 1317-1321. (248) Tharakan T, Kirchgessner AL, Baxi LV, Gershon MD (1995) Appearance of neuropeptides and NADPH-diaphorase during development of enteropancreatic innervation. Brain Res Dev Brain Res 84: 26-38. (249) Tay SS, Moules EW (1994) NADPH diaphorase is colocalized with nitric oxide synthase and vasoactive intestinal polypeptide in rat pancreatic neurons in culture. Arch Hist Cytol 57: 253-257. (250) Wang J, Zheng H, Berthoud HR (1999) Functional vagal input to chemically identified neurons in pancreatic ganglia as revealed by Fos expression. Am J Physiol 277: E958-964. (251) Gunther GR, Jamieson JD (1979) Increased intracellular cyclic GMP does not correlate with protein discharge from pancreatic acinar cells. Nature 280: 318-320. (252) Menozzi D, Sato S, Jensen RT, Gardner JD (1989) Cyclic GMP does not inhibit protein kinase C-mediated enzyme secretion in rat pancreatic acini. J Biol Chem 264: 995-999.

76

(253) Nishizuka Y (1988) The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation. Nature 334: 661-665. (254)

Bruzzone R (1990) The molecular basis of enzyme secretion. Gastroenterology 99: 1157-1176.

(255) Ederveen AGH, Van Emst-De Vries SE, De Pont JJHHM, Williems PHGM (1990) Dissimilar effects of the protein kinase C inhibitors, stauroporine and H-7, on cholecystokinin-induced enzyme secretion from rat pancreatic acini. Eur J Biochem 193: 291-295. (256) Francis LP, Camello PJ, Singh J, Salido GM, Madrid JA (1990) Effects of phorbol ester on cholecystokinin octapeptide-evoked exocrine pancreatic secretion in the rat. J Physiol 431: 27-37. (257) Streb H, Irvine RF, Berridge MJ, Schulz I (1983) Release of calcium from a nonmitochondrial store in pancreatic cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature 306: 67-68. (258) Yule DY, Gallacher DV (1988) Oscillations of cytosolic calcium in single pancreatic acinar cells stimulated by acetylcholine. FEBS Lett 239: 358-362. (259) Stuenkel EL, Tsunoda Y, Williams JA (1989) Secretagogue-induced calcium mobilization in single pancreatic acinar cells. Biochem Biophys Res Commun 158: 863-869. (260)

Clapham DE (1995) Calcium signalling. Cell 8: 259-268.

(261) Pandol SJ, Schoeffield MS, Fimmel CJ, Muallem S (1987) The agonist-sensitive calcium pool in the pancreatic acinar cell. Activation of plasma membrane calcium influx mechanism. J Biol Chem 262: 16963-16968. (262) Tsunoda Y, Stuenkel EL, Williams JA (1990) Characterization of sustained calcium increase in pancreatic acinar cells and its relation to amylsae secretion. Am J Physiol 259: G792-G801. (263) 490.

Pandol S (1994) Pancreatic acinar cell signalling mechanism. Curr Opin Gastroent 10: 485-

(264)

Putney JW (1986) A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium 7: 1-12.

(265)

Putney JW (1990) Capacitative calcium entry revisited. Cell Calcium 11: 611-624.

(266) Thastrup O, Cullen PJ, Brobak BK, Hanley MR, Dawson AP (1990) Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular calcium stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum calcium-ATPase. Biochemistry 8: 2466.2470. (267) Pandol SJ, Schoeffield-Payne MS (1990) Cyclic GMP mediates the agonist-stimulated increase in plasma membrane calcium entry in the pancreatic acinar cell. J Biol Chem 265: 12846-12853. (268) Xu W, Willis JS (1994) Sodium transport through the amiloride-sensitive sodium-magnesium pathway of hamster red cells. J Membr Biol 141: 277-287. (269) Osipchuk YV, Wakui M, Yule DI, Gallacher DV, Petersen OH (1990) Cytoplasmic calcium oscillations evoked by receptor stimulation G-protein activation, internal application of inositol trisphosphate, or calcium: Simultaneous microfluorimetry and calcium-dependent chloride current recording in single pancreatic acinar cells. EMBO J 9: 697-704. (270) Wakui M, Osipchuk YV, Petersen OH (1990) Receptor-activated cytoplasmic calcium spiking mediated by inositol trisphosphate is due to calcium-induced calcium release. Cell 63: 1025-1032. (271) Yule DI, Lawrie AM, Gallacher DV (1991) Acetylcholine and cholecystokinin induced different patterns of oscillating calcium signals in pancreatic acinar cells. Cell Calcium 12: 145-151.

