!HU000003913T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 913
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/47
(21) Magyar ügyszám: E 05 774775 (22) A bejelentés napja: 2005. 08. 29. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050774775 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1794189 A1 2006. 03. 09. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1794189 B1 2008. 06. 04.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20041026931 2004. 08. 31.
(73) Jogosult: Friesland Brands B. V., 7943 PE Meppel (NL)
NL
(72) Feltalálók: DE SLEGTE, Jaap, Doetinchem (NL); KLARENBEEK, Gijsbertus, Ommen (NL) (54)
(2006.01) C12P 21/06 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06025731 PCT/NL 05/000622
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
ACE inhibitor terjsavó-hidrolizátumok
(57) Kivonat
HU 003 913 T2
A találmány tárgya antihipertenzív hatású vegyület. Részletezve a találmány tárgya ACE (angiotenzin I átalakító enzim) inhibitor peptidek felszabadítása tejsavófehérjékbõl. A találmány tárgya eljárás angiotenzinátalakító enzim (angiotensin-converting enzyme, ACE) inhibitor aktivitású fehérjehidrolizátum enzimatikus elõállítására, azzal jellemezve, hogy egy elsõ
reakciólépésben széles spektrumú endoproteázzal kezelnek béta-laktoglobulin (BLG)-tartalmú szubsztrátot, amelyet egy második reakciólépésben prolinspecifikus endoproteázzal végzett kezelés követ. A találmány tárgya továbbá az ilyen eljárásokkal elõállítható ACE-inhibitor-hidrolizátum és a hidrolizátumok alkalmazása.
A leírás terjedelme 8 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 913 T2
A találmány tárgya antihipertenzív hatású készítmény. Részletezve a találmány tárgya ACE (angiotenzin I átalakító enzim) inhibitor peptidek felszabadítása tejsavófehérjékõl. A hipertenzió vagy magas vérnyomás fontos rizikófaktor a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásában, amelyek a nyugati világban a legfõbb halálozást kiváltó okok. Becslések szerint a világon 5 felnõttbõl 1 szenved hipertenzióban. Akkor hivatkozunk hipertenzióra, ha a szisztolés vérnyomás átlagosan 140 Hg mm vagy nagyobb, és/vagy a diasztolés vérnyomás átlagosan 90 Hg mm vagy nagyobb. Általánosan kisebb értékek vonatkoznak a terhes nõkre. A gyermekek vérnyomása normálisan 120/70 Hg mm alatti. A hipertenzió felgyorsítja az artériák öregedését és növeli a szív terhelését. Minél öregebb egy artéria, annál nagyobb a sérülésének az esélye. A hipertenzió a szervezet összes artériáját károsítja, ami szívrohamhoz, szélütéshez vagy a vesék károsodásához vezethet. Ennek elkerülésére szükséges a hipertenzió gyógyszeres kezelése. Hagyományosan a hipertenziót antihipertenzív gyógyszerek beadásával elõzik meg és a táplálkozási szokások és az életstílus beállításával. Az ACE fontos szerepet játszik a vérnyomás fenntartásában. A humán testben az ACE az angitenzin I¹bõl az angiotenzin II létrehozásáért felelõs. A vérben lévõ angiotenzin II mennyiségének a növekedése inter alia a következõ hatásokat váltja ki: (1) vérerek összehúzódása (vazokonstrikció); (2) aldoszteron kibocsátása az adrenal cortexbõl és vazopresszin (antidiuretikus hormon=ADH) kibocsátása a neurohipofízisbõl; és (3) a szomjúságérzet növelése, hogy több víz ivása történjen. Az ACE blokkolása és az angiotenzin II vérbeli mennyisége növekedésének a megelõzése hipertenzív páciensekben a vérnyomás csökkenését eredményezi. Ezért az ACE-inhibitorok fontosak a hipertenzió szabályozásában a gyógyászatban. Azonban a piacon lévõ szintetikus ACE-inhibitoros gyógyászati készítmények egy hátránya, hogy gyakran van kellemetlen mellékhatásuk, mint amilyen a száraz köhögés. Az irodalomban az elmúlt 10 évben tejfehérjékbe potenciálisan beépített bioaktív peptidekrõl rendszeresen írtak. Mindenféle hidrolizátumot gyártottak tejfehérjékbõl, vagy enzimek segítségével, vagy in situ fermentációs eljárásokon keresztül (sajt, joghurt), amelyekben ezeket a bioaktív peptideket demonstrálták. Ezen bioaktív peptidek egyik legfontosabb tulajdonsága az ACE-reakción keresztüli vérnyomáscsökkentés. ACEinhibitor peptidek – vagy fermentációval in situ kialakított proteinhidrolizátumként – elõnyös „természetes” antihipertenzív vegyületek. Egyes peptideket nagyon hatásosnak találtak a hipertenzió kezelésére vagy megelõzésére. Pontosan nem ismert, hogy az ACE-inhibitor-peptideknek milyen szerkezeti jellemzõknek kell megfelelniük, de van valamilyen hasonlóság azon peptidek között, amelyekrõl már bizonyították, hogy ACE-inhibitorok. Ezek általában rövid peptidek (2–4 aminosav) hidrofób aminosavval a C¹terminális végükön. Továbbá a prolin aminosa-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
