MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Význam mikroRNA v molekulární patologii nádorů slinivky břišní Bakalářská práce
Soňa Klusová
Vedoucí práce: Mgr. Petra Faltejsková
Brno 2013
Bibliografický záznam
Autor:
Soňa Klusová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Význam mikroRNA v molekulární patologii nádorů slinivky břišní
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Petra Faltejsková
Akademický rok:
2013
Počet stran:
65+2
Klíčová slova:
nádory slinivky břišní, mikroRNA, qRT-PCR
Bibliographic Entry
Author:
Soňa Klusová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
Significance of microRNA in molecular pathology of pancreatic cancer
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Petra Faltejsková
Academic Year:
2013
Number of Pages:
65+2
Keywords:
pancreatic tumours, microRNA, qRT-PCR
Abstrakt Východisko: Nádory slinivky břišní jsou charakteristické vysokou agresivitou a mortalitou. Většina případů je zjištěna až v pozdním stádiu metastázování, čímž se vyhlídky na úspěšnou léčbu zcela ztrácejí. Včasná diagnostika a zlepšení prognózy pacientů zůstávají velkou výzvou do budoucna. Cíl práce: Cílem této práce je porovnání exprese pěti mikroRNA ve zdravých a nádorových tkáních, konkrétně miR-21, miR-181a, miR-203, miR-217 a miR-222. Práce je dále zaměřena na hledání nového biomarkeru, který by pomohl odlišit nádory slinivky břišní od chronické pankreatitidy. Metody: Hladiny jednotlivých mikroRNA byly analyzovány pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Jako nejvhodnější endogenní kontrola pro normalizaci dat byla identifikována RNU48. Vyhodnocení dat bylo provedeno pomocí softwaru GraphPad Prism s využitím Mann-Whitneyho testu, Kruskal-Wallisova testu, ROC analýzy a Kaplan-Meierovy analýzy. Výsledky: Výledky nám potvrdily funkci miR-217 jako nádorového supresoru a zároveň potenciálního biomarkeru pro odlišení chronické pankreatitidy od nádorů slinivky břišní. Souvislost mezi celkovým přežíváním a hladinou miR-217 nebyla prokázána. Ostatní mikroRNA se v nádorových tkáních nacházely ve zvýšené míře, což poukazuje na jejich onkogenní funkci. Závěr: Nádorově supresorová miR-217 je rozdílně exprimovaná ve zdravé sliznici, v tkáních chronické pankreatitidy a v nádorových buňkách. Tímto miR-217 potvrdila svou funkci potenciálního biomarkeru odlišujícího tyto dvě diagnózy. Avšak přesné funkce a cílové struktury této mikroRNA nejsou doposud zcela jasné, proto je bude potřeba ověřit pomocí in vitro analýz.
Abstract: Background: Pancreatic tumours are characterized by their aggressiveness and high mortality rate. Majority of the cases are detected in their late stages with metastasis, thus the chance of successful treatment is completely lost. Early diagnosis and prognosis improvement are still a great future challenge. Purpose: The aim of this thesis is to compare the expression of five microRNAs in normal and tumour tissues, specifically miR-21, miR-181a, miR-203, miR-217 and miR-222. The study is also focused on analysis of markers which could distinguish pancreatic tumours from chronic pancreatitis.
Methods: We assessed the levels of particular microRNAs using quantitative real-time PCR. RNU48 was selected as the most appropriate endogenous control for data normalization. Data evaluation was performed by software GraphPad Prism using Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, ROC analysis and Kaplan-Meier analysis.
Results: Our results demonstrated a function of miR-217 as a tumor suppressor and also as a potential biomarker of chronic pancreatitis. The relationship has not been observed between overall survival and the level of miR-217. The other microRNAs were proved to function as oncogenes because of their increased levels in tumour tissues.
Conclusion: Tumour suppressor miR-217 was found to be differentially expressed in normal pancreas, chronic pancreatitis and cancerous tissues. Thus, miR-217 was confirmed to be a potential marker discriminating these two diagnoses. However, function and seed region of this microRNA is still not clear, therefore, it will be necessary to explore them by using in vitro analysis.
Poděkování: Bakalářská práce byla vypracována v laboratoři Molekulární onkologie II – solidní nádory Masarykovy univerzity v Brně. Na tomto místě bych chtěla poděkovat především vedoucí práce Mgr. Petře Faltejskové za odbornou pomoc při psaní práce, za asistenci v laboratoři a za výbornou spolupráci. Dále bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Ondřeji Slabému, Ph.D. za odbornou konzultaci a cenné rady při zpracování výsledků.
Prohlášení: „Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci na téma - Význam mikroRNA v molekulární patologii nádorů slinivky břišní - vypracovala samostatně s využitím uvedené literatury pod vedením vedoucího práce.“
V Brně 15. května 2013
...................................... Soňa Klusová
Obsah Seznam použitých zkratek ................................................................................................... 11 Úvod .................................................................................................................................... 13 1
Teoretická část ............................................................................................................. 14 1.1
Nádory slinivky břišní ............................................................................................. 14
1.1.1
Klasifikace ...................................................................................................... 14
1.1.2
Epidemiologie ................................................................................................. 16
1.1.3
Prevence ........................................................................................................ 17
1.1.4
Diagnostika ..................................................................................................... 18
1.1.5
Léčba ............................................................................................................. 19
1.1.6
Molekulární patologie...................................................................................... 21
1.2
MikroRNA .............................................................................................................. 22
1.2.1
Biogeneze ...................................................................................................... 22
1.2.2
MiRNA a karcinogeneze ................................................................................. 25
1.2.3
MiRNA a klíčové signální dráhy u nádorů slinivky břišní ................................. 28
1.2.4
MiRNA a určování diagnózy ........................................................................... 34
1.2.5
Role miRNA při určování prognózy a léčebné odpovědi ................................. 35
1.2.6
MiRNA a nové možnosti léčby ........................................................................ 36
2
Cíl práce ....................................................................................................................... 37
3
Materiál a metody ......................................................................................................... 38
4
3.1
Použité chemikálie ................................................................................................. 38
3.2
Použité přístroje ..................................................................................................... 38
3.3
Použité softwary .................................................................................................... 38
3.4
Soubor pacientů .................................................................................................... 39
3.5
Izolace celkové RNA bohaté na frakci krátkých RNA z FFPE ................................ 39
3.6
Reverzní transkprice .............................................................................................. 41
3.7
qRT-PCR ............................................................................................................... 42
3.8
Statistická analýza dat ........................................................................................... 43
Výsledky práce ............................................................................................................. 44 4.1
Izolace RNA........................................................................................................... 44
4.2
Identifikace endogenní kontroly pro normalizaci qRT-PCR dat .............................. 44
4.3
Analýza vybraných miRNA s deregulovanou expresí v nádorové tkáni slinivky břišní .................................................................................................................................45
4.4
Analýza exprese miR-217 na rozšířeném souboru pacientů .................................. 48
4.5
MiR-217 jako prognostický marker ......................................................................... 50 9
5
Diskuze ......................................................................................................................... 52
6
Závěr ............................................................................................................................ 55
Seznam použité literatury .................................................................................................... 56 Seznam obrázků .................................................................................................................. 64 Seznam tabulek ................................................................................................................... 65 Seznam příloh...................................................................................................................... 65 Příloha 1 .............................................................................................................................. 66
10
Seznam použitých zkratek 5-FU
5-fluorouracil
AKT2
v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2
APC
adenomatous polyposis coli
BCL2
B-cell leukemia/lymphoma 2
BRCA2
breast cancer 2
CA19-9
carbohydrate antigen 19-9
CAE
karcinoembryonální antigen (carcinoembryonic antigen)
CK1
casein kinase
CT
počítačová tomografie
EGF
epidermální růstový faktor (epidermal growth factor)
EGFR
receptor pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor)
EMT
epiteliálně-mezemchymální tranzice
ERCP
endoskopická retrográdní cholangiopankreatikografie
EUS
endoskopická ultrasonografie
FFPE
formalin fixed paraffin embedded
GAP
GTPase activating protein
GEMOX
gemcitabin a oxaliplatina
GSK3
glycogen synthase kinase 3
HER2
human epidermal growth factor receptor 2
KRAS
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LNA
locked nucleic acids
LRP
LDL-receptor-related protein
miRNA
mikroRNA
MR
magnetická rezonance
MRCP
magnetická rezonance cholangiopankreatikografie
PanIN
pankreatické intraepiteliální neoplázie
PCR
polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
PDCD4
programmed cell death protein 4
pre-miRNA
prekurzorová miRNA
pri-miRNA
primární transkript miRNA
RT-PCR
reverse-transcription PCR
PTC
perkutánní transhepatální cholangiografie
PTEN
fosfatázový a tenzinový homolog (phosphatase and tenzin homolog)
R-Smad
receptor-activated Smad 11
RISC
RNA-induced silecing complex
SARA
Smad anchor for receptor activation
TGF
transforming growth factor
TNM
Tumor-Node-Metastasis
UTR
nepřekládaná oblast (untranslated region)
12
Úvod Nádory
slinivky
břišní
patří
mezi
nejvíce
obávaná
onemocnění
v oblasti
gastroenterologie a onkologie. Vyznačují se pozdní diagnostikou a vysokou agresivitou, proto je jejich incidence téměř shodná s mortalitou. Právě nevýrazné příznaky v počátečním stádiu jsou důvodem bezmoci lékařů v detekci tohoto karcinomu a až 50 % případů je diagnostikováno ve fázi metastázování. Jedinou účinnou léčbou onemocnění je radikální resekce, avšak ve většině případů je karcinom zjištěn až v inoperabilním stádiu, čímž se výrazně snižují vyhlídky na úspěšnou léčbu. Více než 95 % pacientů umírá do jednoho roku od stanovení diagnózy a pouze 1 % pacientů přežívá déle než pět let. Průměrná doba přežití v celosvětovém měřítku je potom pouhých 6 měsíců. Nádory pankreatu se nejčastěji objevují u starších lidí, nejvíce v sedmé nebo osmé dekádě života. U mladších jedinců je toto onemocnění vzácné a většinou způsobené genetickými předpoklady. V České republice jsou nádory slinivky pátou nejčastější příčinou úmrtí na nádorová onemocnění [1, 2]. Hlavní snahou mnoha výzkumů v oblasti nádorové biologie je najít nové diagnostické, prognostické a prediktivní markery, které by umožnily odhalit toto onemocnění v časném stádiu nebo pomohly předpovědět jeho další průběh, a tím zlepšit strategii léčby. Jedním ze slibných cílů těchto studií se zdají být mikroRNA (miRNA). Tyto krátké nekódující sekvence o délce 21-23 nukleotidů vytvářejí důležitou regulační síť v živých organizmech a stále více vědeckých prací potvrzuje, že mají významnou úlohu v karcinogenezi. Právě fakt, že více než 50 % miRNA se nachází v genomických oblastech spojených se vznikem nádorů a na nestabilních částech chromozomů, prokazuje úzkou korelaci těchto RNA molekul se vznikem neoplázií. MiRNA plní funkci jak nádorových supresorů, tak i onkogenů, v závislosti na jejich cílové struktuře a stupni exprese. Proto se normalizace deregulované hladiny těchto krátkých regulačních fragmentů stala jedním z cílů protinádorové terapie [3]. Předkládaná bakalářská práce se zabývá stanovením exprese 5 miRNA (miR-21, miR-181a, miR-203, miR-217 a miR-222), jejichž deregulovaná exprese byla již dříve pozorována u nádorů slinivky břišní. Hladiny jednotlivých miRNA byly analyzovány jak v nádorových tkáních, tak ve zdravé sliznici a dále také v tkáních chronické pankreatitidy. Hlavním cílem těchto měření bylo zjistit, zda tyto miRNA plní funkci nádorových supresorů, či onkogenů a zda je možné na základě jejich exprese odlišit pacienty s chronickou pankreatitidou od pacientů s nádorovým onemocněním.
13
1 Teoretická část 1.1
Nádory slinivky břišní Slinivka břišní (lat. pancreas) je žláza hruškovitého tvaru o velikosti 12-16 cm uložená
retroperitoneálně za žaludkem podél břišní stěny až ke slezině. Skládá se ze tří částí rozšířený úsek ústící v dvanáctníku se nazývá hlava, následuje tělo a nejužší výběžek je označován jako ocas. Slinivka je smíšená žláza s vnější a vnitřní sekrecí. Exokrinní tkáň je tvořena lalůčky složenými ze žlázových acinů, které tvoří směs trávících enzymů napomáhajících při trávení potravy. Tato pankreatická šťáva pokračuje do tenkého střeva, kde díky svému obsahu bikarbonátů přispívá k neutralizaci kyselé žaludeční tráveniny. Endokrinní tkáň, tvořena Langerhansovými ostrůvky, je klíčová při tvorbě hormonů, které jsou vylučovány přímo do krve. Mezi nejdůležitější patří inzulín a glukagon, které se podílejí na regulaci hladiny glukózy v krvi [4]. Karcinom pankreatu je nejzávažnější onemocnění slinivky břišní a jeho incidence se neustále zvyšuje. Je to jeden z nejzhoubnějších nádorů a v současnosti patří mezi novotvary trávicího traktu s nejvyšší letalitou. Téměř výhradně se vyskytuje v exokrinních strukturách pankreatu a v 90 % případů se jedná o duktální adenokarcinom. Ten vzniká poškozením buněk vývodných kanálků slinivky břišní a většinou se nachází v části hlavy pankreatu. Je to nejmalignější typ karcinomu pankreatu a jenom 10 až 15 % případů je operabilních a potenciálně léčitelných [5]. Existují i další histologické typy exokrinních nádorů, které se vyskytují v mnohem menší míře. Patří sem mucinózní cystadenokarcinomy, intraduktální papilární mucinózní karcinomy, solidní pseudopapilární karcinomy, karcinomy z acinózních buněk a pankreatoblastomy. Z důvodu jejich vzácného výskytu se však pod pojmem karcinom pankreatu téměř výhradně myslí adenokarcinom [1]. Existují i pankreatické endokrinní nádory, které tvoří pouze 1 a 2 % karcinomů slinivky a pokládají se za velmi atypické neoplázie s méně agresívním průběhem a lepší prognózou. Nejvzácnějším případem je kombinovaný nádor sestávající ze tkání jak exokrinních, tak i endokrinních [6].
1.1.1 Klasifikace K třídění nádorů podle rozsahu a šíření maligních buněk v těle pacienta je využívána tzv. TNM (Tumor-Node-Metastasis) klasifikace (viz. Tabulka I). Popisuje lokalizaci primárního nádoru (kategorie T), postižení regionálních lymfatických uzlin (kategorie N) a výskyt vzdálených metastáz (kategorie M). V současné době jsou rozlišovány dvě formy tohoto členění, klinické hodnocení cTNM a patologické hodnocení pTNM. cTNM klasifikace je stanovena před zahájením léčby a pomáhá při výběru vhodné terapie a hodnocení jejího účinku. Pooperační patologická pTNM klasifikace je prováděna po resekci 14
primárního nádoru (pT), odstranění regionálních uzlin (pN) nebo histologickém důkazu vzdálených metastáz (pM) [7].
Tabulka I: TNM klasifikace [8].
TNM KLASIFIKACE T - Primární nádor TX T0 Tis T1 T2
primární nádor nelze hodnotit bez známek primárního nádoru karcinom in situ nádor omezen na slinivku, 2 cm nebo méně v největším rozměru nádor omezen na slinivku, větší než 2 cm v největším rozměru
T3
nádor se šíří mimo slinivku, nepostihuje však truncus coeliacus nebo a. mesenterica superior
T4 nádor postihuje truncus coeliacus nebo a. mesenterica superior N- Regionální lymfatické uzliny NX regionální lymfatické uzliny nelze hodnotit N0 regionální lymfatické uzliny bez metastáz N1 metastázy v regionálních lymfatických uzlinách M - Vzdálené metastázy MX vzdálené metastázy nelze hodnotit M0 bez vzdálených metastáz M1 vzdálené metastázy
Na základě TNM klasifikace je možné nádorové onemocnění zařadit do příslušného klinického stádia podle anatomického rozsahu. První stádium 0 zahrnuje karcinomy in situ. Nádory, které nepřerostly do okolních tkání a orgánů, ale zůstaly na svém původním místě vzniku, patří do stádií I a II. Lokálně pokročilé novotvary zasahující do regionálních lymfatických uzlin jsou označovány jako stádium III. Nejnebezpečnější stádium IV označuje vzdálené metastázování (viz. Tabulka II) [8].
