A D-vitamin receptor génpolimorfizmusainak jelentosége krónikus betegségek kialakulásában Dr Gyorffy Balázs Doktori (Ph.D.) értekezés
Témavezeto: Dr Szabó András
Készült a Semmelweis Egyetem „Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója“ címu programjának keretében
Programvezeto: Prof. Dr. Tulassay Tivadar, egyetemi tanár Budapest, 2004
1
Összefoglalás cím: A D-vitamin receptor génpolimorfizmusainak jelentosége krónikus betegségek kialakulásában szerzo: Dr Gyorffy Balázs témavezeto: Dr Szabó András SOTE I. Gyermekklinika, 2003
Endokrinológiai
vizsgálatok arra utalnak, hogy a D-vitamin nagydózisú preventív
adásával a T1DM rizikóját nagymértékben csökkenteni lehet. A D-vitamin receptor (VDR) polimorfizmusok összefüggése a fiatalkori diabétesz (T1DM) pathogenezisével nem tisztázott. A Tru9I polimorfizmus és T1DM kapcsolatát eddig egyáltalán nem vizsgálták. Vizsgálataim során ezért célul tuztem ki az öt VDR polimorfizmus prevalenciájának, prognosztikai szerepének és klinikai paraméterekkel (HbAIc, diabétesz kezdete, BMI, mikoralbuminuria) való kapcsolatának vizsgálatát egyes típusú diabéteszes gyermekekben. Eredményeim arra utalnak, hogy a VDR gén BsmI, ApaI és Tru9I polimorfizmusainak együttes jelenléte nagymértékben növeli a diabétesz rizikóját magyar lányokban, de fiúkban nem. A VDR-nak a calcitrol hatásának közvetítése miatt központi szerepe van a PTH szintézis irányításában. Dializált betegekben ellentmondásos adatok jelentek meg a VDR polimorfizmusok lehetséges hatásairól. Vizsgálataim során célul tuztem ki az öt VDR polimorfizmus prevalenciájának, hatásainak és a mellékpajzsmirigy funkcióval való kapcsolatának a vizsgálatát hemodializált vesebetegekben. Az egyes polimorfizmusok prevalenciájában nem találtam különbséget a kontrollhoz viszonyítva. Az ApaI polimorfizmus nem teljesíti a Hardy-Weinberg feltételt, ami az "a" allél hordozóállapot és a veseelégtelenség rizikója közötti kapcsolatot valószínusít. A szérum iPTH és a BsmI, ApaI és Tru9I polimorfizmusok kombinációja között nemfüggo összefüggést találtam a hemodializált betegekben. Az egyes VDR genotípusok egymásra, és a diabétesz, valamint a krónikus veseelégtelenség szövodményeinek kialakulására való együttes hatásának vizsgálatához a VDR
2
polimorfizmus haplotípusok, és az egyes allélok közötti linkage disequilibriumok vizsgálatát tuztem ki célul. Eredményeim alapján a BsmI, az ApaI és a Tru9I VDR polimorfizmusok linkage disequilibriumban vannak egymással. A két vizsgálati csoportban ezen SNP- k kombinációi vezetnek a kimutatott eltérésekhez, míg a linkage-ben levo egyes polimorfizmusok önmagukban nem rendelkeznek kimutatható hatással. Ezen lelet a linkage disequilibrium biológiai jelentoségére hívja fel a figyelmet. A VDR polimorfizmusok vizsgálata mellett in silico kutatásokat is végeztem, amelyek során a Hardy-Weinberg equilibriumot vizsgáltam. Mendeli öröklodésu genetikai polimorfizmusokat vizsgáló populációgenetikai vizsgálatok esetén mindig ellenorizni kell, hogy a Hardy-Weinberg feltétel teljesül-e. Tapasztalataim alapján számos szakcikkben nem közlik a HWE számolás eredményeit. Célul tuztem ki annak vizsgálatát, hogy tudományos közleményekben a kontroll csoportban a Hardy-Weinberg feltétel vizsgálatának elmaradása milyen mértékben kérdojelezi meg az eredményeket, illetve befolyásolja-e a levont következtetéseket. Tíz folyóiratból 540 cikkben számoltam újra a Hardy-Weinberg equilibriumot valamennyi csoportban, valamennyi genotípus megoszlásra. Összesen 211 olyan eltérést találtam 102 cikkben, ahol ezen eltérést a szerzok nem jelezték az adatok feldolgozása során. Ezen eltérésekbol 69 olyan, ahol a kontroll csoportban a számítás vagy elmaradt, vagy hibás volt. Ezen közleményekben nem teljesül a null-hipotézis, így valamennyi leírt következtetést egy új kontroll csoport bevonásával újra kell ellenorizni. Amennyiben a Hardy-Weinberg equilibrium nem teljesül egy adott betegcsoportban, a genotípus kapcsolatban állhat a betegséggel. Célom volt annak a vizsgálata, hogy a HWE számításának elmaradása a bi-allélikus, Mendeli öröklodésü polimorfizmusok esetén milyen mértékben befolyásolja a helyes összefüggések kimutatását. Az elemzés során a fenti cikkek között 142 olyan polimorfizmust találtam, ahol vagy az asszociációs vizsgálat genotípus eloszlása, vagy a betegcsoport nem teljesítette a Hardy-Weinberg feltételt. Ezen polimorfizmusok esetén a HWE számításával a következtetés függvényében a betegséggel való kapcsolatot megerosíteni, illetve új kapcsolatokat lehet kimutatni.
3
Summary title: The significance of the Vitadmin-D receptor gene polymorphisms in chronic diseases author: Balázs Gyorffy MD tutor: András Szabó MD DSc. SOTE Ist Department of Pediatrics, 2003
Recent publications suggest, that high dose Vitamin-D treatment can reduce the risk of the development of type I diabetes (T1DM). However, the role of the Vitamin D receptor (VDR) polymorphisms in the pathogenesis of T1DM is not determined. My aim was to determine the prevalence of the five known VDR polymoprhisms, and their correlation with clinical parameters (HbAIc, age at T1DM diagnosis, BMI, microalbuminuria), and their prognostical value in T1DM children. My results suggest, that the common presence of the BsmI, ApaI and Tru9I polymorphisms highly increases the risk of T1DM in girls, but not in boys. The VDR as a mediator of the effects of calcitriol has a central role in the regulation of the PTH synthesis. In dialysed patients controversary data is available about the influence of VDR polymorphisms on disease complications. My aim was to deremine the prevalence, effects and correlation with parathyroid function of the VDR polymorphisms in hemodialysed patients. No prevalence of a single polymorphism was different compared to the reference group. The ApaI polymorphism misses the HW law in patients, which suggests a correlation between carrier state of the ”a” allele and risk on renal failure. The serum iPTH was correlated to a combination of the BsmI, ApaI and Tru9I polymorphisms in male patients. My third aim was to calculate linkage disequilibrium between the VDR polymorphism alleles to assess the correlation between the combinations of VDR polymorphism haplotypes and T1DM and complications in renal failure. My results indicate a linkage disequilibrium between the BsmI, ApaI and Tru9I polymorphisms. In the investigated conditions the combinations of these polymorphisms were related to the increased risk, whereas no single
4
polymorphism alone had a significant effect. This finding demonstrates the biological importance of the linkage disequilibrium. I have extended my experimental investigations with the in silico study of the HardyWeinberg equilibrium. Population genetic studies investigating polymorphisms with Mendelian inheritance should always test the Hardy- Weinberg (HW) law. According to my experience several publications fail to present the results of the HW calculation. My aim was to determine, how the missing HW calulation in the control group of scientific publications questions the published results. I have re-calculated HW equilibrium for all sub-genotypes in 540 publications from 10 different journals. I have found all together 211 genotypes in 102 publications, where the deviation from the HW- law was not mentioned by the authors. 69 of these errors were in the control group, where the published results do not meet the null-hypothesis. Therefore the conclusion of these papers needs to be validated by investigating new reference groups. The missing HW equilibrium among the investigated patients indicate a relation between genotype and disease. My aim was to determine, how the missing HW calculation in bi- allelic polymorphisms reduces the detected correlations between genotype and disease. Among the above publications I have found 142 genotypes, where the distribution in an association study, or in the patient group do not fulfill the HW criteria. In these polymorphisms the calculation of the HW law can approve or detect a new correlation with the disease.
5
Tartalomjegyzék Összefoglalás
2
Summary
4
Rövidítésjegyzék
9
1. Irodalmi áttekintés
10
1.1. A D-vitamin receptor polimorfizmusai
10
1.1.1. A D- vitamin metabolizmusa és biológiai szerepe
10
1.1.2. A D- vitamin receptor
10
1.1.3. Egy nukleotidra kiterjedo génpolimorfizmusok (SNP)
11
1.1.4. A D- vitamin receptor gén polimorfizmusai
12
1.1.4.1. VDR gén-polimorfizmusok és a csontháztartás
14
1.1.4.2. VDR gén-polimorfizmusok és a parathormon szintézis szabályozása
16
1.1.4.3. VDR gén-polimorfizmusok és az immunrendszer
17
1.1.4.4. VDR gén-polimorfizmusok és a rosszindulatú daganatok
18
1.1.4.5. VDR gén-polimorfizmusok és az autoimmun diabetes
18
1.2. A Hardy-Weinberg equilibrium
20
1.3. Linkage disequilibrium génpolimorfizmusok között
2. Célkituzések
22
24
3. Módszerek 26 3.1. Betegcsoportok a genotípus vizsgálatokhoz
6
26
3.1.1. Diabéteszes betegek
26
3.1.2. Dializált betegek
26
3.1.3. Kontroll csoportok
27
3.2. Genotipizálás
27
3.2.1. DNS izolálás
27
3.2.2. PCR protokoll
27
3.2.3.1. Fok I polimorfizmus
28
3.2.3.2. Apa I és Taq I polimorfizmusok
29
3.2.3.3. Bsm I polimorfizmus
31
2.2.3.4. Tru9 I polimorfizmus
31
3.3. Vesebetegek PTH szintjének meghatározása
32
3.4. Adatgyujtési módszerek a Hardy-Weinberg equilibrium meghatározásához 33 3.5. A Hardy-Weinberg equilibrium számítása
33
3.6. A standardizált linkage disequilibrium koefficiens számítása
35
3.7. Statisztikai analízis
36
4. Eredmények
37
4.1. A VDR polimofizmusok eloszlása
37
4.1.1. Diabéteszes betegek
37
4.1.2. Dializált betegek
40
4.2. Hardy- Weinberg equilibrium
45
4.2.1. HWE vizsgálata a borbetegségekben
59
4.2.2. HWE vizsgálata a gasztroenterológiában
7
61
5. Diszkusszió
63
5.1. VDR polimorfizmusok szerepe
63
5.1.1. VDR polimorfizmusok diabéteszes gyermekekben
65
5.1.2. A BsmI polimorfizmus ismétlodésének jelentosége
65
5.1.3. VDR polimorfizmusok dializált betegekben
65
5.2. Hardy- Weinberg equilibrium
66
6. Eredmények összefoglalása
68
Köszönetnyilvánitás
70
Irodalomjegyzék
71
Saját közlemények jegyzéke
93
Függelék A: Eur J Endocrinol 2002
FA
Függelék B: Orv Hetil 2003
FB
Függelék C: J Invest Dermatol 2004
FC
Függelék D: Kidney Int 2004
FD
Függelék E: Gut 2004
FE
Függelék F: J Am Soc Nephrol 2002 (absztrakt)
8
FF
Rövidítésjegyzék
BMD:
csont ásványianyag tartalom
BMI:
testtömegindex
CD:
Crohn betegség
CRC:
kolorektális rák
ESRD: végstádiumú vesebetegség HW:
Hardy-Weinberg
HWE:
Hardy-Weinberg equilibrium
IBD:
gyulladásos bélbetegség
ICA:
szigetsejt-autoantitest
ICU:
intenzív osztály
iPTH:
intakt parathormon
JDF:
Juvenile Diabetes Foundation
LD:
linkage disequilibrium
LPL:
lipoprotein lipáz
MTHFR:
methylentetrahydrofolát reduktáz
PBC:
primer biliáris cirrhosis
PTH:
parathormon
RFLP:
restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus
RXR:
retinoid X receptor
SNP:
single nukleotid polimorfizmus
T1DM:
egyes típusú diabétesz
T2DM:
kettes típusú diabétesz
UTR:
át nem írt régió
VDR:
D vitamin receptor
VDRE: D vitamin response element
9
1. Irodalmi áttekintés 1.1. A D-vitamin receptor polimorfizmusai 1.1.1. A D-vitamin metabolizmusa és biológiai szerepe A borben 7-dehidrokoleszterinbol a napfény hatására D3 previtamin keletkezik. Ez D3 -vitaminná alakul tovább, mely a májba szállítódik, ahol 25-hidroxi-vitamin-D3-á alakul. A vesében az 1-alfa-hidroxiláz segítségével 1,25- dihidroxi-vitamin-D3 (calcitriol) keletkezik belole, míg a 24-hidroxiláz által 24,25-dihidroxi-vitamin-D3 . A D-vitamin aktív metabolitja az 1,25-dihidroxi-vitamin-D3. Fo hatása, hogy fokozza a kalcium és a foszfát felszívódását a belekbol, valamint a pajzsmirigyre hatva gátolja a parathormon (PTH) szekrécióját és a mellékpajzsmirigy proliferációját. A 24,25- dihidroxi-vitamin-D3 fiziológiás koncentrációban a porcnövekedésben valamint a csontátépülésben játszik eddig még nem teljes mértékben tisztázott szerepet. A D-vitamin fontos immunológiai hatásokkal is rendelkezik. In vitro kísérletekben immunoszuppresszív hatásait igazolták: redukálja a limfocita- aktivációt, proliferációt és a citokin produkciót [178]. Számos növekedési faktor szintézisét is szabályozza, az immunrendszert stimuláló és szuprimáló hatásait in vitro és in vivo vizsgálatok is bizonyítják. Epidemiológiai vizsgálatok az alacsony D-vitamin szint és tuberkolózis, rheumatoid arthritis, sclerosis multiplex, és az IBD közötti kapcsolatot írtak le [198]. Intervenciós vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy a D-vitamin adás a fenti kórképekben a betegség lefolyását kedvezoen befolyásolja [198]. A D- vitamint pleiotrop hatásai miatt “az immunrendszer és az endokrin rendszer találkozása”-ként is jellemezhetjük [113].
1.1.2. A D-vitamin receptor A calcitriol az intracelluláris D-vitamin receptoron keresztül (VDR) fejti ki hatását a gén-transzkripcióra [144] [23] (lásd 1. ábra). VDR-t eddig több mint harminc különbözo szövetben írtak le [198]. A VDR N-terminálisa DNS-köto domainként cink-ujj mintázatot tartalmaz, míg a C-terminális rész a ligand (a calcitriol) kötodéséért felelos. A calcitriol a sejtbe jutva kötodik a VDR-hez, majd a VDR aktív formája a retinoid X receptorral (RXR)
10
heterodimert alkotva jön létre. Ezt követoen lehetové válik a genomhoz való kapcsolódás, megindul a transzkripció. A calcitriol azonnali hatásaiért genomon kívüli mechanizmusok felelosek, melyek közül a cGMP akkumulációja és a VDR reorganizáció megjelenése bizonyított. A magi VDR receptorok mellett Normann és mtsai feltétlezik, hogy az azonnali hatásokat a D-vitamin egy feltételezett, a plazmamembránban elhelyezkedo receptora közvetíti [133] [135]. Továbbra is kérdéses azonban, hogy ez a receptor mely szövetekben helyezkedik el. A D-vitamin endokrin rendszer felépítését és a különbözo VDR-ek szerepét az 1. ábrán foglaltam össze.
1.1.3. Egy nukleotidra kiterjedo génpolimorfizmusok (SNP) A teljes humán genom szekvenciájának megismerése nyomán nyilvánvalóvá vált, hogy az eredmény csak egyetlen egyed teljes génállományát tárja fel, az egyes emberek ettol jelentosen eltéro nukleotid-sorrenddel rendelkeznek. Az egy konkrét helyen elhelyezkedo, egy nukleotidra kiterjedo, a populációban legalább 1%-os elofordulási gyakoriságot eléro variációkat nevezzük „single nucleotide polymorphism” (SNP) -nak. Ezekbol ma 4,5 millió ismert, számuk a hatékony módszereknek köszönhetoen naponta 5- 10 ezerrel no. Várhatóan 10-15 millió lesz a teljes humán genomban lévo összes SNP-k száma. Ezeknek a polimorfizmusoknak nagy része nem kódoló területre esik. Mivel a meiózis során a crossing over nem random módon akárhol, hanem csak bizonyos helyeken fordul elo, ezért sok polimorfizmus egymással kapcsoltan fordul elo. Ez azonban nem jelenti feltétlenül, hogy a két polimorfizmus egymás mellett, vagy egy génen belül van, inkább egyes haplotípusokra, vagyis SNP-kombinációkra vonatkozik. Várható, hogy a linkage - nek köszönhetoen a 10-15 millió polimorfizmusból ki lehet majd szurni kb. 100-150 ezret, amelyeknek jelentosége lehet a különbözo betegségek kialakulása szempontjából.
11
1. ábra A D-vitamin - endokrin rendszer felépítése D3 vitamin máj
25(OH)D3
a vese mint endokrin szerv: 25(OH)D 3 24-a- hidroxiláz 1- a- hidroxiláz
extrarenális 1,25(OH) 2 D3 termelés
24,25(OH) 2D 3
1,25(OH) 2 D3 gyors
24,25(OH) 2D3 a keringésben
PTH
1,25(OH) 2D 3 a keringésben
magi 1,25(OH) 2D3 receptor (VDR)
további biológiai válaszok
visszacsatolás
feltételezett membránreceptorok (24,25(OH) 2D3 és 1,25(OH) 2D3 )
GENOMIKUS HATÁSOK
GYORS HATÁSOK lassú visszacsatolás
klasszikus célszervek: csont, bél, vese A szaggatott nyilak gátlást jelentenek.
1.1.4. A D-vitamin receptor gén polimorfizmusai
12
Ca2 + és Pi szint emelkedés
A D-vitamin receptor génjében eddig 5 olyan polimorfizmust azonosítottak, amelyek a VDR expresszióját befolyásolhatják. Elméletileg – figyelembe véve a polimorfizmusok általános suruségét az emberi genomban, valamint a VDR gén méretét – a VDR génjében még fel nem fedezett polimorfizmusok száma a 100-at is elérheti [180]. A VDR-ral dimereket alkotó RXR génjében eddig még nem írtak le funkcionális polimorfizmust. A VDR gén sematikus struktúráját, valamint az SNP helyeket a 2. ábrán mutatom be. A FokI SNP ("f") a második exonban található, eredményeként megváltozik a transzkripció iniciációs hely, és az "f" allélt hordozó egyénekben három aminosavval hosszabb VDR fehérjetermék készül a génrol [103] [122] [125]. A BsmI ("b"), az ApaI ("a") és a Tru9I ("u") polimorfizmusok intronokban helyezkednek el, azonban szekvenciaváltozások az intronokban befolyásolhatják a fehérje expresszióját. A TaqI polimorfizmus aminosavsorrend változással nem járó T / C szubsztitúció a kilencedik exon 1055-ös aminosavhelyén ("t" allél) [94] [139] [207]. A 3. ábrán összefoglaltam, hogy az egyes szervezeti szinteken milyen paramétereket befolyásolhatnak a VDR polimorfizmusok. A génbank szekvenciák tanulmányozása során kimutattam, hogy egy nagyobb, a BsmI polimorfizmust tartalmazó génszakasz a VDR génen belül repetitíven van jelen. Ezért PCRRFLP módszerrel nem lehet eldönteni, hogy heterozigóta egyénekben egy vagy ketto BsmI restrikciós hely van-e jelen. Sok korábbi közlemény a BsmI polimorfizmus ezen jellegzetességét nem említette az adatok interpretációja során [57] [112] [139] [169] [171].
13
2. Ábra A D-vitamin receptor génjének vázlatos felépítése
Polimorfizmus BsmI FokI @45123
BsmI @110658 ApaI Tru9I TaqI
VDR DNS 1A 1B 1C 2
C12q 3 4 5 6
7 8 9
3’-UTR
Az exonokat alul számokkal, az ismert restrikciós helyeket pedig felül jelöltem. [42] [54] [102] [111] [112] [117] [122]
A VDR génjének 3’ nem transzlált régiójában (3’ untranslated region: 3’-UTR) 13 további variációt írtak le, amelyek jórészt a poly(A) ismétlodések számában különböznek [180], ezeknek azonban nincs eddig kimutatott összefüggése a klinikai kórállapotokkal.
3. ábra A VDR polimorfizmusok lehetséges hatásai [180] Szint
VDR polimorfizmusok által befolyásolható paraméterek
?
mRNS
?
mennyiség, stabilitás, splicing, izoformák, transzláció
?
fehérje
?
mennyiség, stabilitás, izoformák, protein-protein interakció (pld. RXR)
?
transzkripciós aktivitás (VDRE kötodés)
?
sejt
?
sejtnövekedés gátlása, T-sejtek és makrofágok aktivitása
?
szervezet
?
szérumparaméterek (pl. PTH, osteocalcin, kalcium)
?
a D-vitamin hatásai
14
A VDR génjében a haplotípusok azonosítása még nem történt meg. A jelenleg vizsgált polimorfizmusok „anonymok”, vagyis nem rendelkeznek direkt hatással. Emiatt valószínuleg további – funkcionális jelentoséggel bíró – polimorfizmusokkal kapcsoltan fordulnak elo, amelyek a VDR génjében akárhol elhelyezkedhetnek [180].