vat gyakran említik, amely terminálisan, általában C¹terminálisan van jelen a peptiden. A Calpis Co. Ltd. japán cég állított elõ ACE-inhibitor-peptideket fermentációval. Ezek általában kis peptidek, amelyekre a prolin aminosav jelenléte jellemzõ és a nagy ACE-inhibitor-aktivitás. A fermentációval elõállított aktív peptidek fõleg olyan szekvenciákból állnak, amelyek szerkezetében van prolin; nevezetesen ValPro-Pro vagy Ile-Pro-Pro [Nakamura, Y. és munkatársai, (1996), J. Dairy Sci. 78; 777–783]. További antihipertenzív aktivitású peptideket ismertetnek inter alia a következõben: Nouchikusangiyou, Snow Brand, Symbicom AB és Nisshin Flour Milling Co. Ltd. (10–17. hivatkozás). Számos vállalat vitt piacra nem régiben ACE-inhibitor-aktivitású hidrolizátumokat és/vagy fermentált termékeket egy másik tulajdonsággal kombináltan. Így a WO 01/85984 számú nemzetközi közzétételi irat (Davisco) eljárást ismertet tejsavó fehérjébõl ACE-inhibitor-peptidek felszabadítására különbözõ típusú iparilag elérhetõ proteázok segítségével, ideértve a sertés tripszint. Itt véletlenül nem fehérjekoncentrátumot alkalmaztak kiindulási anyagként, hanem egy tisztított tejsavófehérje-terméket, tejsavófehérje-izolátumot. Egy a tripszin hatásával elõállított hidrolizátumról azt találták továbbá, hogy patkányokban, orális beadást követõen antihipertenzív hatása van. Ennek a hidrolizátumnak a hidrolízis mértéke („degree of hydrolysis”, %DH) körülbelül 6% és a BIOZATE (www.daviscofoods.com) termékcsaláddal vitték piacra. A hidrolízis mértéke azt jelöli, hogy egy fehérje peptidkötései milyen mértékben lettek hidrolizálva egy enzimes hidrolizálási reakció eredményeként. Az 50% DH azt jelöli, hogy az adott enzim az enzim számára elérhetõ peptidkötések 50%¹át hidrolizálta. Továbbá az ilyen típusú hidrolizátumokra egy további jellemzõt ismertettek (WO 03/063778 számú nemzetközi közzétételi irat), ahol, az ACE-inhibíción kívül a peptidkeverékben van koleszterinszint (kis sûrûségû lipoprotein) csökkentõ hatás is. Valio WO 01/32906 számú nemzetközi közzétételi irata kazein fermentációt ismertet tejsavbaktériumok segítségével, hogy felszabaduljanak antihipertenzív hatású peptidek. Az ezzel az eszközzel elõállított terméket fermentált termékként vitték a piacra az Evolus terméknéven. Errõl a termékrõl azt is mondják, hogy addicionális tulajdonsága van, miszerint növeli vagy javítja ásványi anyagok abszorpcióját ezen peptidek hatására. Ezeket a peptideket jellemzik továbbá nagy Val-Pro-Pro vagy Ile-Pro-Pro peptidkoncentrációk, hasonlóan a CALPIS termékéhez. Nyilvánvaló, hogy fontos mérhetõ vérnyomáscsökkenéshez, hogy az aktív peptideknek/hidrolizátumoknak elégséges ACE-inhibitor-aktivitásuk legyen. Egy ACE-inhibitor, mint amilyen egy peptid vagy hidrolizátum ACE-inhibitor-aktivitását általában az IC50-értékkel fejezik ki. Ez az érték azt mutatja, hogy mekkora peptid¹/hidrolizátumkoncentráció szükséges az ACE-aktivitás 50%¹os csökkentéséhez. Minél alacsonyabb az IC50-értéke egy ACE-inhibitornak, annál erõsebb az ACE-inhibitor aktivitása.
1
HU 003 913 T2
A találmány célja erõs ACE-inhibitor-aktivitású hidrolizátumok adása. A találmány tárgya eljárás angiotenzinátalakító enzim (ACE)-inhibitor-aktivitású fehérjehidrolizátum enzimatikus elõállítására, amely eljárás tartalmazza bétalaktoglobulin (a továbbiakban: BLG)-dúsított fehérje kezelését széles spektrumú endoproteázzal egy elsõ reakció során, amely után, egy második reakciólépésben, prolinspecifikus proteázos kezelés következik. Az ilyen eljárás, az ismert ACE-inhibitor-aktivitású hidrolizátumokhoz képest, legalább háromszor kisebb IC50értékû fehérjehidrolizátumot eredményez (lásd az 1. táblázatot). Az elsõ reakciólépésben a fehérjehidrolizátumot viszonylag nagy hidrolízis mértékre hidrolizáljuk, általában körülbelül 10%–körülbelül 15% értékre, annak érdekében, hogy prolintartalmú peptideket tegyünk szubsztrátként elérhetõvé prolinspecifikus proteáz számára, hogy ezzel egy második lépésben C¹terminális prolin aminosavas peptidek jöjjenek létre. Még nem lett ismertetve korábban a találmány szerinti kétlépéses hidrolízis folyamat, amely