15
Tabulka II: Rozdělení nádorů do příslušných klinických stádií [8].
ROZDĚLENÍ DO KLINICKÝCH STÁDIÍ Stádium 0 Stádium IA Stádium IB Stádium IIA Stádium IIB Stádium III Stádium IV
Tis T1 T2 T3 T1, T2, T3 T4 jakékoliv T
N0 N0 N0 N0 N1 jakékoliv N jakékoliv N
M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1
Histopatologický grading vyjadřující stupeň diferenciace nádoru je významný prognostický údaj. Popisuje podobnost nádorových a zdravých buněk orgánu, čímž umožňuje posoudit stupeň malignity. Nejagresivnější karcinomy jsou nejméně diferencované, ale zároveň lépe reagují na léčbu (viz. Tabulka III) [7]. Tabulka III: Grading nádorů slinivky břišní [1].
Grade 1
2
3
Glandulární diferenciace dobře diferencované duktální žlázky středně diferencované duktální a tubulární žlázky málo diferencované žlázky, mukoepidermoidní a pleomorfní struktury
Produkce mucinu
Počet mitóz (10 zorných polí)
Atypie jader
intenzivní
<5
mírný polymorfizmus, polární uspořádání
nepravidelná
6-10
abortivní
>10
střední polymorfizmus významný polymorfizmus a vyšší nukleoplazmatický poměr
1.1.2 Epidemiologie Nárůst výskytu nádorů slinivky břišní má neustále vzestupný trend a v současnosti je to čtvrtá nejčastější příčina úmrtí na nádorová onemocnění v USA a šestá nejčastější v Evropě [9]. Alarmující je skutečnost, že Česká republika drží prvenství v počtu nových případů v porovnání s ostatními zeměmi Evropy, jak je zobrazeno na obrázku 1. Nejrizikovější skupinou jsou lidé vyššího věku, což dokazuje fakt, že až 80 % diagnostikovaných případů jsou lidé nad 60 let. Statistiky říkají, že v České republice je nejpočetnější skupina pacientů ve věku od 70-74 let [10]. Co se týče rozdílnosti u obou pohlaví, tento druh nádoru se 1,3krát častěji vyskytuje u mužů než u žen, avšak v poslední 16
době se incidence u obou pohlaví dorovnává, což je způsobené zvýšeným počtem žen kuřaček. V souvislosti s rasovou rozdílností platí, že výskyt nádorů slinivky břišní je u afroameričanů až 1,4krát vyšší než u lidí se světlou pokožkou, což je způsobené větším počtem kuřáků, ale také geneticky podmíněnými faktory u černošské populace, mezi které patří zvýšená frekvence mutací v onkogenu KRAS a nadměrná exprese proteinu HER2 [1]. U nádorů slinivky břišní je až u 80 % pacientů výskyt abnormální glukózové tolerance, což naznačuje úzkou souvislost tohoto maligního onemocnění s diabetem [7]. Z těchto znepokojujících skutečností vyplývá, že je nezbytné nalézt nové diagnostické markery, které by umožnili časný záchyt onemocnění, a tím i zlepšení prognózy pacientů.
Obr. 1: Srovnání incidence v České republice s ostatními zeměmi Evropy [10].
1.1.3 Prevence U onemocnění jakéhokoliv typu je velmi důležitá prevence, nemluvě o její důležitosti v případě nádorových onemocnění. V současné době neexistuje úplně účinná prevence karcinomu slinivky břišní. Avšak svým životním stylem můžeme intenzivně ovlivnit riziko jeho vzniku. Jeden z nejvýraznějších a současně nejsnáze ovlivnitelných faktorů je kouření cigaret, které má vliv na 20-30 % ze všech případů. Výzkumy potvrdily, že aktivní inhalování tabákového kouře zdvojnásobuje riziko vzniku malignity [11]. Zanechání kouření redukuje riziko vzniku novotvaru, avšak nepříznivé účinky na maligní transformaci mohou přetrvávat více než 10 let. Výsledky výzkumů ve světě říkají, že počet úmrtí u nekuřáků, bývalých kuřáků a současných kuřáků jsou v tomto pořadí 16, 23 a 35 případů na 100 000 obyvatel
17
ročně. Konzumace více jak dvaceti cigaret denně je potom spojována s nárůstem rizika vzniku nádorů slinivky břišní až 2,6krát [12, 13]. Další formou prevence je vyhýbání se nadměrné konzumaci alkoholu. Studie sice nepotvrdily přímou spojitost mezi alkoholizmem a vznikem nádorů pankreatu, avšak v určité míře může působit zprostředkovaně, neboť požívání alkoholu zapříčiňuje chronickou pankreatitidu, která je prokázaným spouštěčem maligní transformace. Průzkumy dále prokázaly, že mírná konzumace alkoholu nemá téměř žádný vliv na zhoubnou přeměnu, problém však může nastat při časté a vysoké spotřebě [14]. Velmi nebezpečná je kombinace alkoholizmu a hereditární pankreatitidy, při které je navýšení rizika maligního zvratu vysoce pravděpodobné. Tak jako při mnohých jiných onemocněních, tak i při vzniku karcinomu slinivky břišní má určitou úlohu druh přijímané výživy. Obohacení stravy o přirozené antioxidanty, jakými jsou zelenina, ovoce, vláknina, či vitamín C, působí preventivně proti více druhům nádorů. Naopak nadměrné užívání vysokoenergetické potravy obsahující mnoho cholesterolu a smažených tuků může napomáhat při vzniku nádoru [1]. S tím související obezita je další ovlivnitelný faktor přispívající k maligní změně. Při hodnotě BMI více než 30 mají lidé až o 72 % zvýšené riziko karcinomu pankreatu ve srovnání s jedinci o BMI nižším jako 23. Zvýšení BMI o jednu jednotku je spojené s 5% navýšením rizika vzniku tohoto druhu onkologického onemocnění [15].
1.1.4 Diagnostika U pacientů s nádory slinivky břišní je úmrtnost téměř shodná s incidencí. Toto „tiché onemocnění“ má typickou nespecifickou symptomatologii v časném stádiu a první příznaky se většinou objevují, až když je karcinom inoperabilní. Mezi charakteristické počáteční symptomy patří kovová chuť v ústech, nechutenství k masu, velký úbytek váhy vedoucí k anorexii, či častá únava. Dále se u pacienta mohou objevit bolesti břicha v oblasti nad žaludkem, avšak tento projev je mnohokrát spojen s jinými diagnózami. Častým znakem napovídajícím o vzniku malignity je nebolestivý obstrukční ikterus, nazývaný Curvoisierovo znamení, který postihuje asi polovinu pacientů. Pokročilejší metastatické stádium se může projevit zvětšením nadklíčkové uzliny (tzv. Wirchovova uzlina), což je však typické také pro jiné druhy nádorů zažívacího traktu [16]. Problematika včasné diagnózy nádorů slinivky břišní také spočívá v umístění orgánu v nepřístupné části břišní dutiny, což znemožňuje využití mnohých endoskopických metod, které se běžně aplikují při hledání jiných druhů solidních nádorů zažívacího traktu [13]. V současnosti ani laboratorní testy nemají zatím výrazně důležitou úlohu při hledání nádorů slinivky břišní. U pacientů bývá zaznamenána zvýšená sedimentace erytrocytů, v pozdějším 18
stádiu onemocnění se objevuje anémie. Velká pozornost je věnována imunologickým metodám, které sledují onkomarkery v tělních tekutinách [2]. Jedním z cirkulujících nádorových markerů je karcinoembryonální antigen (CEA), jehož hladiny jsou však obvykle zvýšené jen u pacientů v pokročilém stádiu onemocnění. Citlivější onkomarker přítomný také v časném stádiu je CA19-9, jehož zvýšená hladina byla potvrzena jak v séru, tak v břišní dutině [17]. Mezi nejvíce využívané neinvazivní metody v diagnostice maligních onemocnění patří počítačová tomografie (CT). Při nádorech slinivky břišní je velmi častým počátečním vyšetřením endoskopická ultrasonografie (EUS), která se v kombinaci s biopsií tenkou jehlou využívá na potvrzení diagnózy. Biopsie se provádí ve velmi omezeném rozsahu s vysokou přesností, aby se zasáhl jen nádor, protože by mohlo dojít k úniku pankreatické enzymatické šťávy. Další využívané metody v oblasti diagnostiky, které se týkají určování rozsahu onemocnění, jsou magnetická rezonance (MR), či MR cholangiopankreatikografie (MRCP). Pozitivní nálezy se dále vyšetřují invazivními metodami, z nichž nejspolehlivější je endoskopická
retrográdní
cholangiopankreatikografie
(ERCP).
Z výsledného
pankreatogramu se dá vyčíst rozsah změn pankreatických a žlučových vývodů. Dnes už méně používané invazivní postupy jsou selektivní angiografie a perkutánní transhepatální cholangiografie (PTC) [2].
1.1.5 Léčba Jediným kurabilním postupem se šancí na vyléčení karcinomu pankreatu je úplné odstranění nádoru, které je možné jen v počátečním stádiu onemocnění bez lokálního šíření a metastázování. Vzhledem k vysoké agresivitě nádorových buněk je radikální resekce R0 možná jen u 11-20 % pacientů, což vysvětluje velmi špatnou prognózu onemocnění. Chirurgický zákrok se provádí i v pokročilejších stádiích, avšak resekce R1 a R2 spolu s paliativní léčbou výrazně nezvyšují šance na přežití. Mohou však značně zlepšit kvalitu života pacienta [18]. Na obrázku 2 je schéma znázorňující standardní léčebné postupy při časném i pozdějším stádiu onemocění. 1.1.5.1 Chirurgická terapie Před zahájením chirurgické léčby je velmi důležitá předoperační prohlídka na zjištění celkového stavu nemocného. Protože operativní zákroky jsou provázeny častou úmrtností, nevyhnutelnou podmínkou je dobrý zdravotní stav pacienta a včasná diagnóza. Důležitou součástí předoperačního vyšetření je určení rozsahu nádoru pomocí stagingu. Radikální resekční výkon se může provádět, pokud je nádor ve stádiu T1-3, N0-1 a M0, ve vyšším stádiu onemocnění (T3-4, N2, M1) volíme paliativní zákroky [7]. 19
Nejčastější chirurgická resekční technika je duodenopankreatektomie, nazývaná také Whippleova operace. Využívá se při nádorech hlavy pankreatu, ale také při jiných maligních onemocněních gastrointestinálního traktu. Při duodenopankreatektomii chirurg odstraní pravou část žlázy bez ocasu, odebere celý dvanáctník, žlučník a částečně žaludek. Další operační výkony s kurativním cílem jsou totální pankreatoduodenektomie, kdy dochází k úplnému odstranění slinivky břišní, a méně častá distální pankreatektomie týkající se levé strany orgánu [2, 19]. Jelikož majoritní část nádorů pankreatu je diagnostikovaná až v pozdějším stádiu s lokálním nebo vzdáleným rozšířením, podstatnou část chirurgických zákroků tvoří paliativní spojkové operace. Ty sice nevedou k vyléčení pacienta, ale mohou zmírnit nepříznivé symptomy a částečně prodloužit život nemocného. Do kategorie paliativních metod patří také endoskopické výkony [7]. 1.1.5.2 Nechirurgická terapie Nádory slinivky břišní jsou považovány za chemorezistentní a samotná chemoterapie nemá příliš velký význam. Bývá aplikována především v pokročilých stádiích onemocnění při výskytu metastáz jako paliativní prostředek. Mezi nejpoužívanější chemoterapeutika patří 5-fluorouracil (5-FU). Vyšší účinnost byla prokázána při kombinaci více cytostatik (například GEMOX - gemcitabin a oxaliplatina). Rovněž podání samotné radioterapie nevykazuje velmi vysokou účinnost, proto je nejčastěji aplikována v kombinaci s chemoterapií. Pozitivní výsledky můžeme sledovat u pacientů s inoperabilním nádorem, který nevykazuje známky metastatického šíření. Chemoradioterapie má své postavení jak v adjuvantní, tak i v neoadjuvatní a paliativní léčbě [7, 16].
Obr. 2: Algoritmus terapie nádorů slinivky břišní, který vyjadřuje možný postup lékařů v různých fázích onemocnění [16].
20
1.1.6 Molekulární patologie Při vzniku nádorových onemocnění hrají klíčovou roli genetické mutace a jejich akumulace v organizmu. Maligní transformaci nezpůsobuje jen jedna genetická změna, ale modifikace více genů způsobující ztrátu jejich původních funkcí. Při přechodu buňky z nenádorového do nádorového stádia jsou rozhodující změny hladin onkogenů, které podporují maligní transformaci, a nádorových supresorů bránících této změně [20]. U nádorů slinivky břišní se nejčastěji objevuje inaktivace nádorových supresorových genů CDKN2A (P16INK4A), TP53, SMAD (DPC4) a BRCA2. Naopak onkogenní geny KRAS, ERBB2 (HER2/NEU) a AKT2 jsou exprimovány ve větším množství než ve zdravých pankreatických buňkách [1]. Příčinou těchto alterací v genech mohou být zděděné genetické predispozice, a to v případě, že někdo z předků trpěl tímto onemocněním. Více než 10 % případů nádorů slivky břišní má hereditární charakter a jedinci, jejichž rodiče byli postiženi touto malignitou, mají až 3,2krát větší riziko jejího vzniku [21]. Prekurzorová stádia duktálního karcinomu představují tzv. pankreatické intraepiteliální neoplázie (PanIN). Ty jsou klasifikovány na základě nomenklatury z roku 1999, která je založena na histomorfologickém popisu lézí společně s výskytem molekulárně genetických změn. Vznik těchto počátečních neoplázií je typický hlavně pro hereditární formy nádorů [21]. Na pochopení vývoje a vzniku duktálního adenokarcinomu je potřebné znát postupnost akumulací genetických změn, které jsou znázorněny na obrázku 3. Primární genetická alterace se objevuje v onkogenu KRAS a to u většiny duktálních adenokarcinomů. Avšak tato mutace nemusí hned znamenat vznik nádoru, protože se v určité míře nachází i ve zdravých buňkách. Typickou anomálií prvních stádií PanIN-1A (nepapilární hyperplázie) a PanIN-1B (papilární hyperplázie) je alterace v onkogenu HER-2. Dalšími kroky v maligním procesu pankreatických buněk je inaktivace nádorových supresorů p16, p53, SMAD4 a BRCA2, což však již znamená přechod do pokročilejších stupňů PanIN-2 (atypická hyperplázie)
a následně
PanIN-3
(karcinom
in
situ).
Doba
změny pankreatických
intraepiteliálních neoplázií na zhoubný nádor se nedá přesně určit, protože včasná stádia PanIN, a s nimi související mutace, mohou u jedince přetrvávat delší dobu bez vážnějších příznaků. Avšak po nahromadění dalších genetických změn se spustí maligní transformace buněk, v důsledku čehož dochází ke vzniku duktálního adenokarcinomu [22, 23]. O etiologii nádorů slinivky břišní víme zatím stále poměrně málo a je třeba hledat další faktory, které by nám v budoucnu mohly pomoci ať už v diagnostice, nebo v individualizaci léčby.