1.1.4.1. VDR génpolimorfizmusok és a csontháztartás A D-vitaminnak kulcsfontosságú szerepe van a csontok normális kalcium- tartalmának fenntartásában, elsosorban a szérum kalcium-szint biztosításán keresztül. A D- vitamin receptor polimorfizmusok összefüggésben vannak mind a plazma calcitriol szinttel [140] [112], mind a vizeletbe való kalcium ürítéssel [136]. Ames és mtsai a FokI "FF" genotípus esetén "ff"-el szemben 41,5%-kal nagyobb kalcium-felszívódást mértek, ami 8,2%- kal nagyobb csont ásványianyag-tartalommal társult [5]. Dawson-Hughes és mtsai a BsmI "BB" variánsában alacsonyabb kalcium felszívódást mértek, mint a "bb" variáns esetén. Vizsgálataik szerint azonban ezt a különbséget magasabb kalcium-bevitellel csökkenteni lehetett [29]. A VDR polimorfizmusok ennek következtében összefügghetnek a csonttömeggel és a csontok ásványianyag tartalmával (BMD), amint azt több vizsgálat is bizonyította [40] [94] [104] [145] [168] [169]. A vizsgálatok az alábbi három klinikai következményt kutatták intenzíven: a csontnövekedés mértékét, a rachitis kialakulását és az osteoporosist. Lorentzon és mtsai a BsmI és a TaqI polimorfizmusok növekedésre kifejtett hatását vizsgálták [101] kaukázusi rasszhoz tartozó férfiakban. A "BB" genotípusúak születési hossza kisebb volt. Predikciós modelljük szerint a születési és prenatális hossz, a születési súly és a VDR polimorfimusok együtt a felnottkori magasságot 39%-ban befolyásolják, ahol a VDR polimorfizmusok izolált hatása 8% [101]. Minamitani és mtsai japán lányokban a TaqI polimorfizmus "Tt" genotípusában 4,4 cm-el magasabb növekedést találtak, mint a "TT" genotípussal rendelkezokben [122]. Más tanulmányok azonban [9] nem találtak összefüggést a VDR polimorfizmusok és a csontnövekedés között. Ferrari és mtsai a különbözo munkacsoportok eredményei közötti különbséget a környezeti faktorok figyelembevételével
15
magyarázták [39]: diétás kalciumfelvétel és kor szerint standardizálva mutattak ki összefüggést a BsmI polimorfizmus és a BMD között. Fischer és mtsai nigériai gyermekekben vizsgálták a rachitisre való hajlam összefüggéseit az ApaI, a TaqI, a BsmI és a FokI polimorfizmussal [42]. Eredményeik szerint a FokI "FF" alléllal rendelkezo gyermekekben körülbelül 10%- kal nagyobb valószínuséggel alakul ki rachitis csökkeno diétás kalciumbevitel alatt. A VDR polimorfizmusok és az osteoporosis kapcsolatát kiterjedten vizsgálták a nagy betegszámra való potenciális prognosztikai jelentoség felderítésére. Japán, fertilis korú nokön a "bbaaTT" haplotípus 9,3%-kal magasabb BMD-vel jár, mint a leggyakoribb "BbAATt" haplotípus [179]. Ötven év feletti alanyokban Gomez és mtsai a VDR polimorfizmusok és a csonttömeg-csökkenés között mutattak ki összefüggést nok esetén, de azonos korú férfiakon nem [50]. Gross és mtsai szintén postmenopausalis nokön a FokI és a medencecsonttömegcsökkenés között találtak összefüggést [54]. Egyes tanulmányok nemcsak a csonttömeg-csökkenést vizsgálták, hanem a klinikai következményeket is: Langdahl és mtsai a BsmI polimorfizmus és az osteoporotikus csonttörések elofordulása között találtak kapcsolatot [94]. Sheehan és mtsai ír felnottekben a TaqI "tt" és a FokI "ff" genotípusok esetén nagyobb csont-turnovert találtak, ami alacsony BMD-hez vezet, és növelheti az osteoporosisra való hajlamot [166]. További tanulmányaikban [167] a "tt" genotípus esetén magasabb osteocalcin szintet igazoltak szintén ír betegeken. A VDR polimorfizmusok és az osteoporosis kapcsolatát vizsgáló más vizsgálatok nem találtak összefüggést a BsmI polimorfizmussal [168], illetve megállapították, hogy a kalciumfelvétel és a szérum calcidiol (25(OH)-vitamin-D3) jelentosen befolyásolja a BsmI polimorfizmus hatásait [10]. Az ellentmondások feloldására Gong és mtsai 75, korábban az osteoporosissal foglalkozó cikk adatait dolgozták fel egy meta-analízisben [51]. Megállapították egyrészt, hogy a VDR polimorfizmusok a BMD-re rendkívül eros hatással vannak, másrészt felhívták a figyelmet, hogy a hatást a nem genetikai faktorok és a genetikai heterogenitás nagymértékben befolyásolják.
16
1.1.4.2. VDR gén-polimorfizmusok és a parathormon szintézis szabályozása Több VDR polimorfizmusról is leírták, hogy hatással van a szérum PTH szintre: Carling és mtsai [19] a "bb" az "aa" és a "TT" genotípusokban magasabb PTH szintet találtak. Lorentzon és mtsai az "Aa" genotípusban magasabb PTH és alacsonyabb osteocalcin szintet mértek [155]. Más szerzok azonban [24] a BsmI polimorfizmus "BB" genotípusa esetén mértek magasabb PTH szintet. A FokI polimorfizmus és a mellékpajzsmirigy-funkció között nem találtak összefüggést [25]. Összefüggést találtak a mellékpajzsmirigy kalcium-terhelésre adott válasza [207] és a kalcium-érzékelo fehérje, valamint a VDR polimorfizmusok között [20] [19] . Vesebetegségben a vezeto halálok a cardiovascularis morbiditás [12], amelyben szerepet játszik az emelkedett foszfát szint is. A hyperfoszfatémia fokozott arteria coronaria és szívbillentyu-meszesedéshez [151], arritmia-hajlamhoz, vezetési zavarokhoz [157], myocardialis fibrosishoz [99] és más szövetek calcificatiojához vezet [88]. A hiperfoszfatémia gátolja a 25(OH)-vitamin D3 átalakulását aktív kalcitriollá [146]. A csökkent kalcitriol és a magasabb foszfor szintek a D-vitamin - PTH feedback mechanizmus zavarához, a mellékpajzsmirigy proliferációjához és a PTH szekréció fokozódásához vezetnek, végül másodlagos hiperparathyreosis alakul ki. A VDR polimorfizmusok prognosztikai szerepe vesebetegeknél a legjelentosebb, mivel a vesefunkció beszukülése foszfátretencióhoz is vezet. Bár primer hyperparathyreosisban a mellékpajzsmirigy funkciója és a VDR polimorfizmusok között egyértelmu összefüggést találtak [169], a végstádiumú vesebetegekben (ESRD) végzett kutatások alapján ellentmondásos a BsmI polimorfizmus és a PTH szintézis kapcsolata. Míg Chudek és mtsai a BsmI és a hyperparathyreosis között [24], mások éppen a hypoparathyreosissal figyeltek meg korrelációt. Fernandez és mtsai a "BB" genotípussal rendelkezo betegekben alacsonyabb iPTH szintet mértek [37]. Yokoyama és mtsai az ApaI fontosságát hangsúlyozták a BsmI-el szemben ESRD páciensekben [208]. Vizsgálataikban az "aa" genotípus és a PTH válasz között találtak összefüggést. Nemrég Marco és mtsai összefüggést mutattak ki a dialízis kezelésben részesülo betegek túlélése és a BsmI polimorfizmus között. Ok a FokI polimorfizmust is vizsgálták, de nem találtak kapcsolatot a klinikai paraméterekkel [111].
17
1.1.4.3. VDR gén-polimorfizmusok és az immunrendszer A D-vitamin fontos immunmoduláló hatásokkal is rendelkezik. Eddig kimutatták, hogy csökkenti a limfocita aktivációt, proliferációt és a citokin produkciót, bár a pontos hatásmechanizmus még nem ismert [178]. Idos emberekben és urémiás betegeknél a kalcitriol immunrendszert stimuláló hatását írták le. Az aktivált makrofágok által termelt D-vitamin egy negatív-feedback mechanizmus részeként szabályozhatja a gyulladást [62]. Nemcsak az alacsony D-vitamin szint, illetve bizonyos VDR allélok és a mycobacteriális fertozés között mutattak ki összefüggést, hanem akkor is javult az antitest- mediálta immunitás, amikor a Dvitamint oltások során adjuvánsként alkalmazták [62]. Mindezek arra is utalnak, hogy a Dvitamin-VDR komplex transzkripciós aktivitása a CD4+ T-helper sejtek által irányított sejtes immunválaszban is szerepet játszhat [62]. A VDR polimorfizmusok kapcsolatát kimutatták Graves betegséggel [7]. Két magyar tanulmányban [57] [89] a VDR polimorfizmusok és a primer biliáris cirrhosis (PBC) között találtak kapcsolatot. PBC-ben a celluláris és a humorális immunitás zavarai együtt lépnek fel csökkent T-suppressor sejt funkció, IgM és IgG emelkedés, - és vezetnek a kis intrahepaticus epeutak gyulladásához, majd az epeutak pusztulása után a cirrhosishoz.
1.1.4.4. VDR gén-polimorfizmusok és a rosszindulatú daganatok A VDR polimorfizmusok szerepét kutató kiterjedt tumorgenetikai vizsgálatok során Hamasaki és mtsai japán férfiakban a TaqI polimorfizmus és a prosztatarák, valamint a benignus prosztata hiperplázia között mutattak ki összefüggést [58]. Egy német kutatócsoport nemcsak a TaqI-el, de a FokI-el is talált kapcsolatot [26]. Kim és mtsai a colorectalis adenomáknak a BsmI polimorfizmus "BB" genotípusával járó csökkent rizikóját írták le [83]. Speer és mtsai magyarországi kutatásai az erbB-/HER- 2 oncogének expressziójával, valamint a végbélrák prognózisával mutattak ki összefüggést [171]. Eközben más vizsgálatok [143] nem találtak összefüggést a colorectalis adenomák elofordulása és a FokI polimorfizmus jelenléte között.
18
Ingles és mtsai [77] az emlorák és a BsmI és a FokI polimorfizmus között mutattak ki összefüggést. Egy másik vizsgálatban az ApaI és a TaqI szerepét emelik ki a FokI-el szemben [28]. Egy olasz kutatócsoport a BsmI polimorfizmus "bb" genotípus ában négyszer nagyobb valószínuséggel talált emlorákos betegekben metasztázist, mint a "BB" genotípusban [158].
1.1.4.5. VDR gén-polimorfizmusok és az autoimmun diabétesz A Diabetes Epidemiology Research International Group vizsgálatai során 22 országból 50 millió gyermeket vizsgáltak meg 1978 és 1980 között [31]. Fordított összefüggést találtak az egyes típusú diabetes (T1DM) és az éves napsütéses órák száma között: az egyenlítotol távolodva fokozatosan nott a T1DM elofordulása. Hasonló földrajzi eloszlást figyeltek meg két másik autoimmun betegség – a reumatoid arthritis és a multiplex sclerosis – esetén is. Három további populációvizsgálatban tanulmányozták a csecsemokori D-vitamin-adás és a T1DM kapcsolatát. Az EURODIAB [35] vizsgálatban az élet elso évében adott Dvitamin és a 15 éves korig kialakuló T1DM közötti kapcsolatot vizsgálták 820 T1DM-es betegben és 2335 kontrollban. A szerzok azon gyermekek között, akik D- vitamin pótlásban részesültek, alacsonyabb T1DM prevalenciát találtak. A Stene és mtsai által közölt második tanulmányban [172] az anya által a terhesség során fogyasztott tokehalmáj-olaj és a 15 éves korig kialakuló T1DM között mutattak ki fordított összefüggést norvég gyermekekben. Ezekben a vizsgálatokban azonban nem mérték a kapott D- vitamin mennyiségét. A harmadik vizsgálatba 10821 gyermeket vontak be Finnországban [76]. A protokollok változása miatt Finnországban 1964 és 1975 között folyamatosan csökkent az ajánlott D-vitamin mennyisége. A szerzok a kapott napi D- vitamin mennyisége alapján három csoportba osztották a gyermekeket (alacsony<2000 IU, közepes ~2000 IU és magas>2000IU). Fordított összefüggést találtak nemcsak a D-vitamin-adás gyakorisága, hanem a kapott D-vitamin mennyisége és a 30 éves kor elott kialakuló T1DM kockázata között is. A több mint 20 év alatt kifejlesztett nem-obes diabéteszes (NOD) egérmodellben az egerekben kialakuló diabétesz oka a pancreas béta-sejtek T-sejt mediált autoimmun pusztulása. Az emberi betegségre jellemzo keringo autoantitestek és a leukocita-infiltráció (insulitis) is jelen van ezekben az egerekben. A diabétes tünetei, így a polidipszia, poliuria és a
19
súlyvesztés kizárólag külso inzulin adásával védheto ki. Mathieu és mtsai 1992-ben írták le eloször [114], hogy 1,25(OH)2 D3- al sikerült az insulitis kialakulását gátolni: míg a kezeletlen egerek 75%-ában 100 napos kor elérése elott kialakul, addig a D- vitamin- kezelteknek erre a korra mindössze 42%-a betegszik meg. További vizsgálataikban nemcsak a D-vitamint, de hiperkalcémiát
nem
okozó
analógját,
az
1,25(OH)2-20-epi-22-oxa-24,26,27-
triszhomovitamin D (KH1060)-t is vizsgálták [115]. A KH1060 dózisának 0,4? g/kg-ra való emelésével végül a diabetes kialakulását 11%-ra tudták csökkenteni [116]. Zella és mtsai [196] NOD egerekben a T1DM kialakulását 100%-osan meg tudták akadályozni, amikor az orálisan kapott napi 50ng D-vitamin adagot rögtön a szoptatás végétol alkalmazták. Továbbra is kérdés, hogy mely D-vitamin koncentrációk szükségesek a T1DM megelozéséhez. A jelenlegi amerikai ajánlás (5-25? g/nap) felso értéke például a finnországi vizsgálatban hatásosnak talált mennyiségnek mindössze a fele [61]. Ezen alacsonyabb dózisok hatásosságát eddig nem sikerült bebizonyítani. Fennáll a lehetoség, hogy a különbözö VDR genotípusok különbözo D-vitamin koncentrációk esetén vezethetnek fokozott, vagy csökkent rizikóhoz. Egyes feltételezések szerint a D-vitamin módosíthatja a pancreas ß sejtek immunmediált pusztulását. Intervenciós vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy a D-vitamin adás javítja a glükóz-homeosztázist cukorbetegekben [198]. Az eredményeket az is alátámasztja, hogy állatkísérletes és humán vizsgálati eredmények szerint a D- vitamin hiány az inzulin elválasztást rontja, amely hatás D-vitamin adásával reverzibilis [15] [16] [134]. In vitro a D vitamin immunszuppresszív hatással rendelkezik, redukálja a limfocita aktivációt, proliferációt és citokin produkciót [160] [178], így befolyásolhatja a pancreas ß-sejtek immun-mediált pusztulását is. A pancreas ß- sejtek aktív VDR-t expresszálnak, igazolva a D vitamin közvetlen hatását a sejtekre [95]. A VDR polimorfizmusok hatással vannak az inzulin-elválasztásra [68]. A kettes típusú diabetes (T2DM) és a BsmI polimorfizmus között mutattak ki összefüggést [170], bár egy másik tanulmány [203] nem talált korrelációt a T2DM és a BsmI, ApaI és a Tru9I VDR polimorfizmusok között.
20
A T1DM-re való hajlam és a BsmI, ApaI, valamint a TaqI polimorfizmusok kombinációi között találtak összefüggést európai német [139] és ázsiai indiai [117], illetve tajwani [22] populációkban. Pani és mtsai eredményei szerint az "At", a "Bt" és a "BAt" növelték a T1DM rizikóját, míg az "AT" és az "at" csökkentették. [139]. Ban és mtsai [8] japán populációban találtak kapcsolatot a FokI és a T1DM rizikója között. Továbbra sem tisztázott azonban, hogy a VDR polimorfizmusok milyen mértékben járulnak hozzá a T1DM kialakulásához, illetve, hogy az egyes allélok mekkora rizikót jelentenek. 1.2. A Hardy-Weinberg equilibrium Az elmúlt években a génpolimorfizmus vizsgálatokkal foglalkozó tudományos közlemények száma ugrásszeruen megnott. Sok vizsgálatban azonban egymással akár teljesen ellentétes eredményt találtak. Ennek a hátterében a genotipizálás során fellépo technikai hiba, a statisztikai feldolgozás során fellépo értékelési hiba, vagy a vizsgálati anyag különbözo megválasztása állhat. Egy gyakran fellépo általános statisztikai hiba a Hardy-Weinberg szabály vizsgálatának elhagyása. "A Mendeli öröklodés lehetové teszi a fenotípusvariációk fennmaradását a populációban, és a genetikai folyamatok önmagukban Mendeli öröklodés során nem vezetnek a populációban a génfrekvenciák változásához"- ezen elméletet Hardy és Weinberg egymástól függetlenül publikálták 1908-ban [60] [187]. A Hardy-Weinberg szabály [173] egy olyan matematikai állítás, amely a génfrekvenciák és a genotípusfrekvenciák kapcsolatát írja le. Egy véletlenszeruen párosodó diploid populációban a génfrekvenciák és genotípus frekvenciák generációról generációra nem változnak, ha a párosodás véletlenszeru, és mutáció, szelekció (valamely genotípus több utódot hagy, mint egy másik genotípus, ennek oka vagy a szaporodás vagy az életesélyek javulása lehet) és migráció (egyedek mozgása egyébként izolált populációk között), valamint az úgyne vezett random drift (egy gén elofordulásának véletlenszeru változása a populációban, jellegzetes példája, amikor az alanyok egy csoportja valamilyen természeti akadály révén szeparálódik a populáció többi tagjától) nem jelentkezik. A szabály a populációgenetika egyik alappillére, amely megközelítloleg igaz egy kis létszámú populációra, és a populáció méretének növekedésével no a pontossága. Amennyiben a
21
frekvenciák valamilyen oknál fogva megváltoznak, a várt equilibrium egyetlen generációnyi véletlen párosodás során helyreáll. A Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) számolása lehetové teszi a panmixia és az evolúciós
állandóság
bizonyítását,
valamint
képviseli
a
null
hipotézist,
amihez
populációgenetikai vizsgálatokban a genotípus frekvenciákat viszonyítani kell. A HW törvény alapján ki lehet számitani, hogy mennyi heterozigóta lesz a populációban (lásd 4. ábra). Ha egy allél gyakori, akkor a genotípusok eloszlása a megfelelo homozigóta variáns javára eltolódik.
4. ábra Az allél- és a génfrekvenciák közötti kapcsolat a populációban a Hardy-Weinberg törvény alapján
1 AA
BB
0,8 genotipus- 0,6 frekvencia 0,4
AB
0,2 0 0
0,2
0,4 0,6 allélfrekvencia
0,8
1
A HWE egy génen belül több lokuszban való vizsgálata teszi lehetové, hogy egy bonyolult betegség esetén az oki polimorfizmust a betegség hátterében megtaláljuk. Ez az egyes gének közötti, linkage disequilibrium által létrehozott eltérés azonban csak heterogén genetikai hátteru betegségek esetén jöhet létre. A kettonél több alléllal rendelkezo polimorfizmusok esetén a
22
HWE-tol való eltérés nem feltétlenül bizonyíték a polimorfizmus és a betegség közötti kapcsolatra, ezért ebben az esetben a HWE számolása sem indokolt [132].
1.3. Linkage disequilibrium génpolimorfizmusok között Egy polimorfizmusnak önmagában nem biztos, hogy van szerepe egy adott kórkép kialakulásában. Sok polimorfizmus kapcsoltságban (linkage disequilibriumban - LD) áll egy vagy több másik polimorfizmussal. A több allél által alkotott haplotípusok általában jelentos biológiai hatással rendelkeznek. Az LPL génjében például több tanulmány [131] [154] is LD szigeteket mutatott ki, ahol az egymással kapcsoltságban elhelyezkedo polimorfizmusok koncentrálódnak. Ennek elonye, hogy a haplotípusok azonosítása után már csak néhány polimorfizmust kell vizsgálni, hogy megadjuk az egyed “genetikai ujjlenyomatát”. Azonban az, hogy a kapcsolt allélok közül ki tudjuk választani a valóban oki tényezot, további funkcionális vizsgálatokat igényel.