egy BLG-dúsított fehérjeszubsztrátra alkalmazott széles spektrumú proteázos elsõ hidrolízislépést és prolinspecifikus proteázos második hidrolízislépést tartalmaz. Habár a BLG vagy a BLG-ben gazdag tejsavófehérje-koncentrátum ismert, mint ACE-inhibitor-peptid-forrás, de benne nem alkalmaztak még prolinspecifikus proteázt. Abubakar és munkatársai meghatározták 7 különbözõ enzimmel elõállított tejsavófehérje-hidrolizátum ACE-inhibitor-aktivitását, amely enzimek a következõk voltak: tripszin, proteináz¹K, aktináz¹E, termolizin, papain, pepszin és kimotripszin. Azt találták, hogy az enzim specifitása nagy hatással volt az ACE-inhibitor aktivitására az eredményül kapott hidrolizátumoknak, és azt találták, hogy a biológiai aktivitás 4 domináns fehérjétõl származott (BLG; alfa-laktoglobulin, ALA; vérszérumalbumin, BSA; és immunglobulinok, Ig) [Abubakar és munkatársai, 1996, Tokohu J. Agric. Res., 47 (1¹2):1¹8]. Újabb munkái Abubakar és munkatársainak 9 peptidszekvencia azonosítását ismertetik, amelyek közül a BLG tripeptid (f78–80; Ile-Pro-Ala) mutatta a legerõsebb antihipertenzív aktivitást hipertenzív patkányokon (Abubakar és munkatársai, 1998, J. Dairy Sc, 12: 3131–3138). Mullally és munkatársai izoláltak egy peptidet (f142–148) tripszinnel elõállított borjú BLG hidrolizátumból. Ennek a peptidnek az IC50-értéke 43 mmol/L (Mullally és munkatársai, 1997. FEBS Letters, 402: 99–101). Továbbá BLG-dúsított tejsavófehérje-izolátum hidrolizátumait elõállították és vizsgálták õket az ACE-inhibitor-aktivitásukra. A WO 01/85984 számú nemzetközi közzétételi irat (Davisco International Foods, Inc) ACE-inhibitor-hidrolizátumok elõállítását ismerteti különbözõ kereskedelmi tejsavófehérje-koncentrátumra sertés tripszin vagy bakteriális proteáz alkalmazása révén. Itt összehasonlítást végzünk az ioncsere-kromatográfiával elõállított standard tejsavófehérje-izolátum (94% fehérje) (BiPRO, Davisco Foods International, LeSueur, MN) és a BLGdúsított tejsavófehérje-izolátum ACE-inhibitor-aktivitása között. A tisztított standard izolátumból kapott hidrolizátumról azt találtuk, hogy alacsonyabb volt az IC50-érté-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
kük (290–450 mg/ml), mint a BLG-dúsított izolátumból nyert hidrolizátumnak (530–900 mg/ml). Ez meglepõ volt, mivel a BLG (f142–148) peptidet alkalmaztuk referenciának a vizsgálat során, amelynek a legalacsonyabb volt az IC50-értéke (40 mg/ml). Így, éppen mint a találmány, a WO 01/85984 számú nemzetközi közzétételi irat ACE-inhibitor-peptid-hidrolizátum elõállítását ismerteti BLG-dúsított tejsavófehérje-koncentrátumból. Azonban a WO 01/85984 számú nemzetközi közzétételi iratban az eljárás egyetlen hidrolizációs lépést tartalmaz (vagy tripszinnel, vagy bakteriális proteázzal), míg a találmány szerinti eljárást kétlépéses hidrolízisfolyamat jellemzi egy széles spektrumú proteázt követõen egy prolinspecifikus proteáz. Továbbá a találmány szerinti hidrolizátum ACE-inhibitor-aktivitása sokkal nagyobbnak bizonyul, mint a tejsavófehérje-koncentrátumok ismert hidrolizátumainak az aktivitása (lásd az alábbi 3. táblázatot). Nagyon meglepõ az a felismerés, hogy a BLG hidrolízise prolinspecifikus endoproteázzal (PSE) a találmány szerinti eljárásba egy olyan hidrolizátumot eredményez, amelynek az IC50-értéke viszonylag alacsony. Ahogy azt fent említettük a különösen erõs ACE-inhibitor-tripeptidek (például Val-Pro-Pro vagy Ile-Pro-Pro) nagy koncentrációban tartalmaznak (terminális) prolin aminosavat. Azonban a BLG eredetû ACE-inhibitorpeptidek (lásd 2. táblázat) semelyike sem tartalmaz C¹terminális prolin aminosavat, és csak néhány peptid [f(32–40); f(78–80); f(142–146) és f(142–148)] tartalmaz belsõ prolin aminosavat. Továbbá a BLG-ben lévõ összes fehérjetartalom viszonylag alacsony (5%) például a kazeinnel összehasonlítva (11%), amely egy sokat alkalmazott tejfehérje a (tejsavas) fermentációval történõ ACE-inhibitor-peptidek kialakítására. Tehát a PSE hatása alatt, viszonylag kevés peptid keletkezik terminális prolin aminosavval. Tehát nem nyilvánvaló prolinspecifikus endoproteáz alkalmazása a BLG-bõl történõ ACE-inhibitor-peptid felszabadításra. A találmány most bemutatja, hogy a találmány szerinti kétlépéses kezelést követõen a BLG-hidrolizátumnak nagyobb ACE-inhibitor-aktivitása van, mint a kazein hidrolizátumnak, annak ellenére, hogy a kazein nagyobb mennyiségben tartalmaz prolint (lásd