21
Obr. 3: Zastoupení mutací v jednotlivých stádiích PanIN [1]. V prvotních stádiích PanIN-1A a PanIN-1B se objevují mutace v onkogenu KRAS a zvyšuje se exprese Her-2/neu. V dalším stádiu PanIN-2 je kromě nadměrného množství Her-2/neu také nefunkční nádorový supresor p16. Nejpozdější stádium PanIN-3 je charakteristické dalšími inaktivacemi, a to konkrétně v genech pro proteiny p53, DPC4 a BRCA2.
1.2
MikroRNA Zásluhou výzkumného týmu Victora Ambrose se rok 1993 stal významným bodem
v oblasti molekulární biologie díky objevu mikroRNA (miRNA), čímž bylo vyvráceno mínění, že krátké nekódující RNA jsou jen nepotřebný a přebytkový materiál v buňce. Bylo zjištěno, že miRNA jsou důležité post-transkripční regulátory genové exprese a odhaduje se, že mají vliv na více než polovinu lidského genomu. Tyto 21-23 nukleotidů dlouhé jednovláknové sekvence se nacházejí jak v živočišných, tak i v rostlinných buňkách, a v lidském genomu tvoří přibližně 3 %. Vyznačují se vysoce konzervovanou strukturou také v rámci odlišných organizmů, což potvrzuje skutečnost, že se podílejí na kontrole esenciálních procesů v buňce, jakými jsou například diferenciace, proliferace, apoptóza, či buněčný cyklus. Jejich funkce spočívá v degradaci cílové mRNA anebo v represi translace, což má za následek pokles hladiny proteinů. Je zajímavé, že jedna miRNA má více cílových mRNA a zároveň jedna mRNA může být regulovaná pomocí více miRNA. V současnosti je známo více než 1000 lidských miRNA, avšak jejich počet se ještě může zvýšit [3, 24].
1.2.1 Biogeneze Geny pro miRNA jsou několikanásobně delší než vlastní maturované molekuly. Obsahují desítky až stovky nukleotidů a jejich délka je různá v závislosti na druhu organizmu, či druhu konkrétní miRNA [25]. Nacházejí se na všech lidských chromozómech, kromě chromozómu Y. Podle genomové lokalizace se miRNA rozdělují do čtyř skupin, a to na 22
mezigenové, intronové, mirtronové a exonové. Majoritní část tvoří mezigenové a intronové miRNA, zbylé dvě skupiny se vyskytují vzácně [3]. Samotná biogeneze probíhá v jádře a cytoplazmě buňky za pomoci několika štěpících enzymů a proteinových partnerů. Geny pro miRNA mají vlastní promotor, takže jsou schopné autonomní transkripce jako nezávislé jednotky [26]. Přepis genu je zahájen RNA polymerázou II, která nasedne na promotor a začne s přepisem. Vzniká primární transkript
pri-miRNA
vyznačující
se
vlásenkovou
strukturou,
který
obsahuje
7-methylguanosin na 5'konci a polyadenylový ocas na 3'konci [25]. Následně je tato forma štěpena pomocí mikroprocesoru, který je tvořen enzymem Drosha a proteinem DGCR8, jenž bývá označován rovněž jako Pasha. Nově vytvořený sekundární transkript pre-miRNA dlouhý 60 až 70 nukleotidů je pomocí transportního proteinu Exportin 5 (XPO5) přenesen z jádra do cytoplazmy. Tento proces vyžaduje dodání energie, proto XPO5 pracuje s proteinem Ran vázaným s GTP. Pre-miRNA je dále zpracovaná endoribonukleázou Dicer, která je v komplexu s proteinem TRBP. Výsledkem je maturovaná dvouvláknová miRNA, která se následně rozpadá na dvě samostatná vlákna, z nichž jedno je degradováno a druhé se stává součástí RISC komplexu (RNA-induced silencing complex) [27]. O tom, který řetězec bude navázán a následně bude plnit funkci post-transkripčního regulátoru, rozhoduje nižší stabilita 5'konce [26]. Až po zabudování molekuly miRNA do komplexu RISC, který je tvořen hlavně proteiny z argonautové rodiny a proteiny GEMIN3 a GEMIN4, může začít tato malá molekula provádět svou roli jednoho z nejdůležitějších buněčných regulátorů [3]. Kompletní průběh biogeneze miRNA spolu se zúčastňujícími se buněčnými komponenty je znázorněn na obrázku 4.
23
Obr. 4: Proces biogeneze miRNA – jednotlivé kroky a zúčastněné enzymy s proteiny [28]. Geny pro miRNA jsou přepsány enzymem RNA polymeráza II za vzniku primárního transkriptu pri-miRNA, který je následně štěpen komplexem enzymu Drosha a proteinu DGCR8. Poté je sekundární transkript pre-miRNA transportován pomocí proteinu Exportinu 5 do cytoplazmy, kde je znovu štěpen enzymem Dicer a proteinem TRBP. Vzniklá dvouvláknová maturovaná miRNA se rozpadá, jeden řetězec je degradován a druhý je zabudován spolu s proteiny z argonautové rodiny do funkčního komplexu RISC.
Jako cílová struktura pro mRISC (RNA-induced silencing complex) je 3'UTR oblast na mRNA kódující určitý protein. Tato specifická část mediátorové RNA nese vazebná místa pro regulační faktory a hraje důležitou roli v regulaci syntézy proteinů [29]. U miRNA jsou doposud známé tři hlavní cesty řízení translace v buňce a všechny mají za následek zastavení proteosyntézy. Pokud dojde k dokonalému navázání miRNA s cílovou strukturou, dochází k rozštěpení mRNA na fragmenty. V případě, že sekvence miRNA není stoprocentně komplementární s 3'UTR oblastí, nastává represe translace. Tento druh regulace převládá v živočišných buňkách, zatímco u rostlin je uplatňována především
24
degradace. Jako třetí, nejméně se vyskytující mechanizmus, je deadenylace mRNA, v důsledku čehož dochází ke snížení stability a zastavení proteosyntézy [25]. Biologický poločas rozpadu miRNA dosud nebyl úplně rozluštěn a zůstává předmětem zkoumání. Tyto krátké nekódující molekuly jsou díky své struktuře považovány za velmi stabilní, za což vděčí hlavně velkému množství modifikací a poměrně malé délce. Experimenty objasňující poločas rozpadu miRNA a využívající inhibitory RNA polymeráz dokázaly, že tyto molekuly jsou degradovány až po několika hodinách, v některých orgánech, jako je například srdce nebo játra, jsou dokonce degradovány až po několika dnech [30]. Právě jejich vysoká stabilita je kladnou predispozicí na plnění funkce vhodných diagnostických, prognostických, či prediktivních biomarkerů.
1.2.2 MiRNA a karcinogeneze MiRNA hrají důležitou roli v esenciálních biologických procesech jakými jsou přenos buněčných signálů, diferenciace, proliferace, či apoptóza. Je proto zřejmé, že deregulace těchto molekul má výrazný dopad na správnou funkci buněk. V současnosti se velká pozornost upíná na roli miRNA v karcinogenezi a dnes je už evidentní, že mají nezastupitelnou úlohu téměř u všech druhů nádorů [31]. V závislosti na tom, či je exprese miRNA v maligních buňkách zvýšená anebo snížená, rozdělují se tyto regulátory na onkogeny nebo nádorové supresory, jak je znázorněno na obrázku 5. Onkogenní miRNA, zvané někdy také “onkomirs“, působí pozitivně na růst nádorů a nacházejí se v nich ve zvýšené míře. Jejich úkol spočívá v regulaci nádorově supresorových genů prostřednictvím snížení jejich exprese, což vede ke zvýšené proliferaci maligních buněk, poruchám apoptózy či zvýšenému metastatickému potenciálu. Na druhé straně nádorově supresorové miRNA se v novotvarech nacházejí ve výrazně snížené míře, protože svojí funkcí zpomalují růst buněk, což je pro nádor nepříznivé [32]. Změny hladin jsou způsobené epigenetickými změnami a lokalizací miRNA na fragilních částech chromozomů, které jsou náchylné na změny ve struktuře. Navíc až 50 % všech genů pro miRNA je umístěno v částech genomu spojených s karcinogenezí. Zvýšená exprese onkogenních miRNA v nádorech je výsledkem amplifikace, deregulace transkripčních faktorů anebo demetylace CpG ostrůvků na promotorech. Naopak ke snížené expresi nádorově supresorových miRNA dochází v důsledku delecí, epigenetického tlumení nebo z důvodů snížené hladiny transkripčních faktorů [31, 32].
25
Obr. 5: Role miRNA jako onkogenu nebo nádorového supresoru [33]. Onkogenní miRNA se v nádorových buňkách nachází ve zvýšeném množství a na růst nádorů působí pozitivně inhibicí nádorových supresorů. Tím podporuje proliferaci, angiogenezi a invazivitu buněk, a naopak tlumí buněčnou smrt. Nádorově supresorová miRNA se v maligních buňkách nachází ve snížené míře, díky čemuž se onkogeny vyskytují v nádorech ve větším množství a tím podporují tvorbu nádorů.
Výsledky mnohých výzkumů dokázaly, že hlavní funkce miRNA korelují se všemi vlastnostmi maligního nádoru dle Weinberga a Hanahana, jako je soběstačnost v produkci růstových signálů, necitlivost k signálům zastavujících buněčný cyklus, poškození apoptózy, neomezený replikační potenciál, posilnění angiogeneze, tvorba metastáz, genomová nestabilita, deregulace buněčné energetiky, rezistence k imunitnímu systému a nádorem indukovaný zánět [3]. Zastoupení některých důležitých miRNA ovlivňujících jednotlivé vlastnosti neoplázií je shrnuto v tabulce IV. Co se týče ovlivňování apoptózy, důležitou roli zde hrají miR-15 a miR-16, které mají výrazně nižší expresi v nádorech než ve zdravých buňkách. Za normálních okolností tyto nádorové supresory regulují anti-apoptotický faktor Bcl-2, čímž indukují apoptózu. Avšak při karcinogenezi dochází k výraznému snížení hladiny 26
miR-15 a miR-16, což má za následek nerovnováhu v poměru anti- a pro-apoptotických proteinů z rodiny Bcl-2 ve prospěch inhibice buněčné smrti. Tím se nádorové buňky stávají rezistentnější k signálům stimulujícím apoptózu [34]. Své místo v zakládání metastáz má miR-21, která je jednou z nejvíce prostudovaných onkogenních miRNA u nádorových onemocnění a způsobuje zablokování proteosyntézy nádorového supresoru PTEN, který brání invazivitě buněk [35]. Dále miR-21 přispívá k poškození apoptózy, způsobuje nádorový zánět a ulehčuje soběstačnost v růstových signálech [3]. Tyto a mnohé další deregulované miRNA pomáhají procesu karcinogeneze, zároveň však díky svým výrazně odlišným expresním profilům ve zdravých a nemocných buňkách mohou napomáhat lékařům porozumět patogenezi nádorových onemocnění. Tabulka IV: Vybrané miRNA zapojené do procesu karcinogeneze [3].
Znaky maligní transformace
MikroRNA
let-7, miR-7, miR-21, miR-34b/c, miR-125a/b, soběstačnost v produkci růstových miR-126, miR-128, miR-143, miR-145, miR-199, signálů miR-331 necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus
klastry miR-17-92 a miR-106b-25, miR-34a, miR-221, miR-222
poškozená apoptóza
miR-15, miR-16, miR-21, miR-29, rodina miR-34, miR-125b, miR-133, miR-145, miR-221, miR-222, miR-605
neomezený replikační potenciál
rodina miR-34, miR-138, miR-290, miR-372, miR-373
angiogeneze
miR-23, miR-24, miR-26, miR-27, miR-103, miR-107, miR-126, miR-181, miR-210, miR-213, miR-221, miR-222, miR-296
invazivita a metastázování
rodina miR-9, miR-10b, miR-21, miR-31, miR-122, miR-146a, miR-148a/b, miR-155, rodina miR-200, miR-210, miR-373, miR-520c
narušený energetický metabolizmus miR-23a/b, miR-122, miR-375 únik imunitnímu systému genomová nestabilita nádorový zánět
miR-17-5p, miR-20a, miR-93, miR-106b, miR-372, miR-373, miR-520c, miR-155 klastr miR-17-92, miR-15, miR-16, let-7 miR-9, klastr miR-17-92, miR-21, miR-101, miR-146a, miR-192
27
1.2.3 MiRNA a klíčové signální dráhy u nádorů slinivky břišní Důležité pochody v buňce, jako je vývoj, růst, diferenciace, či koordinace buněčných funkcí, jsou řízené pomocí důležitých kaskád zvaných signální dráhy. Tento sled kroků je odstartován navázáním ligandu na receptorový protein, který zahájí složitý proces stupňovitého předávání signálu hlouběji do buňky, až do cílového místa s očekávaným efektem. Signální kaskády způsobují, že počáteční stimul je postupným přenášením zesilován a v určitém bodě se může rozdělit na více signálních drah, které ovlivňují různé pochody buňky [36]. Jak již bylo vícekrát zmíněno, miRNA mají nezanedbatelnou regulační funkci, a proto je zřejmé, že v tak důležitých procesech, jako je buněčná signalizace, mají své nezastupitelné místo.
1.2.3.1 TGF-β Nádory slinivky břišní se vyznačují mutacemi v genu SMAD4, který je esenciální součástí signální dráhy TGF-β (transforming growth factor-β) kontrolující buněčnou proliferaci, diferenciaci a apoptózu v buňce. Až přibližně 50 % případů pankreatického duktálního adenokarcinomu vykazuje delece anebo bodové mutace v SMAD4 genu, který plní funkci jak transkripčního faktoru, tak i nádorového supresoru. Proto je očividné, že jakékoliv genetické poruchy tohoto regulátoru vedou k závažným změnám v buňce. V případě nádorů slinivky břišní je abnormální funkce SMAD4 pozorována v pozdějších stádiích PanIN a výrazně přispívá k invazivitě a metastázování [37, 38]. Spuštění TGF-β signální kaskády je zahájeno navázáním proteinů z TGF-β rodiny na receptory typu I nebo II se serin / threonin kinázovou aktivitou. Tyto dimerní receptory se navzájem fosforylují a vytvářejí tetramer. Po aktivaci receptoru typu I receptorem typu II dochází k fosforylaci proteinů SMAD2 nebo SMAD3 z rodiny R-Smad (receptor-activated Smads). Ty se následně uvolní z receptorů a navážou se na další protein SMAD4 s cílem vytvořit komplex. Tento oligomer poté putuje do jádra, kde se spojí s dalšími regulačními molekulami za tvorby kompletního transkripčního faktoru specifického genu. Velmi důležitou součástí této celé kaskády je protein nazývaný SARA (Smad anchor for receptor activation), který zvyšuje efektivitu fosforylace receptorem typu I [39]. Jak ukazuje obrázek 6, důležitými regulátory exprese SMAD4 a potenciálními terapeutickými cíli se zdají být miR-421 a miR-483-3p, které se v nádorech pankreatu nachází ve výrazně zvýšené míře v porovnání se zdravými tkáněmi a fungují jako onkogeny [40, 41].