77

(272) Thenevod F, Dehlinger-Kremer M, Kemmer TP, Christian AL, Potter BVL, Schulz I (1989) Characterization of inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive (IsCaP) and insensitive (IisCaP) nonmitochondrial calcium pools in rat pancreatic acinar cells. J Membr Biol 109: 173-186. (273) Tsunoda Y, Stuenkel EL, Williams JA (1990) pancreatic acinar cells. Am J Physiol 258: C147-C155. (274) Ehrlich BE (1995) Neurobiol 5: 304-309.

Oscillatory model of calcium signalling in rat

Functional properties of intracellular calcium-release channels. Curr Opin

(275) Miyazaki S (1995) Inositol trisphosphate receptor-mediated spatiotemporal calcium signalling. Curr Opin Cell Biol 7: 190-196. (276)

Petersen OH (1996) New aspects of cytosolic calcium signalling. News Physiol Sci 11: 13-17.

(277) Galione A (1992) Calcium-induced calcium release and its modulation by cyclic ADP-ribose. Trends Pharmacol Sci 13: 304-306. (278) Vu CQ, Lu PJ, Chen CS, Jacobson MK (1996) Cyclic ADP-ribose, a calcium mobilising agent derived from NADP. J Biol Chem 271: 4747-4754. (279) Galione A, White A, Wilmott N, Turner M, Potter BVL, Watson SP (1993) cGMP mobilizes intracellular calcium in sea urchin eggs by stimulating cyclic ADP-ribose system. Nature 365: 456-459. (280) Yule DY, Williams JA (1994) Stimulus-secretion coupling in the pancreatic acinus. In: Physiology of the Gastrointestinal Tract. ed LR Johnson, Raven Press, New York, pp 1447-1472. (281) Molero X, Guarner F, Salas A, Mourelle M, Puig V, Malagelada JR (1995) Nitric oxide modulates pancreatic secretion and response to caerulein in the rat: Effects in acute pancreatitis. Gastroenterology 108: 1855-1862. (282) Konturek SJ, Bilski J, Konturek JW, Cieszkowski M, Pawlik W (1993) Role of endogenous nitric oxide in the control of canine pancreatic secretion and blood flow. Gastroenterology 104: 896-902. (283) Maczka M, Thor P, Bilski J, Konturek SJ (1994) Nitric oxide and the interrelation between intestinal motility and pancreatic seecretion in fasted and fed dogs. J Physiol Pharmacol 45: 285-298. (284) Onaga T, Nagashima C, Sakata T (2000) Effect of nitric oxide sunthase inhibitors on the temporal coordination of duodenal contractions and pancreatic exocrine secretion in sheep. J Comp Physiol 170: 469-479. (285) Conner EM, Aiko S, Fernandez M, Battarbee HD, Gray L, Grisham MB (2000) Duration of hemodynamic effects of N(G)-nitro-L-arginine methyl ester in vivo. Nitric Oxide 4: 85-93. (286) Holst JJ, Rasmussen TN, Schmidt P (1994) Role of nitric oxide in neurally induced pancreatic exocrine secretion in pigs. Am J Physiol 266: G206-G213. (287) Wrenn RW, Currie MG, Herman LE (1994) acinar cell secretion. Life Sci 55: 511-518.

Nitric oxide participates in the regulation of

(288) Tremblay J, Gerzer R, Hamet P (1988) Cyclic GMP in cell function. In: Advances in Second Messenger and Phosphorylation Research. eds P Greengard, GA Robinson, Raven Press, New York pp 319-384. (289) Kapoor CL, Krishna G (1978) Possible role of guanosine 3'5' monophosphate in the stimulussecretion coupling in exocrine pancreas. Biochim Biophys Acta 544: 102-112.