az 1. táblázatot). Ebbõl azt a következtetést lehet levonni, hogy az egyedi specifikus aminosavszekvenciák a terminális peptiddel határozzák meg az ACE-inhibitor-aktivitást, és nem az általános, terminális prolint tartalmazó peptidek. Elõnyösen a találmány szerinti eljárást olyan szubsztráton végezzük, amely fehérjék keverékébõl áll, amelyek közül legalább 25% BLG, mint például 30% vagy 35% BLG, elõnyösen legalább 40% BLG, mint 45%, 50% vagy 55%, elõnyösebben legalább 60% BLG, mint 65% vagy 70%. Továbbá, (tisztított) BLG is alkalmazható szubsztrátként. Azonban nem szabad elfeledkeznünk arról, hogy ez esetben az ACE-inhibitor hidrolizátum elõállítási költségei magasabbak lesznek, mivel jobban tisztított fehérjeszubsztrátot alkalmazunk kiindulási anyagnak. A béta-laktoglobulinnal dúsított tejsavófehérje-koncentrátum egy elõnyös kiindulási anyag a találmány
1
HU 003 913 T2
szerinti eljárásban. BLG-dúsított WPC elõállítható a többi fehérje, fõleg ALA, BSA és Ig¹specifikus körülmények alkalmazása általi kicsapásával. A sótlanítás, hõmérséklet és pH egyedi kombinációja denaturálja a megfelelõ fehérjéket, ami után ezek aggregálnak és centrifugálisan vagy membránszûréssel elválaszthatóak. A tejsavó adja a termelési folyamatba belépõ tej térfogatának 80–90%¹át és az eredeti tej tápanyagainak, mint például fehérjék, laktóz, vitaminok és ásványi anyagok, körülbelül 50%¹át tartalmazza. A múltban a tejsavót mindig a sajtipar hulladékának tekintették, de a sajt tejsavó elhelyezése súlyos környezeti gondokat okoz. Azonban, mivel a fehérjéknek jó funkcionális tulajdonságaik vannak, ezért napjainkban nagy az érdeklõdés a tejsavónak ezen fehérjék extrakciójára történõ alkalmazására. A tejsavónak csupán 0,55%¹a áll fehérjébõl. Száraz anyagra vetítve ez 10%. A tejsavófehérjék egy heterogén keveréket alkotnak, amelybõl a fõ fehérjék a b¹laktoglobulin (50%), a¹laktoglobulin (ALA; 20%), vérszérumalbumin (BSA; 5%) és immunglobulinok (Ig; 12%). A szárazanyag-tartalomnak legalább 50–60%¹ra történõ növelésére a tejsavót betöményítik vagy szárítják. Tejsavófehérje-koncentrátumot (WPC) állítanak elõ a tejsavó frakcionálásával és betöményítésével ultracentrifugálással. Ahogy további betöményedés játszódik le, különbözõ fehérjeszintek keletkeznek a tejsavófehérje-koncentrátumban. Az iparilag elõállított WPC-ket alacsony fehérjetartalmú WPC (25–40%¹os fehérjetartam), közepes fehérjetartalmú WPC (45–60%¹os fehérjetartam) és nagy fehérjetartalmú WPC (60–80%¹os fehérjetartam) kategóriákba osztályozzák. Minél nagyobb a WPC fehérjetartalma, annál több BLG érhetõ el az ACE-inhibitor-peptidekké történõ hidrolízisre. Mivel a tejsavófehérje körülbelül 50% BLG-bõl áll, ezért a nagy fehérjetartalmú WPC 30–40% BLG¹t tartalmaz, amelyet elégséges WPC-ként alkalmazni a találmány szerinti eljárásban. Azonban az alacsony fehérjetartalmú és a közepes fehérjetartalmú WPC¹k BLG-tartalma gyakran túl alacsony. A körülbelül 55–60%¹os vagy ennél alacsonyabb fehérjetartalmú WPC¹k esetében tehát szükséges a dúsítás a BLG¹re. A megfelelõ kereskedelmi WPC¹k közé tartozik a Domovictus 535 a BDI-tõl (35% fehérje, amelynek 85%¹a BLG); a Hiprotal 880 a BDI-tõl (80% fehérje, amelynek 50–55%¹a BLG) és a Hiprotal 580 (80% fehérje, amelynek 80–85%¹a BLG), melyek mindegyike beszerezhetõ a Borculo Domo Ingredients (BDI) cégtõl, Zwolle, Hollandia. A találmány szerinti eljárásban az elsõ lépésben széles spektrumú endoproteázként különbözõ endoproteázok alkalmazhatóak. A megfelelõ endoproteázok állati, növényi vagy mikrobiális eredetûek. Elõnyös a mikrobiális széles spektrumú endoproteáz, mivel ezek gyakran könnyen beszerezhetõek kereskedelmileg viszonylag megfelelõ áron. Kémiailag vagy genetikailag módosított mutáns proteázok is alkalmasak lehetnek. A széles spektrumú proteáz lehet szerin-proteáz vagy metalloproteáz, elõnyösen alkáli mikrobiális proteáz. Az alkáliproteázok példái a szubtilizinek (EC 3.4.21.62), különösen a Bacillus fajokból származóak, például szubtilizin Novo, szubtilizin Carlsberg, szubtili-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