28
Obr. 6: TGF-β signální dráha a zapojení miRNA do této kaskády. TGFβ – transformující růstový faktor beta, TGFβR – receptor pro transformující růstový faktor β
1.2.3.2 EGFR Receptor pro epidermální růstový faktor EGFR (epidermal growth factor receptor) je transmembránový glykoprotein, který patří do rodiny tyrosin kináz ErbB. Jako hlavní regulační cíle této kaskády jsou buněčná proliferace, diferenciace, schopnost přežití a růstu, proto i zde platí, že deregulace této kaskády má za následek nadměrné mitotické signály a následnou karcinogenezi. V případě nádorů slinivky břišní mutace EGFR vedou k autokrinní produkci ligandů, a tím ke zvýšené aktivitě celé signální dráhy [42]. Přenos signálů z povrchu do jádra zdravé buňky začíná navázáním ligandu, jako například EGF (epidermal growth factor) anebo TGF-α (transforming growth factor alpha), na receptory, které se následně dimerizují a navzájem fosforylují díky své proteinkinázové aktivitě. Tím se stávají plně aktivními a jsou rozpoznávány dalšími signálními molekulami, které si navzájem odevzdávají stimul putující až na transkripční faktor s následným vyvoláním exprese určitého genu. Mezi dvě hlavní signalizační dráhy, které jsou aktivované prostřednictvím EGFR, patří MAP-kinázová kaskáda a dráha PI3K/AKT/mTOR [43, 44]. Pro iniciaci vzniku nádorů slinivky břišní jsou nepochybně velmi důležité mutace v onkogenu KRAS, které se nacházejí téměř u všech pacientů. Protein KRAS patří do rodiny Ras s GTPázovou aktivitou a je důležitým přenašečem signálu v různých kaskádách. Tento mutovaný onkogen se vyskytuje již v časných stádiích PanIN1 a dokonce ho sporadicky najdeme i ve zdravých acinárních buňkách. Na rozdíl od jiných mutací v onkogenech, které obvykle zvyšují jejich katalytickou aktivitu, u KRAS je to opačně. Genetické změny způsobují snížení anebo ztrátu schopnosti hydrolýzy GTP, v důslesku čehož je protein trvale aktivní a přenáší signál na další efektory. Navíc se takto pozměněný gen stává rezistentní vůči
29
molekulám GAP (GTPase activating protein) zajišťujícím deaktivaci proteinu KRAS [37, 45]. Významnou roli v regulaci KRAS sehrávají molekuly miRNA, které zde mají funkci nádorových supresorů, a v nemocných tkáních pankreatu se vyskytují ve výrazně snížené míře. Výzkumy potvrdily přímé cílení několika miRNA na onkogen KRAS, a vědci tím získali další potenciální terapeutické cíle v léčbě nádorů slinivky břišní. Takto fungující a prokázané miRNA jsou miR-217 [46], miR-126 [47], miR-155, miR-216b [48], let-7i [49], miR-143, miR-145 [50] a miR-96 [51]. Zajímavým zjištěním je, že exprese onkogenní miR-21 je regulována prostřednictvím proteinů KRAS a EGFR, které stimulují promotor této miRNA v nádorových buňkách slinivky břišní [52]. Co se týče cílení samotného EGFR, zde má klíčovou funkci nádorově supresorová miR-146a [53]. Působení jednotlivých miRNA v této signální dráze, ať už podporováním anebo tlumením kaskády, je vykresleno na obrázku 7.
Obr. 7: EGFR/KRAS signální dráha a zapojení miRNA do této kaskády. EGF – epidermální růstový faktor, TGFα - transformující růstový faktor alfa, EGFR – receptor pro epidermální růstový faktor
V souvislosti s častými mutacemi v nádorech pankreatu je třeba zmínit onkogen HER2 (human epidermal growth factor receptor), který stejně jako EGFR patří do rodiny ErbB tyrosin-kinázových receptorů. Genetické alterace v HER2 se v normálních acinárních buňkách nevyskytují vůbec, ale úzce souvisí s rozvojem nádorů slinivky břišní od raných stádií PanIN.
Zvýšená exprese tohoto onkogenu je pozorována hlavně v dobře
diferenciovaných neopláziích v porovnání s anaplastickými novotvary [1, 54]. Regulační miRNA, která cílí HER2 a zároveň inhibuje jeho expresi, je miR-150 [55].
30
1.2.3.3 Wnt/β-katenin Za zmínku stojí také signální dráha Wnt/β-katenin, která sice nemá pro nádory slinivky břišní takový význam jako například pro kolorektální karcinom, avšak v buňce patří mezi nejdůležitější. Sice samotná deregulace této signální kaskády nedokáže iniciovat vznik nádorů pankreatu, avšak její nadměrná aktivita přispívá k maligní proliferaci. To potvrzuje i fakt, že u většiny neinvazivních prekurzorových lézí PanIN se nachází nahromaděný jaderný a cytoplazmatický β-katenin [45]. Wnt/β-katenin hraje důležitou roli v embryonálním vývoji a při udržování homeostázy, a proto při porušení rovnováhy přenosů signálů touto kaskádou nastávají v těle organizmu vážné poruchy, a to nejčastěji buď jako defekty při narození, anebo nádorová onemocnění [56]. V případě, že nedojde k navázání glykoproteinů z Wnt rodiny na Frizzled receptor a LRP koreceptor (LDL-receptor-related protein), tak destrukční komplex, tvořen proteiny axin a APC (Adenomatous polyposis coli) spolu s aktivními kinázami GSK3 (glycogen synthase kinase) a CK1 (casein kinase), fosforyluje β-katenin, což má za následek jeho ubikvitinaci a degradaci proteazomem. V důsledku toho nenastává uvolnění transkripčního faktoru
LEF1/TCF,
který
je
blokován
represorem
Groucho
a transkripce
zůstává
pozastavená. Až po navázání Wnt proteinu na receptory Frizzled a LRP se destrukční komplex rozpadá a β-katenin se může v buňce hromadit. Po dosažení určité hladiny β-kateninu v cytoplazmě se v nefosforylované formě dostává do jádra, kde spouští transkripci genů odstraněním jejich represorů [39]. Tento typ signální dráhy pomocí Wnt proteinů využívající β-katenin se nazývá kanonický, existují však i jiné, nezávislé na β-kateninu a označované jako nekanonické. Co se týče miRNA a Wnt/β-katenin signální dráhy, významné místo zde zaujímají například miR-315 a miR-135a/b, které svou regulační aktivitou potencují tuto signální dráhu. Naopak miR-200a, miR-21 a miR-8 snižují transkripční aktivitu β-kateninu [57]. Názorné schéma působení zmíněných miRNA je zobrazeno na obrázku 8.
31
Obr. 8: Wnt/β-katenin signální dráha a zapojení miRNA do této kaskády. DSH – Dishevelled, GSK3 – glykogen syntáza kináza 3, APC – adenomatous polyposis coli
1.2.3.4 Úloha miRNA v buněčném cyklu a apoptóze Porucha regulace buněčného cyklu je jedním z klíčových důvodů nadměrného bujnění a vzniku nádoru. Nejčastější genetická alterace v maligních buňkách je inaktivace proteinu p53 řídícího transkripci p21, který je inhibitorem cyklin-dependentních kináz a je zodpovědný za zástavu buněčného cyklu v G1 fázi z důvodu reparace. Právě inhibice onkogenních miR-21 a miR-221 indukuje zástavu v této fázi a navozuje programovanou smrt [58]. V případě vysokého poškození DNA vydá p53 apoptotický signál a spouští se tak degradace poškozené DNA. U nádorů slinivky břišní se zmutovaný p53 nachází ve velké míře, přibližně ve 40-70 % případů [59]. Důležitou miRNA zasahující do signální dráhy p53 je miR-34a, která se účastní na apoptotickém programu a při opravě poškozené DNA. V maligních tkáních pankreatu je její exprese, podobně jako u jiných druhů novotvarů, velmi často snížená [60]. Také onkogenní miR-301a ovlivňuje programovou buněčnou smrt inhibicí proapoptotického proteinu Bim z Bcl-2 rodiny, a tím podporuje nadměrnou proliferaci [61]. Existují i jiné Bcl-2 proteiny, které mají naopak antiapoptický efekt v buňce a pozitivně působí na nádorový růst. Tyto proteiny jsou často regulovány prostřednictvím miR-15b, miR-16 [62], miR-491-5p [63] nebo miR-21 [64]. Další důležitý kontrolní bod buněčného cyklu, který rozhoduje o pokračování z fáze G1 do S, je zajišťován proteinem RB. U nádorů slinivky břišní je tento nádorový supresor inhibován onkogenními miR-132 a miR-212 [65].
32
Obr. 9: Zapojení jednotlivých miRNA do buněčného cyklu a apoptózy. Bcl-2 – B-cell leukemia/lymphoma 2, RB – retiblastoma protein
1.2.3.5 Úloha miRNA u metastatického nádoru slinivky břišní Pankreatické maligní buňky jsou charakteristické svou vysokou agresivitou a invazivitou. Je známé, že jednou z možných příčin vzniku sekundárních nádorů je epiteliálně-mezenchymální
tranzice
(EMT),
která
souvisí
s poklesem
E-kaderinu
zabezpečujícím adhezi epiteliálních buněk. Laboratorní testy prokázaly, že rodina miR-200 inhibuje EMT, a tím působí antimetastaticky [66]. Naopak miR-197 tento proces podporuje a invazivitě výrazně napomáhá [67]. S tím souvisí také působení nádorově supresorových miR-143 a miR-101, které k expresi E-kaderinu přispívají, avšak v invazivních nádorových buňkách pankreatu se nacházejí ve snížené míře [68, 69]. Dalším aspektem pozitivně ovlivňujícím migraci je hladina EGFR. Tady plní svou regulační funkci miR-146a [53], miR-150 [55] a miR-216b [48], které produkci tohoto receptoru pro růstové faktory snižují. MiR-216b spolu s miR-143 negativně ovlivňují také hladinu K-ras, který stejně jako EGFR napomáhá k extenzi buněk i mimo primární nádor [48, 68]. Existují i další nádorové supresorové miRNA, jako miR-20a [70], miR-126 [66] a miR-520h [71], které negativně ovlivňují metastázování, a zvýšení jejich hladiny tak může být do budoucna jedním z terapeutických procesů v léčbě nádorů slinivky břišní. Na druhé straně v buňce existují také molekuly, které invazitivu zpomalují. Jejich exprese je však regulována onkogeny, například miR-21 [72], miR-224 a miR-486 [73]. Celkové schéma působení jednotlivých miRNA je zobrazeno na obrázku 10.
33
Obr. 10: Zapojení miRNA do procesu metastázování. EMT - epiteliálně mezenchymální tranzice, PDCD4 - programmed cell death protein 4, EGFR - receptor pro epidermální růstový faktor
1.2.4 MiRNA a určování diagnózy Při závažných onemocněních, jako jsou nádorová, je nesmírně důležitá včasná diagnostika, aby mohla být co nejrychleji nastavena léčba. Proto je cílem mnohých výzkumů hledání vhodných diagnostických biomarkerů, které by umožnily tato onemocnění co nejrychleji odhalit. Velmi slibnými se zdají být miRNA, které díky svým unikátním expresním profilům v tkáních a vysoké stabilitě v plazmě a séru splňují podmínky dobrého biomarkeru. Jejich výjimečnost spočívá v tom, že mohou plnit funkci minimálně invazivního a zároveň robustního ukazovatele stavu pacienta a jejich exprese může být snadno analyzována v mražených i parafínových tkáních, v krvi nebo jiných tělních tekutinách, jako jsou například sliny. Navíc mají potenciál určit původ tkáně při nádorech neznámého původu anebo identifikovat podtypy neoplázie na molekulární úrovni [33]. Nádory slinivky břišní jsou typické pozdní diagnostikou a drtivá většina pacientů v čase diagnózy už nemá šanci na dlohodobé přežití. Včasná detekce tohoto onemocnění by v budoucnu mohla být umožněna na základě měření exprese miR-196a a miR-217 spolu s provedením endoskopické ultrasonografie [74]. Kromě toho hladina samotné miR-196a anebo miR-196b dokáže rozlišit nádorovou tkáň od tkáně postižené chronickou pankreatitidou či tkáně zdravého jedince [75]. K odhalení intraduktálně papilární mucinózní neoplázie, což je neivazivní prekurzor nádoru slinivky břišní, může posloužit miR-155 [76]. Jsou známé i jiné potenciální diagnostické onkogenní miRNA, jako například miR-135b, miR-103 a miR-107 [77, 78].
34
Velmi důležitým poznatkem při výzkumu miRNA jako biomarkerů byl jejich objev v tělních tekutinách, čímž se potvrdila jejich velmi dobrá dostupnost u pacienta. Většina miRNA se nachází intracelulárně, avšak nezanedbatelné množství se vyskytuje i v séru a plazmě. Tyto cirkulující regulátory jsou chráněny před účinkem RNáz, které se běžně nacházejí v krvi, zabalením do struktur jako jsou exozómy, či mikrovezikuly. Ty jim zabezpečují ještě vyšší stabilitu, která je důležitým aspektem dobrého biomarkeru [79]. Význam cirkulujících miRNA byl potvrzen také v případě nádorů slinivky břišní, a to konkrétně u miR-155 [80], miR-221 [81], miR-200a, miR-200b [82] a miR-18a [83]. Ve všech pěti případech byla potvrzena signifikantně zvýšená exprese jak v nádorových tkáních pankreatu, tak v krevním séru či plazmě, a všechny splňovaly základní podmínky pro roli diagnostických biomarkerů. Další možností pro včasné odhalení onemocnění je současné stanovení sérových miRNA a jiného druhu onkomarkeru. Účinné je spojení miR-27a-3p s antigenem CA19-9 [84], anebo kombinace miR-16, miR-196a a CA19-9 [85]. Jiné východisko detekce je sledování hypoxie, která se přímo pojí s karcinogenezí slinivky břišní. Výrazným markerem je zvýšená exprese miR-210 v buňkách, která indikuje hypoxii, a tím také vznik nádoru [86]. Existují i další cirkulující miRNA poukazující nejen na vznik, ale také na progresi tohoto onemocnění, jako například miR-20a, miR-21, miR-24, miR-25, miR-99a, miR-185 a miR-191 [87].
1.2.5 Role miRNA při určování prognózy a léčebné odpovědi Při nádorových onemocněních je velmi obtížné předpovědět prognózu, protože každý pacient má svoji jedinečnou genetickou výbavu a jeho tělo reaguje na nepřátelské maligní buňky vlastním způsobem. Proto jsou pro lékaře důležité biomarkery, které dokážou předvídat chování těla pacienta. I tady nám nové obzory nabízejí miRNA, které mají své zastoupení také v oblasti určování prognózy. Jejich originální exprese v tkáních dokáže napovědět, jakým způsobem organizmus bude bojovat s nepřítelem, a tím pomáhá aplikovat individuálnější přístup lékařů k pacientům. Prognóza nemocných s nádory slinivky břišní nebývá velmi příznivá, avšak díky inovativním markerům se může zlepšit. Například zvýšená exprese miR-212 a miR-675 a snížená hladina miR-148a*, miR-187 a let-7g* predikuje brzké úmrtí pacienta po provedení operativního zákroku bez chemoterapie, a to nezávisle na věku, pohlaví, nebo stupni malignity. Z nich nejvýraznější vliv na přežití pacienta má právě let-7g* [88]. Dalším nezávislým biomarkerem je miR-203, která se nachází ve větší míře u adenokarcinomů na rozdíl od zdravých tkání, či tkání chronické pankreatitidy. Také úzce koreluje se špatnou prognózou pacientů, kteří již podstoupili chirurgickou léčbu [89]. Jiné onkogenní miRNA s podobnými prognostickými vlastnostmi jsou například miR-21, miR-155 35
[90] a miR-10b [91]. Zajímavým markerem je miR-211, jejíž zvýšená hladina se nachází u pacientů s kratším přežitím než u těch, kteří mají lepší vyhlídky [92]. Nejčastější chemoterapeutikum při léčbě nádorů slinivky břišní je gemcitabin, avšak jeho účinek je limitován velmi častou rezistencí těchto neoplázií. Přibližně až polovina pacientů po resekčním výkonu nevykazuje jakýkoliv benefit z chemoterapie. MiR-142-5p je nový testovaný prediktivní marker a jeho exprese vysoce koreluje s celkovým časem přežití pacientů po terapii gemcitabinem [93]. Jednou z miRNA, která má na svědomí rezistenci vůči chemoterapii, je také miR-17-5p a právě inhibice této molekuly je možnou cestou pro zlepšení léčebné odpovědi [94]. Podobný přístup se může využít například při inhibici miR-200 a let-7, které regulují EMT zodpovědnou za chemorezistenci [95]. Co se týče prediktivních biomarkerů neoadjuvantní léčby, tak svoje místo zde zastává už zmíněná miR-10b, kdy nižší hladiny této miRNA jsou asociovány s lepší odpovědí na léčbu [96].