78

(290) Gukovskaya A, Pandol S (1994) Nitric oxide production regulates cGMP formation and calcium influx in pancreatic acinar cells. Am J Physiol 266: G350-G356. (291) Francis SH, Corbin JD (1994) Structure and function of cyclic nukleotide-dependent protein kinases. Annu Rev Physiol 56: 237-272. (292) Lander HM, Sehajpal P, Levine DM, Novogrodsky A (1993) Activation of human peripheral blood mononuclear cells by nitric oxide-generating compounds. J Immunol 150: 1509-1516. (293) Lambert M, Deschodt-Lanckman M, Furnelle J, Christophe J (1981) Similar characteristics of guanine nucleotide regulatory sites involved in adenylate cyclase activation, specific ATPase activity, and cholecystokinin binding in rat pancreatic plasma membranes. J Cycl Nukleotide Res 7: 385-397. (294) Matozaki T, Williams JA (1995) Regulation of phospholipid hydrolysis in streptolysin-opermabilised rat pancreatic acini. Pancreas 7: 59-65. (295) 257.

Neer EJ (1995) Heterometric G proteins: Organisers of transmembrane signals. Cell 80: 249-

(296) Gopalakrishna R, Chen CH, Gundimeda U (1993) Nitric oxide and nitric oxide-generating agents induce a reversible inactivation of protein kinase C activity and phorbol ester binding. J Biol Chem 268: 27180-27185. (297) Calvo JJ, Garcia-Benito M, Acosta JJ, San Roman JI, Lopez MA, Garcia LJ (1997) Tyrosine phosphorilation of both p125 focal adhesion kinase and paxillin in rat pancreatic acinar cells after nitric oxide stimulation. Digestion 58: 8. (298) Garcia-Benito M, San Roman JI, Lopez MA, Garcia-Marin LJ , Calvo JJ (2000) Nitric oxide stimulates tyrosine phosphorilation of p125 (FAK) and paxillin in rat pancreatic acini. Biochem Biophys Res Commun 274: 635-640. (299) Schulz HU, Niederau C, Klonowski-Stumpe H, Luthen R, Lippert H (1999) Oxidative stress in acute pancreatitis. Hepatogastroenterology 46: 2736-2750. (300) Ayub K, Serracino-Inglott F, Williamson RC, Mathie RT (2001) Expression of inducible nitric oxide synthase contributes to the development of pancreatitis following pancreatic ischaemiai and reperfusion. Br J Surg 88: 1189-1193. (301) Al-Mufti RA, Williamson RC, Mathie RT (1998) Increased nitric oxide activity in a rat model of acute pancreatitis. Gut 43: 564-570. (302) Viola G, Al-Mufti RA, Sohail M, Williamson RC, Mathie RT (2000) Nitric oxide induction in a rat model of selective pancreatic ischaemia and reperfusion. Hepatogastroenterology 47: 1250-1255. (303) Dabrowski A, Gabryelewicz A (1994) Nitric oxide contributes to multiorgan oxidative stress in acute experimental pancreatitis. Scand J Gastroenterol 29: 943-948. (304) Abe T, Shimosegawa T, Satoh A, Abe R, Kikuchi Y, Koizumi M, Toyota T (1995) Nitric oxide modulates pancreatic edema formation in rat caerulein-induced pancreatitis. J Gastroenterol 30: 636-642. (306) Werner J, Rivera J, Fernandez del Castillo C, Lewandrowski K, Adrie C, Rattner DW, Warshaw AL (1997) Differing roles of nitric oxide in the pathogenesis of acute edematous versus necrotizing pancreatitis. Surgery 121: 23-30. (306) Werner J, Fernandez del Castillo C, Rivera JA, Kollias N, Lewandrowski KB, Rattner DW, Warshaw AL (1998) On the protective mechanisms of nitric oxide in acute pancreatitis. Gut 43: 401407.

79

(307) Liu X, Nakano I, Yamaguchi H, Ito T, Goto M, Koyanagi S, Kinjoh M, Nawata H (1995) Protective effect of nitric oxide on the development of acute pancreatitis in rats. Dig Dis Sci 40: 21622169. (308) Closa D, Hotter G, Prats N, Gelpi E, Rosello-Catafau J (1995) A bradykinin agonist inhibited nitric oxide generation and thromboxane biosynthesis in acute pancreatitis. Prostaglandins 49: 285-294. (309) Closa D, Hotter G, Prats N, Bulbena O, Rosello-Catafau J, Fernandez-Cruz L, Gelpi E (1994) Prostanoid generation in early stages of acute pancreatitis: a role for nitric oxide. Inflammation 18: 469480. (310) Andrzejewska A, Jurkowska G (1999) Nitric oxide protects the ultrastructure of pancreatic acinar cells in the course of caerulein-induced acute pancreatitis. Int J Exp Pathol 80: 317-324. (311) Dawson TM, Bredt DS, Fotuhi M, Hwang PM, Snyder SH (1991) Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci USA 88: 7797-7801 (312) Michalek R, Templeton D (1987) Description of an automated assay for measurement of αamylase in vitro from rat parotid gland slices. Gen Pharmacol 18: 555-558. (313) Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J Biol Chem 260: 3340-3450. (314) Busconi L, Michel T (1993) Endothelial nitric oxide synthase, N-terminal myristoylation determines subcellular localization. J Biol Chem 268: 8410-8413. (315) Louie DS, Owyang C (1986) Muscarinic receptor subtypes on pancreatic acini: secretion and binding studies. Am J Physiol 251: G275-G279. (316) Davison JS, Pearson GT, Petersen OH (1980) Mouse pancreatic acinar cells: effects of electrical field stimulation on membrane potential and resistance. J Physiol (Lond) 301: 295-305. (317) Pearson GT, Singh J, Daoud MS, Davison JS, Petersen OH (1981) Control of pancreatic cyclic nukleotide levels and amylase secretion by noncholinergic, nonadrenergic nerves. A study employing electrical field stimulation of guinea pig segments. J Biol Chem 256: 11025-11031. (318) Pearson GT, Singh J, Petersen OH (1984) Adrenergic nervous control of cAMP-mediated amylase secretion in the rat pancreas. Am J Physiol 246: G563-G573. (319) Belvisi MG, Stretton D, Barnes PJ (1991) Nitric oxide as an endogenous modulator of cholinergic neurotransmission in guinea-pig airways. Eur J Pharmacol 198: 219-221. (320) Ikeda S, Schweiss JF, Frank PA, Homan SM (1987) In vitro cyanide release from sodium nitroprusside. Anesthesiology 66: 381-385. (321) Rogers J, Hughes RG, Mathews EK (1988) Cyclic GMP inhibits protein kinase C-mediated secretion in rat pancreatic acini. J Biol Chem 263: 3713-3719. (322) Mothet JP, Fossier P, Tauc L, Baux G (1996) NO decreases evoked quantal Ach release at a synapse of Aplasia by a mechanism independent of Ca2+ influx and protein kinase G. J Physiol (Lond) 493: 769-784

80

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK • CIKKEK: (I) Adeghate E, Ember Zs, Donáth T, Pallot DJ, Singh J (1996) Immunohistochemical identification and effects of atrial natriuretic peptide, pancreastatin, leucin-enkephalin and galanin in the porcine pancreas. Peptides 17(3): 503-509. IF: 1.816 (II) Ember Zs, Fehér E, Donáth T (1997) A nitrogén-oxid szintáz immuncitokémiai kimutatása patkányok hasnyálmirigy szöveteiben. Orv Hetil 138: 2113-15. (III) Ember Zs (1997) Age-dependent distribution of nitric oxide synthase containing elements in the rat pancreas. Biogenic Amines 13(4): 277-284. IF: 0.466 (IV) Ember Zs, Réti A, Fehér E (2000) Enzyme- and immunohistochemical localization of nitric oxide synthase in nerves of the porcine pancreas. Neuroscience Letters 292: 163-166. IF: 2.091 (V) Yago MD, Manas M, Ember Zs, Singh J (2001) Nitric oxide and the pancreas: Morphological base and role in the control of the exocrine pancreatic secretion. Molecular and Cellular Biochemistry 219: 107-120. IF: 2.054 (VI) Ember Zs, Yago MD, Singh J (2001). Distribution of nitric oxide synthase and secretory role of exogenous nitric oxide in the isolated rat pancreas. International Journal of Pancreatology 29: 9-16 IF: 0.924 össz IF: 7.351 • IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK: Ember Zs, Fehér, E, Donáth T (1996) Nitric oxide immunocytochemistry of the pancreas of neonatal and adult rats. Zeitschrift für Gastroenterologie 5/1996: 308. Ember Zs, Yago MD, Singh J (1998) Nitrergic nervous control of amylase secretion and calcium mobilization in the isolated rat pancreas. J Physiol (London) 511P: 24P. Ember Zs, Réti A (2000) Immunohistochemical detection of peripherin in porcine pancreatic neurons. Zeitschrift für Gastroenterologie 5/2000: 403.

81

Yago MD, Manas M, Ember Zs, Singh J (2000) Modulation of cholinergic neurotransmission by exogenous nitric oxide in isolated rat pancreatic segments. J Physiol (London) 526 P: 21-22P. • KONGRESSZUSI ELŐADÁSOK, POSZTEREK Ember Zs, Fuszek P, Adeghate E, Donáth T (1991) Acetylcholinesterase enzyme histochemistry of pancreatic tissue transplants. In: Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft, Gustav Fischer Verlag, Jena, pp. 69. Ember Zs, Altdorfer K (1998) A nitrogén monoxid kimutatásának morfológiai alapjai. XXVIII. Membrán-transzport Konferencia, Sümeg, 1998. 05. 26-29., In: Programfüzet, E2. Altdorfer K, Ember Zs (1998) A nitrogén monoxid tartalmú idegelemek lokalizációja a tápcsatorna egyes zsigereiben. Debreceni Egyetemi Szövetség I. Idegtudományi Konferenciája, Debrecen, 1998. 11. 6.-7., In: Programfüzet. Fehér E, Altdorfer K, Ember Zs (1999) A nitrogén monoxid tartalmú idegelemek megoszlása és precíz lokalizációja az emésztőrendszerben. X. Magyar Anatómus Kongresszus, Budapest, SOTE Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet, 1999. 06. 3.-5., In: Programfüzet 16. o.

82

ÖSSZEFOGLALÓ A NITROGÉN-MONOXID SZABAD GYÖK KIMUTATÁSA ÉS SZEREPE A PANCREAS EXOKRIN RÉSZÉBEN DR. EMBER ZSOLT Témavezető: Dr. Fehér Erzsébet egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Budapest 2002

A nitrogén-monoxid (NO) kisméretű molekula gyök, mely számos funkciót lát el a különböző szövetekben. A NO igen elterjedt az emésztőrendszerben, többek között a hasnyálmirigyben is, és feltehetően szerepet játszik a vérátáramlás, a motilitás és a szekréció szabályozásában. Jóllehet a morfológiai beszámolók bizonyítják, hogy a NO termelődik a pancreasban, a NO-nak a pancreas szöveteire kifejtett közvetlen hatásairól jóval kevesebbet tudunk. A NO-ot termelő enzim egyik típusát, a neuronális nitrogén monoxid szintázt (nNOS) NADPH diaforáz (NADPHd) hisztokémiai, valamint NOS immunhisztokémiai eljárásokkal lokalizáltuk patkány és sertés pancreasban. NADPHd reaktivitást (R) és/vagy NOS immunreaktivitást (IR) észleltünk a pancreas ganglionsejtjeiben, valamint az erek mentén és az acinusok közelében lévő idegrostokban. A sertés pancreasban az erek endothelje is mutatott NADPHd R-t, míg a szigetsejtekben és a patkány pancreas kivezetőcsöveinek hámsejtjeiben esetenként nNOS IR-t lehetett kimutatni. Az nNOS eloszlása az idegi, de különösen a nem-idegi szövetekben az életkortól függően változott, felnőtt és idős patkányok hasnyálmirigyében a NOS mennyisége megnövekedett. A NO in vitro patkány preparátumokra gyakorolt direkt hatásainak kimutatásához a NO donor nitroprusszid-nátrium (SNP), a NOS szubsztrát L-arginin (L-Arg), a NOS inhibitor NGnitro-L-arginin (LNNA) és a ciklusos GMP (cGMP) analóg 8-bromo cGMP (8-Br cGMP) nyugalmi és a stimulált amiláz szekrécióra kifejtett hatásait vizsgáltuk. Ingerlésre acetilkolint (ACh) vagy elektromos mező stimulációs technikát (EFS) alkalmaztunk. Az intracelluláris szabad kálcium koncentráció ( [Ca++]i ) változásait is mértük fura-2 reagenssel kezelt izolált acinussejtekben. Az amiláz elválasztást és a [Ca++]i-t egyaránt fluorimetriás módszerekkel határoztuk meg. Eredményeink azt mutatják, hogy mind az EFS, mind az ACh (10-5 M/l) jelentősen fokozta a pancreas szegmentumok amiláz outputját. Az SNP (10-3 M/l)