zin 309, szubtilizin 147 és szubtilizin 168 (a WO 89/06279 nemzetközi közzétételi iratban ismertetve) és kimotripszin (EC 3.4.21.1), amely elsõsorban hidrofób aminosavak, mint például Tyr, Trp, Phe és Leu, C¹terminális oldalán hidrolizálja a peptidkötést, az elsõ reakciólépésben kettõ vagy több endoproteáz keveréke is alkalmazható. A megfelelõ kereskedelemben kapható proteázok közé tartozik az Alcalase™, Savinase™, Primase™, Everlase™, Esperase™ és Kannase™ (Novozymes A/S), a Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OXP™, FN2™, és FN3™ (Genencor International Inc.), a Corolase™ és Veron™ (AB Enzymes). Elõnyösen az Alcalase™ enzimet alkalmazzuk az elsõ reakciólépésben. A találmány egy további megvalósítási módja szerint széles spektrumú proteázként aszpartát-proteázt alkalmazunk. Csakúgy, mint a PSE-nek, ennek az enzimnek is savas pH optimuma van, amelynek az az elõnye, hogy nem kell beállítani a pH¹értékét az elsõ lépést követõen. Adott esetben egylépéses hidrolízisben aszpartát-proteázt egyidejûleg alkalmazzuk a PSE-vel. Azonban ebben az esetben figyelembe kell venni azt a tényt, hogy a széles spektrumú proteáz a PSE enzimet is el tudja hidrolizálni. Az elsõ reakciólépés hossza különbözõ tényezõktõl függ, mint például az alkalmazott enzim és/vagy szubsztrát. Elõnyösen addig játszódik le hidrolízis, amíg legalább 8%¹os mértékû hidrolízist, elõnyösebben legalább 10%¹os, mint például 12% vagy 15% mértékû hidrolízist nem érünk el. A legtöbb említett széles spektrumú proteázra igaz, hogy az adott enzimre megfelelõ körülmények között (pH, hõmérséklet, sókoncentráció és a hasonlók), elérhetõ ilyen mértékû hidrolízis néhány óra alatt. Az elsõ inkubációs lépést követõen az alkalmazott széles spektrumú endoproteáz elõnyösen inaktiválásra kerül, hogy megelõzzük a PSE-nek a széles spektrumú proteáz általi hidrolízisének a lehetõségét a második reakciólépés során. Az enziminaktiválásra szolgáló eljárások ismertek szakember számára, mint például a hõkezelés vagy az enzimaktivitást gátló vegyület alkalmazása. A második reakciólépést prolinspecifikus endopeptidázzal végezzük (PSE; EC 3.4.21.26). A találmány szerinti eljárásban alkalmazható megfelelõ PSE például az A. niger prolinspecifikus endopeptidáza, mint például a piacon EndoPro néven ismert enzim, amelyet a WO 02/45524 számú nemzetközi közzétételi irat ismertet. Egy további megvalósítási mód szerint a második reakciólépésben a Flavobacterium meningosepticum prolinspecifikus endoproteázát alkalmazzuk. A találmány tárgya továbbá angiotenzinátalakító enzim (ACE)-inhibitor-aktivitású fehérjehidrolizátum, amely elõállítható a fent ismertetett eljárással. A hidrolizátumra jellemzõ az erõs ACE-inhibitor-aktivitás (lásd a 3. táblázatot) és ezért elõnyösen alkalmazhatóak az ACE-aktivitás gátlására emlõsökben, mint például emberben. A hidrolizátum megfelelõ állatorvosi alkalmazásra is, például kutyában vagy macskában. Mivel az ACE gátlásának antihipertenzív hatása van in vivo, ezért az ACE-inhibitor-hidrolizátum alkalmazható a hi-
1
HU 003 913 T2
pertenzió kezelésére. A találmány szerinti hidrolizátum különbözõ termékekké alakítható, mint például folyékony és száraz termékek. Amennyiben ez kívánatos, akkor további, késõbbi (downstream) feldolgozás történik például ultraszûréses (UF) kezelés formájában. Az enzimeknek sokkal nagyobb molekulatömegük van, mint a peptideknek és elválaszthatóak az ACE-inhibitor-peptidektõl UF alkalmazásával. Az UF további elõnye, hogy azok a fehérjeszubsztrátok, amelyek nem lettek lebontva az enzimek által szintén elválaszthatóak a biológiailag aktív hidrolizátumtól. Feltételezhetõen az orális bevételt követõen a találmány szerinti hidrolizátum peptidei a gyomorba intakt vagy gyakorlatilag intakt formában kerülnek, hogy ezt követõen a véráramba kerüljenek. A széles spektrumú proteáz a találmány szerinti eljárás elsõ lépésében szélesebb szubsztrátspecifitású, mint a kefeszegélyproteázok a belek falában, ezért a találmány szerinti hidrolizátum nem vagy csak nehezen hidrolizálódik tovább az orális bevételt követõen. Adott esetben egyéb ACE-inhibitorokkal kombinációban is alkalmazható a hidrolizátum. A találmány egy további szempontja szerint az ACE-inhibitor-hidrolizátumot megelõzõ módon alkalmazzuk hipertenzió megelõzésére, például olyan személyben, akinek genetikai hajlama van a hipertenzióra vagy, ha olyan gyógyszerek kerülnek alkalmazásra, amelyek mellékhatásként hipertenziót okoznak. Azon túl, hogy hatásosak a hipertenzióra, az ACEinhibitorok szintén hatásosnak bizonyultak a szívelégtelenségre. A találmány szerinti eljárással elõállított ACE-inhibitor-hidrolizátum, ezért alkalmazható szívproblémák esetén is, például koronáriát követõen a kiújulást megelõzni. Ennek