1.2.6 MiRNA a nové možnosti léčby Využití miRNA v onkologii nespočívá jen na úrovni diagnostických, prognostických, či prediktivních biomarkerů, ale také otevírá nové možnosti při léčbě malignit. Jak již bylo zmíněno, miRNA úzce souvisí s karcinogenezí a ovlivňují proteosyntézu klíčových proteinů. To vedlo k poznání, že cílení miRNA, které mají odlišnou expresi ve zdravých a nádorových buňkách, může být nová éra v oblasti protinádorových léčiv. Dosud známe dvě základní strategie v cílení struktury miRNA, a to buď přímé anebo nepřímé. Mezi přímé inhibiční metodiky patří využití antisense oligonukleotidů, což jsou jednovláknové molekuly komplementární k maturované miRNA. Pro zvýšení efektivity a vazbové afinity vědci vytvořili modifikované jednovláknové RNA analogy antagomiRs, nebo “locked nucleic acids“ LNA. Druhým přístupem v přímých strategiích je substituce nádorově supresorových miRNA, které jsou v novotvarech v nedostatečném množství. Mezi nepřímé inhibiční techniky patří léčiva, která necílí miRNA, ale zasahují do signální dráhy biogeneze těchto krátkých molekul [97, 98]. Co se týče nádorů slinivky břišní, je potřeba zmínit miR-21, která je v těchto buňkách výrazně up-regulovaná. Kromě zvyšování invazivity a proliferace má tato miRNA na svědomí také chemorezistenci. I z toho důvodu je právě miR-21 jedním z hlavních terapeutických cílů při hledání léčiv na nádory pankreatu a první výzkumy již potvrdily pozitivní terapeutický efekt inhibice této miRNA. Bude to však ještě dlouhá cesta k aplikaci tohoto terapeutika v boji proti zákeřným nádorům slinivky břišní a vědce čeká mnoho práce, aby mohl být vysoký potenciál miRNA plně využitý [72, 97].
36
2 Cíl práce Cílem praktické části této bakalářské práce bylo porovnat expresi pěti miRNA (miR-21, miR-181a, miR-203, miR-217 a miR-222) v nádorových tkáních slinivky břišní, ve tkáních postižených chronickou pankreatitidou a u zdravých jedinců, a tím zjistit zda tyto miRNA plní funkci nádorových supresorů anebo onkogenů, a zda je možné na základě jejich exprese odlišit pacienty s chronickou pankreatitidou od pacientů s nádorovým onemocněním.
Dílčí cíle:
získat teoretické znalosti o nádorech slinivky břišní a miRNA
izolovatovat celkovou RNA obohacenou o frakci krátkých RNA ze 73 nádorových tkání a 7 tkání chronické pankreatitidy
provést reverzní transkripci a expresi vybraných miRNA stanovit pomocí qRT-PCR
identifikovat vhodnou endogenní kontrolu pro normalizaci dat získaných pomocí qRT-PCR
analyzovat
získaná
data
a porovnat
hodnoty
exprese
jednotlivých
miRNA
v nemocných a zdravých tkáních
korelovat hladiny analyzovaných miRNA s klinicko-patologickými znaky pacientů
37
3 Materiál a metody Použité chemikálie
3.1
High Pure miRNA Isolation Kit, Cat. 05080576001 (Roche, Švýcarsko)
mirVana™miRNA isolation Kit, Cat. AM1560 (Ambion, USA)
TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit, Cat. 4366597 (Applied Biosystems, USA)
TaqMan® MicroRNA Assays – hsa-miR-217, hsa-miR-222, hsa-miR-21, hsa-miR181a, hsa-miR-203, miR-1233, hsa-RNU6B, hsa-RNU48, hsa-RNU44 (Applied Biosystems, USA)
TaqMan® Universal PCR Master Mix, Cat. 4304437 (Applied Biosystems, USA)
FirstChoice Human Pancreas Total RNA, Cat. AM7954 (Applied Biosystems, USA)
Total RNA Pancreas Human, Cat. 540023 (Agilent Technologies, USA)
Použité přístroje
3.2
NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA)
DNA Engine, MJ Research PTC-200, Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)
Applied Biosystems Sequence Detection System ABI 7500 (Applied Biosystems, USA)
Použité softwary
3.3
GenEx 5.3.6 (MultiD Analyses AB, Švédsko) GraphPad Prism 5 (San Diego, California, USA)
38
3.4
Soubor pacientů V praktické části bakalářské práce byly použity FFPE (formalin fixed paraffin
embedded) vzorky od 73 pacientů (36 mužů, 37 žen) s histopatologicky ověřeným nádorem slinivky břišní a dále od 7 pacientů (5 mužů, 2 ženy) s chronickou pankreatitidou. Všichni pacienti podstoupili chirurgický zákrok ve FN Brno v letech 2000-2012. Medián věku pacientů s nádorem slinivky břišní v době odběru vzorku byl 60 let, medián věku pacientů s chronickou pankreatitidou byl 40 let. Zastoupení jednotlivých klinických stádií je uvedeno v tabulce V. Všichni nemocní podepsali informovaný souhlas týkající se odběru biologického materiálu a použití klinických a demografických údajů pro vědecké účely. Kontrolní vzorky tkání od zdravých jedinců nebyly bohužel k dispozici, protože je velmi obtížné sehnat nepoškozené tkáně pankreatu. Z toho důvodu byly použity dva komerční vzorky již vyizolované RNA obohacené o krátké miRNA. Jeden vzorek od firmy Applied Biosystems pocházel od 73letého muže a druhý od Agilent Technologies patřil 76leté ženě.
Tabulka V: Zastoupení pacientů s nádorem slinivky břišní v jednotlivých klinických stádiích
3.5
Klinické stádium
počet pacientů
T2N0M0 (IB)
1
T3N0M0 (IIA)
18
T2N1M0 (IIB)
7
T3N1M0 (IIB)
40
T2N0M1 (IV)
1
T2N1M1 (IV)
1
T3N1M1 (IV)
5
Izolace celkové RNA bohaté na frakci krátkých RNA z FFPE Při práci s nukleovými kyselinami je prvním a nezbytným krokem jejich izolace. Při
získávání RNA je největším problémem vysoká přítomnost RNáz, které se prakticky nacházejí všude. Proto je potřebné během celého procesu používat rukavice a speciální roztoky zbavené těchto enzymů. Izolace FFPE vzorků probíhá ve dvou dnech, prvním krokem je deparafinizace za pomoci xylenu a trávení přes noc, druhý den se provádí samotná izolace. Pro lepší uvolnění nukleových kyselin se využívá proteináza K, která štěpí bílkoviny včetně histonů, a tím ulehčuje izolaci RNA. Ostatní kroky jsou stejné jako při izolaci 39
nukleových kyselin z neparafínové tkáně, a to organická extrakce pomocí kyselého fenol-chloroformu, precipitace čistým alkoholem, imobilizace RNA na křemíkovém filtru, promytí a nakonec eluce.
Postup: Den 1: Deparafinizace a trávení (pomůcky: jehla; 1,5ml zkumavky; xylen; 99,8% ethanol; kit firmy Roche)
vzorek vložit do mikrozkumavky a pomocí jehly rozřezat na co nejmenší kousky
do zkumavky se vzorkem přidat 800 µl xylenu a 5 minut v ruce převracet
přidat 400 µl ethanolu a znovu protřepat, následně centrifugovat (2´ / 12000g / RT) a odstranit supernatant
přidat 1 ml ethanolu a protřepat, následně centrifugovat (2´ / 12000g / RT) a odstranit supernatant
sušit otevřenou zkumavku se vzorkem v termobloku (10´ / 55 oC)
přidat 100 µl Paraffin Tissue Lysis Buffer, 16 µl 10% SDS, 40 µl proteinázy K a následně celý vzorek důsledně protřepat
nechat trávit přes noc v otevřené zkumavce v termobloku při 55 oC
Den 2: Izolace RNA (pomůcky: 2ml zkumavky; 99,8% ethanol; kit firmy Ambion - mirVana™)
ke vzorku přidat 600 µl Lysis/Binding Buffer a 100 µl miRNA Homogenate Additive a následně vše důkladně zvortexovat
inkubovat 10 min na ledu
přidat 600 µl směsi kyselého fenolchloroformu, zvortexovat a následně centrifugovat (5´ / 12000g / RT)
přenést vodní fázi do nové 2ml kalibrované zkumavky a změřit přenesený objem
přidat 1,25x objem ethanolu a opatrně promíchat
ze vzorku odebrat 500 µl a přenést na novou kolonu se zkumavkou, následně centrifugovat (15´´ / 10000g / RT) a odstranit filtrát
filtraci opakovat dokud nepoužijeme celý původní vzorek
přidat 700 µl Wash Solution 1, centrifugovat (5-10´´ / 10000g / RT) a odstranit filtrát
přidat 500 µl Wash Solution 2/3, centrifugovat (5-10´´ / 10000g / RT) a odstranit filtrát
opět přidat 500 µl Wash Solution 2/3, centrifugovat (5-10´´ / 10000g / RT) a odstranit filtrát
centrifugovat bez přidání roztoku (3´ / 10000g / RT) a odstranit filtrát 40
kolonu přemístit do nové zkumavky
RNA eluovat pomocí 50µl Elution Solution předehřátého na 95 oC
centrifugovat (30´´ / 12000g / RT)
změřit koncentraci a čistotu získané RNA (NanoDrop-1000), vzorky uchovávat v mrazáku při teplotě -80 oC
Reverzní transkprice
3.6
Reverzní transkripce (RT) je proces přepisu genetické informace RNA do molekuly DNA na základě komplementarity bází a za pomocí reverzní transkriptázy. Při přepisu sekvence miRNA se využívá speciální smyčkovitý primer (stem-loop), který prodlouží krátkou sekvenci molekuly.
Postup:
jednotlivé reagencie z kitu pro RT nechat roztát na ledě
připravit master mix (MM) v 1,5ml zkumavce dle rozpisu v tabulce VI
Tabulka VI: Složení směsi pro RT
Master mix pro RT v 10 µl Master mix pro RT počet reakcí
1 vzorek
100mM dNTPs (with dTTP)
0,10 µl
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U∙µl-1
0,67 µl
10× Reverse Transcription Buffer
1,00 µl
Rnase Inhibitor, 20 U∙µl-1
0,13 µl
Nuclease-free watter
2,77 µl
Celkem
4,67 µl
promíchat na vortexu a nechat zchladit na ledě
naředit RNA na koncentraci 6,67 ng / 3,33 µl, tzn. 2 ng.µl-1
do připravených 0,2ml zkumavek napipetovat po 4,67 µl master mixu
do každé mikrozkumavky přidat 3,33 µl naředěného vzorku vyizolované RNA 41
do každé mikrozkumavky přidat 2 µl příslušného RT primeru
obsah mikrozkumavek promíchat a stočit
inkubovat 5 min na ledě
nastavit v termocykléru objem reakce 10 µl a navolit příslušný program dle tabulky VII Tabulka VII: Nastavení termocykléru
teplota
čas
hold 16 oC
30 min
hold 42 oC
30 min
hold 85 oC
5 min
hold 4 oC
∞ min
zahájit reverzní transkripci
po ukončení reakce vzorky ihned použít na PCR nebo zamrazit při -20 oC
3.7
qRT-PCR Kvantitativní PCR v reálnem čase patří mezi základní techniky využívané při
molekulárně biologických výzkumech nukleových kyselin. Výhodou je, že tato metoda vyžaduje jen malé množství nukleových kyselin, které si dokáže amplifikovat, a tím detekovat míru exprese různých genů, a to ve více tkáních. V této práci byla pomocí qRT-PCR porovnána exprese vybraných miRNA v nádorových a ve zdravých tkáních slinivky břišní a dále ve tkáních postižených chronickou pankreatitidou.
Postup:
podle počtu vzorků si připravit dostatečné množství směsi pro PCR podle tabulky VIII
Tabulka VIII: Objemové zastoupení jednotlivých složek směsi na PCR pro 1 vzorek
složka směsi pro PRC
objem složky
PCR Master Mix
10,00 µl
voda
7,67 µl
miRNA assay
1,00 µl 42
do každé jamky 96jamkové desky pro PCR napipetovat 18,67 µl směsi z předchozího bodu
do každé jamky přidat 1,33 µl produktu reverzní transkripce
desku pokrýt fólií, aby se roztok nevypařil během reakce
stočit a spustit přístroj s nastavením podle tabulky IX
Tabulka IX: Nastavení PCR cykléru
počet cyklů hold
40 cyklů
teplota
čas
50 oC
2 min
95 oC
10 min
95 oC
30 s
60 oC
1 min
Statistická analýza dat
3.8
Exprese jednotlivých miRNA analyzovaná pomocí RT-PCR byla vyhodnocena softwarem SDS 2.0.1 (Applied Biosystem). Hladiny jednotlivých miRNA byly měřeny v duplikátu a pro další analýzy byly použity průměrné hodnoty výsledných CT. Exprese byla normalizována pomocí endogenní kontroly RNU48. Následně byla provedena relativní kvantifikace pomocí metody 2-ΔCT: ΔCT(analyzovaná miRNA) = CT(analyzovaná miRNA) – CT(endogenní kontrola) Pro vyhodnocení hladin miRNA v nádorech vzhledem k hodnotám ve zdravých tkáních byla použita metoda 2-ΔΔCT: ΔΔCT= ΔCT(analyzovaná miRNA v nádorové tkáni) – ΔCT(průměrná exprese miRNA ve zdravé sliznici) Jednotlivé analýzy hladin miR-217 byly provedeny ve statistickém programu GraphPad Prism 5 pomocí Mann-Whitneyho testu a Kruskal-Wallisova testu. Rozbor korelace miR-217 s celkovým přežitím pacientů byl realizován za pomoci ROC analýzy a Kaplan-Meierovy analýzy. Výsledky byly považovány za statisticky významné v případě, kdy P bylo menší než 0,05.
43
4 Výsledky práce 4.1
Izolace RNA Na začátku studie byla provedena izolace celkové RNA obsahující krátké RNA. Byly
použity FFPE vzorky od 73 pacientů s nádorem slinivky břišní a 7 vzorků od pacientů s chronickou pankreatitidou. Zdravé vzorky slinivky břišní se nepodařilo získat, proto bylo využito komerčních vzorků již vyizolované RNA. Koncentrace byla zjištěna přístrojem Nanodrop ND-1000 a pohybovala se v rozmezí 22,02 – 1800,48 ng.µl-1. Na základě absorbancí při různých vlnových délkách byla změřena míra kontaminace a hodnoty A260/280 byly v rozsahu 1,70 – 2,06. Hodnoty A260/A230 charakterizující znečištění organickými rozpouštědly byly v rozmezí 0,23 - 2,14.
4.2
Identifikace endogenní kontroly pro normalizaci qRT-PCR dat U prvních dvaceti vzorků nádorů byla testována endogenní kontrola vhodná pro
normalizaci CT hodnot, která by měla mít stabilní expresi jak v nádorových, tak ve zdravých tkáních. S využitím softwaru GenEx byl určen jako nejvhodnější gen RNU48. V programu byly použity dva různé matematické algoritmy geNorm a NormFinder, které hodnotily stabilitu testovaných genů - RNU6B, RNU44, RNU48 a miR-1233. Jak je znázorněno na obrázcích 11 a 12, aplikace geNorm vybrala RNU44 a RNU48 jako 2 nejstabilněji expimované geny a následně NormFinder potvrdil jako vhodnější kontrolu RNU48.
Obr. 11: Geny RNU44 a RNU48 jako vhodné endogenní kontroly vybrané pomocí aplikace geNorm v programu GenEx.