5. ábra Az eloszló haplotípusok jelentosége egy képzeletbeli gén esetén
gén:
promoter
kódoló terület
allélok:
+/ -
+/-
+ /-
A
B
1: - / - / -
3: - / - / +
2: + / + / +
4: + / + / -
11
33333
22222222
44444
alany
3’-UTR
haplotípusok:
mRNS
Három SNP kombináció két alanyban, akik mindketten heterozigóták mindhárom polimorfizmusra, azonban két különbözo haplotípussal rendelkeznek. A „+” egy pozitív
23
hatású (pld. sok mRNS képzodik), míg a „-” negatív hatású allélt jelöl. A promoter terület szabályozza a termelést, míg a 3’-UTR terület szabályozza a stabilitást. Az „A” alanynak kevesebb lehet az adott fehérjébol, mint a „B” alanynak. Mindezt egyetlen genotípus vizsgálatával nem lehetne kimutatni.
Az 5. ábrán egy képzeletbeli gén szerkezete látható, amely rendelkezik promoter, kódoló és egy 3’-UTR területtel. A promoter és a 3’-UTR terület befolyásolhatják az mRNS szintjét (a produkciót, illetve a stabilitást), a kettojük interakciója pedig befolyásolja a fehérjekészítéshez rendelkezésre álló mRNS mennyiségét. Az 5. ábrán csak egy bizonyos allélkombináció teszi lehetové a biztosan elegendo fehérje szintézisét. Fontos kiemelnem, hogy itt az egyes genotípusokban nincsen különbség, minden hatásért kizárólag a haplotípusok a felelosek.
24
2. Célkituzések
1. VDR polimorfizmusok az egyes típusú diabetes pathogenesisében A VDR polimorfizmusok szerepe a fiatalkori diabétesz pathogenezisében nem tisztázott. A Tru9I polimorfizmus és T1DM kapcsolatát eddig egyáltalán nem vizsgálták. Eközben endokrinológiai vizsgálatok arra utalnak, hogy a D-vitamin nagydózisú adásával a T1DM rizikóját nagymértékben csökkenteni lehet. Vizsgálataim során ezért célul tuztem ki az öt VDR polimorfizmus prevalenciájának, prognosztikai szerepének és klinikai paraméterekkel (HbAIc, diabétesz kezdete, BMI, mikoralbuminuria) való kapcsolatának vizsgálatát egyes típusú diabéteszes gyermekekben.
2. VDR polimorfizmusok és a dializált betegek szövodményei A D-vitamin receptornak (VDR) a kalcitrol hatásának közvetítése miatt központi szerepe van a PTH szintézis irányításában. Dializált betegekben ellentmondásos adatok jelentek meg a VDR polimorfizmusok lehetséges hatásairól. Emellett jelenleg még nincsenek adatok az újabban felfedezett Tru9I és TaqI polimorfizmusok mellékpajzsmirigyre gyakorolt hatásáról. Vizsgálataim során célul tuztem ki az öt VDR polimorfizmus prevalenciájának, hatásainak és a mellékpajzsmirigy funkcióval való kapcsolatának vizsgáltát hemodializált vesebetegekben.
3. Hardy-Weinberg equilibrium mint null-hipotézis Mendeli öröklodésu genetikai polimorfizmusokat vizsgáló populációgenetikai vizsgálatok esetén mindig ellenorizni kell, hogy a Hardy-Weinberg feltétel teljesül-e. Tapasztalataim alapján azonban számos szakcikkben nem közlik a HWE számolás eredményeit. Célul tuztem ki annak a vizsgálatát, hogy tudományos közleményekben a kontroll
25
csoportban a Hardy-Weinberg feltétel vizsgálatának elmaradása milyen mértékben kérdojelezi meg az eredményeket, illetve, hogy ez hogyan befolyásolja az adott vizsgálat konkluzióit.
4.
Hardy-Weinberg
equilibrium
jelentosége
a
betegség
- genotípus
kapcsolatban Amennyiben a Hardy-Weinberg equilibrium nem teljesül az adott betegcsoportban, a genotípus kapcsolatban van a betegséggel. Célul tuztem ki annak vizsgálatát, hogy a HWE számításának elmaradása a bi-allélikus, Mendeli öröklodésü polimorfizmusok esetén milyen mértékben befolyásolja a helyes összefüggések kimutatását.
26
3. Módszerek 3.1. Betegcsoportok a genotípus vizsgálatokhoz 3.1.1. Diabéteszes betegek A T1DM vizsgálatához a Semmelweis Egyetem I- es Gyermekklinikájára járó 107 gyermektol (57 fiú/50 lány) vettünk mintát. A betegek már legalább öt éve diabéteszesek voltak. Valamennyi beteg ICA autoantitest pozitív volt (JDF egység >10). A diabetes kezdetekor a betegek életkora 1 és 14 év között mozgott, az átlag 5,8±3,2 év volt. Az átlagos BMI 17±2,3 kg/m2 volt. A BMI értékeket a korspecifikus percentilis görbékhez viszonyítva valamennyi gyermek a 25-75 percentilis tartományban volt. Mikroalbuminuria a betegek 34%ában fordult elo, a szérum HbAIc szint 7,87±1,05 volt. A fiúk és a lányok között nem voltak különbségek.
3.1.2. Dializált betegek A dializált betegek vizsgálatába 99 (57 férfi/42 no), a budapesti Bajcsy-Zsilinszky kórházban dializált vesebeteget vontunk be. A betegeket Haemophan membránnal (Gambro, Svédország) dializálták heti három alkalommal négy órán át. Az ESRD okai voltak: diabetikus glomerulopáthia (n=17), pyelonephritis (n=13), glomerulonephritis (n=15), polycisztás vesebetegség (n=14), vaszkuláris vesebetegség (n=17) és egyebek (n=23). A dialízis kezdetekor a kor 56±14 év volt. A betegek átlagos BMI értéke 25,0±4,3 kg/m2 volt. A betegek calcitriol ellátottsága a PTH szinttol függo volt, a terápia során a kóros értéket meghaladó betegek heti három alkalommal 0,5 µg kalcitriol kezelést kaptak. A mintagyujtés kezdetén a betegek tájékoztatás után írásbeli beleegyezésüket adták a minták diagnosztikus és tudományos célú felhasználásához. Az adatfeldolgozás során minden minta egy háromjegyu kódot kapott, a további analízisek során ezt használtam, a beteg nevének
említése
nélkül.
Egy
független
vizsgálatsorozatokat.
27
intézeti
etikai
bizottság
jóváhagyta
a
3.1.3. Kontroll csoportok A genetikai variánsok prevalenciájához a kontroll értéket 183 egészséges véradó mintája szolgáltatta (98 férfi és 85 no). Valamennyi beteg és kontroll magyar állampolgár, valamint budapesti vagy Pest megyei lakos volt.
3.2. Genotipizálás 3.2.1. DNS izolálás A vért EDTA-K3 csövekben gyujtöttük, és -20°C-on tartottuk a DNS izolálásáig. A DNS- t standard proteináz K emésztés, fenol-kloroform extrakció és ethanol precipitáció segítségével izoláltuk [121].
3.2.2. PCR protokoll A DNS-t standard PCR technikával amplifikáltam. A 4 perces 94 °C fokos kezdo denaturálás után a mintákat 35 cikluson át sokszorosítottam, amely ciklusok 30 másodperces 94 fokos denaturálásból, 30 másodperces annealingbol (a homérsékleteket lásd lent) és 30 másodperces 72 fokos extenziós fázisból álltak. Egy 4 perces 72 fokos szakasz volt a program végso lépése. A restrikciós endonukleázokkal való emésztés után a végterméket 0,4 mg/L ethidium bromidot tartalmazó 2%-os agaróz gélen futtattam meg. A polimorfizmusokat UV fénnyel való megvilágítás alatti fotóval dokumentáltam. Az emésztés hatásfokának ellenorzését egy belso kontrollal végeztem. Akey és mtsai véletlenszeru tesztek segítségével bebizonyították [3], hogy már néhány százalékos genotipizálási hiba is drámai következményekkel járhat az asszociációs vagy kapcsoltsági vizsgálatok eredményére. Ezért egy véletlenszeruen kiválasztott csoportot (a minták kb 10%- át) ismételten is megmértünk, hogy ellenorizzük a méréseket. Nagybetuvel jelöltük a hasítóhely jelenlétét, kisbetuvel a hiányát. Az egyes allélokat a restrikciós endonukleázok elso betujével jelöltük, kivéve a Tru9Iet, ahol „u”-t használtunk.
28
3.2.3. Fok I polimorfizmus Az egyik primer szekvenciája: 5-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT3, a második primer szekvenciája: 5-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC- 3 [122] volt, a primer kapcsolódási homérséklet 60°C. Öt egység Fok I restrikciós endonukleázt (Promega Corp., Madison, WI, USA) és 1,5 µl buffert adtam 10 µl PCR termékhez. Az emésztés 37°C-on, egy éjszakán át zajlott. A FokI allélokat „F”-el és „f”-el jelöltem (lásd 6.ábra).
6. ábra. A FokI restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni inverz képe. A mintáknak megfelelo genotípust a megfelelo betukombinációval jelöltem, ahol a kisbetu a restrikciós hely jelenlétét, a nagybetu pedig hiányát jelöli.
29
A felsokszorozott szakasz a Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) AC004466 -es accession jelu [128] szekvencia 11963-as pozíciójánál kezdodik, a hossza 265 bázispár. A FokI enzim a 12019-es pozíciónál kötodik (GGATG(N)9^).
3.2.4. Apa I és Taq I polimorfizmusok
7. ábra. Az ApaI restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni inverz képe. A mintáknak megfelelo genotípust a megfelelo betukombinációval jelöltem, ahol a kisbetu a restrikciós hely jelenlétét, a nagybetu pedig hiányát jelöli.
30
Az Apa I és a Taq I polimorfizmusok detektálására két közös primert használtam: 5CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA- 3 és 5-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3. A primerek kapcsolódási homérséklete 70°C volt. Az Apa I- el (GGGCC^C, F. Hoffmann- La Roche Inc., Nutley, New Jersey, USA) való emésztés során 10 egység enzimet adtam 10µl PCR termékhez, majd 4 órán át 30°C-on inkubáltam a keveréket. Az Apa I allélokat "A"-val és "a"-val jelöltem (lásd 7.ábra). A Taq I enzimbol (T^CGA, MBI Fermentas Inc., St.Leon-Rot, Germany) 3 egységet adtam a PCR termékhez, majd 4 órán át 65°C- on inkubáltam a keveréket [155]. A Taq I allélokat „T”- vel és „t”-vel jelöltem (lásd 8.ábra). A 740 bázispár hosszú amplifikált szekvencia AC004466-es Genbank bejegyzés 111403-as pozíciójánál kezdodik, és a 112143-s pozíciónál végzodik. Apa I- es emésztés
31
után egy 530 és egy 210 bázispár hosszú szakasz keletkezik. A Taq I két kötohellyel is rendelkezik, az egyik egy 495 és 245 bázispár hosszú fragmenst hoz létre, a másik –amelyik az SNP helyen van- hatására a 495-ös szakasz tovább bomlik egy 290 és egy 205 bázispár hosszú szakaszra.
8. ábra. A TaqI restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni inverz képe. A mintáknak megfelelo genotípust a megfelelo betukombinációval jelöltem, ahol a kisbetu a restrikciós hely jelenlétét, a nagybetu pedig hiányát jelöli.
3.2.5. Bsm I polimorfizmus Az egyik primer szekvenciája: 5-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3, a második primer szekvenciája: 5-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3 volt, a primer kapcsolódási homérséklet 65°C volt. Öt egység Bsm I restrikciós endonukleázzal (GAATGCN^, Qbiogene Inc., Heidelberg, Germany) emészttettem 65°C-on 4 órán át [169]. A Bsm I allélokat „B”-vel és „b”-vel jelöltem (lásd 9.ábra). A felsokszorozott szakasz a AC004466-es Genbank bejegyzés 45007-es és 45198as illetve a 110543-as és a 110734- es pozíciói között található. A teljes mérete 191 bázispár, sikeres emésztés után egy 115-ös és egy 76-os fragmens keletkezik. Az egyik BsmI vágóhely (GAACTGgg^) a 45123-as, a másik a 110658-as pozíciónál van.
32
9. ábra. A BsmI restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni inverz képe. A mintáknak megfelelo genotípust a megfelelo betukombinációval jelöltem, ahol a kisbetu a restrikciós hely jelenlétét, a nagybetu pedig hiányát jelöli.
3.2.6. Tru9 I polimorfizmus Az egyik primer szekvenciája: 5-TGA GGT TTC TTG CGG GCA GGG TA-3, a második primer szekvenciája: 5-CAG GGC CGC CCC TCT TTG GA-3 volt, a primer kapcsolódási homérséklet 72°C volt. Öt egység Tru9 I restrikciós endonukleázzal (Promega Corp., Madison, WI, USA) emésztettem 65°C-on 4 órán át. A primereket a Primer3 software (http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html) segítségével terveztem a AC004466-as Genbank szekvenciára [128] [186]. A felsokszorozott szakasz 212 bázispár hosszú, és a 90260-as pozíciónál kezdodik. A Tru9 I allélokat „U”-val és „u”val jelöltem (lásd 10.ábra).
33
10. ábra. A Tru9I restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni inverz képe. A mintáknak megfelelo genotípust a megfelelo betukombinációval jelöltem, ahol a kisbetu a restrikciós hely jelenlétét, a nagybetu pedig hiányát jelöli.
3.3. Vesebetegek PTH szintjének meghatározása A genotipizáláshoz a vérmintát a többi laborparamé ter meghatározásához levett vérrel egyidejuleg, 1999 és 2002 között négyhavonta gyujtöttük. Az emberi intakt PTH meghatározásához a szendvics-immunlumineszcenciás immunanalitikai módszert használtuk [11], a módszer szenzitivitása 0.5 pmol/L. Átlagosan 6 (5-7) alkalommal mértük meg ezt a paramétert minden betegnél. A mérések átlagát viszonyítottam a genotípushoz. A PTH értékek alapján a betegeket három csoportba osztottam: alacsony (<12 pmol/L), közepes (12 és 60 pmol/L között) és magas Ipth (>60 pmol/L) csoportok [37]. (Laboratóriumunkban az egészséges kontrollérték 5,6 pmol/L alatti). A szérum foszfor, kalcium és egyéb rutin laboratóriumi paramétereket egy Hitachi 712 klinikai kémiai automatával határoztuk meg. 3.4. Adatgyujtési módszerek a Hardy-Weinberg equilibrium meghatározásához Az egyes folyóiratokból eloször kigyujtöttük az 1998 és 2003 májusa között megjelent, a genetikai polimorfizmusok pathogenetikai szerepét vizsgáló cikkeket. Ezek közül azon cikkeket választottuk ki, amelyek bi-allélikus, Mendeli öröklodésu génpolimorfizmusokat vizsgáltak. További feltétel volt a rendelkezésre álló genotípus eloszlási adat. A polimorfizmusok adatainak kigyujtése mellett azt is ellenoriztük, hogy a szerzok számoltak-e HWE-t. Vizsgálataim során tíz különbözo szakterületet reprezentáló, az adott területen vezeto
34
lapban (a „Gut ", a „Diabetes“, a „Stroke”, a „Journal of Investigative Dermatology”, a „Neurology”, a „Critical Care Medicicne”, a „Kidney International”, az „Atherosclerosis”, a „Human Molecular Genetics” és a „Journal of Human Genetics”) ellenoriztem az 1998 és 2003 közötti cikkekben, hogy a vizsgált polimorfizmusok teljesítik- e a HW feltételt. A „Gut” és a „Journal of Investigative Dermatology”-ból kiválasztott tizennégy cikkben részletesen elemeztem, hogy a megjelent, az eredmények alapján levonható következtetéseket hogyan módosítja az, ha a HW-értéket minden szubpopulációra kiszámolták volna a szerzok.
3.5. A Hardy-Weinberg equilibrium számítása A Hardy-Weinberg szabály alapján várható genotípus eloszlást a párosodási táblával lehet kiszámolni, amelyen a párosodások során keletkezett új génfrekvenciák lehetséges variációit kombináljuk. Feltetélezzük, hogy a szülok genotípusainak frekvenciája: P (=AA)+Q (=AB)+R (=BB) =1,0, valamint "a" az egyik allél prevalenciája: a=AA+0.5×AB, és "b"a másik allél prevalenciája: b=BB+0.5×AB. Ebben a konstellációban a párosodási frekvenciák: P2+2PQ+2PR+Q2+2QR+R 2 = (P+Q+R)2 =1 A lehetséges kombinációk prevalenciája: AA:
P2+0.5PQ+0.5PQ+0.25Q2 = (P+0.5Q)×(P+0.5Q) = (a)×(a) = a2
AB:
0.5PQ+PR+0.5PQ+0.5Q 2+0.5QR+PR+0.5RQ = PQ+2PR+0.5Q2 +QR = 2(0.5PQ+PR+0.25Q2+0.5QR) = 2(P+0.5Q)×(0.5Q+R) = 2(a)×(b) = 2ab
BB:
0.25Q2+0.5QR+0.5QR+R 2 = (0.5Q+R)×(0.5Q+R) = (b)×(b) = b 2
35
összesen tehát: a2 +2ab+b2=1.
P P P Q Q Q R R R
generáció 0. férfi no AA P AA AA Q AB AA R BB AB P AA AB Q AB AB R BB BB P AA BB Q AB BB R BB összesen:
párosodási frekvencia P2 PQ PR QP Q2 QR RP RQ R2 (P+Q+R)2
AA P2 0.5PQ 0.5PQ 0.25Q2
a2
generáció 1. AB BB 0.5PQ PR 0.5PQ 0.5Q2 0.5QR RP 0.5RQ 2ab
0.25Q2 0.5QR 0.5RQ R2 b2
A fentiek alapján a genotípusszámitások során a várható genotípus eloszlást a következo képletekkel számoltam ki:
AAvárt = ((AA mért +AB mért /2)/n)*((AAmért+ABmért/2)/n)*n, BBvárt = ((BBmért+ABmért/2)/n)*((BBmért +ABmért /2)/n)*n, ABvárt = n- (AAvárt+BBvárt),
ahol n = AAmért+ABmért+BBmért , tehát az összes mérés összege. Második lépésként a várt és a mért genotípus eloszlásokat hasonlítottam össze:
x = (AAmért -AAvárt)*(AA mért -AAvárt )/AAvárt +(AB mért-ABvárt)*(ABmért -ABvárt /ABvárt +(BBmértBBvárt )*(BBmért -BBvárt )/BBvárt.
36
Amennyiben x értéke 3.84- nál magasabb volt (ami a chi-négyzet tesztben az 1-es szabadságfok mellett a p=0,05-ös értéknek felel meg), a különbséget szignfikánsnak fogadtam el. A chi- négyzet teszten alapuló módszer azonban kis n esetén nem alkalmas a p pontos meghatározására, ezért azon SNP- k esetén, ahol a különbséget szignifikánsnak találtam, a p értékét az Arlequin szoftware-vel [162] számoltam ki, amely a számításhoz a Guo és Thomson által kidolgozott módszert [56] használja. Ez a Fisher-teszt analógja, azonban a 2x2-es kontingenciatáblát egy tetszoleges számú sorból álló hármas kontingenciatáblára egészítették ki. A módszer kis esetszám esetén is alkalmas a Hardy- Weinberg egyensúlytól való eltérés pontos mérésére. A táblázatokban csak azokat a polimorfizmusokat foglaltam össze, ahol szignifikáns eltérést találtam a várt és mért genotípus eloszlások között.
3.6. A standardizált linkage disequilibrium koefficiens számitása A LD számitásához az Arlequin szoftware- t használtam. A két allél közötti véletlenszeru asszociációtól való eltérésre jellemzo klasszikus LD koefficiens- t a következo képlettel számoltam: Dij=Pij -Pi*Pj, ahol Pij azon haplotípusok elofordulásának frekvenciája, ahol az i allél az elso helyen van, j allél pedig a másodikon, P i és Pj pedig az i és j allélok frekvenciáját jelölik. A standardizált LD koefficiens a klasszikus LD koefficiens maximum felveheto értéke (D ij, max
) alapján standardizált: D’=Dij /Dij,max
ahol Dij, max a következo értékek egyikét veheti fel: min(Pi Pj,(1-Pi)(1- Pj )), ha a Dij <0 min((1-Pi)*Pj, P i *(1- Pj )), ha Dij>0.
37
Az standardizált LD koefficiens számítását bemutatom egy példán. Tételezzük fel, hogy két polimorfizmus alléljainak elofordulása: lokusz 1 lokusz 2
0
1
összesen
0
11
15
26
1
9
65
74
20
80
100
összesen
Ebben az esetben a klasszikus LD koefficiens: D=0.65-0.8*0.74=0.058 D értéke pozitív, ezért a D ij, max = min(0.208, 0.148) Így a D’ értéke: D’=0.058/0.148=0.392
3.7. Statisztikai analízis Hardy-Weinberg equilibriumot számoltam az allélfrekvenciák és a genotípus frekvenciák kapcsolatának vizsgálatához [56]. Chi- négyzet és Fisher egzakt teszt segítségével hasonlítottam össze a génpolimorfizmusok prevalenciáját az egyes csoportokban. ANOVA teszt segítségével hasonlítottam össze a folyamatos változókat. Az allél prevalenciát az „y”=(AA+AB/2)/(AA+AB+BB) képlettel számoltam. A kapcsoltsági és disztribuciós számításokhoz az Arlequin softwaret (http://anthropologie.unige.ch/arlequin/) használtam [162]. A statisztikai szignifikanciát p<0,05-nél állapítottam meg.