megfelelõen a találmány tárgya kezelési eljárás az ACE-aktivitás gátlására emlõsben, amely tartalmazza a találmány szerinti eljárással elõállított ACEinhibitor-hidrolizátum, elõnyösen orális, beadását az ACE-aktivitás gátlásához szükséges mennyiségben és gyakoriságban. A találmány egy még további szempontja szerint a találmány tárgya kezelési eljárás hipertenziós tünetek csökkentésére emlõsben, amely tartalmazza a találmány szerinti hidrolizátum, elõnyösen orális, beadását a hipertenzió tüneteinek gátlásához szükséges mennyiségben és gyakoriságban. A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti ACE-inhibitor-hidrolizátumot tartalmazó készítmény. Ilyen ACE-inhibitor/antihipertenzív aktivitású készítmény például a gyógyászati készítmény vagy az élelmiszer vagy a luxusélelmiszer. Az ACE-inhibitor-készítmény lehet szilárd vagy folyékony alakban. Lehet például por vagy tabletta. Elõnyösen a találmány szerinti ACE-inhibitor-készítmény folyékony, mint például folyékony tejtermék, gyümölcslé vagy egyéb típusú iható termék, amely inter alia alkalmazható hipertenzió megelõzésére. Végül a találmány tárgya a találmány szerinti készítmény alkalmazása szív vagy keringési betegségek (megelõzõ) kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. Részletezve, az elkészítendõ gyógyszer emlõsben
2
ACE-aktivitást gátló gyógyszer; vérnyomáscsökkentõ gyógyszer; és/vagy (megelõzõen) gyógyszer hipertenzió elõfordulására. Kísérletes rész Az ACE-inhibíció in vitro mérése A peptidek vagy egyéb termékek (például hidrolizátumok) ACE-inhibitor-aktivitásának in vitro meghatározását a következõ módon végeztük: – Borátból, nátrium-kloridból álló, pH=8,3 mérõpuf10 ferben oldottuk a terméket. – A mérésre alkalmazott szubsztrát a Hippuril-HisLeu volt a Sigmától (H1635). – Az ACE enzim is a Sigmától származik (A6778). Egy mikroküvettában inkubáltuk a szubsztrátot 15 38 °C¹on az ACE enzimmel és spektrofotométeresen 260 nm¹en követtük az aktivitást. A vizsgálandó peptid vagy hidrolizátum jelenlétében ennek az aktivitásnak az inhibícióját mértük, amelyet az enzim aktivitásának 20 50%¹os csökkentéséhez szükséges termék mennyiségeként fejeztünk ki. Ezt az inhibíciót a mérendõ termék négy különbözõ koncentrációjára határoztuk meg. 5
25
30
35
40
45
50
55
60 5
1. Kísérlet Kétlépéses hidrolízis eljárást alkalmazva ACE-inhibitor-peptideket szabadítottunk fel tej- vagy tejsavófehérjékbõl. Az elsõ lépésben a fehérjéket Alcalase (Novozymes) alkalmazásával hidrolizáltuk Bacillus lichenformis széles spektrumú endoproteázával. Ennek érdekében 2,5 g fehérjét oldottunk 50 ml vízben. A pH¹értékét 8,0¹ra állítottuk 4 M NaOH-val. A reakciókeveréket rázató vízfürdõre tettük 60 °C hõmérsékletre, ami után Alcalase¹t (125 ml tiszta enzim) adtunk hozzá. Az inkubációt 4 órát végeztük. Az inkubációs idõszak végén a pH¹értékét 5,0¹ra állítottuk 4 M HCl-lel. Ezután inaktiváltuk 5 perces 95 °C¹os inkubálással a széles spektrumú endoproteázt. Ezt követõen a reakciókeverék készen állt a második reakciólépésre a prolinspecifikus endoproteázzal (PSE; úgy is, mint endoprolil hidroláz) az EndoPro-val (DSM), amely az Aspergillus niger prolil hidroláza. Az 1 U/gramm fehérje enzim/szubsztrát arány eléréséhez, 556 ml EndoPro¹t adtunk a reakciókeverékhez. Az inkubáció 50 °C¹on történt rázató vízfürdõben. A t=0, 60, 180, 360 és 1440 perc idõpontokban 200 ml mintát vettünk, amelyet tízszeresére hígítottunk és inaktiváltunk 95 °C¹on 5 percet. Ezután meghatároztuk a kapott hidrolizátum IC50-értékét. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. A kísérlet során vizsgált fehérjeszubsztrátok a következõek: 1. Domovictus 535 (BDI); egy WPC körülbelül 35% fehérjével, amelynek körülbelül 85%¹a BLG 2. Hiprotal 580 (BDI); egy WPC 80% fehérjével, amelynek 80%¹a BLG 3. Kazein (Sigma) 4. Hiprotal 880 (BDI); egy WPC 80% fehérjével, amelynek 50%¹a BLG 5. Béta-laktoglobulin (Sigma) 6. Alfa-laktalbumin (Sigma)
1
HU 003 913 T2
2
1. táblázat A prolinspecifikus proteázos kezelés hatása az ACE-inhibitor-aktivitásra, amelyet az elõzõleg széles spektrumú proteázzal kezelt fehérjeszubsztrát IC50 (mg/ml) értékeként fejeztünk ki. Fehérje száma
Fehérjeszubsztrát
t=0 (perc)
60
180
360
1440
30,1
23,1
14,6
15,4
16,8
1.
Domovictus 535
2.
Hiprotal 1580
20,1
13,8
7,6
11,2
14,7
3.
Kazein
64,2
35,2
27,2
23,2
19,8
4.
Hiprotal 880
20,4
14,8
11,4
10,1
20,3
5.
b-laktoglobulin
23,0
14,6
13,3
10,8
18,7
6.