44
Obr. 12: Gen RNU48 jako vhodná endogenní kontrola vybraná pomocí aplikace NormFinder v programu GenEx.
4.3
Analýza vybraných miRNA s deregulovanou expresí v nádorové tkáni slinivky břišní Samotná analýza expresí se skládala ze dvou fází. U prvních dvaceti vzorků nádorové
tkáně bylo testováno všech pět miRNA (miR-21, miR-181a, miR-203, miR-222 a miR-217), které byly vybrány na základě literatury [46, 58, 85, 89, 99]. Jak je žřejmé z obrázků 13 až 17, jediná miR-217 se prokázala jako nádorový supresor díky své snížené expresi u pacientů s nádorem slinivky. Naproti tomu miR-21, miR-181a, miR-203 a miR-222 byly exprimovány v nádorech ve zvýšené míře, a fungují tedy pravděpodobně jako onkogeny.
miR-21
10
4279
2749
3708
12555
6275
1128
7622
5446
19899
17004
8685
10647
7063
13304
1256
1995
17150
809
9073
1 16474
Normalizována exprese (log)
100
Vzorky nádorovýh tkání Obr. 13: Normalizovaná exprese miR-21 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí -ΔΔCT
referenčního genu RNU48 s využitím metody 2
45
).
Normalizována exprese (log)
miR-181a 100
10
3708
4279
2749
13304
17004
8685
1128
19899
7622
1995
7063
6275
16474
9073
17150
5446
10647
1256
12555
809
1
Vzorky nádorových tkání Obr. 14: Normalizovaná exprese miR-181a ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí -ΔΔCT
referenčního genu RNU48 s využitím metody 2
).
miR-203
10
4279
7063
10647
12555
8685
2749
7622
19899
5446
6275
1128
17004
9073
3708
13304
16474
809
1995
1256
1 17150
Normalizována exprese (log)
100
Vzorky nádorových tkání Obr. 15: Normalizovaná exprese miR-203 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí -ΔΔCT
referenčního genu RNU48 s využitím metody 2
46
).
miR-222
10
4279
13304
3708
2749
7622
12555
10647
17004
7063
5446
17150
8685
1128
19899
6275
1995
809
16474
1256
1 9073
Normalizována exprese (log)
100
Vzorky nádorových tkání Obr. 16: Normalizovaná exprese miR-222 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí -ΔΔCT
referenčního genu RNU48 s využitím metody 2
).
miR-217
Normalizována exprese (log)
1128
19899
16474
10647
2749
7622
3708
1995
9073
12555
13304
6275
809
4279
7063
8685
5446
17150
1256
1,0000
17004
Vzorky nádorových tkání
0,1000 0,0100 0,0010 0,0001
Obr. 17: Normalizovaná exprese miR-217 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí -ΔΔCT
referenčního genu RNU48 s využitím metody 2
47
).
4.4
Analýza exprese miR-217 na rozšířeném souboru pacientů V další fázi studie byla zkoumána již jen miR-217, která měla nejvýznamnější rozdíly
exprese v nádorových a zdravých tkáních. Zároveň bylo již dříve prokázáno, že tato miRNA má potenciál odlišit nádorovou tkáň od chronické pankreatitidy [74, 100]. Pomocí qRT-PCR byly proto stanoveny její hladiny v ostatních 53 vzorcích nádorové tkáně a 7 vzorcích chronické pankreatitidy. Jak je patrné z obrázku 18, u 89 % pacientů s nádorem slinivky břišní vykazovala miR-217 sníženou hladinu oproti zdravým tkáním, čímž se potvrdila její funkce významného nádorového supresoru.
MiR-217 10,0000
Normalizovaná exprese (log)
Vzorky nádorových tkání 1,0000
0,1000
0,0100
0,0010
0,0001
Obr. 18: Porovnání exprese miR-217 v 73 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2
V programu
GraphPad
Prism
byl
následně
-ΔΔCT
pomocí
).
Mann-Whitneyho
testu
vyhodnocen rozdíl v expresi miR-217 u pacientů s chronickou pankreatitidou a pacientů s nádorem slinivky břišní, jak je znázorněno na obrázku 19. Podle očekávání byla hladina miR-217 významně snížená v nádorové tkáni v porovnání s tkání chronické pankreatitidy (P = 0,0038).
48
P=0,0038 normalizovaná exprese (log)
10
1
0.1
0.01
0.001
0.0001
tkáň pankreatitidy
nádorová tkáň
Obr. 19: Porovnání exprese miR-217 u pacientů s chronickou pankreatitidou a u pacientů s nádorem slinivky břišní (Mann-Whitney test, P = 0,0038).
V další fázi studie byla srovnána exprese miR-217 v tkáních chronické pankreatitidy, nádorových tkáních a zdravé sliznici. S využitím Kruskal-Wallisova testu bylo prokázáno, že hladiny miR-217 významně klesají se vznikem nádorového onemocnění (P = 0,0036; obr. 20). Nevýznamný rozdíl v tkáni chronické pankreatitidy oproti zdravé sliznici je pravděpodobně dán malým počtem vzorků v obou skupinách.
normalizovaná exprese (log)
P=0,0036 10
1
0.1
0.01
0.001
0.0001 zdravá sliznice
tkáň pankreatitidy
nádorová tkáň
Obr. 20: Porovnání exprese miR-217 u pacientů s chronickou pankreatitidou, u pacientů s nádorem slinivky břišní a ve zdravé sliznici (Kruskal-Walis test, P = 0,0036).
49
4.5
MiR-217 jako prognostický marker Z dostupných informací o klinických stádiích našeho souboru pacientů byla pomocí
Kruskal-Wallisovho testu provedena analýza vztahu hladiny miR-217 a klinického stádia. Z výsledného obrázku 21 je vidět, že hladina exprese miR-217 je mírně snížená v pozdějšim stádiu IIB než v klinickém stádiu IIA, avšak rozdíly nejsou nijak významné. Metastatické stádium IV dokonce vykazuje překvapivě vyšší hladinu nádorově supresorové miR-217 v porovnání s časnějšími stádii. Tím se nám potvrdilo, že hladina exprese miR-217 nesouvisí se stádiem nádoru.
P=0,2965 normalizovaná exprese (log)
10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 IIA
IIB
IV
klinické stádium Obr. 21: Analýze exprese miR-217 v závislosti na klinickém stádiu (Kruskal-Wallis test, P=0,2965).
Na závěr byla analyzována korelace mezi expresí miR-217 a celkovým přežitím pacientů s nádory slinivky břišní po provedení operativního zákroku. Pomocí ROC analýzy bylo možné odlišit pacienty s přežíváním delším než 9 měsíců od pacientů, kteří umřeli dříve než 9 měsíců po operaci, se senzitivitou 83,33 % a specificitou 52,63 % (obr. 22).
50
100 cut-off = 0,006191 senzitivita = 83,33 % specificita = 52,63 %
Senzitivita %
80 60 40 20
10 0
80
60
40
20
0
0
100% - Specificita Obr. 22: ROC analýza na zjištění hraniční cut-off hodnoty exprese miR-217 u pacientů s celkovým přežíváním delším a kratším než 9 měsíců.
Následně byla provedena Kaplan-Meierova analýza přežití pacientů, která však nepotvrdila souvislost mezi expresí miR-217 a celkovým přežíváním pacientů s nádory slinivky břišní (P = 0,6872; obr. 23).
P=0,6872 100
pacienti s vyšší hladinou exprese miR-217
přežití (%)
80
pacienti s nižší hladinou exprese miR-217
60 40 20 0 0
500
1000
1500
2000
celkové přežití (dny)
Obr. 23: Kaplan-Meierovy křivky přežití pacientů s vyšší hladinou exprese miR-217 (červená křivka) a s nižší hladinou exprese miR-217 (černá křivka) u nádorů slinivky břišní.
51
5 Diskuze MikroRNA jsou důležité buněčné regulátory podílející se na mnohých esenciálních procesech, jakými jsou proliferace, embryogeneze, diferenciace, či apoptóza. Je proto očividné, že jakékoliv narušení jejich regulační rovnováhy má výrazný vliv na další vývoj buňky a také na vznik nádorových onemocnění. Výsledky mnohých studií potvrdily úlohu miRNA v maligní transformaci buněk rozličných nádorů, ať už v roli onkogenů nebo nádorových supresorů. Také nádory slinivky břišní jsou charakteristické řadou miRNA, které je ovlivňují buď pozitivně, nebo negativně [47, 66, 78, 80, 87, 88]. Cílem této práce bylo analyzovat expresi pěti miRNA, které byly vybrány na základě prostudované literatury, a to konkrétně miR-21, miR-181a, miR-203, miR-217 a miR-222. Záměrem bylo potvrdit jejich funkci nádorových supresorů nebo onkogenů u nádorů slinivky břišní, a také identifikovat nové potenciální diagnostické markery, které by umožnily odlišit nádory slinivky břišní od chronické pankreatitidy. Jako první a nezbytný krok při práci s parafínovými vzorky byla izolace krátkých RNA, se kterými se dále pracovalo. V některých případech byly výtěžky poměrně nízké, avšak všechny získané koncentrace byly dostatečné pro další analýzy. Případná kontaminace produktů izolace byla zjištěná přístrojem NanoDrop, který také měřil koncentraci RNA. Hodnoty A260/A280, vyjadřující znečištění bílkovinami, byly u všech vzorků větší než 1,8, avšak hodnoty A260/A230 byly u většiny vzorků menší než 1,7 v důsledku znečištění chaotropními solemi nebo fenolem. Přesto bylo možné použít všechny vzorky pro další analýzy. Dalším úkolem bylo najít nejvhodnější endogenní kontrolu pro normalizaci dat z qRT-PCR. Byly testovány RNU6B, RNU44, RNU48 a miR-1233, a to u prvních dvaceti vzorků nádorové tkáně a dvou komerčních zdravých vzorků RNA. Následně pomocí softwaru GenEx byl vyhodnocen jako nejvhodnější gen pro normalizaci RNU48. Avšak jeho CT hodnoty nebyly zcela stabilní a vykazovaly nepatrně odlišné hladiny v tkáních nádorů, chronické pankreatitidy a ve zdravé sliznici. Tato endogenní kontrola se neprokázala jako ideální, avšak v porovnání s ostatními byla nejlepší. Důvodem mohl být fakt, že izolované miRNA ze zdravých buněk pocházely z nativní tkáně, zatímco ostatní vzorky nádorů a pankreatitid byly fixované v parafínu. Protože molekula RNU48 má 64 nukleotidů a je o mnoho delší než miRNA, v parafínových vzorcích mohlo dojít k její částečné degradaci. Přestože tento gen byl vyhodnocen jako optimální, do budoucna ostává cíl najít lepší a stabilnější gen pro normalizaci, pravděpodobně ze skupiny miRNA. S tím souvisí také získání zdravých tkání slinivky břišní fixovaných v parafínu pro snížení variability vzorků. Výběr endogenní kontroly v této práci je v rozporu s více studiemi [46, 48, 89], protože ve většině případů byla pro normalizaci dat použita právě RNU6B. Avšak ve vzorcích 52
analyzovaných v této studii nebyla RNU6B stabilní a vykazovala velké odchylky expresí ve zdravých a parafínových tkáních, proto nemohla být použita. Hladiny exprese jednotlivých miRNA byly stanoveny pomocí qRT-PCR. Data byla normalizována pomocí výše zmíněné endogenní kontroly RNU48 a následně vyhodnocena metodou 2-ΔΔCT. Jediná miR-217 se prokázala jako nádorový supresor a zároveň vykazovala nejsignifikantnější rozdíl expresí ve zdravých a nádorových tkáních. Proto byla vybrána pro další analýzy zabývající se hledáním potenciálního diagnostického nebo prognostického markeru. Tento výsledek byl v souladu s jinými studiemi zabývajícími se miR-217 v maligní transformaci slinivky břišní. Zhao et al. [46] se zaměřil na cílovou strukturu miR-217. Z výsledků studie je zřejmé, že nádorový supresor miR-217 se podílí na regulaci onkogenu KRAS, který je jedním z nejčastěji mutovaných genů u mnoha nádorových onemocnění. U duktálních adenokarcinomů slinivky břišní se mutace KRAS nacházejí ve více než 90 % případů, proto je patrné, že tento onkogen má klíčovou roli v maligní tranformaci pankreatu. Szafranska et al. [100] se zabývala jinou signální dráhou, a to konkrétně wnt/β-katenin. Bylo zjištěno, že miR-217 se podílí na regulaci β-kateninu, který má důležitou roli ve vývoji růstu slinivky břišní. Ostatní analyzované miRNA (miR-21, miR-181a, miR-203 a miR-222) pravděpodobně fungují jako onkogeny, neboť jejich exprese v nádorových buňkách byla zvýšená. Toto pozorování bylo rovněž v souladu s dřívě publikovanými studiemi. Park et al. [58] uvádí, že miR-21 ovlivňuje proliferaci, regulaci buněčného cyklu a apoptózu ve prospěch nádorového růstu. Onkogenní role miR-21 byla prokázána také prostřednictvím inhibice této miRNA za použití anti-miR-21, v důsledku čehož došlo ke zvýšení hladiny nádorových supresorů PTEN a RECK. Dále byl potvrzen vliv miR-21 na rezistenci vůči gemcitabinu. Výsledky studie Di Rieu et al. [52] prokázaly, že v nádorech pankreatu je promotor miR-21 stimulován signálními dráhami EGFR a KRAS. Co se týče miR-181a, Liu et al. [85] zjistil signifikantně zvýšenou expresi v plazmě pacientů s nádorem slinivky břišní, což by mohlo poukazovat na funkci miR-181a jako potenciálního diagnostického markeru této malignity. Ikenaga et al. [89] zkoumal expresi miR-203 v tkáních pacientů po provedení operativního zákroku nádoru pankreatu. Z výsledků je patrné, že tato miRNA vykazovala vlastnosti prognostického markeru pro pacienty, kteří podstoupili úplnou radikální resekci. Také miR-222 úzce koreluje s prognózou pacientů a podle Greither et al. [99] její zvýšená exprese v nádorových tkáních pankreatu souvisí s celkovým přežíváním nemocných. Jako jedny z cílových molekul miR-222 byly identifikovány proteiny p27 a p57. Dalším problémem komplikujícím diagnostiku nádorů slinivky břišní je podobnost klinických příznaků s chronickou pankreatitidou. Proto ve druhé fázi studie byla testována miR-217 v úloze diagnostického markeru odlišujícího nádor slinivky břišní od chronické pankreatitidy. Výsledky této práce potvrdily významně sníženou expresi miR-217 v maligních buňkách oproti buňkám chronické pankreatitidy. Tímto byly potvrzeny výsledky dřívějších 53
studií, které předpokládají, že nádorově supresorová miR-217 by v budoucnosti mohla sloužit jako účinný diagnostický nástroj k odlišení nádorů slinivky břišní a chronické pankreatitidy. Szafranska et al. [74, 100] uvádí, že kombinace miR-217 spolu s onkogenní miR-196a je vhodná pro rozlišení těchto dvou diagnóz. Navíc miR-217 se téměř výhradně tvoří v acinárních buňkách, které tvoří slinivku břišní z 90 %, a naopak miR-196a se exprimuje jenom v buňkách nádoru pankreatu, z toho důvodu by mohly být tyto dvě miRNA specifickými markery diferenciace slinivky břišní v procesu maligní proměny. Posledním cílem práce bylo zjistit, zda by miR-217 mohla v budoucnosti sloužit jako potenciální prognostický marker. Výsledky analýz však neprokázaly přímou souvislost mezi hladinou miR-217 a klinickým stádiem onemocnění. Překvapivě metastatické stádium vykazovalo
vyšší
hladinu
nádorově
supresorové
miR-217
než
včasnější
fáze.
Kaplan-Meierovy křivky přežití ukázaly další nečekané výsledky. Onkologičtí pacienti s vyšší hladinou miR-217 se dožívali nepatrně nižšího věku, než ti, co měli expresi miR-217 nižší. Tím bylo definitivně prokázáno, že miR-217 nekoreluje s klinicko-patologickými znaky a nemá vlastnosti prognostického markeru v karcinogenezi nádorů slinivky břišní. Cílem této bakalářské práce bylo potvrdit výsledky výzkumů, které se zabývaly podobnou problematikou, což se úspěšně povedlo. Bylo zjištěno, že miR-217 má vhodné vlastnosti potenciálního diagnostického markeru k odlišení nádorů slinivky břišní od chronické pankreatitidy, avšak jako ukazatel prognózy se neosvědčila. Do budoucna by tato práce mohla být rozšířena o větší soubor pacientů a hlavně větší počet zdravých vzorků slinivky břišní, nejlépe paralelních s nádorovými. Také bude potřeba ještě detailněji prozkoumat funkce miR-217 v regulaci signálních drah pomocí in vitro analýz a in vivo testováním na myších modelech, a v neposlední řadě též najít další cílové molekuly tohto významného nádorového supresoru.
54
6 Závěr V této práci bylo dosaženo následujících výsledků: -
Byla izolována celková RNA obohacená o krátké miRNA ze 74 vzorků nádorů slinivky břišní a ze 7 vzorků tkání chronické pankreatitidy.
-
Byla identifikována vhodná endogenní kontrola (RNU48) pro normalizaci dat získaných pomocí qRT-PCR.
-
V první fázi byla pomocí qRT-PCR porovnána exprese pěti miRNA, konkrétně miR-21, miR-181a, miR-203, miR-217 a miR-222, ve dvaceti vzorcích nádorové tkáně slinivky břišní a ve dvou komerčních vzorcích RNA ze zdravé sliznice. Všechny miRNA kromě miR-217 se prokázaly jako onkogeny.
-
Rozšířená analýza miR-217 na větším souboru pacientů s nádory pankreatu potvrdila sníženou expresi této miRNA v 89 % nádorových tkání.
-
Testování miR-217 jako biomarkeru pro odlišení nádorů slinivky břišní a chronické pankreatitidy potvrdilo potenciální využití miR-217 v této oblasti.
-
Nebyla prokázána korelace mezi hladinou miR-217 a klinicko-patologickými znaky pacientů, ani celkovým přežíváním pacientů s nádorem slinivky břišní.
-
V práci se podařilo splnit všechny vytyčené cíle. Výsledky se shodují s dříve publikovanými studiemi.
55
Seznam použité literatury 1. Zavoral M: Karcinom pankreatu. 1. vyd. Praha: Galén, 2005. ISBN 80-726-2348-6. 2. Mařatka Z: Gastroenterologie. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1999. ISBN 80-718-4561-2. 3. Slabý O, Svoboda M: MikroRNA v onkologii. 1. vyd. Praha: Galén; 2012, ISBN 978-8072625-871. 4. Čihák R, Grim M: Anatomie 2. 2. vyd. Praha: Grada, 2002. ISBN 80-247-0143-X. 5. Bellizzi AM, Frankel WL: Pancreatic Pathology: A Practical Review. Lab Medicine 2009, 40:417–426. 6. Chang S-M, Yan S-T, Wei C-K, Lin C-W, Tseng C-E: Solitary concomitant endocrine tumor and ductal adenocarcinoma of pancreas. World J Gastroenterol 2010, 16:2692– 2697. 7. Klener P: Klinická onkologie. Praha: Galén, 2002. ISBN 978-802-4604-688. 8. Sobin LH, Wittekind C: TNM klasifikace zhoubných novotvarů. 6. vyd. Praha: Ústav zdravotnických informací a statistiky České republiky; 2004, ISBN 80-7280-391-3 9. Michaud DS: Epidemiology of pancreatic cancer. Minerva Chir 2004, 59:99–111. 10. Dušek L, Mužík J, Kubásek M, Koptíková J, Žaloudík J, Vyzula R: Epidemiologie zhoubných nádorů v České republice [online]. Masarykova univerzita, 2005. Dostupný z WWW: http://www.svod.cz. 11. Lowenfels AB, Maisonneuve P: Epidemiology and Prevention of Pancreatic Cancer. Jpn J Clin Oncol 2004, 34:238–244. 12. Kuzmickiene I, Everatt R, Virviciute D, Tamosiunas A, Radisauskas R, Reklaitiene R, Milinaviciene E: Smoking and other risk factors for pancreatic cancer: A cohort study in men in Lithuania. Cancer Epidemiol 2013, 37:133–139. 13. Lowenfels AB, Maisonneuve P: Risk factors for pancreatic cancer. J Cell Biochem 2005, 95:649–656. 14. Ye W, Lagergren J, Weiderpass E, Nyrén O, Adami H-O, Ekbom A: Alcohol abuse and the risk of pancreatic cancer. Gut 2002, 51:236–239. 15. Michaud DS, Giovannucci E, Willett WC, Colditz GA, Stampfer MJ, Fuchs CS: Physical activity, obesity, height, and the risk of pancreatic cancer. JAMA 2001, 286:921–929. 16. Adam Z, Krejčí M, Vorlíček J: Speciální onkologie: příznaky, diagnostika a léčba maligních chorob. 1. vyd. Praha: Galén, 2010. ISBN 80-726-2648-5. 17. Hoskovec D, Varga J, Konečná E, Antos F: Levels of CEA and Ca 19 - 9 in the sera and peritoneal cavity in patients with gastric and pancreatic cancers. Acta Cir Bras 2012, 27:410–416. 18. Hohenberger W, Schlag PM, Junginger T, Becker HD: Chirurgická onkologie. 1. vyd. Praha: Grada, 2005. ISBN 80-247-0720-9. 56
19. Adam Z, Vaníček J, Vorlíček J: Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob. 2. aktualiz. a dopl. vyd. Praha: Grada, 2004. ISBN 80-247-0896-5. 20. Rejthar A, Vojtěšek B: Obecná patologie nádorového růstu. 1. vyd. Praha: Grada, 2002. ISBN 80-247-0238-X. 21. Segura PP, Ponce CG, Ramón Y Cajal T, Blanch RS, Aranda E: Hereditary pancreatic cancer: molecular bases and their application in diagnosis and clinical management: a guideline of the TTD group. Clin Transl Oncol 2012, 14:553–563. 22. Lüttges J, Hahn S, Klöppel G: Where and when does pancreatic carcinoma start? Med Klin (Munich) 2004, 99:191–195. 23. Matsuyama M, Kondo F, Ishihara T, Yamaguchi T, Ito R, Tsuyuguchi T, Tawada K, Yokosuka O: Evaluation of pancreatic intraepithelial neoplasia and mucin expression in normal pancreata. J Hepatobiliary Pancreat Sci 2012, 19:242–248. 24. Eulalio A, Huntzinger E, Izaurralde E: Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell 2008, 132:9–14. 25. Zhang B, Wang Q, Pan X: MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants. J Cell Physiol 2007, 210:279–289. 26. Lee Y, Kim M, Han J, Yeom K-H, Lee S, Baek SH, Kim VN: MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 2004, 23:4051–4060. 27. Graves P, Zeng Y: Biogenesis of mammalian microRNAs: a global view. Genomics Proteomics Bioinformatics 2012, 10:239–245. 28. Winter J, Jung S, Keller S, Gregory RI, Diederichs S: Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol 2009, 11:228–234. 29. Wilkie GS, Dickson KS, Gray NK: Regulation of mRNA translation by 5’- and 3’-UTRbinding factors. Trends Biochem Sci 2003, 28:182–188. 30. Krol J, Loedige I, Filipowicz W: The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet 2010, 11:597–610. 31. Ruan K, Fang X, Ouyang G: MicroRNAs: novel regulators in the hallmarks of human cancer. Cancer Lett 2009, 285:116–126. 32. Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA: microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Dev Biol 2007, 302:1–12. 33. Iorio MV, Croce CM: MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med 2012, 4:143–159. 34. Lynam-Lennon N, Maher SG, Reynolds JV: The roles of microRNA in cancer and apoptosis. Biol Rev Camb Philos Soc 2009, 84:55–71. 35. Melo SA, Esteller M: Dysregulation of microRNAs in cancer: playing with fire. FEBS Lett 2011, 585:2087–2099.
57
36. Alberts B: Základy buněčné biologie: úvod do molekulární biologie buňky. 2. vyd. Ústí nad Labem: Espero, 1998. ISBN 80-902906-0-4. 37. Hezel AF, Kimmelman AC, Stanger BZ, Bardeesy N, Depinho RA: Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes Dev 2006, 20:1218–1249. 38. Romero D, Iglesias M, Vary CPH, Quintanilla M: Functional blockade of Smad4 leads to a decrease in beta-catenin levels and signaling activity in human pancreatic carcinoma cells. Carcinogenesis 2008, 29:1070–1076. 39. Alberts B: Molecular Biology of the Cell. 5. vyd. New York: Garland Science, 2008. ISBN 08-153-4106-7. 40. Hao J, Zhang S, Zhou Y, Liu C, Hu X, Shao C: MicroRNA 421 suppresses DPC4/Smad4 in pancreatic cancer. Biochem Biophys Res Commun 2011, 406:552– 557. 41. Hao J, Zhang S, Zhou Y, Hu X, Shao C: MicroRNA 483-3p suppresses the expression of DPC4/Smad4 in pancreatic cancer. FEBS Lett 2011, 585:207–213. 42. Tzeng C-WD, Frolov A, Frolova N, Jhala NC, Howard JH, Vickers SM, Buchsbaum DJ, Heslin MJ, Arnoletti JP: EGFR genomic gain and aberrant pathway signaling in pancreatic cancer patients. J Surg Res 2007, 143:20–26. 43. Lo H-W, Hung M-C: Nuclear EGFR signalling network in cancers: linking EGFR pathway to cell cycle progression, nitric oxide pathway and patient survival. Br J Cancer 2006, 94:184–188. 44. Rozsypal S: Nový přehled biologie. 1. vyd. Praha: Scientia, 2003. ISBN 80-718-3268-5. 45. Morris JP 4th, Wang SC, Hebrok M: KRAS, Hedgehog, Wnt and the twisted developmental biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Nat Rev Cancer 2010, 10:683–695. 46. Zhao W-G, Yu S-N, Lu Z-H, Ma Y-H, Gu Y-M, Chen J: The miR-217 microRNA functions as a potential tumor suppressor in pancreatic ductal adenocarcinoma by targeting KRAS. Carcinogenesis 2010, 31:1726–1733. 47. Jiao LR, Frampton AE, Jacob J, Pellegrino L, Krell J, Giamas G, Tsim N, Vlavianos P, Cohen P, Ahmad R, Keller A, Habib NA, Stebbing J, Castellano L: MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS ONE 2012, 7:e32068. 48. Ali S, Banerjee S, Logna F, Bao B, Philip PA, Korc M, Sarkar FH: Inactivation of Ink4a/Arf leads to deregulated expression of miRNAs in K-Ras transgenic mouse model of pancreatic cancer. J Cell Physiol 2012, 227:3373–3380. 49. Ali S, Ahmad A, Aboukameel A, Bao B, Padhye S, Philip PA, Sarkar FH: Increased Ras GTPase activity is regulated by miRNAs that can be attenuated by CDF treatment in pancreatic cancer cells. Cancer Lett 2012, 319:173–181. 58
50. Kent OA, Chivukula RR, Mullendore M, Wentzel EA, Feldmann G, Lee KH, Liu S, Leach SD, Maitra A, Mendell JT: Repression of the miR-143/145 cluster by oncogenic Ras initiates a tumor-promoting feed-forward pathway. Genes Dev 2010, 24:2754–2759. 51. Yu S, Lu Z, Liu C, Meng Y, Ma Y, Zhao W, Liu J, Yu J, Chen J: miRNA-96 suppresses KRAS and functions as a tumor suppressor gene in pancreatic cancer. Cancer Res 2010, 70:6015–6025. 52. Du Rieu MC, Torrisani J, Selves J, Al Saati T, Souque A, Dufresne M, Tsongalis GJ, Suriawinata AA, Carrère N, Buscail L, Cordelier P: MicroRNA-21 is induced early in pancreatic ductal adenocarcinoma precursor lesions. Clin Chem 2010, 56:603–612. 53. Li Y, Vandenboom TG 2nd, Wang Z, Kong D, Ali S, Philip PA, Sarkar FH: miR-146a suppresses invasion of pancreatic cancer cells. Cancer Res 2010, 70:1486–1495. 54. Walsh N, Kennedy S, Larkin A, Corkery B, O’Driscoll L, Clynes M, Crown J, O’Donovan N: EGFR and HER2 inhibition in pancreatic cancer. Invest New Drugs 2012. 55. Srivastava SK, Bhardwaj A, Singh S, Arora S, Wang B, Grizzle WE, Singh AP: MicroRNA-150 directly targets MUC4 and suppresses growth and malignant behavior of pancreatic cancer cells. Carcinogenesis 2011, 32:1832–1839. 56. MacDonald BT, Tamai K, He X: Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell 2009, 17:9–26. 57. Huang K, Zhang J-X, Han L, You Y-P, Jiang T, Pu P-Y, Kang C-S: MicroRNA roles in beta-catenin pathway. Mol Cancer 2010, 9:252. 58. Park J-K, Lee EJ, Esau C, Schmittgen TD: Antisense inhibition of microRNA-21 or 221 arrests cell cycle, induces apoptosis, and sensitizes the effects of gemcitabine in pancreatic adenocarcinoma. Pancreas 2009, 38:e190–199. 59. Sirivatanauksorn V, Sirivatanauksorn Y, Lemoine NR: Molecular pattern of ductal pancreatic cancer. Langenbecks Arch Surg 1998, 383:105–115. 60. Chang T-C, Wentzel EA, Kent OA, Ramachandran K, Mullendore M, Lee KH, Feldmann G, Yamakuchi M, Ferlito M, Lowenstein CJ, Arking DE, Beer MA, Maitra A, Mendell JT: Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis. Mol Cell 2007, 26:745–752. 61. Chen Z, Chen L-Y, Dai H-Y, Wang P, Gao S, Wang K: miR-301a promotes pancreatic cancer cell proliferation by directly inhibiting Bim expression. J Cell Biochem 2012, 113:3229–3235. 62. Shen J, Wan R, Hu G, Yang L, Xiong J, Wang F, Shen J, He S, Guo X, Ni J, Guo C, Wang X: miR-15b and miR-16 induce the apoptosis of rat activated pancreatic stellate cells by targeting Bcl-2 in vitro. Pancreatology 2012, 12:91–99.
59
63. Guo R, Wang Y, Shi W-Y, Liu B, Hou S-Q, Liu L: MicroRNA miR-491-5p Targeting both TP53 and Bcl-XL Induces Cell Apoptosis in SW1990 Pancreatic Cancer Cells through Mitochondria Mediated Pathway. Molecules 2012, 17:14733–14747. 64. Dong J, Zhao Y-P, Zhou L, Zhang T-P, Chen G: Bcl-2 upregulation induced by miR-21 via a direct interaction is associated with apoptosis and chemoresistance in MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells. Arch Med Res 2011, 42:8–14. 65. Park J-K, Henry JC, Jiang J, Esau C, Gusev Y, Lerner MR, Postier RG, Brackett DJ, Schmittgen TD: miR-132 and miR-212 are increased in pancreatic cancer and target the retinoblastoma tumor suppressor. Biochem Biophys Res Commun 2011, 406:518– 523. 66. Li W-G, Yuan Y-Z, Qiao M-M, Zhang Y-P: High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cells. World J Gastroenterol 2012, 18:2630–2639. 67. Hamada S, Satoh K, Miura S, Hirota M, Kanno A, Masamune A, Kikuta K, Kume K, Unno J, Egawa S, Motoi F, Unno M, Shimosegawa T: miR-197 induces epithelialmesenchymal transition in pancreatic cancer cells by targeting p120 catenin. J Cell Physiol 2013, 228:1255–1263. 68. Hu Y, Ou Y, Wu K, Chen Y, Sun W: miR-143 inhibits the metastasis of pancreatic cancer and an associated signaling pathway. Tumour Biol 2012, 33:1863–1870. 69. Qazi AM, Gruzdyn O, Semaan A, Seward S, Chamala S, Dhulipala V, Sethi S, Ali-Fehmi R, Philip PA, Bouwman DL, Weaver DW, Gruber SA, Batchu RB: Restoration of Ecadherin expression in pancreatic ductal adenocarcinoma treated with microRNA101. Surgery 2012, 152:704–711; discussion 711–713. 70. Yan H, Wu J, Liu W, Zuo Y, Chen S, Zhang S, Zeng M, Huang W: MicroRNA-20a overexpression inhibited proliferation and metastasis of pancreatic carcinoma cells. Hum Gene Ther 2010, 21:1723–1734. 71. Wang F, Xue X, Wei J, An Y, Yao J, Cai H, Wu J, Dai C, Qian Z, Xu Z, Miao Y: hsa-miR520h downregulates ABCG2 in pancreatic cancer cells to inhibit migration, invasion, and side populations. Br J Cancer 2010, 103:567–574. 72. Bhatti I, Lee A, James V, Hall RI, Lund JN, Tufarelli C, Lobo DN, Larvin M: Knockdown of microRNA-21 inhibits proliferation and increases cell death by targeting programmed cell death 4 (PDCD4) in pancreatic ductal adenocarcinoma. J Gastrointest Surg 2011, 15:199–208. 73. Mees ST, Mardin WA, Sielker S, Willscher E, Senninger N, Schleicher C, ColomboBenkmann M, Haier J: Involvement of CD40 targeting miR-224 and miR-486 on the progression of pancreatic ductal adenocarcinomas. Ann Surg Oncol 2009, 16:2339– 2350. 60
74. Szafranska AE, Doleshal M, Edmunds HS, Gordon S, Luttges J, Munding JB, Barth RJ Jr, Gutmann EJ, Suriawinata AA, Marc Pipas J, Tannapfel A, Korc M, Hahn SA, Labourier E, Tsongalis GJ: Analysis of microRNAs in pancreatic fine-needle aspirates can classify benign and malignant tissues. Clin Chem 2008, 54:1716–1724. 75. Nana-Sinkam SP, Fabbri M, Croce CM: MicroRNAs in cancer: personalizing diagnosis and therapy. Ann N Y Acad Sci 2010, 1210:25–33. 76. Habbe N, Koorstra J-BM, Mendell JT, Offerhaus GJ, Ryu JK, Feldmann G, Mullendore ME, Goggins MG, Hong S-M, Maitra A: MicroRNA miR-155 is a biomarker of early pancreatic neoplasia. Cancer Biol Ther 2009, 8:340–346. 77. Munding JB, Adai AT, Maghnouj A, Urbanik A, Zöllner H, Liffers ST, Chromik AM, Uhl W, Szafranska-Schwarzbach AE, Tannapfel A, Hahn SA: Global microRNA expression profiling of microdissected tissues identifies miR-135b as a novel biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma. Int J Cancer 2012, 131:E86–95. 78. Roldo C, Missiaglia E, Hagan JP, Falconi M, Capelli P, Bersani S, Calin GA, Volinia S, Liu C-G, Scarpa A, Croce CM: MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior. J Clin Oncol 2006, 24:4677–4684. 79. Etheridge A, Lee I, Hood L, Galas D, Wang K: Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res 2011, 717:85–90. 80. Wang J, Chen J, Chang P, LeBlanc A, Li D, Abbruzzesse JL, Frazier ML, Killary AM, Sen S: MicroRNAs in plasma of pancreatic ductal adenocarcinoma patients as novel blood-based biomarkers of disease. Cancer Prev Res (Phila) 2009, 2:807–813. 81. Kawaguchi T, Komatsu S, Ichikawa D, Morimura R, Tsujiura M, Konishi H, Takeshita H, Nagata H, Arita T, Hirajima S, Shiozaki A, Ikoma H, Okamoto K, Ochiai T, Taniguchi H, Otsuji E: Clinical impact of circulating miR-221 in plasma of patients with pancreatic cancer. Br J Cancer 2013, 108:361–369. 82. Li A, Omura N, Hong S-M, Vincent A, Walter K, Griffith M, Borges M, Goggins M: Pancreatic cancers epigenetically silence SIP1 and hypomethylate and overexpress miR-200a/200b in association with elevated circulating miR-200a and miR-200b levels. Cancer Res 2010, 70:5226–5237. 83. Morimura R, Komatsu S, Ichikawa D, Takeshita H, Tsujiura M, Nagata H, Konishi H, Shiozaki A, Ikoma H, Okamoto K, Ochiai T, Taniguchi H, Otsuji E: Novel diagnostic value of circulating miR-18a in plasma of patients with pancreatic cancer. Br J Cancer 2011, 105:1733–1740. 84. Wang W-S, Liu L-X, Li G-P, Chen Y, Li C-Y, Jin D-Y, Wang X-L: Combined Serum CA19-9 and miR-27a-3p in Peripheral Blood Mononuclear Cells to Diagnose Pancreatic Cancer. Cancer Prev Res (Phila) 2013. 61
85. Liu J, Gao J, Du Y, Li Z, Ren Y, Gu J, Wang X, Gong Y, Wang W, Kong X: Combination of plasma microRNAs with serum CA19-9 for early detection of pancreatic cancer. Int J Cancer 2012, 131:683–691. 86. Ho AS, Huang X, Cao H, Christman-Skieller C, Bennewith K, Le Q-T, Koong AC: Circulating miR-210 as a Novel Hypoxia Marker in Pancreatic Cancer. Transl Oncol 2010, 3:109–113. 87. Liu R, Chen X, Du Y, Yao W, Shen L, Wang C, Hu Z, Zhuang R, Ning G, Zhang C, Yuan Y, Li Z, Zen K, Ba Y, Zhang C-Y: Serum microRNA expression profile as a biomarker in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Clin Chem 2012, 58:610–618. 88. Schultz NA, Andersen KK, Roslind A, Willenbrock H, Wøjdemann M, Johansen JS: Prognostic microRNAs in cancer tissue from patients operated for pancreatic cancer--five microRNAs in a prognostic index. World J Surg 2012, 36:2699–2707. 89. Ikenaga N, Ohuchida K, Mizumoto K, Yu J, Kayashima T, Sakai H, Fujita H, Nakata K, Tanaka M: MicroRNA-203 expression as a new prognostic marker of pancreatic adenocarcinoma. Ann Surg Oncol 2010, 17:3120–3128. 90. Papaconstantinou IG, Manta A, Gazouli M, Lyberopoulou A, Lykoudis PM, Polymeneas G, Voros D: Expression of microRNAs in patients with pancreatic cancer and its prognostic significance. Pancreas 2013, 42:67–71. 91. Nakata K, Ohuchida K, Mizumoto K, Kayashima T, Ikenaga N, Sakai H, Lin C, Fujita H, Otsuka T, Aishima S, Nagai E, Oda Y, Tanaka M: MicroRNA-10b is overexpressed in pancreatic cancer, promotes its invasiveness, and correlates with a poor prognosis. Surgery 2011, 150:916–922. 92. Giovannetti E, van der Velde A, Funel N, Vasile E, Perrone V, Leon LG, De Lio N, Avan A, Caponi S, Pollina LE, Gallá V, Sudo H, Falcone A, Campani D, Boggi U, Peters GJ: High-throughput microRNA (miRNAs) arrays unravel the prognostic role of MiR-211 in pancreatic cancer. PLoS ONE 2012, 7:e49145. 93. Ohuchida K, Mizumoto K, Kayashima T, Fujita H, Moriyama T, Ohtsuka T, Ueda J, Nagai E, Hashizume M, Tanaka M: MicroRNA expression as a predictive marker for gemcitabine response after surgical resection of pancreatic cancer. Ann Surg Oncol 2011, 18:2381–2387. 94. Yan H-J, Liu W-S, Sun W-H, Wu J, Ji M, Wang Q, Zheng X, Jiang J-T, Wu C-P: miR-175p inhibitor enhances chemosensitivity to gemcitabine via upregulating Bim expression in pancreatic cancer cells. Dig Dis Sci 2012, 57:3160–3167. 95. Li Y, VandenBoom TG 2nd, Kong D, Wang Z, Ali S, Philip PA, Sarkar FH: Up-regulation of miR-200 and let-7 by natural agents leads to the reversal of epithelial-tomesenchymal transition in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells. Cancer Res 2009, 69:6704–6712. 62
96. Preis M, Gardner TB, Gordon SR, Pipas JM, Mackenzie TA, Klein EE, Longnecker DS, Gutmann EJ, Sempere LF, Korc M: MicroRNA-10b expression correlates with response
to
neoadjuvant
therapy
and
survival
in
pancreatic
ductal
adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2011, 17:5812–5821. 97. Nana-Sinkam SP, Croce CM: MicroRNAs as therapeutic targets in cancer. Transl Res 2011, 157:216–225. 98. Garzon R, Marcucci G, Croce CM: Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Discov 2010, 9:775–789. 99. Greither T, Grochola LF, Udelnow A, Lautenschläger C, Würl P, Taubert H: Elevated expression of microRNAs 155, 203, 210 and 222 in pancreatic tumors is associated with poorer survival. Int J Cancer 2010, 126:73–80. 100. Szafranska AE, Davison TS, John J, Cannon T, Sipos B, Maghnouj A, Labourier E, Hahn SA: MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and nonneoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Oncogene 2007, 26:4442–4452.
63
Seznam obrázků Obr. 1:
Srovnání incidence v České republice s ostatními zeměmi Evropy.
Obr. 2:
Algoritmus terapie nádorů slinivky břišní, který vyjadřuje možný postup lékařů v různých fázích onemocnění.
Obr. 3:
Zastoupení mutací v jednotlivých stádiích PanIN.
Obr. 4:
Proces biogeneze miRNA – jednotlivé kroky a zúčastněné enzymy s proteiny.
Obr. 5:
Role miRNA jako onkogenu nebo nádorového supresoru.
Obr. 6:
TGF-β signální dráha a zapojení miRNA do této kaskády.
Obr. 7:
EGFR/KRAS signální dráha a zapojení miRNA do této kaskády.
Obr. 8:
Wnt/β-katenin signální dráha a zapojení miRNA do této kaskády.
Obr. 9:
Zapojení jednotlivých miRNA do buněčného cyklu a apoptózy.
Obr. 10:
Zapojení miRNA do procesu metastázování
Obr. 11:
Geny RNU44 a RNU48 jako vhodné endogenní kontroly vybrány pomocí aplikace geNorm v programu GenEx.
Obr. 12:
Gen RNU48 jako vhodná endogenní kontrola vybrána pomocí aplikace NormFinder v programu GenEx.
Obr. 13:
Normalizovaná exprese miR-21 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2-ΔΔCT).
Obr. 14:
Normalizovaná exprese miR-181a ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2-ΔΔCT).
Obr. 15:
Normalizovaná exprese miR-203 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2-ΔΔCT).
Obr. 16:
Normalizovaná exprese miR-222 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2-ΔΔCT).
Obr. 17:
Normalizovaná exprese miR-217 ve 20 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2-ΔΔCT).
Obr. 18:
Porovnání exprese miR-217 v 73 nádorových tkáních (normalizováno pomocí referenčního genu RNU48 s využitím metody 2-ΔΔCT).
Obr. 19:
Porovnání
exprese
miR-217
u
pacientů
s chronickou
pankreatitidou
a u pacientů s nádorem slinivky břišní (Mann-Whitney test, P = 0,0038). Obr. 20:
Porovnání
exprese
miR-217
u
pacientů
s chronickou
pankreatitidou,
u pacientů s nádorem slinivky břišní a ve zdravé sliznici (Kruskal-Walis test, P = 0,0036). Obr. 21:
Analýze exprese miR-217 v závislosti na klinickém stádiu (Kruskal-Wallis test, P = 0,2965). 64
Obr. 22:
ROC analýza na zjištění hraniční cut-off hodnoty exprese miR-217 u pacientů s celkovým přežíváním delším a kratším než 9 měsíců.
Obr. 23:
Kaplan-Meierovy křivky přežití pacientů s vyšší hladinou exprese miR-217 (červená křivka) a s nižší hladinou exprese miR-217 (černá křivka) u nádorů slinivky břišní.
Seznam tabulek Tabulka I:
TNM klasifikace
Tabulka II:
Rozdělení nádorů do příslušných klinických stádií
Tabulka III:
Grading nádorů slinivky břišní
Tabulka IV:
Vybrané miRNA zapojené do procesu karcinogeneze [3].
Tabulka V:
Zastoupení pacientů s nádorem slinivky břišní v jednotlivých klinických stádiích
Tabulka VI:
Složení směsi pro RT
Tabulka VII: Nastavení termocykléru Tabulka VIII: Objemové zastoupení jednotlivých složek směsi na PCR pro 1 vzorek Tabulka IX:
Nastavení PCR cykléru
Seznam příloh Příloha 1:
Klinicko-patologické informace o pacientech s nádorem slinivky břišní
65
Příloha 1
Klinicko-patologické informace o pacientech s nádorem slinivky břišní kód vzorků
pohlaví
věk
stage
grade
celkové přežití (dny)
810/03 3707/03 12914/03 16894/03 15347/04 18690/04 20092/04 11911/05 3580/06 11114/06 12135/06 7809/07 20266/07 8929/08 14393/08 11268/09 4064/10 4589/10 11461/10 11521/10 13444/10 13827/10 14925/10 194/11 484/11 1988/11 7622/11 9073/11 10647/11 12139/11 12555/11 13304/11 15740/11 16474/11 17004/11 17150/11 809/12 1128/12
ž m m m m ž ž m m m ž ž m m ž ž ž ž m m ž ž ž m ž m ž ž m m m m ž ž m ž m m
68 55 68 55 66 67 71 54 69 43 69 49 51 45 30 67 70 66 61 64 60 51 69 49 60 66 57 73 63 56 58 68 69 60 37 63 72 55
IIB IIB IIB IIB IIB IIB IIB IIB IIA IV IIA IIB IIB IIB IV IIA IB IIA IIB IIA IIA IIB IIB IIA IIB IIB IIB IIA IIB IIB IIB IIB IIB IIA IIB IIA IIB IIA
2 2 3 2 3 3 3 2 3 -
632 512 230 346 139 305 15 722 361 141 722 454 192 467 516 840 1152 22 1048 442 500 465 100 278 397 -
66
1256/12 1995/12 2749/12 3708/12 5446/12 6275/12 8685/10 13383/10 1138/11 4279/11 7063/11 4901/04 1868/05 4209/05 13122/09 19899/09 5877/11 4296/01 4127/01 10146/02 2948/02
4342/01 10312/02 9900/02 4215/03 1368/03 8769/03 16156/03 11590/03 15661/01
10959/03 12872/03 3249/02 3453/03 3926/05
ž m m m ž m m m m m ž ž m ž m ž ž ž ž m m ž ž ž ž ž ž ž m m ž m m ž ž
79 59 74 52 72 57 59 74 60 49 67 72 47 63 66 50 62 60 58 55 65 54 57 59 59 69 71 48 73 63 62 60 48 50 64
IIB IIB IIB IIB IIB IIA IIA IIB IIB IIB IIA IV IIB IIB IIB IIB IIB IIB IIB IIB IV IIA IIB IIB IIB IIA IV IIB IIB IIB IIB IIA IV IV IIA
67
3 1 1 3 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 2 3 3 2
266 274 1174 416 295 1381 17 1005 1770 218 656 800 378 455 692 1751 866 291 304 270 330 389 327 199 554