38
4. Eredmények 4.1. A VDR polimofizmusok eloszlása 4.1.1. Diabéteszes betegek Az "f", "b", "a" és "u" allélek elofordulása teljesítette a Hardy-Weinberg feltételt. A "t" és "T" allélek nem voltak Hardy-Weinberg equilibriumban (p<0.0001), ezért a további analízisbol kizártam ezt a polimorfizmust (lásd 1. táblázat). Az "f", "b" és "a" polimorfizmusok prevalenciája nem különbözött fiúkban és lányokban sem a diabéteszes, sem a kontroll csoportban. A homozigóta "uu" genotípussal nem találkoztam egyik csoportban sem. Klinikai paraméterek és VDR allélok között nem találtam összefüggést. Míg a "b" és "a", valamint a "b" és "u" allélok linkage disequilibriumban (LD) álltak a kontroll és a dializált csoportokban is, az "a" és "u" allélok csak a kontrollokban (lásd 2. táblázat). Az "f" allél egyetlen másik alléllal sem volt kapcsoltságban. A tanulmányozott polimorfizmusok prevalenciája nem különbözött egészséges és diabéteszes alanyokban (lásd 1. táblázat). Önmagában egyik allél sem állt összefüggésben a diabétesszel. Azonban az "Uu" prevalenciája a diabéteszes lányok körében a kontrollhoz viszonyítva magasabb volt (lány/fiú: kontroll 7/18 vs. T1DM 16/5, p<0.01). A "b", "a" és "u" allélokat egyidejuleg hordozó lányok többen voltak a diabéteszes csoportban, mint a kontrollban ("b"+"a"+"u" hordozó / nem hordozó: diabéteszes: 13/50, egészséges: 0/53, p<0.005). A szérum HbAIc, a mikroalbuminuria, a BMI, és a diabétesz kezdetekori kor nem különbözött a "b"+"a"+"u" hordozó lányok és a többi diabéteszes között. Fiúkban
hasonló
jelenséget
nem
figyeltem
meg
("b"+"a"+"u"
hordozó: egészséges: 1/53, diabéteszes: 1/49, n.s.) (lásd 3. táblázat).
39
hordozó
/
nem
1. táblázat A polimorfizmusok prevalenciája egészséges és diabéteszes gyermekekben. kontroll
allél prevalencia
T1DM
allél prevalencia
n=183
n=107
FF
0.33
0.28
Ff
0.46
"f"=0.43
0.55
"f"=0.44
ff
0.20
"F"=0.57
0.17
"F"=0.56
Fok1
Bsm1 BB
0.16
0.18
Bb
0.50
"b"=0.58
0.43
"b"=0.60
bb
0.33
"B"=0.42
0.39
"B"=0.40
Taq1 TT
0.41
Tt
0.26
"t"=0.45
0.32
"t"=0.41
tt
0.31
"T"=0.55
0.25
"T"=0.59
0.41
Apa1 AA
0.31
0.22
Aa
0.42
"a"=0.46
0.52
"a"=0.51
aa
0.25
"A"=0.54
0.25
"A"=0.49
Tru9I UU
0.81
0.78
Uu
0.18
"u"=0.09
0.21
"u"=0.10
uu
0
"U"=0.91
0
"U"=0.90
T1DM: egyes típusú diabétesz. A Taq1 polimorfizmus nem teljesíti a HWE feltételt az egészséges csoportban (p<0.0001).
40
2. táblázat Linkage disequilibrium a BsmI, ApaI és a Tru9I allélok között ("b", "a" és "u") a kontroll és a diabéteszes alanyokban. D'
chi2
szignifikancia
kontroll, n=183 "b" x "a"
0.86
23.12
p<0.001
"b" x "u"
-0.75
5.04
p<0.05
"a" x "u"
0.60
7.39
p<0.01
diabéteszes, n=107 "b" x "a"
0.78
44.04
p<0.001
"b" x "u"
-0.76
4.14
p<0.05
"a" x "u"
0.12
1.36
n.s.
Az "f" alléllal nem figyeltünk meg korrelációt. D': standardizált disequilibrium értékek.
3. táblázat Allél kombinációk (BsmI, ApaI és a Tru9I polimorfizmusok: "b", "a" és "u") prevalenciája a kontroll és diabéteszes csoportokban. Kontroll
T1DM
U
u
U
u
Ba
0.18
0
0.16
0.01
BA
0.02
0
0.03
0
bA
0.02
0.09
0
0.07
ba
0.67
0.02*
0.57
0.16* * p<0,005
41
4.1.2. Dializált betegek Huszonketto betegnek volt alacsony (<12 pmol/L), nyolc betegnek magas (>60 pmol/L) az iPTH szintje. 69 betegnél ez az érték a közepes tartományban volt. Az iPTH és a foszforszint között korrelációt mutattam ki (r=0.2, p<0.05). A dialízisen eltöltött ido összefüggött a szérum foszfor szintjével (r=0.22, p<0.05). Az ESRD és hemodialízis kezdetekori kor fordítottan volt arányos a szérum iPTH szinttel (r=0.32, p<0.05). A nok iPTH koncentrációja marginálisan magasabb volt, mint a férfiaké (medián és tartomány: férfiak 18.2, 0.2- 93 pmol/L, vs. nok 27, 1.1-129 pmol/L, p=0.053), míg a szérum foszforszint hasonló volt mindkét nemben (medián és tartomány: férfi 1.81, 0.833.36 mmol/L, nok 1.78, 0.59-3.09 mmol/L). Egészséges kontrollokban a FokI, BsmI, az ApaI és a Tru9I polimorfizmusok teljesítették a Hardy-Weinberg feltételt. Mivel a TaqI polimorfizmus várt és mért értékei szignifikánsan különböztek (p<0,0001), ezért a "t" allélt kizártuk a további analízisbol. Az ApaI ("a") allélok nem voltak Hardy- Weinberg equilibriumban a dializált betegekben. A "b", az "a" és az "u" allélok linkage disequilibriumban voltak. A "b" és "a", valamint az "a" és "u" közötti kapcsoltság szignifikáns volt (p<0.001 és p<0.01) egészségesekben. A "b" és "a", "b" és "u", és "a" és "u" közötti kapcsoltság dializáltakban szignifikáns volt (p<0,001, p<0,05 és p<0,001). A standardizált kapcsoltsági koefficiens a "b" és "a", valamint az "a" és "u" között pozitív (D’=0,86 és D’=0,60), a "b" és "u" között negatív (D’=-0,24) volt. Az "f" allél nem volt kapcsolva a "b", "a" és "u" allélokhoz. A VDR polimorfizmusok prevalenciája nem különbözött egészséges férfiakban és nokben. Azonban férfi ESRD páciensek a "b" és "a" alléleket gyakrabban hordozták ("b": odds ratio: 4.08, 95% confidencia tartomány: 1.3-12.7, p<0.05, "a": odds ratio: 2.42, 95% confidencia tartomány: 1.06-5.5, p<0.05).
42
4. táblázat Polimorfizmusok prevalenciája a kontroll csoportban és a haemodializált betegekben. Enzim
kontroll
allél prevalencia
dializáltak
allél prevalencia
n=183
n=99
FF
0,33
0,45
Ff
0,46
"f"=0,44
0,40
"f"=0,34
ff
0,21
"F"=0,56
0,14
"F"=0,66
Fok1
Bsm1 BB
0,16
0,17
Bb
0,51
"b"=0,59
0,41
"b"=0,62
bb
0,33
"B"=0,41
0,42
"B"=0,38
Taq1 TT
0,42
0,41
Tt
0,26
"t"=0,45
0,34
"t"=0,41
tt
0,32
"T"=0,55
0,24
"T"=0,59
Apa1 AA
0,32
0,42
Aa
0,43
"a"=0,47
0,37
"a"=0,39
aa
0,26
"A"=0,53
0,20
"A"=0,61
Tru9I UU
0,81
0,76
Uu
0,19
"u"=0,09
0,23
"u"=0,13
uu
0,00
"U"=0,91
0,01
"U"=0,87
A Taq1 polimorfizmus nem teljesíti a HWE feltételt az egészséges csoportban (p<0.0001).
43
A VDR polimorfizmusokat és allél prevalenciákat összefoglaltam a 4. táblázatban. Az "f" allél prevaenciája marginálisan alacsonyabb volt dializált betegekben (odds ratio: 0.6, 95% confidencia tartomány: 0.35-1.04, p=0.06). A Tru9I, ApaI és BsmI VDR polimorfizmusok prevalenciája hasonló volt a kontroll és a dializált populációkban. A vizsgált polimorfizmusok nem voltak korrelációban az iPTH vagy a foszforszinttel (lásd 11. és 12. ábra). Az 5. táblázatban az iPTH szinteket a dializált nokben és férfiakban a BsmI, ApaI és Tru9I hordozóállapothoz viszonyítva foglaltam össze.
11. ábra. Az iPTH szintek (tartomány és medián, n=99) az egyes genotípusok függvényében 1000
iPTH pmol/l
100
10
1
0.1 FF
Ff
ff
BB Bb bb
44
AA Aa aa
UU Uu uu
12. ábra. Az foszforszintek (tartomány és medián, n=99) az egyes genotípusok függvényében
4 3.5
foszfor mmol/l
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 FF
Ff
ff
BB Bb bb
AA Aa aa
UU Uu uu
Azon férfiaknál, akik a BsmI "b" allélt és az ApaI "a" allélt egyszerre hordozták, a többi férfi beteghez viszonyítva alacsonyabb szérum iPTH koncentrációt találtam (medián: 17, tartomány: 0.8-82 vs. medián: 26, tartomány: 0.2-129pmol/L, p=0.01). A BsmI "b" és a Tru9I "U" allélt hordozó férfiaknál a többi férfibeteghez viszonyítva szintén alacsonyabb iPTH koncentrációt találtam (medián: 18, tartomány: 1.2- 82pmol/L vs. medián: 26, tartomány: 0.2-129pmol/L, p=0.04). Noknél hasonló jelenséget nem figyeltem meg (lást 5. táblázat). A FokI "f" alléljának hordozó állapota nem volt kapcsolatban az iPTH szintekkel.
45
5. táblázat A kétéves utánkövetési vizsgálat alatt mért medián iPTH szintek férfi és noi betegekben a VDR polimorfizmusok különbözo allélkombinációinak függvényében. Az értékek a következo formátumban vannak: medián, tartomány pmol/L (prevalencia) a, A BsmI és az ApaI polimorfizmus hordozóállapotának kombinációi BsmI “b”
allél
ApaI „a“
allél
hordozó
nem hordozó
hordozó
nem hordozó
hordozó
23, 1.1-129 (13)
-
28, 6.9-92 (11)
27, 4-121 (19)
férfi
26, 22-93 (6)
-
25, 0.3-77 (11)
17, 0.8-82 (39)*
total
26, 1.1-129 (19)
-
27, 0.3-92 (22)
19, 0.8-121 (58)
no iPTH
nem hordozó
b, A BsmI és a Tru9I polimorfizmus hordozóállapotának kombinációi BsmI “b”
allél
Tru9I „u“
allél
hordozó
nem hordozó
hordozó
nem hordozó
hordozó
26, 1.1-129 (13)
-
21, 4.3-92 (20)
30, 6.9-121 (11)
férfi
25, 22-93 (5)
-
18, 1.2-82 (38)**
22, 0.3-77 (12)
total
26, 1.1-129 (18)
-
20, 1.2-92 (58)
27, 0.3-121 (23)
no iPTH
nem hordozó
c, Az ApaI és a Tru9I polimorfizmus hordozóállapotának kombinációi ApaI „a“
allél
Tru9I „u“
allél
iPTH
nem hordozó
hordozó
nem hordozó
hordozó
nem hordozó
hordozó
no
27, 1.1-129 (16)
27, 6.9-57 (8)
21, 4.3-77 (17)
79, 37-121 (2)
férfi
24, 11.4-92 (7)
27, 0.3-77 (11)
18, 1.2-82 (36)
15, 12- 17 (2)
total
25, 1.1-129 (23)
27, 0.3-77 (19)
19, 1.2-82 (53)
27, 12-121 (4)
n=99, *p=0.01 vs. többi beteg, **p=0.04 vs. többi beteg.
46
4.2. Hardy-Weinberg equilibrium Összesen 540 cikk teljesítette a vizsgálatba való bekerülési kritériumokat. Ezen közlemények közül 102 cikkben összesen 211 polimorfizmus esetében találtunk hibát a HWE számításában. Az egyes folyóiratokban az általunk kimutatott, a szerzok által nem közölt HWE eltéréseket a 6-15. táblázatokban foglaltam össze. Kizárólag azokat a polimorfizmusokat jeleztem, ahol a HWE nem, vagy marginálisan teljesül. Az egyes polimorfizmusok pontos leírását és a rövidítések referenciáját lásd az eredeti cikkekben.
6. táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Journal of Investigative Dermatology“-ban 1998;110 és 2003;120 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt genotípus
Újraszámolt várt
HWE
eloszlás
eloszlás
p
AA
AB
BB
AA
AB
BB
érték
36
35
21
31
45
16
0,032
kontrollok
102
0
2
100
4
0
0,001
MHC S394
psoriasis
41
51
3
47
40
9
0,006
(Ser/Leu)
betegek
Pyo és mtsai
TAP2-665
kontrollok
20
103
61
28
87
69
0,016
[147]
(Ala/Thr) betegek
131
136
0
148
101
17
0,001
Mee és mtsai
VDR BsmI
[119]
psoriasis betegek
Gonzalez és
MHC S393
mtsai [52]
(Gly/Val)
Richter-Hintz GST M1
47
és mtsai
kontrollok
89
132
0
109
93
20
0,001
NQOR
kontrollok
169
52
13
163
65
7
0,004
McGregor és p53-72
kontrollok
16
16
16
12
24
12
0,021
mtsai [118]
V-ös típusú
kontrollok
84
88
75
66
123
57
0,001
bazalsejtes
84
98
79
68
130
63
0,002
38
44
29
32
55
23
0,034
17
7
5
14
12
2
0,031
33
42
135
14
80
116
0,001
12
9
18
7
19
13
0,001
kontrollok
119
37
11
113
49
5
0,005
kaukázusi
16
1
2
14
4
0
0,011
80
30
10
75
40
5
0,01
[153]
genotípus
borrel Kennedy és
MICA 5.1
mtsai [82]
(MHC komplex
carcinoma
class I lánc kapcsolt fehérje)
malignus melanoma betegek
Cairey-
TP53,
immun-
Remonnay és codon 72,
kompetens
mtsai. [18]
vérminták,
4-es exon
kontrollok Werth és
TNF -308A kontrollok
mtsai [190]
és HLA DR3
dermatomyositis
asszociáció Werth és
MBL
mtsai [189]
Asp54
DLE TNF GG és
kontrollok,
MBL
TNF GG
Asp54
csoport
asszociáció
48
7. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Gut“-ban 1998;42 és 2003;53 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt genotípus
Újraszámolt várt
HWE
eloszlás
eloszlás
p érték
AA
AB
BB
AA
AB
BB
248
20
3
246
25
1
0,017
Helio és
NOD2 gén
Crohn’s
mtsai. [67]
1007fs
disease
variáns
betegek
CTLA-4
kontrollok
62
47
21
56
59
15
0,034
HLA DR3
54
36
16
49
46
11
0,027
178
85
60
151
140
33
0,001
Djilali-Saiah
és mtsai. [32] exon 1 49es pozíció
negatív kontrollok
Aguilar-
HFE H63D
vas
Martinez és
SNP haplo -
túlterhelt
mtsai. [2]
típusok
betegek
Shannon és
methylene-
kontrollok
533
560
114
548
531
129
0,050
mtsai. [165]
tetrahydro-
kontrollok
204
229
34
217
203
47
0,005
134
101
35
126
117
27
0,031
folát
60 years<
reduktáz noi colorectal cc betegek
49
colorectal
94
64
28
85
81
19
0,003
148
116
39
140
132
31
0,036
kontrollok
122
22
5
119
29
2
0,012
kontrollok
59
58
32
52
72
25
0,018
cc stádium: Dukes B colorectal cc és p53 mutációde Jong és
CYPA1A1
mtsai. [30]
exon7 EPXH exon 3
50
8. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Diabetes“-ben 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt
Újraszámolt
genotípus
HWE
várt eloszlás p érték
eloszlás AA AB BB AA AB BB Penno és mtsai.
ACE
betegek
77 296 137 99 251 159 0,001
Kao és mtsai.
ald. reductase
betegek
35
35
27
28 48 20
0,007
[80]
ald. reductase
betegek
19
21
56
9
0,001
ald. reductase
betegek
41
13
13
34 28
6
0,001
PPP1r3, ARE
betegek
196 172 58 187 191 49
0,047
PON L54M
betegek
59
0,03
adiponectin T/G
kontrollok
CCR2
betegek
adiponectin
Sentinelli és mtsai. [164]
[142]
Maegawa és
41 46
mtsai. [107] James és
52
26
53 65 20
mtsai.[79] Stumvoll és
268 88
15 262 99
9
0,031
68
73
47 99 52
0,001
kontrollok
126 206 52 137 185 63
0,034
resistin
kontrollok
191
3
4
187 11
0
0,001
resistin
betegek
204
1
2
202 5
0
0,001
resistin
betegek
183
1
2
181 5
0
0,001
mtsai. [D5] Nakajima és
58
mtsai. [129] Hara és mtsai. [59]
51
Awata és mtsai.
VEGF
betegek
15
51
14
21 40 20
0,022
VEGF
betegek
57
10
3
55 14
1
0,034
eNEMS exon7
betegek
52
63
44
44 79 36
0,011
SHP G171A
kontrollok
291 34
4
288 39
1
0,033
SDF1
betegek
88
8
83 31
3
0,001
Kretowski és
IL-18 -137
betegek
63 125 13
78 94 28
0,001
mtsai. [86]
IL-18 -137
kontrollok
94
IL-18 -607
betegek
IL-18 -607
kontrollok
[6]
Monti és mtsai. [126] Mitchell és mtsai. [124] Dubois-
21
Laforgue és mtsai. [33]
Esterbauer és
PPARg
mtsai. [34] Hung és mtsai.
FOXC2
94
6
102 77 14
0,001
72 129
0
93 88 21
0,001
73 110 11
84 87 22
0,001
asszociációs 120 89 253 59 212 192 0,001 vizsgálat
346 69
47 313 134 14
0,001
kontrollok
127 65
17 122 76 12
0,052
[75]
52
9. táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Stroke“-ban 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt
Újraszámolt várt
HWE
genotípus
eloszlás
p
eloszlás
Longstreth
prothrombin
és mtsai
G20210A
érték
AA
AB
BB
AA
AB
BB
kontrollok
376
6
1
375
8
0
0,033
482
64
7
478
72
3
0,014
262
849
84
241
891
825
0,032
56
51
12
0,018
[100] Rossi és
hemochro-
asszociációs
mtsai [156]
matosis
vizsgálat
C282Y Mannami és
ACE I/D
mtsai [109] Voetsch és
asszociációs vizsgálat
PON1 192
6
kontrollok
50
62
6
mtsai [184]
10. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Critical Care Medicine“-ben 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
Schroeder és mtsai. [163] Fang és mtsai. [36] Reid és mtsai. [149]
SNP
Alanyok
Közölt genotípus
Újraszámolt várt
eloszlás
eloszlás
AA
AB
BB
AA
AB
BB
HWE, p érték
HSP70-2
kontrollok
10
64
33
16
51
39
0,013
IL-1- ?
kontrollok
68
33
11
64
41
7
0,039
TNF- ?
kontrollok ICU betegek
17 31
24 5
65 52
8 13
42 41
56 34
0,001 0,001
53
TNF-?