a-laktalbumin
26,9
24,5
26,9
24,0
20,8
Az elsõ széles spektrumú proteázos hidrolízis lépést követõen a hidrolizátumok IC50-értékei 20,1 mg/ml (Hiprotal 580) és 64,2 mg/ml (kazein) között változtak, amint azt az 1. táblázat t=0 oszlopában mutatjuk. Az ezt követõ 60 perces prolinspecifikus endoproteázos (PSE) kezelés elégségesnek bizonyult a Hiprotal 580, Hiprotal 880 és a BLG esetében 15 mg/ml alatti IC50-érték eléréséhez. Három órás PSE inkubáció további IC50-érték csökkenést eredményez, miközben a Hiprotal 580 hidrolizátum (úgy is nevezik, hogy Hydrohiprotal 980) esetében egy nagyon alacsony 7,6 mg/ml¹es értéket értünk el. Az inkubációs idõszak 6 órára való elnyújtása (t=360 perc) egy prolinspecifikus proteázzal az IC50-érték további (kis mértékû) csökkenését eredményezi számos fehérjeszubsztrát esetében, az IC50-értékek újra növekedést mutatnak 24 órás inkubációt követõen (t=1440 perc). Tehát úgy tûnik van egy optimális inkubációs idõszakasz, amelyet az a tény magyarázhat, hogy a
hidrolízis elõrehaladtával az éppen csak elõállított ACEinhibitor-peptidek tovább bomlanak peptidekre, amelyeknek alacsonyabb az ACE-inhibitor-aktivitásuk. Az 1. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a 20 BLG-dúsított fehérjeszubsztrátból (Domovictus 535, Hiprotal 580, Hiprotal 880 és BLG) elõállított hidrolizátumoknak a kétlépéses eljárás szerint angiotenzin I átalakító enzim (ACE)-inhibitor-aktivitásuk van, amely körülbelül háromszor alacsonyabb, mint amit eddig 25 megfigyeltek tejsavófehérjékre. Az is kitûnik az 1. táblázat eredményeibõl, hogy a magasabb prolintartalom ellenére a kazeinszubsztrát (11% prolin) alacsonyabb ACE-inhibitor-aktivitást eredményez a kétlépéses enzimes kezelést követõen, mint a BLG-dúsított szubsztrá30 ton alapuló hidrolizátum (5% prolin). Látszólag egyes terminális prolinos specifikus szekvenciák a meghatározóak az ACE-inhibitor-aktivitás tekintetében, és nem csak a terminális prolint tartalmazó peptidek.
2. táblázat A BLG eredetû ACE-inhibitor-peptidek szakirodalmi IC50-értékei. Peptid
IC50 (mmol/L)
IC50 (mg/mL)
Hivatkozás
f(142–148)
43
40
(8)
f(78–80)
141
42
(9)
f(9–14)
580
390
(10)
f(15–20)
1682
1170
(10)
f(22–25)
1062
430
(11)
f(32–40)
635
616
(11)
f(102–103)
122
86
(12), (8)
f(81–83)
1029
404
(11)
f(94–100)
946
807
(11)
f(102–105)
172
95
(12), (8)
f(104–105)
350
97
(12), (8)
f(106–111)
788
515
(11)
f(142–146)
521
296
(11)
f(146–149)
1153
620
(12), (8)
6
1
HU 003 913 T2
2. Kísérlet Ebben a kísérletben a találmány szerinti hidrolizátumok in vitro ACE-inhibitor-aktivitását (20 óráig Alcalase-zal kezelt Hiprotal 580, ezt követõen 3 órás hidrolízis prolinspecifikus endoproteázzal) hasonlítottuk össze a következõ, kereskedelmi forgalomban elérhetõ, hidrolizátumok ACE-inhibitor-aktivitásával, amelyek közül néhánynak antihipertenzív hatása van. DMV hidrolizátum (standard fehérjehidrolizátum gyermektáplálékban való alkalmazásra) CE90 ACE (DMV termék, amely állítólag gátolja az ACE¹t; lásd: www.dmv-international.com) DI 3065 hidrolizátum (Aria) (79,8% protein) LE 80 BM hidrolizátum (DMV) (81,7% fehérje) CE 90 STL hidrolizátum (DMV) (83,5% fehérje) CE 90 CPP hidrolizátum (DMV) (87,0% fehérje) A jelen lévõ fehérje mennyisége körülbelül 80% és 90% között van a különbözõ termékekben. Az ACE-inhibitor-aktivitás mérése elõtt 200–250 mg terméket oldottunk 20 ml inkubációs pufferben. Miután a termék teljesen feloldódott, az oldatot 40X¹re hígítottuk az inkubációs pufferrel. Ezt a hígítást alkalmaztuk az ACEinhibitor-aktivitás meghatározására. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. 3. táblázat Kereskedelemben kapható fehérjehidrolizátumok kísérletes IC50-értékeinek az összehasonlítása a találmány szerinti ACE-inhibitor-hidrolizátummal.
5
10
15
20
25
30 Termék
A találmány szerinti hidrolizátum
IC50 (mg/ml)
7,2
DMV hidrolizátum
47,0
CE90 ACE (DMV)
35,0
DI 3065 (Arla)
33,0
LE 80 BM (DMV)
44
CE90 STL (DMV)
>44
CE90 CPP (DMV)
>44
Evolus (VALIO)
>44
Biozate (DAVISCO)
62
A kapott eredményekbõl úgy tûnik, hogy néhány kereskedelmi termék (DMV, Aria, Davisco) IC50-értéke ugyanabban a tartományban van, mint a standard tejfehérjehidrolizátumoké (30–40 mg/ml). Meglepõ módon a találmány szerinti BLG dúsított hidrolizátum IC50-értéke körülbelül ötször alacsonyabb (körülbelül 7 mg/ml) és ennek megfelelõen az aktivitása ötször nagyobb, mint az egyéb standard tejsavófehérje-hidrolizátumoké.