83

szignifikánsan csökkentette a bazális amiláz elválasztást. Gátló hatását utánozta a 8-Br cGMP (10-5 M/l). Ha az EFS eljárás és az SNP vagy a 8-Br cGMP kombinációját alkalmaztuk, az EFS hatásához képest szignifikánsan csökkent amiláz elválasztást mértünk. Ezek a gátló hatások nem jelentkeztek, ha az extracelluláris Ca++ koncentrációt 2.56-ról 5 mM/l-re emeltük. Az SNP és a 8-Br cGMP a kontrollal összevetve szignifikánsan nem befolyásolta az ACh-nal kiváltott szekréciós választ. Az L-Arg (10-3 M/l) és az LNNA(10-3 M/l) szignifikánsan nem befolyásolta sem a bazális sem pedig az EFS vagy ACh által stimulált amiláz elválasztást. Fura-2-vel kezelt izolált acinussejtekben az ACh jellemzően nagyfokú [Ca++]i emelkedést váltott ki, míg az SNP és a 8-Br cGMP szignifikánsan csökkentette az [Ca++]i-t. Sem az SNP, sem a 8-Br cGMP nem befolyásolta az ACh-nal kiváltott [Ca++]i emelkedést. A fenti eredmények azt mutatják, hogy NO tartalmú idegek jelen vannak a pancreasban, az exogén NO közvetlen hatással van a patkány pancreas acinussejtjeire, és felvetik a NO-nak az exocrin pancreas szekréció szabályozásában betöltött neuromodulátor funkcióját, mely elsősorban valószínűleg az ACh felszabadulást érinti.

84

SUMMARY IN ENGLISH DETECTION AND ROLE OF THE FREE RADICAL NITRIC OXIDE IN THE EXOCRINE PANCREAS ZSOLT EMBER MD Tutor: Professor Erzsébet Fehér Semmelweis University Budapest, School of PhD Studies 2002 Nitric oxide (NO) is a small free radical molecule that has several functions in various tissues. NO is well distributed in the gastrointestinal system including the pancreas and thought to be involved in the regulation of blood flow, motility and secretion. Although morphological reports provide evidence for the intrapancreatic production of NO, much less is known about the direct actions of NO exerted on the exocrine pancreatic tissues. In order to localize the neuronal isoform of the enzyme of NO production, the neuronal nitric oxide synthase (nNOS), we applied NADPH diaphorase (NADPHd) histochemistry and NOS immunohistochemistry in the rat and porcine pancreas. NADPHd reactivity (R) and/or NOS immunoreactivity (IR) were identified in the pancreatic ganglion cells and in nerve fibers next to acini and blood vessels. NADPHd R was also displayed by the porcine vascular endothelium, whereas the islet cells and the rat ductal epithelium occasionally showed nNOS IR. The distribution of nNOS in the neuronal and especially in the non-neuronal tissues showed age-related changes with increased contents of nNOS in the adult and ageing rat pancreas. In order to demonstrate the direct actions of NO on in vitro rat preparations, we studied the effects of the NO donor sodium nitroprusside (SNP), the NOS substrate L-arginine (L-Arg), the NOS inhibitor NG-nitro-L-arginine (LNNA) and the cyclic GMP (cGMP) analogue 8-bromo cGMP (8-Br cGMP) on basal and stimulated amylase secretion in isolated rat pancreatic segments. Stimulation was achieved by either acetylcholine (ACh) or electrical field stimulation (EFS). The changes in intracellullar free calcium concentration ( [Ca++]i ) were also investigated in fura-2 loaded isolated rat acinar cells. Both amylase output and [Ca++]i were measured by fluorimetric methods. Our results show that both EFS and ACh (10-5 M) resulted in marked increases in amylase output from pancreatic segments. SNP (10-3 M) significantly reduced basal amylase output. This inhibitory effect could be mimicked by 8-Br-cGMP (10-5 M). Combining SNP or 8-Br cGMP with EFS caused a significant decrease in amylase secretion compared with the response with EFS alone. This inhibitory effect was not evident when extracellular Ca++

85

concentration was elevated from 2.56 to 5 mM. SNP or 8-Br cGMP seemed to have no significant inhibitory effect on ACh-evoked amylase output compared with ACh alone. L-Arg (10-3 M) or LNNA (10-3 M) had no significant effects on either basal or EFS- or ACh-evoked amylase output from pancreatic segments. In fura-2 loaded isolated acinar cells, ACh induced the typical large increase in [Ca++]i whereas SNP and 8-Br cGMP significantly decreased basal [Ca++]i. Neither SNP nor 8-Br cGMP elicited any modification in ACh-evoked rise in [Ca++]i. The results above indicate the presence of nitrergic pancreatic nerves and the existence of a direct action of exogenous NO on rat acinar cells and also suggest its neuromodulatory role in the regulation of exocrine pancreatic secretion, possibly through the inhibition of ACh release.

86