ICU betegek
5
54
51
27
11
39
33
0,005
11. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Human Molecular Genetics“-ben 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt genotípus eloszlás
Újraszámolt várt HWE p eloszlás érték
AA
AB
BB
AA
AB
BB
kontrollok
85
108
60
76
125
51
0,034
Lambert és mtsai. [93]
APOE és Th1/E47cs
Holmes és mtsai. [71]
5-HT2A receptor
betegek
1
30
12
6
20
17
0,002
betegek
1
20
10
4
14
13
0,05
5-HT2C receptor
betegek
138
24
6
134
32
2
0,005
betegek
145
28
8
140
39
3
0,001
betegek
94
19
5
91
25
2
0,016
betegek
71
17
5
68
23
2
0,021
betegek
77
10
6
72
19
1
0,001
betegek
19
6
4
17
11
2
0,027
betegek
146
30
6
142
37
2
0,018
betegek
165
36
10
159
49
4
0,001
kontrollok
71
13
6
67
22
2
0,019
betegek
137
13
21
120
46
4
0,001
kontrollok 269
65
25
253
97
9
0,001
Liao és mtsai. A2M [97]
betegek
442
56
68
390
159
16
0,001
betegek
639
42
3
637
46
1
0,043
Sarmanova és EPHX mtsai. [161] GSTP
betegek
108
74
39
95
100
26
0,001
betegek
97
85
35
90
100
28
0,035
EPHX
betegek
60
33
19
52
48
11
0,001
betegek
41
21
15
34
34
8
0,001
betegek
38
24
15
32
35
9
0,006
Lambert és mtsai. [91]
LBP1c/CP2/LSF
GSTP1-exon5
55
betegek EPHX
GSTP1
22
14
9
19
21
6
0,043
kontrollok 187
185
75
175
209
63
0,014
betegek
70
46
28
60
66
18
0,001
betegek
38
24
15
32
35
9
0,007
Gaunt és mtsai. L15440 6815 [48] A/T
kontrollok 1377
906
111
1399
862
133 0,009
L15440 8173 C/T
kontrollok 621
689
148
639
652
166 0,044
Ranade és mtsai. [148]
exon 5 PM
betegek
93
105
10
102
87
19
Kuschel és mtsai. [87]
KU70 G/T @ 1796
betegek
365
476
111
382
442
128 0,023
RAD32 C/T @ betegek 2259
215
326
168
202
353
155
0,05
XRCC2 G/A @ 31479
887
145
12
882
155
7
0,04
XRCC2 C/T @ kontrollok 893 41657
107
8
889
115
4
0,028
APM1 +45
kontrollok 500
156
24
491
173
15
0,014
APM1 +276
kontrollok 387
220
74
363
269
50
0,001
APM1 +349
kontrollok 510
146
21
502
162
13
0,014
APM1 +712
kontrollok 208
241
103
195
266
90
0,024
Vasseur és mtsai. [182]
Levecque és mtsai. [96]
betegek
0,003
APM1 +276
betegek
323
203
51
312
224
40
0,027
INOS 22
betegek
70
118
19
80
97
29
0,002
56
12. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Neurology“-ban 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt genotípus
Újraszámolt várt
eloszlás
eloszlás
AA
AB
BB
AA
AB
BB
HWE p érték
MacLeod és mtsai. [106]
NOS3 gén (Glu/Asp)
kontrollok
154
203
36
166
179
48
0,007
Mann és mtsai. [108]
GSTM3
kontrollok
221
64
15
213
79
7
0,001
Orth és mtsai. [137]
Prion protein gén (Met/Val)
kontrollok
156
44
198
80
197
122
0,001
129
25
146
67
150
84
0,001
21
1
19
11
20
9
0,001
14
1
7
10
10
3
0,001
betegek
Richard és mtsai. [152]
ACE I/D
betegek
120
239
74
132
214
86
0,020
Maruyama és mtsai. [110]
CST3 - 157 G/C
betegek
140
33
6
137
39
3
0,038
CST3 + 73 G/A
kontrollok
180
40
8
175
49
3
0,009
Misbahuddin és D1.1 mtsai. [123] D1.8
kontrollok
16
32
42
11
41
37
0,039
kontrollok
17
7
5
14
12
2
0,034
Xu és mtsai. [200]
Nurr1 7048G7049
betegek
162
48
15
154
64
7
0,004
Green és mtsai. [53]
IL-1B(-511)
kontrollok
95
107
15
102
94
22
0,038
Lambert és mtsai. [90]
APOE promoter
betegek
94
18
4
91
23
1
0,031
kontrollok
67
102
19
74
88
26
0,042
betegek
57
118
100
49
134
92
0,047
120
361
194
134
333
208
0,044
(- 491 ) APOE promoter (- 219 )
57
Wilkie és mtsai. OPRM1 [191]
betegek
193
29
8
187
41
2
0,001
Zappia és mtsai. [194]
betegek
61
48
23
55
61
17
0,024
A2MIle1000Val
13. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „J Med Genet“-ben 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
Lambert és mtsai. [92]
Zusterzeel és mtsai. [199]
Boniotto és mtsai. [13]
SNP
Alanyok
Közölt genotípus
Újraszámolt várt
eloszlás
eloszlás
AA
AB
BB
AA
AB
BB
HWE p érték
ORL1 3’UTR +1071 T/A
francia kontrollok
450
144
4
456
133
10
0,04
ORL1 3’UTR +1073 C/T
USA kontrollok
52
57
34
45
70
27
0,029
ORL1 3’UTR +1071 T/A
USA kontrollok
115
22
4
113
27
2
0,050
EPHX gene exon 3
preeclampsia
51
48
84
31
89
64
0,001
preeclampsia -HELLP
27
22
38
17
43
28
0,001
preeclampsia +HELLP
24
26
46
14
45
36
0,001
HLA-DQ2 vagy DQ8 nélküli alanyok
25
7
5
22
13
2
0,008
CD14 gén G/T az 1359 –es pozíciónál
58
14. táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, az „Atherosclerosis“-ban 1998 és 2003 között megjelent cikkekben
Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt genotípus
Újraszámolt várt
eloszlás
eloszlás
HWE p érték
AA
AB
BB
AA
AB
BB
kontrollok
94
4
2
92
8
0
0,005
asszociációs vizsgálat
173
70
17
166
83
10
0,020
Herrmann és PON Glu/Arg mtsai. [66]
kontrollok
362
265
74
349
291
61
0,016
Galinsky és mtsai. [46]
kontrollok
46
80
72
37
97
63
0,011
Iwai és mtsai. PAF 4G/5G [78]
betegek
22
37
38
17
47
33
0,037
Ou és mtsai. [138]
betegek
61
84
69
50
107
58
0,001
betegek
93
134
25
102
117
34
0,034
asszociációs vizsgálat
46
204
121
59
178
134
0,010
Ye és mtsai. [202]
APO B
Tamminen és CETP mtsai. [175]
ACE I/D
MTHFR
Mackness és PON1 55 mtsai. [105] Humphries és stromelysin-1 mtsai. [74] 5A:6A Verhoeff és mtsai. [183]
MTHFR
kontrollok
38
105
129
30
121
121
0,041
Ferrieres és mtsai. [41]
ACE I/D
asszociációs vizsgálat
136
151
70
125
172
59
0,018
Kee és mtsai. Apo A1 Pst [81]
kontrollok
66
5
4
63
12
1
0,000
kontrollok
555
74
7
551
82
3
0,022
Gardemann és AGT 235 M/ mtsai. [47]
betegek
319
582
157
352
517
190
0,000
betegek
141
244
68
153
221
80
0,027
Yamada és mtsai. [205]
5- HT 2AR T102C
betegek
62
150
43
74
127
55
0,007
Fowkes és mtsai. [44]
MTHFR
kontrollok
21
147
132
30
129
141
0,023
Yamada és
PAF
betegek
512
310
28
523
287
39
0,025
59
mtsai. [206] Friedlander és APO B SP mtsai. [45] 27/24
asszociációs vizsgálat
104
80
4
110
67
10
0,013
APO B SP asszociációs T2488 (XbaI) vizsgálat
15
107
88
22
92
95
0,030
Hegele CYP7 ABrousseau és 278C mtsai. [64]
asszociációs vizsgálat
286
269
39
298
246
51
0,026
Brousseau és ABC-T1 mtsai. [17] G596A
betegek
454
484
76
478
437
100
0,000
kontrollok
965
43
5
961
52
1
0,000
betegek
98
215
74
109
193
85
0,029
Wu és mtsai. CETP G i. 1 [193] A
asszociációs vizsgálat
63
159
52
74
137
63
0,012
Thamer és mtsai. [177]
asszociációs vizsgálat
81
218
87
94
193
100
0,012
Yamakawa és HL 514 C/T mtsai. [201]
asszociációs vizsgálat
57
69
48
48
87
39
0,008
Wang és mtsai. [185]
asszociációs vizsgálat
562
124
15
555
137
8
0,021
betegek
239
150
52
224
181
37
0,000
kontrollok
553
354
83
538
383
68
0,015
betegek
122
234
166
109
259
153
0,031
Gugl és mtsai. Fracalkine R [55] CX3CR1
kontrollok
268
210
25
277
193
34
0,047
Weisberg és mtsai. [188]
kontrollok
74
35
13
69
46
8
0,013
betegek
83
8
2
81
11
0
0,040
94
9
2
92
12
0
0,043
kontrollok
394
51
5
391
57
2
0,043
ABC-T1 G3456 C Zee és mtsai. CD14 C[195] 260T
ACE I/D
CYP1A1
Zito és mtsai. F12 C26T [197] Renner és mtsai. [150]
ACE I/D
B-HMTFR R/Q
Hoy és mtsai. MPO G[73] 129A
Horinek és mtsai. [72]
APO AV T1131 C
kontrollok
2164 355
40
2142
398
18
0,000
Abuzeid és mtsai. [1]
LP-ass. Pl A2 Ala 379 Val
kontrollok
121
16
116
71
11
0,046
60
61
15. Táblázat Genotípusok, amelyek nem teljesítik a Hardy-Weinberg feltételt, a „Kidney International“ben 1998 és 2003 között megjelent cikkekben Közlemény
SNP
Alanyok
Közölt
Újraszámolt várt
genotípus
eloszlás
HW p érték
eloszlás AA AB BB
AA
AB
BB
Narita és mtsai. AGT -235 asszociációs [130] vizsgálat
3
87
169
8
76
174
0,028
Melk és mtsai. [120]
TGF-? 1 codon10
betegek
8
22
0
12
14
4
0,009
TNF-? 308
kontrollok
10
31
132
4
43
126
0,001
betegek
85
37
11
81
46
7
0,041
COLIA 1
betegek
10
2
5
7
8
2
0,003
TGF-? 1 codon10
betegek
24
24
17
20
32
13
0,045
Girndt és mtsai. IL-10 –1082 asszociációs 66 [49] vizsgálat
125 109
55
147
98
0,011
Cotton és mtsai. [27]
AlvarezHernandez és mtsai. [4] Wong és mtsai. [192]
TGF-? 1 509
betegek
16
27
0
20
19
4
0,016
TGF-? 1 codon10
betegek
13
27
3
16
20
6
0,050
GLUT-1 (XbaI-)
betegek
10
29
3
14
20
7
0,011
Marco és mtsai. [112]
VDR BsmI
kontrollok
29
123
68
37
107
76
0,027
Fodinger és mtsai. [43]
MTFR –677
betegek
46
27
12
42
36
8
0,036
Liu és mtsai. [98]
GLUT-1 (XbaI-)
betegek
43
78
10
51
61
18
0,002
Hodgkinson és mtsai. [69]
61
Kimura és mtsai. [84]
GLUT-1 (XbaI-)
betegek
12
48
4
20
32
12
0,001
PAI-1
betegek
64
116
28
72
101
36
0,047
betegek
42
88
22
49
75
29
0,030
betegek
28
58
12
33
48
17
0,036
kontrollok
19
48
8
25
37
14
0,009
FernandezACE I/D Llama és mtsai. [38]
4.2.1. HWE vizsgálata a borbetegségekben A JID-bol összesen 22 közleményt dolgoztam fel, amelyek közül mindössze 8 (36%) jelezte, hogy a HW számításokat elvégezték. Öt közleményben a HWE nem teljesült a referencia és a vizsgált populációkban [52] [82] [153] [189] [190]. Három közlemé nyben a HWE az egészséges referencia populációban nem teljesült [18] [118] [147], egy közleményben a beteg populációban [119]. Egyetlen eltérést sem jeleztek a szerzok. Minden egyes esetben analizáltam, hogy a HW feltétel nem teljesülése hogyan befolyásolj a az eredmények értelmezését. A jobb áttekinthetoségért a vizsgált kórképek szerint csoportosítottam ezen közleményeket. Psoriasis Gonzalez és mtsai [52] az OTF3 gén polimorfizmusa és a psorisais között a HLACw*602-tól függelten kapcsolatot találtak. Az OTF3 gén polimorfizmusa mellett az MHC és más HLA gének mutációit is vizsgálták. A HW feltétel azonban nem teljesült az MHC S393 (Gly/Val) polimorfizmus esetén az egészséges referencia alanyokban. A referenciacsoportban nem teljesülo HWE miatt ezen polimorfizmus jelentoségét nem lehet vizsgálni ebben a tanulmányban. Ezzel szemben egy másik polimorfizmus, az MHC S394 (Ser/Leu) nem teljesítette a HW feltételt a beteg populációban. Ez az MHC S394 (Ser/Leu) allél és a psoriasis közötti kapcsolatra utalhat. Mee és mtsai [119] nem találtak összefüggéset a VDR genotípus és a calcipotriolra adott klinikai válasz között. Azonban az összes páciens összevonva nem teljesítette a
62
HW feltételt. Jóllehet ezen tény nem befolyásolja a következtetéseiket, a HW nem teljesülése a VDR BsmI polimorfizmus és a psoriasis rizikója közötti kapcsolatra utal. 2002- ben egy japán kutatócsoport [159] leírt kapcsolatot a VDR BsmI polimorfizmusa és a psoriasis között. Mee és mtsainak eredménye további bizonyíték a VDR BsmI és a psoriasis közötti kapcsolatra kaukázusi betegekben. Pyo és mtsai. [147] azt találták, hogy a TAP és a HLA-DM allélok a psoriasis genetikai rizikóját növelik koreaiakban. Ok számoltak HWE-t, de nem minden génre. A kivétel a TAP2 volt, ahol -leírásuk szerint- nem tudtak minden heterozigótát megkülönböztetni tipizáló rendszerükkel. Valóban, a TAP2-665 polimorfizmus nem teljesíti a HWE-t. Kérdéses, hogy ezen polimorfizmus alkalmas-e vizsgálatra methodológiai okok miatt, és hogy lehet-e következtetéseket levonni a TAP2-665 eredményeikbol. Richter-Hintz és mtsai [153] a különbözo phase II enzimek közül a GST M1-el találtak, de a GST T1 vagy NQOR-el nem találtak összefüggést psoriasissal. A phase I és phase II enzimek egyes kombinációi védelmet jelentenek. Azonban az NQOR és a GST M1 polimorfizmusok nem teljesítették a HWE feltételt a referencia populációjukban, és ez kérdésessé teszi eredményeiket. (További kérdés, hogy milyen módszert használtak a HWE számolására, mivel munkájuk során teljesített HWE feltételt írtak le.) Borrák McGregor és mtsai. [118] a p53 polimorfizmus különbözo formái között funkcionális differenciákat írtak le, amelyek valószínuleg jelentoséggel bírnak a borben lejátszódó carcinogenezis folyamatában. A p53- 72 genotípus azonban nem teljesíti a HWE-t a vizsgált, valamint az egészséges V- bortípusú alanyokban. Emiatt a közölt eredményeket óvatosan kell kezelni erre a bortípusra, javasolt egy más (nagyobb) referenciacsoport bevonása. Egy másik borrákkal foglalkozó tanulmányban [82] nem találtak összefüggést a borrák fokozott rizikója és MICA gén polimorfizmusai között. A MICA 5.1 polimorfizmus azonban nem teljesíti a HW feltételt a referencia alanyokban, bazálsejtes carcinoma páciensekben, és malignus melanoma páciensekben.
63
Cairey-Remonnay és mtsai [18] nem találtak összefüggést a TP53 exon 4 codon 72 polimorfizmus és squamosus sejtes borrák, valamint a humán papillomavírus státusz között immunkompetens alanyokban. Arra következtetnek, hogy a TP53 arginine/arginine genotípus egy lehetséges rizikótényezo a squamosus sejtes carcinoma kialakulására a vesetranszplantált betegekben az immunkompetens kontrollokhoz viszonyítva. A TP53 exon 4 codon 72 polimorfizmus azonban az immunkompetens vérmintákban nem teljesíti a HWE feltételt, így ezen következtetések további bizonyításra szorulnak. Dermatomyositis Werth és mtsai 2002-ben két közleményben is vizsgálták a dermatomyositis és egyes genotípus eloszlások kapcsolatát, azonban egyikben sem közöltek adatot HWE számolásról. Elso közleményükben a TNF -308A polimorfizmus és a dermatomyositis kapcsolatát írják le. Emellett a HLA-DR3-al kapcsolatban különbségeket is leírtak. A TNF-308A és a HLA DR3 kombináció nem teljesíti a HW feltételt, ez szintén eredményeiket támasztja alá. Azonban továbbra is kérdés, hogy magával a derma tomyositissel van- e kapcsolat, mivel a genotípusok sem a kontroll, sem a páciens csoportokban nem teljesítették a HW feltételt. Második közleményükben az apoptotikus keratinsejtek fokozott termeléséhez vezeto polimorfizmusoknak a pathogenetikai szerepét vizsgálták. Az MBL Asp54 polimorfizmus azonban nem teljesíti a HW feltételt a kontroll csoportban és a kaukázusi DLE betegekben, így ezen polimorfizmus pathogenetikai szerepét további vizsgálatokkal kell alátámasztani.
4.2.2. HWE vizsgálata a gasztroenterológiában A Gut-ból 20 publikációt vontam be a vizsgálatba, amelyekben összesen 166 genotípust vizsgáltak. Azonban összesen mindössze 4 közlemény (20%) jelezte, hogy a HWE kalkulációt elvégezték, és a genotípus disztribúció teljesítette a HW feltételt. Az egyes közleményekben a HWE újraszámolása után nyert információt az alábbiakban összefoglaltam. de Jong és mtsai a Crohn betegség (CD) és a biotranszformációs enzimek polimorfizmusa közötti kapcsolatot vizsgálták [30]. Vizsgálataik során azt a következtetést vonták le, hogy a "mikroszomális epoxid hidroláznak szerepe lehet a CD pathofiziológiájában".
64
Vizsgálataik során azonban nem jelezték, hogy két polimorfizmus (CYPA1A1 exon7 és EPXH exon 3) nem teljesíti a HWE feltételt kontroll csoportjukban. Emiatt ezen polimorfizmusok betegségre való hatását nem lehet vizsgálni ebben a tanulmányban. Aguilar-Martinez és mtsai a vasterhelés fenotipikus megjelenésének kapcsolatát vizsgálták a HFE H63D polimorfizmussal [2]. Következtetéseikben a H63D homozigóta állapottal kapcsolt fenotípusok és más HFE mutációk között nem találtak kapcsolatot. Azonban a vizsgált csoportban a HFE haplotípusok nem teljesítették a HWE-t, ami egy, a haemochromatosissal való -nem detektált - kapcsolatra utalhat. Shannon és mtsai az vizsgálták, hogy a metiléntetrahidrofolát reduktáz (MTHFR) polimorfizmusai milyen mértékben prediszponálnak a kolorektális rákra mikroszatellita instabilitással (CRC) [165]. Vizsgálataik során azt találták, hogy az MTHFR "TT" genotípusa az idosebb populációban fokozott CRC rizikóval jár. A referencia csoportjuk azonban nem teljesíti a HWE feltételt, emiatt nem lehet eldönteni, hogy ezen lelet egy nagyobb populáció esetén is igaz- e. Számításaink során azt is megfigyeltük, hogy a korreláció a nem, a stádium, a p53 mutáció, valamint a genotípus között szignifikáns, mivel a HWE a betegek ezen alcsoportjaiban sem teljesült. Djilali-Saiah és mtsai [32] közleményükben leírják, hogy a CTLA-4 génpolimorfizmus a coeliákiára prediszponáló nem-HLA tényezok között van. A CTLA- 4 exon 1 49-es pozíciónál levo polimorfizmus a kontrollok és a HLA DR3 negatív kontrollok között nem teljesíti a HWE feltételt, emiatt a következtetések értéke korlátozott. A végso következtetés meghozatalához egy új egészséges kontrollcsoport bevonására volna szükség. Helio és mtsai a CARD15/NOD2 génvariánsok családi elofordulása és a CD komplikált formái között kerestek kapcsolatot a finn lakosságban [67]. A NOD2 polimorfizmus elofordulását ritkábbnak találták a genetikailag homogén finn populációban más kontrollokhoz viszonyítva. Ezen kívül leírták a 1007fs variáns kapcsolatát CDvel. Következtetésüket támasztja alá az a nem jelzett tény, hogy a CARD15 1007fs polimorfizmus nem teljesíti a HWE feltételt CD betegeikben.
65
5. Diszkusszió 5.1. VDR polimorfizmusok szerepe Ma már több száz tudományos közlemény foglalkozik az öt ismert VDR polimorfizmus hatásaival. A polimorfizmusok közül legtöbben a BsmI, a FokI, a TaqI és az ApaI hatását vizsgálták. Az újabban felfedezett Tru9I polimorfizmusra vonatkozóan még kevés az adat. Meg kell említeni, hogy a polimorfizmusok leírt hatásainak mechanizmusa még teljesen ismeretlen. A FokI polimorfizmusnál három aminosavval rövidebb lesz a VDR fehérje, ennek ellenére ezzel a polimorfizmussal kapcsolatosan mutatták ki a legkevesebb eltérést. A BsmI, az ApaI és a Tru9I polimorfizmusok valószínuleg a gén mRNS- re való átírásának folyamatát befolyásolhatják. A TaqI polimorfizmus exonban helyezkedik el, a splicing illetve a processzálás folyamatában lehet szerepe.
5.1.1. VDR polimorfizmusok diabéteszes gyermekekben Vizsgálataim során LD-t találtam a "b", "a" és "u" allélok között magyar populációban. A kapcsoltságot vesebeteg és diabéteszes gyermekpopulációban is igazoltam. Ez arra utal, hogy
ezen
polimorfizmusok
öröklodése nem független egymástól. Jóllehet ezen
polimorfizmusok közeli elhelyezkedése magyarázatul szolgálhat ezen kapcsoltság stabilitására, magának a kapcsoltság kialakulásának a vizsgálata további vizsgálatot igényel. A "b" és a többi allél közötti kapcsoltság azt jelzi, hogy ezen polimorfizmusok is állhatnak a korábban a BsmI- el talált klinikai asszociációk mögött [24] [37] [208] [170] [139] [117]. A korábbi vizsgálatokhoz hasonló LD-t találtunk a "b", "a" és "t" allélok között [127] [181]. Fontos megjegyezni, hogy az RFLP helyek közötti linkage fokának változásával a detektált asszociációk közötti variációk várhatóak a különbözo vizsgált populációkban [141]. Valószínu, hogy az általunk vizsgált polimorfizmusok további SNP helyekkel vannak kapcsolatban, amelyek a funkcionális hatásokért felelosek. A VDR génjének teljes feldolgozása után válik lehetové az összes haplotípuskombináció meghatározása, és végül a lényeges kapcsolatok kimutatása (diabetesszel, osteoporosissal stb). Ameddig az összes polimorfizmus nincs feldolgozva, addig nem lehet végezni meta-analízist az egyes polimorfizmusok tényleges részvételének meghatározására.
66
Az "f", "b", "a" és "u" allélek prevalenciája az egészséges kontrollokban megegyezett a korábban Japán [122] és kaukázusi [169] [103] [186] [169] [186] populációkban mért adatokkal.
Vizsgálataimban
ezen
allélok
prevalenciája
hasonló
volt
valamennyi
betegcsoportban és az egészséges kontrollokban. Az Ongphiphadhanakul és mtsai. által Thaiföldön [136] mért értékektol különbözo "t" allél frekvenciát mértem. Azonban a "T" és "t" allélok nem teljesítették a Hardy-Weinberg feltételt, emiatt a "t" allél kapcsolatát az egyes kórképekkel nem vizsgáltem. A Hoh és mtsai által kidolgozott elemzési módszer [70] során azon polimorfizmusok esetén, ahol a HWE nem teljesül, két lehetoséget ajánlanak: vagy kivonjuk a polimorfizmust a vizsgálatból, vagy egy dinamikus változtatás, az úgynevezett “trimming” során átalakítjuk az adatokat. Ezen utóbbi lehetoséget akkor javasolják, ha a genotipizálási hiba valószínusége is fennáll. Mivel mi a minták ismételt mérése során genotipizálási hibát nem észleltünk, ezért döntöttünk úgy, hogy a TaqI polimorfizmust teljesen kivonjuk a vizsgálatokból. További kérdésként vetodik fel, hogy az egészséges csoport miért nem teljesítette a Hardy-Weinberg feltételt. Kapcsoltság, illetve a magyar populáció valamilyen genetikai jellemzoje lehet a háttérben [65]. Pani és mtsai német betegekben a T1DM-re való fokozott hajlamról számoltak be egyes VDR polimorfizmus kombinációk esetén. Vizsgálataikban az "At", a "Bt" és a "BAt" allélok fokozott hajlammal, míg az "AT" és "at" fokozott védelemmel rendelkeztek [139]. Mivel én a "t" allél hatásait nem tudtam vizsgálni, ezért eredeményeiket sem megerosíteni, sem elvetni nem tudom. Vizsgálataim során eros asszociációt találtam a "b"+"a"+"u" allélok hordozóállapota és a T1DM jelenléte között lányokban. Eredményeim arra utalnak, hogy bár ezen kombináció egy fontos rizikótényezot jelent a T1DM szempontjából, a többi vizsgált klinikai paramétert nem befolyásolja. Hasonló összefüggést génpolimorfizmusok hatásai és az alanyok neme között korábbi közlemények is leírnak [85]. A hormon szenzitív lipáz polimorfizmusa összefügg
az
inzulin
érzékenységgel
nokben,
de
férfiakban
nem
[176].
A
VDR polimorfizmusok nemfüggo összefüggésben vannak a növekedéssel [174]. Azonban ezen lelet jelentoségét nehéz megbecsülni, hiszen a diabetes fiúkat és lányokat egyenlo
67
mértékben érint. Ennek a jelenségnek a további, mélyebb vizsgálata más genetikai megközelítéssel, például családfa-vizsgálatokkal lenne lehetséges.
5.1.2. A BsmI polimorfizmus ismétlodésének jelentosége Az adataink kiértékelését tovább bonyolítja, hogy a BsmI ("b") enzimnek két restrikciós helye is van a VDR génben. A PCR RFLP során amplifikált szakaszok hossza identikus, emiatt az általam használt módszerrel nem lehet eldönteni, hogy heterozigóta alanyokban egy vagy két BsmI restrikciós hely van-e jelen. A VDR gén ezen jellemzojét a korábbi adatok értelmezése során nem említették [57] [139] [140] [169] [171]. A "b"+"a"+"u" pozitív lányok közül a "Bb" genotípussal rendelkezok további vizsgálata szükséges, hogy el tudjuk dönteni, egy vagy ketto "b" allél van-e jelen?
5.1.3. VDR polimorfizmusok dializált betegekben Második kísérletes vizsgálatom során a VDR polimorfizmusok prevalenciáját és hatásait vizsgáltam az iPTH- és foszforszintekre végstádiumú vesebetegekben. Az ApaI ("a") allélok Hardy- Weinberg equilibriumban voltak a kontroll csoportban, de a hemodializált betegekben nem. Vizsgálataimban az ESRD több különbözo betegség eredménye volt, és a betegcsoport nagymértékben heterogén volt. Emiatt ezen lelet az "a" allél hordozóállapot és a veseelégtelenség súlyossága, illetve az ESRD rizikója közötti kapcsolatot valószínusít vesebetegekben. ESRD során a D-vitamin szintézis zavart, valamint az emelkedett plazma foszforszint direkt is hat a PTH szintézisre. Mivel a hyperparathyreosis az egyik kulcstényezo a veseelégtelenség során a csont és kardiovaszkuláris szövodmények kialakulásában, több tanulmány is vizsgálta a VDR polimorfizmusok és a szövodmények közötti kapcsolatot. Yokoyama és mtsai. [208] az ApaI "aa" genotípus és a parathyroid válasz közötti kapcsolatról számolt be vesebetegekben. Fernandez és mtsai. [37] [14] alacsonyabb iPTH szintet találtak a BsmI "BB" genotípusával rendelkezo betegekben. Ezekkel a viszgálatokkal szemben Marco és mtsai [111] nem találtak összefüggést a BsmI és a szérum iPTH szint között hemodializált
68
betegekben. A sok ellentmondásos adat lehetséges oka, hogy a vizsgálatokat különbözo etnikumokon és éghajlati területeken végezték. Sok esetben megnehezíti az értékelést, hogy a betegek D- vitamin fogyasztását és a D-vitamin statust, valamint az egyideju diétás kalciumfelvételt nem vizsgálták. Tovább bonyolítja a képet, hogy az A-vitamin ellátottság a rendelkezésre álló RXR receptorok számán keresztül szintén befolyásolhatja a VDR polimorfizmusok hatásait. Kisérleteim során az adatok kiértékelését tovább nehezíti, hogy a calcitriol-kezelés hatékonysága különbözo lehetett a különbözo betegeknél. Saját vizsgálataim során összefüggést találtam a BsmI "b" és ApaI "a", valamint a BsmI "b" és Tru9I "U" allélok egyideju hordozása és a szérum iPTH szintek között férfi hemodializált betegekben. Eredményeim azt jelzik, hogy ezen allélkombinációk hordozóállapota protektív hatással rendekezik férfiakban, jóllehet a többi vizsgált klinikai paramétert nem befolyásolják. Ezen új eredmény a fiatalkori diabéteszben találthoz hasonló nemfüggo különbséget jelez. Korábbi közlemények már beszámoltak a VDR polimorfizmusok nemfüggo hatásairól [85] [174]. Míg a dializált betegekben korábbi vizsgálatok 1-2 mérés alapján állapították meg az iPTH koncentrációt, kísérleteim során ehhez 6 mérés átlagát használtam fel, ami betegeinkben egy sokkal reprezentatívabb iPTH profil meghatározását tette lehetové. Összefoglalva elmondhatom, hogy mind az öt ismert VDR polimorfizmus prevalenciáját
vizsgáltam
hemodializált
betegekben.
Az
egyes
polimorfizmusok
prevalenciájában nem találtam különbséget a kontrollhoz viszonyítva. A szérum iPTH és a BsmI, ApaI és Tru9I polimorfizmusok kombinációja között nemfüggo összefüggést találtam a magyaroszági hemodializált betegekben.
5.2. Hardy-Weinberg equilibrium A HWE számolása kritikus információkkal szolgál a genetikai polimorfizmusokat vizsgáló tanulmányokban. Ha a HW feltétel nem teljesül, ez a tény az eredményeket és a következtetéseket dönto mértékben befolyásolja. Ha a kontroll populáció nem teljesíti a HWE-t, az eredményeket óvatosan kell kezelni, mert a megfigyelt genotípus eloszlás a referenciapopulációban nem képviseli az egészséges emberekben mérheto genotípus eloszlást, és emiatt a következtetések értéke limitált. Ha a HWE feltétel teljesül a kontroll csoportban,
69
de nem teljesül a vizsgált csoportban, ez egy újabb evidencia a betegség és a polimorfizmus közötti kapcsolatra. Több magyarázata lehet annak, ha a megfigyelt genotípus eloszlás szignifikánsan eltér a várt eloszlástól. A modell egyes feltételezései hibásak lehetnek, nem véletlenszeru párkapcsolatok kialakulása (beltenyészet, vagy az allélikus hatás a párválasztásra), géntranszfer a vizsgált és egy külso populáció között, vagy szelekció jöhetnek szóba. A HWE nem teljesülése esetén mintavételi hiba is eloforulhat: a minta nem egy populációból van, vagy az egyes genotípusok különbözo valószínuséggel kerülnek be a mintába [63]. Érdekes módon több közleményben leírták, hogy a HWE feltétel teljesült, azonban az újraszámolás során nem tudtuk igazolni állításukat. Emiatt a szakirodalomban is jelzett, általánosan elfogadott programok használata javasolt a HWE számítására. Az általános kijelentés -"a genotípusok eloszlása teljesítette a HW feltételt"- helyett minden egyes alcsoportra kiszámolt, részletesen leírt HWE eredmények közlése javasolt.
70
6. Eredmények összefoglalása
1. VDR polimorfizmusok a fiatalkori diabetes pathogenesisében A VDR polimorfizmusokat vizsgáló populációgenetikai tanulmányok közül ezen vizsgálatom az elso, amelyben mind az öt ismert VDR polimorfizmusról gyujtöttem adatokat diabéteszes és egészséges populációban. Kimutattam, hogy a VDR gén BsmI, ApaI és Tru9I polimorfizmusainak együttes jelenléte nagymértékben növeli a diabétesz rizikóját magyar lányokban, de fiúkban nem. Eredményeim arra utalnak, hogy bár ezen kombináció egy fontos rizikótényezot jelent a T1DM szempontjából, a többi vizsgált klinikai paramétert nem befolyásolja.
2. VDR polimorfizmusok és a dializált betegek szövodményei Kísérletes vizsgálataim második részében a VDR polimorfizmusokat vizsgáltam hemodializált betegekben. Az egyes polimorfizmusok prevalenciájában nem találtam különbséget a kontrollhoz viszonyítva. Az ApaI polimorfizmus nem teljesíti a Hardy-Weinberg feltételt, ami az "a" allél hordozóállapot és a veseelégtelenség rizikója közötti kapcsolatot valószínusít vesebetegekben. A szérum iPTH és a BsmI, ApaI és Tru9I polimorfizmusok kombinációja között nemfüggo összefüggést igazoltam a magyaroszági hemodializált betegekben.
3. Linkage disequilibrium a VDR polimorfizmusok között Eredményeim alapján a BsmI, az ApaI és a Tru9I VDR polimorfizmusok linkage disequilibriumban vannak egymással. A két vizsgálati csoportban ezen SNP-k kombinációi vezetnek a kimutatott eltérésekhez. Fontos felhívnom a figyelmet arra, hogy a linkage-ben levo polimorfizmusok önmagukban nem rendelkeznek kimutatható hatással. Ezen lelet az LD biológiai jelentoségére hívja fel a figyelmet.
71
4. Hardy-Weinberg equilibrium mint null-hipotézis Tíz folyóiratból 540 cikkben számoltam újra a Hardy-Weinberg equilibriumot valamennyi rész-genotípusra. Összesen 211 olyan eltérést találtam 102 cikkben, ahol ezen eltérést a szerzok nem jelezték az adatok feldolgozása során. Ezen eltérésekbol 69 olyan, ahol a kontroll csoportban a számítás vagy elmaradt, vagy hibás volt. Ezen közleményekben nem teljesül a null-hipotézis, így valamennyi leírt következtetést egy új kontroll csoport bevonásával újra kell ellenorizni.
5.
Hardy-Weinberg
equilibrium
jelentosége
a
betegség
- genotípus
kapcsolatban Az elemzés során a fenti cikkek között 142 olyan polimorfizmust találtam, ahol vagy az asszociációs vizsgálat genotípus eloszlása, vagy a betegcsoport nem teljesítette a HardyWeinberg feltételt. Ezen polimorfizmusok esetén a HWE számításával a következtetés függvényében a betegséggel való kapcsolatot megerositeni, illetve új kapcsolatokat kimutatni lehet.
72
Köszönetnyilvánítás PhD hallgatóként a 2. számú programban (Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója) vettem részt. Programvezetom, Prof. Tulassay Tivadar (SOTE I. Gyermekgyógyászati Klinika) irányította a kutatást és biztosította a módszerek beállításához és a mérések elvégzéséhez szükséges vegyszerek anyagi hátterét. Meghatározó szerepe volt tudományos érdeklodésem további alakulásában. Hálás vagyok témavezetomnek, Dr Szabó Andrásnak (SOTE I. Gyermekklinika) a PhD képzés alatti támogatásáért. Bevont az Intézetben már folyamatban levo tudományos témákba, illetve önálló kutatási feladatokkal látott el. Négy évvel ezelott az o irányítása alatt kezdtem el a PhD programomat. Köszönetet szeretnék mondani Dr Vásárhelyi Barnának (Gyermekgyógyászati és Nephrológiai Kutatócsoport, Magyar Tudományos Akadémia és SOTE I. Gyermekklinika), hogy tudományos munkámat tanácsaival irányította. Segítségével tanultam meg a helyes kérdésfelvetés, adatgyujtés, elemzés és értékelés módszereit. Tudományos pályámon o indított el 1996-ban. A vérminták begyujtéséért köszönettel tartozom Prof. Madácsy Lászlónak (SOTE I. Gyermekklinika), Dr Krikovszky Dórának (SOTE I. Gyermekklinika), Dr Tordai Attilának (Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest), Dr Süveges Zsuzsának és Dr Faludi Máriának (Bajcsy-Zsilinszky Kórház, Budapest). Hálás vagyok a SOTE I. Gyermekklinika központi laboratóriumában dolgozó munkatársaimnak, hogy lehetoséget biztosítottak a mérések elvégzésére.
73
Irodalomjegyzék [1] Abuzeid A.M., Hawe E., Humphries S.E., Talmud P.J.: HIFMECH Study Group. Association between the Ala379Val variant of the lipoprotein associated phospholipase A2 and risk of myocardial infarction in the north and south of Europe. Atherosclerosis 2003;168:283-288. [2] Aguilar-Martinez P., Bismuth M., Picot M.C. és mtsai. Variable Phenotypic Presentation of iron Overload in H63D Homozygotes: are Genetic Modifiers the Cause? Gut 2001;48:836-842. [3] Akey J.M., Zhang K., Xiong M., Doris P., Jin L.: The effect that genotyping errors have on the robustness of common linkage-disequilibrium measures. Am J Hum Genet 2001;68:1447-1456. [4] Alvarez-Hernandez D., Naves M., Diaz-Lopez D.B., Gomez C., Santamaria I., Cannataandia J.B.: Influence of polymorphisms in VDR and COLIA1 genes on the risk of osteoporotic fractures in aged men. Kidney Int 2003;63:S14–S18. [5] Ames S.K., Ellis K.J., Gunn S.K. és mtsai: Vitamin D receptor gene Fok1 polymorphism predicts calcium absorption and bone mineral density in children. J Bone Miner Res 1999;14:740-746. [6] Awata T., Inoue K., Kurihara S. és mtsai: A common polymorphism in the 5'-untranslated region of the VEGF gene is associated with diabetic retinopathy in type 2 Diabetes. Diabetes 2002;51:1635-1639. [7] Ban Y., Taniyama M., Ban Y.: Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with Graves' disease in the Japanese population. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:4639-4643. [8] Ban Y., Taniyama M., Yanagawa T. és mtsai: Vitamin D receptor initiation codon polymorphism influences genetic susceptibility to type 1 diabetes mellitus in the Japanese population. BMC Med Genet 2001;2:7
74
[9] Baroncelli G.I., Federico G., Bertelloni S. és mtsai: Vitamin-D receptor genotype does not predict bone mineral density, bone turnover, and growth in prepubertal children. Horm Res 1999;51:150-156. [10] Bernad M., Jaramillo G., Aguado P. és mtsai: Polymorphism of the gene of vitamin D receptor and bone mineral density in postmenopausal women. Med Clin (Barc) 1999;112:651-655. [11] Blind E., Schmidt-Gayk H., Scharla S., Flentje D.: Two-site assay of intact parathyroid hormone in the investigation of primary hyperparathyroidism and other disorders of calcium metabolism compared with a midregion assay. J Clin Endocrinol Metab 1988;67:353-360. [12] Block G.A., Hulbert-Shearon T.E., Levin N.W., Port F.K.: Association of serum phosphorus and calcium x phosphate product with mortality ris k in chronic hemodialysis patients:a national study. Am J Kidney Dis 1998;31:607- 617. [13] Boniotto M., Braida L., Ventura A., Percopo S., Amoroso A., Crovella S.: Promoter polymorphisms of the CD14 gene in Italian patients with coeliac disease. J Med Gene t 2003;40:e108 [14] Borras M., Torregrossa V., Oliveras A. és mtsai: BB genotype of the vitamin D receptor gene polymorphism postpones parathyroidectomy in hemodialysis patients. J Nephrol 2003;16:116-120. [15] Boucher B.J., Mannan N., Noonan K., Hales C.N., Evans S.J.: Glucose intolerance and impairment of insulin secretion in relation to vitamin D deficiency in East London Asians. Diabetologia 1995;38:1239- 1245. [16] Bourlon P.M., Faure-Dussert A., Billaudel B. és mtsai: Relationship between CalbindinD28K levels in the A and B cells of the rat endocrine pancreas and the secretion of insulin and glucagon: influence of vitamin D3 deficiency and 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Endocrinol 1996;48:223-232. [17] Brousseau M.E., Bodzioch M., Schaefer E.J. és mtsai: Common variants in the gene encoding ATP -binding cassette transporter 1 in men with low HDL cholesterol levels and coronary heart disease. Atherosclerosis 2001;154:607-611.
75
[18] Cairey-Remonnay S., Humbey O., Mougin C., és mtsai: TP53 polymorphism of exon 4 at codon 72 in cutaneous squamous cell carcinoma and benign epithelial lesions of renal transplant recipients and immunocompetent individuals: lack of correlation with human papillomavirus status. J Invest Dermatol 2002;118:1026-1031. [19] Carling T., Rastad J., Akerstrom G. és mtsai: Vitamin D receptor (VDR) and parathyroid hormone messenger ribonucleic acid levels correspond to polymorphic VDR alleles in human parathyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:2255-2259. [20] Carling T., Ridefelt P., Hellman P. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphism and parathyroid calcium sensor protein (CAS/gp330) expression in primary hyperprathyroidism. World J Surg 1998;22:700-707. [21] Carling T., Ridefelt P., Hellman P., Rastad J., Akerstrom G.: Vitamin D receptor polymorphisms correlate to parathyroid cell function in primary hyperparathyroidism J Clin Endocrinol Metab 1997;82:1772-1775. [22] Chang T.J., Lei H.H., Yeh J.I. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphisms influence susceptibility to type 1 diabetes mellitus in the Taiwanese population. Clin Endocrinol (Oxf) 2000;52:575-580. [23] Christakos S., Raval-Pandya M., Wernyj R.P., Yang W.: Genomic mechanisms involved in the pleiotropic actions of 1,25- dihydroxyvitamin D3. Biochemical Journal 1996;316:361371. [24] Chudek J., Karkoszka H., Schmidt- Gayk H. és mtsai: Plasma parathyroid hormone, phosphatemia and vitamin D receptor genotype: are they interrelated? J Nephrol 2000;13:54-58. [25] Correa P., Rastad J., Schwarz P. és mtsai: The vitamin D receptor (VDR) start codon polymorphism in primary hyperparathyroidism and parathyroid VDR messenger ribonucleic acid levels. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:1690-1694. [26] Correa-Cerro L., Berthon P., Haussler J. és mtai: Vitamin D receptor polymorphisms as markers in prostate cancer. Hum Genet 1999;105:281-287.
76
[27] Cotton S.A., Gbadegesin R.A., Williams S., Brenchley P.E., Webb N.J.: Role of TGFbeta1 in renal parenchymal scarring following childhood urinary tract infection. Kidney Int 2002;61:61-67. [28] Curran J.E., Vaughan T., Lea R.A. és mtsai: Association of a vitamin D receptor polymorphism with sporadic breast cancer development. Int J Cancer 1999;83:723-726. [29] Dawson-Hughes B., Harris S.S., Finneran S.: Calcium absorption on high and low calcium intakes in relation to vitamin D receptor genotype. J Clin Endocrinol Metab 1995;80:3657-3661. [30] de Jong D.J., van der Logt E.M., van Schaik A., és mtsai: Genetic Polymorphisms in Biotransformation Enzymes in Crohn's Disease: Association with Microsomal Epoxide Hydrolase. Gut 2003;52:547-551. [31] Diabetes Epidemiology Research International Group: Geographic patterns of childhood insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetes 1988;37:1113-1119. [32] Djilali-Saiah I., Schmitz J., Harfouch-Hammoud E., és mtsai. CTLA-4 Gene Polymorphism is Associated with Predisposition to Coeliac Disease. Gut 1998;43:187-189. [33] Dubois- Laforgue D., Hendel H., Caillat-Zucman S., Zagury J.F., Winkler C., Boitard C., Timsit J.: A common stromal cell-derived factor-1 chemokine gene variant is associated with the early onset of type 1 Diabetes. Diabetes 2001;50:1211- 1213. [34] Esterbauer H., Oberkofler H., Linnemayr V. és mtsai: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- Coactivator-1 Gene Locus: Associations With Obesity Indices in Middle -Aged Women Diabetes 2002;51:1281- 1286. [35] EURODIAB Substudy 2 Study Group (The).: Vitamin D supplement in early childhood and risk for Type I (insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia 1999;42:51-54. [36] Fang X.M., Schroder S., Hoeft A., Stuber F.: Comparison of two polymorphisms of the interleukin-1 gene family: interleukin-1 receptor antagonist polymorphism contributes to susceptibility to severe sepsis. Crit Care Med 1999;27:1330-1334.
77
[37] Fernandez E., Fibla J., Betriu A. és mtsai: Association between vitamin D receptor gene polymorphism and relative hypoparathyroidism in patients with chronic renal failure. J Am Soc Nephrol 1997;8:1546-1552. [38] Fernandez-Llama P., Poch E., Oriola J. és mtsai: Angiotensin converting enzyme gene I/D polymorphism in essential hypertension and nephroangiosclerosis. Kidney Int 1998;53:1743-1747. [39] Ferrari S.L., Rizzoli R., Slosman D.O. és mtsai: Do dietary calcium and age explain the controversy surrounding the relationship between bone mineral density and vitamin D receptor gene polymorphisms? J Bone Miner Res 1998;13:363-370. [40] Ferrari S., Manen D., Bonjour J.P., Slosman D., Rizzoli R.: Bone mineral mass and calcium and phosphate metabolism in young men: relationships with vitamin D receptor allelic polymorphisms J Clin Endocrinol Metab 1999;84:2043-2048. [41] Ferrieres J., Ruidavets J.B., Fauvel J. és mtsai: Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism in a low-risk European population for coronary artery disease. Atherosclerosis 1999;142:211-216. [42] Fischer P.R., Thacher T.D., Pettifor J.M. és mtsai: Vitamin D receptor polymorphisms and nutritional rickets in Nigerian children. J Bone Miner Res 2000;15:2206-2210. [43] Fodinger M., Wolfl G., Fischer G. és mtsai: Effect of MTHFR 677C>T on plasma total homocysteine levels in renal graft recipients. Kidney Int 1999;55:1072-1080. [44] Fowkes F.G., Lee A.J., Hau C.M., Cooke A., Connor J.M., Lowe G.D.: Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) and nitric oxide synthase (ecNOS) genes and risks of peripheral arterial disease and coronary heart disease: Edinburgh Artery Study. Atherosclerosis 2000;150:179-185. [45] Friedlander Y., Leitersdorf E., Vecsler R., Funke H., Kark J.: The contribution of candidate genes to the response of plasma lipids and lipoproteins to dietary challenge. Atherosclerosis 2000;152:239-248.
78
[46] Galinsky D., Tysoe C., Brayne C.E. és mtsai: Analysis of the apo E/apo C-I, angiotensin converting enzyme and methylenetetrahydrofolate reductase genes as candidates affecting human longevity. Atherosclerosis 1997;129:177- 183. [47] Gardemann A., Stricker J., Humme J. és mtsai: Angiotensinogen T174M and M235T gene polymorphisms are associated with the extent of coronary atherosclerosis. Atherosclerosis 1999;145:309-314. [48] Gaunt T.R., Cooper J.A., Miller G.J., Day I.N., O'Dell S.D.: Positive associations between single nucleotide polymorphisms in the IGF2 gene region and body mass index in adult males. Hum Mol Genet 2001;10:1491-1501. [49] Girndt M., Kaul H., Sester U., Ulrich C., Sester M., Georg T., Kohler H.: Antiinflammatory interleukin-10 genotype protects dialysis patients from cardiovascular events. Kidney Int 2002;62:949-955. [50] Gomez C., Naves M.L., Barrios Y. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphisms, bone mass, bone loss and prevalence of vertebral fracture: differences in postmenopausal women and men. J Osteoporos Int 1999;10:175-182. [51] Gong G., Stern H.S., Cheng S.C. és mtsai: The association of bone mineral density with vitamin D receptor gene polymorphisms. Osteoporos Int 1999;9:55-64. [52] Gonzalez S., Martinez- Borra J., Del Rio J.S. és mtsai: The OTF3 gene polymorphism confers susceptibility to psoriasis independent of the association of HLA-Cw*0602. J Invest Dermatol 2000;115:824-828. [53] Green E.K., Harris J.M., Lemmon H. és mtsai: Are interleukin-1 gene polymorphisms risk factors or disease modifiers in AD? Neurology 2002;58:1566-1568. [54] Gross C., Eccleshall T.R., Malloy P.J. és mtsai: The presence of a polymorphism at the translation initiation site of the vitamin D receptor gene is associated with low bone mineral density in postmenopausal Mexican-American women. J Bone Miner Res 1996;11:18501855.
79
[55] Gugl A., Renner W., Seinost G. és mtsai: Two polymorphisms in the fracalkine receptor CX3CR1 are not associated with peripheral arterial disease. Atherosclerosis 2003;166:339343. [56] Guo S.W., Thompson E.A.: Performing the exact test of Hardy–Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 1992;48:361–372. [57] Halmos B., Szalay F., Cserniczky T. és mtsai: Association of primary biliary cirrhosis with vitamin D receptor Bsm1 genotype polymorphism in a Hungarian population. Dig Dis Sci 2000;45:1091-1095. [58] Hamasaki T., Inatomi H., Katoh T. és mtsai: Clinical and pathological significance of vitamin D receptor gene polymorphism for prostate cancer which is associated with a higher mortality in Japanese. Endocr J 2001;48:543-549. [59] Hara K., Boutin P., Mori Y. és mtsai: Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 Diabetes in the Japanese population. Diabetes 2002;51:536-540. [60] Hardy G.H.: Mendelian proportions in a mixed population. section: "Discussion and Correspondence". Science 1908;28:49-50. [61] Harris S.: Can vitamin D supplementation in infancy prevent type 1 diabetes? Nutr Rev 2002;60:118-121. [62] Hayes C.E., Nashold F.E., Spach K.M., Pedersen L.B.: The immunological functions of the vitamin D endocrine system Cell Mol Biol 2003;49:277-300. [63] Hedrick P.W.: Genetics of Populations. Van Nostrand Reinhold Co., New York. 1983 [64] Hegele R.A., Wang J., Harris S.B. és mtsai: Variable association between genetic variation in the CYP7 gene promoter and plasma lipoproteins in three Canadian populations. Atherosclerosis 2001;154:579-587. [65] Hermann R., Mijovic C.H., Rayner M. és mtsai: HLA alleles and IDDM in children in Hungary: a comparison with Finland. Human Immunology 2001;62:391-398.
80
[66] Herrmann S.M., Blanc H., Poirier O. és mtsai: The Gln/Arg polymorphism of human paraoxonase (PON 192) is not related to myocardial infarction in the ECTIM Study. Atherosclerosis 1996;126:299-303. [67] Helio T., Halme L., Lappalainen M. és mtsai. CARD15/NOD2 Gene Variants are Associated with familially Occurring and Complicated Forms of Crohn's Disease. Gut 2003;52:558-562. [68] Hitman G.A., Mannan N., McDermott M.E. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphisms influence insulin secretion in Bangladeshi Asians. Diabetes 1998;47:688-690. [69] Hodgkinson A.D., Millward B.A., Demaine A.G.: Polymorphisms of the glucose transporter (GLUT1) gene are associated with diabetic nephropathy. Kidney Int 2001;59:985-989. [70] Hoh J., Wille A., Ott J.: Trimming, weighting, and grouping SNPs in human case-control association studies. Genome Res 2001;11:2115-2119. [71] Holmes C., Arranz M.J., Powell J.F., Collier D.A., Lovestone S.: 5-HT2A and 5-HT2C receptor polymorphisms and psychopathology in late onset Alzheimer's disease. Hum Mol Genet 1998;7:1507-1509. [72] Horinek A., Vrablik M., Ceska R., Adamkova V., Poledne R., Hubacek J.A.: T-1131->C polymorphism within the apolipoprotein AV gene in hypertriglyceridemic individuals. Atherosclerosis 2003;167:369-370. [73] Hoy A., Leininger-Muller B., Poirier O. és mtsai: Myeloperoxidase polymorphisms in brain infarction. Association with infarct size and functional outcome. Atherosclerosis 2003;167:223-230. [74] Humphries S.E., Luong L.A., Talmud P.J. és mtsai: The 5A/6A polymorphism in the promoter of the stromelysin-1 (MMP-3) gene predicts progression of angiographically determined coronary artery disease in men in the LOCAT gemfibrozil study. Lopid Coronary Angiography Trial. Atherosclerosis 1998;139:49-56.
81
[75] Hung C.C., Farooqi I.S., Ong K. és mtsai: Contribution of Variants in the Small Heterodimer Partner Gene to Birthweight, Adiposity, and Insulin Levels: Mutational Analysis and Association Studies in Multiple Populations Diabetes 2003;52:1288-1291. [76] Hyppönen E., Läärä E., Reunanen A. és mtsai: Intake of vitamin D and risk of type 1 diabetes: a birth-cohort study. Lancet 2001;358:1500-1503. [77] Ingles S.A., Garcia D.G., Wang W. és mtsai: Vitamin D receptor genotype and breast cancer in Latinas (United States). Cancer Causes Control 2000;11:25-30. [78] Iwai N., Shimoike H., Nakamura Y., Tamaki S., Kinoshita M.: The 4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor gene is associated with the time course of progression to acute coronary syndromes. Atherosclerosis 1998;136:109-114. [79] James R.W., Leviev I., Ruiz J., Passa P., Froguel P., Garin M.C.: Promoter polymorphism T(-107)C of the paraoxonase PON1 gene is a risk factor for coronary heart disease in type 2 diabetic patients. Diabetes 2000;49:1390-1393. [80] Kao Y.L., Donaghue K., Chan A., Knight J., Silink M.: A novel polymorphism in the aldose reductase gene promoter region is strongly associated with diabetic retinopathy in adolescents with type 1 Diabetes. Diabetes1999;48:1338-1340. [81] Kee F., Amouyel P., Fumeron F. és mtsai: Lack of association between genetic variations of apo A-I-C- III- A-IV gene cluster and myocardial infarction in a sample of European male: ECTIM study. Atherosclerosis 1999;145:187-195. [82] Kennedy C., Naipal A., Gruis N.A. és mtsai: MICA gene polymorphism is not associated with an increased risk for skin cancer. J Invest Dermatol 2002;118:686-691. [83] Kim H.S., Newcomb P.A., Ulrich C.M. és mtsai: Vitamin D receptor polymorphism and the risk of colorectal adenomas: evidence of interaction with dietary vitamin D and calcium. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001;10:869-874. [84] Kimura H., Gejyo F., Suzuki Y., Suzuki S., Miyazaki R., Arakawa M.: Polymorphisms of angiotensin converting enzyme and plasminogen activator inhibitor-1 genes in diabetes and macroangiopathy1. Kidney Int 1998;54:1659-1669.
82
[85] Kitagawa I., Kitagawa Y., Kawase Y., Nagaya T., Tokudome S.: Advanced onset of menarche and higher bone mineral density depending on vitamin D receptor gene polymorphism. Eur J Endocrinol 1998;139:522-527. [86] Kretowski A., Mironczuk K., Karpinska A. és mtsai: Interleukin-18 promoter polymorphisms in type 1 Diabetes. Diabetes 2002;51:3347-3349. [87] Kuschel B., Auranen A., McBride S. és mtsai: Variants in DNA double - strand break repair genes and breast cancer susceptibility. Hum Mol Genet 2002;11:1399-1407. [88] Kuzela D.C., Huffer W.E., Conger J.D., Winter S.D., Hammond W.S.: Soft tissue calcification in chronic dialysis patients. Am J Pathol 1977;86:403-424. [89] Lakatos P.L., Bajnok É., Hegedus D. és mtsai: Vitamin D receptor, oesrogen receptoralpha- gene and interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphisms in Hungarian patients with primary biliary cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002;14:733- 740. [90] Lambert J.C., Araria-Goumidi L., Myllykangas L. és mtsai: Contribution of APOE promoter polymorphisms to Alzheimer's disease risk. Neurology 2002;59:59-66. [91] Lambert J.C., Goumidi L., Vrieze F.W. és mtsai: The transcriptional factor LBP1c/CP2/LSF gene on chromosome 12 is a genetic determinant of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet 2000;9:2275-2280. [92] Lambert J.C., Luedecking-Zimmer E., Merrot S. és mtsai: Association of 3'-UTR polymorphisms of the oxidised LDL receptor 1 (OLR1) gene with Alzheimer's disease. J Med Genet 2003;40:424-430. [93] Lambert J.C., Pasquier F., Cottel D., Frigard B., Amouyel P., Chartier-Harlin M.C.: A new polymorphism in the APOE promoter associated with risk of developing Alzheimer's disease. Hum Mol Genet 1998;7:533-540. [94] Langdahl B.L., Gravholt C.H., Brixen K. és mtsai: Ploymorphisms in the vitamin D receptor gene and bone mass, bone turnover and osteoporotic fractures. Eur J Clin Invest 2000;30:608-617.
83
[95] Lee S., Clark S.A., Gill R.K., Christakos S.: 1,25- Dihydroxyvitamin D3 and pancreatic ß-cell function: vitamin D receptors, gene expression and insulin secretion. Endocrinology 1994;134:1602-1610. [96] Levecque C., Elbaz A., Clavel J. és mtsai: Association between Parkinson's disease and polymorphisms in the nNOS and iNOS genes in a community-based case- control study. Hum Mol Genet 2003;12:79- 86. [97] Liao A., Nitsch R.M., Greenberg S.M. és mtsai: Genetic association of an alpha2macroglobulin (Val1000lle) polymorphism and Alzheimer's disease. Hum Mol Genet 1998;7:1953-1956. [98] Liu Z.H., Guan T.J., Chen Z.H., Li L.S.: Glucose transporter (GLUT1) allele (XbaI-) associated with nephropathy in non-insulin- dependent diabetes mellitus. Kidney Int 1999;55:1843-1848. [99] London G.M.: Left ventricular alterations and end- stage renal disease. Nephrol Dial Transplant 2002;17 Suppl 1:29-36. [100] Longstreth W.T. Jr., Rosendaal F.R., Siscovick D.S. és mtsai: Risk of stroke in young women and two prothrombotic mutations: factor V Leiden and prothrombin gene variant (G20210A) Stroke 1998;29:577-580. [101] Lorentzon M., Lorentzon R., Nordstrom P.: Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with birth height, growth to adolescence, and adult stature in healthy caucasian men: a cross-sectional and longitudinal study. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:1666-1670. [102] Lorentzon M., Lorentzon R., Nordstrom P.: Vitamin D receptor gene polymorphism is related to bone density, circulating osteocalcin, and parathyroid hormone in healthy adolescent girls. J Bone Miner Metab 2001;19:302-307. [103] Lucotte G., Mercier G., Burckel A.: Fok I polymorphism at the human vitamin D receptor gene locus in Europeans and Africans. Clin Genet 1999;55:281- 282.
84
[104] Lucotte G., Mercier G., Burckel A.: The vitamin D receptor FokI start codon polymorphism and bone mineral density in osteoporotic postmenopausal French women. Clin Genet 1999;56:221-224. [105] Mackness B., Mackness M.I., Arrol S. és mtsai: Serum paraoxonase (PON1) 55 and 192 polymorphism and paraoxonase activity and concentration in non-insulin dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis 1998;139:341-349. [106] MacLeod M.J., Dahiyat M.T., Cumming A., Meiklejohn D., Shaw D., St Clair D.: No association between Glu/Asp polymorphism of NOS3 gene and ischemic stroke. Neurology 1999;53:418-420. [107] Maegawa H., Shi K., Hidaka H. és mtsai: The 3'- untranslated region polymorphism of the gene for skeletal muscle-specific glycogen-targeting subunit of protein phosphatase 1 in the type 2 diabetic Japanese population. Diabetes 1999;48:1469-1472. [108] Mann C.L., Davies M.B., Boggild M.D. és mtsai: Glutathione S-transferase polymorphisms in MS: their relationship to disability. Neurology 2000;54:552-557. [109] Mannami T., Katsuya T., Baba S. és mtsai: Low Potentiality of Angiotensin-Converting Enzyme Gene Insertion/Deletion Polymorphism as a Useful Predictive Marker for Carotid Atherogenesis in a Large General Population of a Japanese City : The Suita Study. Stroke 2001;32:1250-1256. [110] Maruyama H., Izumi Y., Oda M. és mtsai: Lack of an association between cystatin C gene polymorphisms in Japanese patients with Alzheimer's disease. Neurology 2001;57:337339. [111] Marco M.P., Craver L., Betriu A. és mtsai: Influence of vitamin D receptor gene polymorphisms on mortality risk in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2001;38:965974. [112] Marco M.P., Martínez I., Amodeo M.L. és mtsai: Vitamin D receptor genotype influences parathyroid hormone and calcitriol leveles in predialysis patients. Kidney Int 1999;56:1349-1353.
85
[113] Mathieu C., Decallonne B., van Etten E.: 1,25-dihydroxyvitamin D3: the endocrine system meets the immune system Verh K Acad Geneeskd Belg 2002;64:71-80. [114] Mathieu C., Laureys J., Sobis H., Vandeputte M., Waer M., Bouillon R.: 1,25Dihydroxyvitamin D3 prevents insulitis in NOD mice. Diabetes 1992;41:1491-1495. [115] Mathieu C., Waer M., Casteels K., Laureys J., Bouillon R.: Prevention of type I diabetes in NOD mice by nonhypercalcemic doses of a new structural analog of 1,25dihydroxyvitamin D3, KH1060. Endocrinology 1995;136:866-872. [116] Mathieu C., Waer M., Laureys J., Rutgeerts O., Bouillon R.: Prevention of autoimmune diabetes in NOD mice by 1,25 dihydroxyvitamin D3. Diabetologia 1994;37:552- 558. [117] McDermott M.F., Ramachendran A., Ogunkolade B.W. és mtsai: Allelic variations in the vitamin D receptor influences susceptibility to IDDM in Indian Asians. Diabetologia 1997;40:971-975. [118] McGregor J.M., Harwood C.A., Brooks L. és mtsai: Relationship between p53 codon 72 polymorphism and susceptibility to sunburn and skin cancer. J Invest Dermatol 2002;119:84-90. [119] Mee J.B., Cork M.J.: Vitamin D receptor polymorphism and calcipotriol response in patients with psoriasis. J Invest Dermatol 2002;110:301-3028. [120] Melk A., Henne T., Kollmar T. és mtsai: Cytokine single nucleotide polymorphisms and intrarenal gene expression in chronic allograft nephropathy in children. Kidney Int 2003;64:314-320. [121] Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F.: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucleic Acids Research 1988;16:1215. [122] Minamitani K., Takahashi Y., Minagawa M. és mtsai: Difference in height associated with a translation start site polymorphism in the vitamin D receptor gene. Pediatr Res 1988;44:628-632.
86
[123] Misbahuddin A., Placzek M.R., Chaudhuri K.R., Wood N.W., Bhatia K.P., Warner T.T.: A polymorphism in the dopamine receptor DRD5 is associated with blepharospasm. Neurology 2002;58:124-126. [124] Mitchell S.M., Weedon M.N., Owen K.R. és mtsai: Genetic variation in the small heterodimer partner gene and young-onset type 2 diabetes, obesity, and birth weight in U.K. subjects. Diabetes 2003;52:1276-1279. [125] Miyamoto K., Kesterson R.A., Yamamoto H. és mtsai: Structural organization of the human vitamin D receptor chromosomal gene and its promoter. Mol Endocrinol 1997;11:1165-1179. [126] Monti L.D., Barlassina C., Citterio L. és mtsai: Endothelial nitric oxide synthase polymorphisms are associated with type 2 Diabetes and the insulin resistance syndrome. Diabetes 2003;52:1270-1275. [127] Morrison N.A., Qi J.C., Tokita A. és mtsai. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature 1994;367:284- 287. [128] Muzny D., Arenson A.D., Adams C. és mtsai. VDR gene. Genbank accession nr. AC004466. [129] Nakajima K., Tanaka Y., Nomiyama T. és mtsai: Chemokine receptor genotype is associated with diabetic nephropathy in Japanese with type 2 Diabetes. Diabetes 2002;51:238-242. [130] Narita I., Goto S., Saito N. és mtsai: Angiotensinogen gene variation and renoprotective efficacy of renin-angiotensin system blockade in IgA nephropathy. Kidney Int 2003;64:1050-1058. [131] Nickerson D.A., Taylor S.L., Weiss K.M. és mtsai: DNA sequence diversity in a 9.7kb region of the human lipoprotein lipase gene. Nat Gene t 1998;19:233-240. [132] Nielsen D.M., Ehm M.G., Weir B.S.: Detecting marker-disease association by testing for Hardy-Weinberg disequilibrium at a marker locus. Am J Hum Genet 1998;63:15311540.
87
[133] Norman A.W., Collins E.D.: Vitamin D and gene expression. Gene Interactions in Health and Disease, CRC Press, Orlando, USA, 348-391., 2001. [134] Norman A.W., Frankel B.J., Helt A.M., Grodsky G.M.: Vitamin D deficiency inhibits pancreatic secretion of insulin. Science 1980;209:823-825. [135] Norman A.W., Okamura W.H., Bishop J.E., Henry H.L.: Update on biological actions of 1alpha,25(OH)2- vitamin D3 (rapid effects) and 24R,25(OH)2-vitamin D3. Mol Cell Endocrinol 2002;197:1-13. [136] Ongphiphadhanakul B., Rajatanavin R., Chanpraserthyothin S. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with urinary calcium excretion but not with bone mineral density in postmenopausal women. J Endocrinol Invest 1997;20:592-596. [137] Orth M., Tabrizi S.J., Schapira A.H.: Sporadic inclusion body myositis not linked to prion protein codon 129 methionine homozygosity. Neurology 2000;55:1235. [138] Ou T., Yamakawa-Kobayashi K., Arinami T. és mtsai: Methylenetetrahydrofolate reductase and apolipoprotein E polymorphisms are independent risk factors for coronary heart disease in Japanese: a case- control study. Atherosclerosis 1998;137:23-28. [139] Pani M.A., Knapp M., Donner H. és mtsai: Vitamin D receptor allele combinations inluence genetic susceptibility to type 1 diabetes in Germans. Diabetes 2000;49:504-507. [140] Paz Marco M., Martínez I., Amodeo M.L., Borrás M., Saracho R., Almirall J. és mtsai. Vitamin D receptor genotype influences parathyroid hormone and calcitriol levels in predialysis patients. Kidney Int 1999;56:1349-1353. [141] Peltekova V.D., Rubin L., Uitterlinden A.G., Hawker G., Vieth R., Trang H. és mtsai. Direct Hapoltyping at the Vitamin D Receptor Locus Improves Genetic Resolution. J Bone Miner Res 1997;12:494-495. [142] Penno G., Chaturvedi N., Talmud P.J. és mtsai: Effect of angiotensin- converting enzyme (ACE) gene polymorphism on progression of renal disease and the influence of ACE inhibition in IDDM patients: findings from the EUCLID Randomized Controlled Trial. EURODIAB Controlled Trial of Lisinopril in IDDM. Diabetes 1998;47:1507- 1511.
88
[143] Peters U., McGlynn K.A., Chatterjee N. és mtsai: Vitamin D, calcium, and vitamin D receptor polymorphism in colorectal adenomas. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001;10:1267-1274. [144] Pike JW.: Vitamin D3 receptors: structure and function in transcription. Ann Rev Nutrition 1991;11:189-216. [145] Pollak R.D., Blumenfeld A., Bejarano-Achache I., Idelson M., Celinke Hochner D.: The BsmI vitamin D receptor gene polymorphism in Israeli populations and in perimenopausal and osteoporotic Ashkenazi women. Am J Nephrol 2001;21:185-188. [146] Portale A.A., Halloran B.P., Morris R.C.: Physiologic regulation of the serum concentration of 1,25-dihydroxyvitamin D by phosphorus in normal men. J Clin Invest 1989;83:1494-1499. [147] Pyo C.W., Hur S.S., Kim Y.K., Kim T.Y., Kim T.G.: Association of TAP and HLADM genes with psoriasis in Koreans. J Invest Dermatol 2003;120:616-622. [148] Ranade K., Wu K.D., Hwu C.M. és mtsai: Genetic variation in the human urea transporter- 2 is associated with variation in blood pressure. Hum Mol Genet 2001;10:21572164. [149] Reid C.L., Perrey C., Pravica V., Hutchinson I.V., Campbell I.T.: Genetic variation in proinflammatory and anti-inflammatory cytokine production in multiple organ dysfunction syndrome. Crit Care Med 2002;30:2216-2221. [150] Renner W., Pabst E., Paulweber B. és mtsai: The angiotensin-converting-enzyme insertion/deletion polymorphism is not a risk factor for peripheral arterial disease. Atherosclerosis 2002;165:175-178. [151] Ribeiro S., Ramos A., Brandao A., Rebelo J.R., Guerra A., Resina C., és mtsai. Cardiac valve calcification in haemodialysis patients:role of calcium-phosphate metabolism. Nephrol Dial Transplant 1998;13:2037-2040. [152] Richard F., Fromentin-David I., Ricolfi F. és mtsai: The angiotensin I converting enzyme gene as a susceptibility factor for dementia. Neurology 2001;56:1593-1595.
89
[153] Richter-Hintz D., Their R., Steinwachs S. és mtsai: Allelic variants of drug metabolizing enzymes as risk factors in psoriasis. J Invest Dermatol 2003;120:765- 770. [154] Rieder M.J., Taylor S.L., Clark A.G., Nickerson D.A.: Sequence variation in the human angiotensin converting enzyme. Nat Genet 1999;22:59-62. [155] Riggs B.L., Nguyen T.V., Melton L.J., és mtsai: The contribution of vitamin D receptor gene alleles to the determination of bone mineral density in normal and osteoporotic women. J Bone Miner Res 1995;10:991-996. [156] Rossi E., McQuillan B.M., Hung J. és mtsai: Serum Ferritin and C282Y Mutation of the Hemochromatosis Gene as Predictors of Asymptomatic Carotid Atherosclerosis in a Community Population Stroke 2000;31:3015-3020. [157] Rostand S.G., Brunzell J.D., Cannon R.O., Victor R.G.: Cardiovascular complications in renal failure. J Am Soc Nephrol 1991;2:1053-1062. [158] Ruggiero M., Pacini S., Aterini S. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with metastatic breast cancer. Oncol Res 1998;10:43-46. [159] Saeki H., Asano N., Tsunemi Y. és mtsai: Polymorphisms of vitamin D receptor gene in Japanese patients with psoriasis vulgaris. J Dermatol Sci 2002;30:167-171. [160] Saggese G., Frederico G., Balestri M., Torriolo A.: Calcitriol inhibits the PHA-induced production of IL-2 and IFN-gamma and the proliferation of human peripheral blood leukocytes while enhancing the surface expression of HLA class II molecules. J Endocrinol Invest 1989;12:329-335. [161] Sarmanova J., Benesova K., Gut I., Nedelcheva-Kristensen V., Tynkova L., Soucek P.: Genetic polymorphisms of biotransformation enzymes in patients with Hodgkin's and nonHodgkin's lymphomas. Hum Mol Genet 2001;10:1265-1273. [162] Schneider S., Roessli D., Excoffier L.: Arlequin ver. 2.000: a Software for Population Genetics Data Analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland 2000
90
[163] Schroeder S., Reck M., Hoeft A., Stuber F.: Analysis of two human leukocyte antigenlinked polymorphic heat shock protein 70 genes in patients with severe sepsis. Crit Care Med 1999;27:1265-1270. [164] Sentinelli F., Romeo S., Arca M. és mtsai: Human resistin gene, obesity, and type 2 Diabetes: mutation analysis and population study. Diabetes 2002;51:860-862. [165] Shannon B., Gnanasampanthan S., Beilby J., és mtsai. A Polymorphism in the Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Predisposes to Colorectal Cancers with Microsatellite Instability. Gut 2002;50:520- 524. [166] Sheehan D., Bennett T., Cashman K.: An assessment of genetic markers as predictors of bone turnover in healthy adults. J Endocrinol Invest 2001;24:236-245. [167] Sheehan D., Bennett T., Cashman K.: The genetics of osteoporosis: vitamin D receptor gene polymorphisms and circulating osteocalcin in healthy Irish adults. Ir J Med Sci 2001;170:54-57. [168] Sosa M., Torres A., Dominguez C. és mtsai: Genetic polymorphism of vitamin D receptor and osteoporosis. Med Clin (Barc) 1998;110:646-650. [169] Sosa M., Torres A., Martin N. és mtsai: The distribution of two different vitamin D receptor polymorhisms (BsmI and start codon) in primary hyperparathyroidism. J Intern Med 2000;247:124-130. [170] Speer G., Cseh K., Winkler G. és mtsai: Vitamin D and estrogen receptor gene polymorphisms in type 2 diabetes mellitus and in android type obesity. Eur J Endocrinol 2001;144:385-389. [171] Speer G., Dworak O., Cseh K. és mtsai: Vitamin D receptor gene BsmI polymorphism correlates with erbB-2/HER-2 expression in human rectal cancer. Oncology 2000;58:242247. [172] Stene L.C., Ulriksen J., Magnus P., Joner G.: Use of cod liver oil during pregnancy associated with lower risk of Type I diabetes in the offspring. Diabetologia 2000;43:10931098.
91
[173] Stern C.: The Hardy-Weinberg Law. Science 1943;97:137–138. [D5] Stumvoll M., Tschritter O., Fritsche A és mtsai: Association of the T-G polymorphism in adiponectin (exon 2) with obesity and insulin sensitivity: interaction with family history of type 2 Diabetes. Diabetes 2002;51:37- 41. [174] Suarez F., Zeghoud F., Rossignol C. és mtsai: Association between vitamin D receptor gene polymorphism and sex-dependent growth during the first two years of life. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:2966-2970. [175] Tamminen M., Kakko S., Kesaniemi Y.A., Savolainen M.J.: A polymorphic site in the 3' untranslated region of the cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene is associated with low CETP activity. Atherosclerosis 1996;124:237- 247. [176] Talmud P.J., Palmen J., Luan J. és mtsai. Variation in the promoter of the human hormone sensitive lipase gene shows gender specific effects on insulin and lipid levels: results from the Ely study Biochimica et Biophysica Acta 2001;1537:239-244. [177] Thamer C., Koch M., Haap M., Machicao F., Haring H.U., Stumvoll M.: Association of the ACE gene I/D polymorphism with insulin sensitivity depends on the presence of additional macroangiopathic risk factors. Atherosclerosis 2002;160:257-258. [178] Thomasset M.: Vitamin D and the immune system. Pathol Biol 1994;42:163-172. [179] Tokita A., Matsumoto H., Morrison N.A. és mtsai: Vitamin D receptor alleles, bone mineral density and turnover in premenopausal Japanese women. J Bone Miner Res 1996;11:1003-1009. [180] Uitterlinden A.G., Fang Y., Bergink A.P., van Meurs .JB., van Leeuwen H.P., Pols H.A.: The role of vitamin D receptor gene polymorphisms in bone biology. Mol Cell Endocrinol 2002;197:15-21. [181] Uitterlinden A.G., Pols H.A., Burger H. és mtsai. A large-scale population-based study of the association of vitamin D receptor gene polymorphism with bone mineral density. J Bone Miner Res 1996;11:1241- 1248.
92
[182] Vasseur F., Helbecque N., Dina C. és mtsai: Single-nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM1 gene modulate adipocytesecreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians. Hum Mol Genet 2002;11:2607-2614. [183] Verhoeff B.J., Trip M.D., Prins M.H., Kastelein J.J., Reitsma P.H.: The effect of a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation on levels of homocysteine, folate, vitamin B12 and on the risk of premature atherosclerosis. Atherosclerosis 1998;141:161166. [184] Voetsch B., Benke K.S., Damasceno B.P. és mtsai: Paraoxonase 192 GlnArg Polymorphism: An Independent Risk Factor for Nonfatal Arterial Ischemic Stroke Among Young Adults. Stroke 2002;33:1459-1464. [185] Wang X.L., Greco M., Sim A.S., Duarte N., Wang .J, Wilcken D.E.: Effect of CYP1A1 MspI polymorphism on cigarette smoking related coronary artery disease and diabetes. Atherosclerosis 2002;162:391-397. [186] Wei-Zhen Y., Fernandes Reis A., Velho G.: Identification of a novel Tru9I polymorphism in the human vitamin D receptor gene. J Hum Genet 2000;45:56- 57. [187] Weinberg W.: Über den Nachweis der Vererbung beim Menchen. Jahresh. Verein f. vaterl. Naturk. in Wüttemberg 1908;64:368- 382. [188] Weisberg I.S., Park E., Ballman K.V. és mtsai: Investigations of a common genetic variant in betaine- homocysteine methyltransferase (BHMT) in coronary artery disease. Atherosclerosis 2003;167:205-214. [189] Werth V.P., Berlin J.A., Callen J.P., Mick R., Sullivan K.E.: Mannose binding lectin (MBL) polymorphisms associated with low MBL production in patients with dermatomyositis. J Invest Dermatol 2002;119:1394-1399. [190] Werth V.P., Callen J.P., Ang G., Sullivan K.E.: Associations of tumor necrosis factor alpha and HLA polymorphisms with adult dermatomyositis: implications for a unique pathogenesis. J Invest Dermatol 2002;119:617-620.
93
[191] Wilkie H., Osei-Lah A., Chioza B., Nashef L., McCormick D., Asherson P., Makoff A.J.: Association of mu-opioid receptor subunit gene and idiopathic generalized epilepsy. Neurology 2002;59:724-728. [192] Wong T.Y., Poon P., Chow K.M., Szeto C.C., Cheung M.K., Li P.K.: Association of transforming growth factor-beta (TGF-beta) T869C (Leu 10Pro) gene polymorphisms with type 2 diabetic nephropathy in Chinese. Kidney Int 2003;63:1831-1835. [193] Wu J.H., Lee Y.T., Hsu H.C., Hsieh L.L.: Influence of CETP gene variation on plasma lipid levels and coronary heart disease: a survey in Taiwan. Atherosclerosis 2001;159:451458. [194] Zappia M., Cittadella R., Manna I. és mtsai: Genetic association of alpha2macroglobulin polymorphisms with AD in southern Italy. Neurology 2002;59:756-758. [195] Zee R.Y., Lindpaintner K., Struk B., Hennekens C.H., Ridker P.M.: A prospective evaluation of the CD14 C(-260)T gene polymorphism and the risk of myocardial infarction. Atherosclerosis 2001;154:699-702. [196] Zella J.B., DeLuca H.F.: Vitamin D and autoimmune diabetes. J Cell Biochem 2003;88:216-222. [197] Zito F., Lowe G.D., Rumley A., McMahon A.D., Humphries S.E.: WOSCOPS Study Group West of Scotland Coronary Prevention Study. Association of the factor XII 46C>T polymorphism with risk of coronary heart disease (CHD) in the WOSCOPS study. Atherosclerosis 2002;165:153-158. [198] Zittermann A.: Vitamin D in preventive medicine: are we ignoring the evidence? Br J Nutr. 2003;89:552-572. [199] Zusterzeel P.L., Peters W.H., Visser W. és mtsai: A polymorphism in the gene for microsomal epoxide hydrolase is associated with pre-eclampsia. J Med Genet 2001;38:234237.
94
[200] Xu P.Y., Liang R., Jankovic J., Hunter C. és mtsai: Association of homozygous 7048G7049 variant in the intron six of Nurr1 gene with Parkinson's disease. Neurology 2002;58:881-884. [201] Yamakawa-Kobayashi K., Somekawa Y., Fujimura M. és mtsai: Relation of the 514C/T polymorphism in the hepatic lipase gene to serum HDL and LDL cholesterol levels in postmenopausal women under hormone replacement therapy. Atherosclerosis 2002;162:1721. [202] Ye P., Chen B., Wang S.: Association of polymorphisms of the apolipoprotein B gene with coronary heart disease in Han Chinese. Atherosclerosis 1995;117:43-50. [203] Ye W.Z., Reis A.F., Dubois-Laforgue D. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphisms are associated with obesity in type 2 diabetic subjects with early age of onset. Eur J Endocrinol 2001;145:181-186. [204] Ye W.Z., Reis A.F., Velho G.: Identification of a novel Tru9I polymorphism in the human vitamin D receptor gene. J Hum Genet 2000;45:56-57. [205] Yamada S., Akita H., Kanazawa K. és mtsai: T102C polymorphism of the serotonin (5-HT) 2A receptor gene in patients with non- fatal acute myocardial infarction. Atherosclerosis 2000;150:143-148. [206] Yamada Y., Yoshida H., Ichihara S. és mtsai: Correlations between plasma plateletactivating factor acetylhydrolase (PAF-AH) activity and PAF-AH genotype, age, and atherosclerosis in a Japanese population. Atherosclerosis 2000;150:209- 216. [207] Yokohama K., Shigematsu T., Kagami S. és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphism detected by digestion with ApaI influences the parathyroid response to extracellular calcium in Japanese chronic dialysis patients. Nephron 2001;89:315-320. [208] Yokoyama K., Shigematsu T., Tsukada T. és mtsai:. ApaI polymorphism in the vitamin D receptor gene may affect the parathyroid response in Japanese with end-stage renal disease. Kidney Int 1998;53:454-458.
95
Saját közlemények jegyzéke 1. Gyorffy B, Vásárhelyi B, Krikovszky D, Madácsy L, Tordai A, Tulassay T, Szabó A: Gender-specific association of vitamin D receptor polymorphism combinations with type 1 diabetes mellitus, Eur J Endocrinol 2002;147: 803- 808. (2002-es IF: 2.56, közlemény típusa: klinikai tanulmány) 2. Gyorffy B, Szabó A, Vásárhelyi B: A D-vitamin receptor genetikai polimorfizmusok populációgenetikai összefüggései klinikai kórállapotokkal, Orv Hetil 2003;41:11-16 (közlemény típusa: összefoglaló referátum) 3. Kocsis I, Gyorffy B, Vásárhelyi B: Testing of HW equilibrium in population genetic studies: an underused analytical tool for the detection of association between gene polymorphism and disease in papers published in Kidney International between 1998 and 2003, Kidney Int (közlésre elfogadva, 2002-es IF: 5.01, közlemény típusa: technikai cikk) 4. Gyorffy B, Kocsis I, Vásárhelyi B: Missed calculations and new conclusions: recalculation of genotype distribution data published in J Invest Dermatol, 1998- 2003, J Invest Dermatol (közlésre elfogadva, 2002-es IF: 3.74, közlemény típusa: levél a szerkesztohöz) 5. Gyorffy B, Kocsis I, Vásárhelyi B: Biallelic genotype distributions in papers published in Gut between 1998 and 2003: altered conclusions after re-calculating the Hardy-Weinberg equilibrium, Gut (közlésre elfogadva, 2002-es IF: 6.23, közlemény típusa: levél a szerkesztohöz)
Idézheto konferencia absztraktok:
96
Formázott: Felsorolás és számozás
1. Gyorffy B, Sü
veges Zs, Tulassay T,
Szabó A, Vásárhelyi B: Parathyroid Function and Vitamin D Receptor Polymorphisms in Hemodyalised Uremic Patients, Nephrol Dial Transpl 2003, 18, supplement 4: 24 2. Gyorffy B, Vannay Á, Héninger E, Tulassay T, Szabó A: Retinoid Receptors: loss of Correlation with the Vitamin D Receptor in Experimental Renal Failure, Nephrol Dial Transpl 2003, 18, supplement 4: 138
3. Gyorffy B, Sü
veges Zs, Vásárhelyi B,
Szabó A: Associations Between Vitamin-D Receptor Polymorphisms and Parathyroid Function in Dialysed Patients, J Am Soc Nephrol 2002, Abstracts Issue 13:515A.
97
4. Gyorffy B, Vásárhelyi B, Krikovszky D, Madácsy L, Tordai A, Tulassay T, Szabó A: Vitamin D receptor polymorphisms: effect on development of type I diabetes in Hungarian children, Pediatric Nephrology 2002,17:C83 5. Gyorffy B, el-Shakmak A, Vannay Á, Reichel H, Szabó A: Bone turnover: independent changes of PTH and bone remodelling markers in experimental renal failure, Nephrol Dial Transpl 2002, Supplement 1: 63 6. Gyorffy B, Vannay Á, Héninger E, Reichel H, Szabó A: Vitamin K: effects on bone metabolism in experimental renal failure, Nephrol Dial Transpl 2001, 6: A28
98