35
40
45
50
55 Hivatkozások 1. Process for producing fermented milk containing angiotensin converting enzyme inhibitory peptide and process for producing milk serum; CALPIS CO, LTD.; EP 1142481A1
60 7
2
2. Process for producing fermented milk containing angiotensin converting enzyme inhibitory peptide and process for producing milk serum; CALPIS CO, LTD.; EP 1142481A4 3. HIGH YIELD PRODUCTION OF CURDS AND WHEY CONTAINING AN ACE INHIBITOR PEPTIDE (VAL-PRO-PRO AND/OR ILE-PRO-PRO) MADE UNDER STIRRING CONDITIONS; CALPIS CO, LTD; NZ0513305A 4. Process for producing granules containing angiotensin- converting enzyme inhibiting peptides; CALPIS CO, LTD.; US 6428812 5. GRANULES FOR ORAL ADMINISTRATION, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND TABLETS PRODUCED FROM THE GRANULES; CALPIS CO, LTD.; WO 0041677A1 6. GRANULATED MATERIAL, ITS PRODUCTION AND TABLET USING THE SAME; CALPIS CO., LTD.; JP 200020405A2 7. Method of purifying whey of lactic acid fermentation by electrodialysis; CALPIS CO. LTD; US 6204362 8. Mullally et al.; Identification of a novel angiotensinI-converting enzyme inhibitory peptide corresponding to a tryptic fragment of bovine [beta]-lactoglobulin; FEBS Lett. 402 (1997), 99–101. 9. Abubakar et al.; Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion; J. of Dairy Sci. 81 (1998), 3131–3139. 10. Pihlanto-Leppala et al.; Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins; Int. Dairy J. 8 (1998), 325–331. 11. Pihlanto-Leppala et al.; Angiotensin-I-converting enzyme 5 inhibitory properties of whey protein digests: concentration and characterization of active peptides; J. of Dairy Res. 67 (2000), 53–64. 12. NEW PEPTIDE AND ITS UTILIZATION; SNOW BRAND CO. LTD.; JP 0829088A2 13. Human [beta]-casein, process for producing it and use thereof; o SYMBICOM AKTIEBOLAG; US 5739407 14. GENE ENCODING A HUMAN BETA-CASEIN PROCESS FOR OBTAINING THE PROTEIN AND USE THEREOF IN AN INFANT FORMULA; SYMBICOM EP 0599978A1 15. GENE ENCODING A HUMAN BETA-CASEIN PROCESS 5 FOR OBTAINING THE PROTEIN AND USE THEREOF IN AN INFANT FORMULA; SYMBICOM AKTIEBOLAG; WO 9304172A3 16. GENE ENCODING A HUMAN BETA-CASEIN PROCESS FOR OBTAINING THE PROTEIN AND USE THEREOF IN AN INFANT FORMULA; SYMBICOM AKTIEBOLAG; WO 9304172A2 17. New peptide and angiotensin transferase inhibitor; NTSSHIN FLOUR MILLING CO. LTD; JP 04082898A2 18. Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals; DAVISCO; WO 0185984
1
HU 003 913 T2
19. Reducing cholesterol with hydrolyzed whey protein; DAVISCO; WO 03/063778 A2. 20. Process for producing a product containing antihypertensive tripeptides; VALIO; WO 01/32906. 5 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás angiotenzinátalakító enzim (angiotensinconverting enzyme, ACE) inhibitor aktivitású fehérjehidrolizátum enzimatikus elõállítására, azzal jellemezve, hogy egy elsõ reakciólépésben széles spektrumú endoproteázzal kezelünk béta-laktoglobulin (BLG)-tartalmú szubsztrátot, amelyet egy második reakciólépésben prolinspecifikus endoproteázzal végzett kezelés követ. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szubsztrát tejsavófehérje-koncentrátum (WPC), elõnyösen olyan WPC, amely dúsított béta-laktoglobulinnal (BLG). 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szubsztrát legalább 25%, elõnyösen legalább 35%, elõnyösebben legalább 60% BLG¹t tartalmaz. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a széles spektrumú endoproteáz szerin-proteáz, metalloproteáz vagy aszpartát-proteáz. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a széles spektrumú endoproteáz mikrobiális proteáz, elõnyösen Bacillus lichenformisból vagy Bacillus subtilisbõl izolált proteáz. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prolinspecifikus endoproteáz az EC 3.4.21.26 szerinti prolinspecifikus endoproteáz. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az elsõ reakciólépést addig folytatjuk, míg körülbelül 10–körülbelül 15%¹os hidrolízismértéket nem érünk el.
10
15
20
25
30
35
2
8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a második reakciólépést legalább 0,5 óráig, elõnyösen legalább 1 óráig, és még elõnyösebben legalább 2 óráig, legelõnyösebben legalább 3 óráig végezzük. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a második reakciólépést legfeljebb 24 óráig, elõnyösen legfeljebb 16 óráig, és még elõnyösebben legfeljebb 10 óráig végezzük. 10. Fehérjehidrolizátum, amely angiotenzinátalakító enzim (angiotensin-converting enzyme, ACE) inhibitor aktivitású és az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítható elõ. 11. A 10. igénypont szerinti hidrolizátumot tartalmazó készítmény, amely elõnyösen gyógyászati készítmény vagy élelmiszer vagy luxusélelmiszer. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, amelyben a készítmény folyékony termék, mint például tejtermék vagy gyümölcslé, vagy szilárd termék, mint például por. 13. A 10. vagy 11. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlõsben, elõnyösen emberben vérnyomáscsökkentésre és/vagy hipertenzió elõfordulásának megelõzésére alkalmas, ACE-aktivitás gátlására szolgáló gyógyszer elõállítására. 14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az emlõs hipertenzióban szenvedõ vagy megemelkedett hipertenziókockázatú ember. 15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az ACE-aktivitás gátlása tartalmazza a 11. vagy 12. igénypont szerinti készítmény orális beadását az ACE-aktivitás gátlásához szükséges mennyiségben és gyakoriságban. 16. A 13. vagy 14. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a hipertenzió csökkentése tartalmazza a 11. vagy 12. igénypont szerinti készítmény orális beadását a hipertenzió csökkentéséhez szükséges mennyiségben és gyakoriságban.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest